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Neuroscience

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere ( Published: July 25, 2013 doi: 10.3791/50446

Summary

In questo protocollo, si descrive due strategie che sopprimono contemporaneamente due geni (doppia knockdown gene) di api mellifere. Poi ci presentiamo come usare la risposta estensione proboscide (PER) test per studiare l'effetto di doppio knockdown gene sul miele d'api percezione gustativa.

Abstract

Questo video mostra nuove tecniche di RNA interference (RNAi), che downregulate due geni contemporaneamente in api utilizzando iniezioni di RNA a doppio filamento (dsRNA). Essa presenta anche un protocollo di risposta estensione proboscide (PER) test per la misurazione della percezione gustativa.

RNAi-mediata knockdown gene è una tecnica efficace downregulating espressione del gene bersaglio. Questa tecnica è solitamente utilizzata per la singola manipolazione genica, ma ha limitazioni di rilevare interazioni ed effetti congiunti tra geni. Nella prima parte di questo video, vi presentiamo due strategie per battere contemporaneamente giù due geni (chiamati doppia knockdown gene). Mostriamo entrambe le strategie sono in grado di sopprimere efficacemente due geni, vitellogenina (vg) e ultraspiracle (USP), che sono in un ciclo di feedback normativo. Questo doppio approccio knockdown gene può essere utilizzato per analizzare interrelazioni tra geni e può essere facilmente applicato indiverse specie di insetti.

La seconda parte di questo video è una dimostrazione di proboscide estensione della risposta (PER) saggio di api mellifere, dopo il trattamento di doppia knockdown gene. Il saggio PER è un test standard per misurare la percezione gustativa di api mellifere, che è un fattore predittivo fondamentale per la velocità con la maturazione comportamentale un miele di ape è. Maggiore percezione gustativa di api nido indica maggiore sviluppo comportamentale, che è spesso associata a una precedente età di insorgenza di foraggiamento e di foraggiamento specializzazione nel polline. Inoltre, per saggio può essere applicata per identificare gli stati metabolici di sazietà o di fame di api mellifere. Infine, per saggio combinato con l'associazione diversi stimoli odore per il condizionamento delle api è anche ampiamente usato per l'apprendimento e la memoria gli studi di api mellifere.

Introduction

RNA interference (RNAi) è RNA a base di post-trascrizionale silenziamento genico, che si verifica in una grande varietà di organismi eucarioti. Il processo di RNAi è attivato da RNA a doppio filamento (dsRNA) precursori endogeni o esogeni. Il dsRNA attiva la proteina Dicer ribonucleasi che lega e scinde il dsRNA di piccoli frammenti (20-25 bp). Poi i piccoli frammenti della guida dsRNA un riconoscimento e di clivaggio mRNA complementari da proteine ​​argonaute, un componente catalitico di indotto da RNA silencing complex (RISC) 1. Nei mammiferi, dsRNAs più di 30 nt, attivano una risposta antivirale (risposta all'interferone, IFN), che porta alla degradazione aspecifica di RNA trascritti 2. Tuttavia, lunghi dsRNAs hanno dimostrato di essere efficaci e specifici negli insetti poiché non vi è una mancanza di questo IFN 3.

DsRNAs lunghi sono stati utilizzati per sottoregolazione di geni bersaglio in diverse specie di insetti. Le api da miele sono uno del pioneorganismi di insetti eer in cui le funzioni di molti geni importanti per lo sviluppo e il comportamento sono stati rivelati mediante dsRNA 4,5. Diversi metodi di consegna dsRNA sono stati eseguiti in api: dsRNA alimentazione downregulates efficiente espressione del gene bersaglio nel miele delle api larve 6, mentre l'iniezione dsRNA è un approccio efficace per il knockdown gene in embrioni di miele d'api 4 e api adulte 7,8.

Gene effetti knockdown esposti applicando dsRNA di insetti sono transitori e localizzati. Studi hanno dimostrato che entrambe le iniezioni dsRNA addominali e iniezioni dsRNA toraciche sopprimere efficacemente l'espressione del gene bersaglio in cellule addominale di grasso corporeo di insetti 9,10. DsRNA viene iniettato nella cavità addominale e toracica e le cellule di grasso corporeo sono in grado di riprendere il dsRNA dal emolinfa in cui le cellule sono immerse 10. Tuttavia, i geni in altri organi, come ovaie ei cervelli, non possono essere bersaglio di unoiniezioni addominali o toracici. Al fine di mirare geni nel cervello miele ape, iniezione di dsRNA cervello è stato anche eseguito, che influenza in modo efficace espressione del gene bersaglio in aree cerebrali locali 11. Qui, noi documentiamo solo dsRNA iniezione addominale che è più comunemente usato in api adulte.

RNAi è stato principalmente utilizzato per mirare ad un singolo gene ed è stato un potente strumento per rivelare la funzione del gene. Tuttavia, qualsiasi gene non è isolato dagli altri, ma è in reti complesse di regolazione. Una chiave per comprendere un processo biologico è di sezionare come i geni interagiscono tra loro, che richiede manipolazioni simultanee di geni multipli, piuttosto che un singolo gene knockdown. In linee cellulari di mammiferi, gli scienziati sono riusciti a inibire simultaneamente due o tre geni utilizzando sistemi di consegna 12 o più microRNA (miRNA) disegni tornante 13. Ma negli insetti, più atterramenti geni sono ancora collaudati. Qui, Present strategie di iniezione differenti in modo da raggiungere un duplice knockdown gene. Ci rivolgiamo due geni: vitellogenina (vg), che codifica per una proteina precursore tuorlo, e ultraspiracle (USP), che codifica per un recettore putativo di ormone giovanile (JH) e può servire come un fattore di trascrizione mediare le risposte a JH 14 di api mellifere. Vg e JH regolano a vicenda in un ciclo di feedback 15 e sono coinvolti nel miele delle api comportamentale regola 9. Usando il doppio knockdown gene, abbiamo turbare entrambi Vg e percorsi JH, e scopriamo come influenzano congiuntamente comportamento delle api il miele e la fisiologia e come vg, USP e JH interagiscono 9.

Percezione gustativa è un predittore comportamentale per il miele delle api comportamento sociale 16. In termini di sviluppo del comportamento, le api nido con alta percezione gustativa comportamentale veloci maturo, e di solito foraggio primi anni di vita e preferiscono raccogliere il polline 16,17. Sebbene m normativoechanisms sottostanti percezione gustativa sono ancora poco chiari, gli studi hanno dimostrato che la percezione gustativa è legata a metabolismi energetici interni 9, la secrezione ormonale 18,19 e biogenetica ammina percorsi 20. Sia Vg e JH sono importanti regolatori ormonali modulando la percezione gustativa 7,21. In laboratorio, una variazione di percezione gustativa in api può essere valutata analizzando la risposta estensione proboscide (PER) a soluzioni di saccarosio diversi. Ogni ape è testato toccando entrambe le antenne con una gocciolina di acqua seguita da una serie crescente concentrazione di 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% di saccarosio. Una risposta positiva si osserva se un ape estende completamente la proboscide quando una goccia d'acqua o di saccarosio è toccata a ciascuna antenna. In base al numero di risposte positive alle soluzioni, il livello di percezione gustativa di ogni individuo può essere determinato 16. Tuttavia, l'applicazione del PER non è limitato alla misura gpercezione ustatory. Il PER è anche un metodo efficace per testare lo stato metabolico delle api quali sazietà vs fame. Le api con maggiori risposte al saccarosio sono più affamato in generale (Wang e Amdam, dati non pubblicati). Inoltre, il paradigma PER può essere utilizzato anche in apprendimento associativo e la memoria di api mellifere. In questo caso le api saranno addestrati per associare la presenza dell'acqua saccarosio con un odore. Quando le api imparano l'associazione, solo la presenza di odore può evocare una risposta positiva proboscide senza premiare con il saccarosio 22,23. In questo video vi mostriamo come effettuare PER per valutare la percezione gustativa che è stato collegato con vg e USP doppio atterramento in uno studio precedente 9.

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Protocol

Parte 1: RNAi mediato doppio knockdown gene

1. dsRNA Synthesis

  1. Progettazione di primer dsRNAs rivolte vg, USP e un gene codificante la proteina fluorescente verde di controllo (GFP), che non è nel miele delle api genoma: primer sono stati progettati utilizzando il software gratuito online di Primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/ ) .
  2. sintesi di dsRNA per vg, USP e GFP: uso RiboMax T7 sistema di produzione di RNA da Promega per la trascrizione in vitro.
  3. dsRNA purificazione:
    1. Denaturazione e rinaturazione: il calore del dsRNA a 85 ° C per 5 minuti e lasciare raffreddare a temperatura ambiente per 1 ora.
    2. DNasi trattamento I: aggiungere 1 ml DNasi I in ciascuna reazione dsRNA e mescolare muovendo i tubi. Incubare per 15 minuti a 37 ° C.
    3. Aggiungere 150 microlitri di acqua priva di nucleasi e 750 microlitri TRIzol - LS in ogni reazione, e mescolare delicatamente loro da inverting il tubo. Incubare i campioni per 5 min a 30 ° C.
    4. Aggiungere 200 microlitri cloroformio in ciascun campione. Mescolare energicamente per 20 sec. Centrifugare i campioni per 15 min a 12.000 xga 4 ° C.
    5. Trasferire la fase surnatante a ciascuna nuova provetta e aggiungere 500 alcool isopropilico microlitri in ciascun tubo. Mescolare capovolgendo la provetta. Incubare la miscela per 20 minuti a -20 ° C. Centrifugare per 10 minuti a 12.000 xg a 4 ° C.
    6. Rimuovere il surnatante e utilizzare 1,000 microlitri 75% di etanolo per lavare il pellet. Dopo centrifugazione del tubo per 5 minuti a 7500 xga 4 ° C, l'aria secca dsRNA pellet, e utilizzare acqua priva di nucleasi per sciogliere il pellet. Per assicurare l'efficacia del gene down-regolazione, la concentrazione dsRNA dovrebbe essere di circa 9 -10 mg / mL.

2. dsRNA iniezione addominale

Per il doppio knockdown gene, ci sono due strategie: 1) iniezione singola: dsRNA miscela di due geni e inject miscela; 2) due giorni di iniezione: iniettare il primo dsRNA di targeting un gene il primo giorno, e iniettare il secondo dsRNA nelle stesse api il secondo giorno.

  1. Freddo di recente emerso api in un 4 ° C frigorifero per 1-2 min. Quando le api sono immobilizzati, montare 3-4 api in parallelo su piastre di Petri piene di cera solida con perni di insetti incrociate tra loro addomi e thoraces.
  2. Raffreddare ancora le api in un 4 ° C frigorifero. Assicurarsi che le api sono completamente immobile. Ci vogliono circa 1-2 min. Le api devono guardare sciolta. Se le api diventano arricciate o contorta, vuol dire che sono raffreddati troppo tempo che dovrebbe essere evitato. Raffreddando troppo causa alta mortalità, ma completa immobilizzazione è importante come qualsiasi movimento aumenta la dimensione della ferita e mortalità.
  3. Metti un usa e getta 30 ago G (BD) in un Hamilton micro siringa. Prendere 3 dsRNA microlitri e assicurarsi che non vi è alcuna bolla d'aria nella siringa. L'ago viene inserito in un lato dell'addome per evitare damaging organi interni. Premere lentamente lo stantuffo della siringa per consentire il dsRNA di essere assorbito. Poiché dsRNA è molto viscoso, richiede 2-3 secondi per essere completamente espulso dalla siringa. Dopo aver completamente spingendo verso il basso il pistone, lasciare l'ago nella ferita per 4-5 sec. Osservare le api per 3-5 sec dopo le iniezioni. Se un emolinfa gocciolina perdite dalla ferita, scartare l'ape.
  4. Utilizzare colori diversi per contrassegnare i loro thoraces corrispondenti ai diversi trattamenti. A questo punto, se è stata utilizzata la strategia di iniezione singola, le api possono essere messi di nuovo in una colonia dopo 1 ora di osservazione. Tuttavia, se è stata utilizzata la strategia di iniezione di due giorni, dopo l'iniezione con il primo dsRNA, le api devono essere posti in una gabbia di rete cilindro con miele fornito sul lato ed essere mantenute in un incubatore a 34 ° C e 80% di umidità .
  5. Il secondo giorno, seguire i punti 2.2 e 2.3 per rilassarsi le api nelle gabbie in rete e montarli su lastre di cera. Eseguire iniezioni con il secondo dsRNA come è descriletto nel passo 2.4.
  6. Lasciate che le api recuperano a temperatura ambiente per 1 ora e li introducono in una colonia.

Nota: Gli effetti Knockdown possono essere rilevate da RT-PCR quantitativa (RT-PCR quantitativa) e western blotting. In generale, l'efficacia knockdown varia e dipende da molti fattori. Nel nostro studio, il doppio knockdown gene può essere rilevato 7 giorni dopo singole iniezioni e le iniezioni di due giorni.

Parte 2: proboscide estensione di risposta (PER) assay

1. Raccolta api dall'alveare

Il giorno 6 dopo le iniezioni, raccogliere le api trattate dalla colonia senza utilizzare un fumatore. Raccogliere api in metallo gabbie cilindro mesh. Mantenere tre api in ogni gabbia.

2. Api di montaggio per PER

Raffreddare le api a 4 ° C fino a completa immobilizzati. Montare ogni ape verticalmente in un tubo di plastica appositamente progettato per PER. Mantenere l'addome all'interno del tubo da using due piccoli pezzi di nastro, e mantenere la testa fuori dal tubo. Mettere le provette su un rack a due ordini di colonnine di plastica, e assegnare ogni tubo (ape), con un numero ID. Poi mettere le api trattate sugli scaffali in un incubatore (34 ° C e 80% di umidità) e tenerli in incubatrice per 2 ore.

3. Preparazione di una serie di saccarosio Water Solutions

Preparare 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% e soluzioni acquose di saccarosio 30% e caricare le soluzioni in siringhe con ago G 15-20.

4. Per saggio

Toccare l'antenna del ape con una goccia di soluzione di 0% (acqua) seguito da 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% e soluzioni acquose di saccarosio 30%. Provare tutte le api con acqua prima e consentono almeno due minuti come l'intervallo tra ogni soluzione viene utilizzato. Pertanto, di solito abbiamo almeno 20 api per ogni prova. Se un'ape si estende completamente la proboscide, una risposta positiva viene contato.

5.Gestione dei dati

Sommare il totale delle risposte positive per ogni individuo per il punteggio risposta gustativa (GRS). Effettuare un'analisi statistica appropriata sui dati.

Parte 3. Convalida knockdown gene

Corpi grassi sono sezionati da un altro set di 7 giorni di età api trattate. Una procedura TRIzol standard è utilizzato per l'estrazione di RNA, che è seguita da un trattamento DNasi I 24. Vg e l'espressione genica USP è analizzato da un due fasi qRT-PCR. Actina è usato come un gene di riferimento in quanto ha espressioni stabili in differenti tessuti delle api. Pubblicato primer PCR real-time per vg e USP gene sono utilizzati in questo esperimento 24. I dati sono analizzati utilizzando Delta-Delta metodo CT 25.

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Representative Results

Sia l'iniezione singola e due giorni a iniezione strategie ridotto significativamente vg (One-way ANOVA, p <0.001) (Figura 2A) e USP (One-way ANOVA, p <0.001) (Figura 2B) livelli di trascrizione di api sei giorni dopo il dsRNA è stato iniettato. La soppressione della trascrizione USP utilizzando la singola iniezione con miscela dsRNA e l'iniezione di due giorni con vg primo e secondo USP (vg / USP) era significativamente inferiore alla iniezione di due giorni con USP prima e seconda vg (USP / vg) (analisi post-hoc, miscela P vs USP / vg = 0.013, p vg / USP vs USP / vg = 0,019).

Il GRS in doppia api atterramento era significativamente più alta rispetto alle api di controllo GFP (test t di Student, p = 0,0496) (Figura 3).


Figura 1. Diagramma di flusso della RNA interference (RNAi) / risposta estensione proboscide (PER) del test. Quattro gruppi di 50 api appena emerse sono state iniettate con RNA a doppio filamento (dsRNA) di vitellogenina (vg) e ultraspiracle (USP), utilizzando diverse strategie di combinazione o con il dsRNA di fluorescenza verde proteina (GFP) gene che non esiste nel genoma delle api il miele. Le api sono stati collocati di nuovo ad un alveare dopo le iniezioni, e sono stati raccolti dopo 6 giorni. Sedici le api per gruppo sono stati raccolti per la convalida knockdown gene mediante PCR in tempo reale, e trenta per gruppo sono stati per proboscide risposta estensione (PER) test. Il 'GFP dsRNA' indica le api iniettati con GFP dsRNA; la 'vg + miscela usp' indica le api inproiettata con vg e USP miscela dsRNA; la 'vg / usp' indica le api iniettati con dsRNA vg il primo giorno, poi iniettati con USP dsRNA il secondo giorno, il 'USP / vg' indica le api iniettati con dsRNA USP su il primo giorno, e iniettati con vg dsRNA il secondo giorno.

Figura 2
Figura 2. Doppia gene convalida atterramento utilizzando Real-time PCR. Entra trasformato valore relativo mRNA (media ± SEM) nel corpo di grasso addominale delle api trattate. Il valore relativo mRNA è stato calcolato utilizzando il metodo CT Delta-Delta. (A) espressione Vg 6 giorni dopo le iniezioni dsRNA. Le trascrizioni vg erano significativamente down-regolati da tre doppie k approcci nockdown (One-way ANOVA, p <0.001). (B) espressione Usp 6 giorni dopo le iniezioni dsRNA. Le trascrizioni usp sono stati significativamente ridotti da tre approcci doppio atterramento (One-way ANOVA, p <0.001). Tuttavia, l'espressione USP nelle api iniettata la miscela dsRNA e vg / USP era molto inferiore che nelle api iniettati con USP / vg (post-hoc analisi, pagg miscela vs USP / vg = 0.013, p vg / USP vs USP / vg = 0,019), indicando che vg può essere un regolatore primario nel ciclo normativo vg e JH. Il 'RQ' indica il livello di quantificazione relativa dei trascritti del gene bersaglio. Le diverse lettere di cui sopra barre indicano differenze significative tra i gruppi di trattamento.

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Figura 3. Punteggio risposta gustativa (GRS) utilizzando risposta estensione proboscide (PER) del test. Le api, che sono stati iniettati con vg e USP miscela dsRNA aveva GRS superiore rispetto ai controlli GFP, che indica che erano più sensibili al saccarosio. Le diverse lettere di cui sopra barre indicano differenze significative tra i gruppi di trattamento (test t di Student, p = 0,0496).

Figura 4
Figura 4. Possibili reti gene regolatore rivelato utilizzando vg e USP doppio approccio knockdown. Ormone giovanile (JH) è prodotto nel cervello delle api il miele e secreto al emolinfa. Vitellogenina (VG) è un precursore proteina tuorlo prodotta dalle cellule di grasso corporeo. Vg e JH sono in un ciclo di feedback regolazione Physiol metabolicalogia, la percezione gustativa, e l'età di insorgenza di foraggiamento e di foraggiamento preferenza di api. Studi suggeriscono che ultraspiracle (USP) è un recettore putativo per JH e può servire come un fattore di trascrizione. Il nostro doppio atterramento di vg e USP ha rivelato vg gioca un ruolo centrale nel rapporto tra vg, USP e JH. 1. Abbiamo trovato doppio atterramento di vg e USP causato un aumento maggiore JH di un vg unico knockdown, e un USP singolo atterramento non ha indotto alcun cambiamento nella JH. Essa suggerisce che Vg non solo inibisce la produzione JH, ma inibisce la risposta valutazioni di JH USP atterramento (A). Nel doppio atterramenti, il drammatico aumento dei risultati di produzione JH da una inibizione ridotta da Vg causato da vg knockdown e una risposta compensatoria ad una ridotta trasduzione JH causata da USP knockdown (B). 2. Abbiamo trovato usptrascrizione abbondanza è stato più ridotto di usp dsRNA quando vg è principalmente o contemporaneamente inibiti, suggerendo vg sopprime la sensibilità del usp mRNAto sua dsRNA. Come può vg essere coinvolto in RNA interference (RNAi)? Vg regola il miele delle api difesa immunitaria e RNAi è una parte di antivirale del sistema immunitario innato. Il nostro studio precedente dimostra argonaute 3 (GB19389, piwi), una componente importante della RNA-indotto silencing complex (RISC), è uno dei geni che influenzano il miele delle api comportamento sociale (percezione gustativa, l'età di esordio foraggiamento e foraggiamento preferenza), che è controllata dal modulo Vg / JH. Pertanto, una possibilità è che Vg può sopprimere proteine ​​argonaute influenzano l'attività di RISC (A). Quando vg è downregulated, USP dsRNA è in grado di degradare in modo più efficiente USP mRNA (B). 3. Nostro studio doppio atterramento rivela anche che la USP faNon mediare effetto inibitorio di JH sulla produzione Vg nel corpo grasso perché né singolo atterramento usp colpisce vg trascrizione abbondanza, né doppio vg e USP atterramento provoca un'ulteriore riduzione del vg trascrizioni. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Discussion

Il nostro studio è il primo tentativo di battere contemporaneamente giù due geni in insetti adulti. I nostri risultati mostrano che le due strategie di dsRNA iniezioni (singola iniezione e iniezione di due giorni) sono efficaci per il doppio repressione genica, e simultanea silenziamento genico di vg e USP possono essere testati 6 giorni dopo le iniezioni dsRNA in api 8,9. Tuttavia, l'efficacia gene knockdown varia nelle diverse specie di insetti seconda del livello di trascrizione del gene bersaglio, i tassi di turnover proteico ed efficienza dsRNA assorbimento da parte delle cellule o organi. Inoltre, l'effetto di RNAi è dose dipendente. Abbiamo trovato un ape di recente è emerso potrebbe accettare 4 dsRNA microlitri, ma la mortalità aumentata rapidamente se più di 4 dsRNA microlitri è stato iniettato. Pertanto, la strategia di iniezione di due giorni può essere più adatto rispetto alla singola iniezione per un esperimento che richiede una maggiore quantità di volume di iniezione.

Qui, il doppio gene knockdown 9

Per esempio Vg e JH sono in un ciclo di feedback regolare il miele delle api fisiologia 9 e maturazione comportamentale 26,27. Studi precedenti hanno dimostrato che l'vg knockdown gene può aumentare il livello di JH nelle api 28, mentre l'applicazione topica di JH in grado di ridurre l'espressione vg 29. Inoltre, studi hanno suggerito USP è un recettore putativo per JH, e possono mediare risposte a JH come fattore di trascrizione 14,30. Tuttavia, come vg modula JH titolo e se USP è coinvolta nella regolazione di vg da JH sono ancora poco conosciuti. Utilizzando l'approccio doppio atterramento, abbiamo scoperto interrelazioni dettagliate tra vg, USP e JH ( vg ha un ruolo centrale tra i vg, USP e JH. Alto livello di Vg non solo inibisce la produzione JH 15, ma inibisce la risposta dei feedback sistematico alla USP knockdown (Figura 4A). In vg e USP doppie api atterramento, produzione JH è stata aumentata più 9 da quello in vg singoli abbattimenti. Una possibile spiegazione è che il drammatico aumento di JH tra doppi abbattimenti risultati da una significativa riduzione dell'effetto negativo di Vg su JH causato da vg knockdown e una risposta compensatoria ad una ridotta trasduzione JH causata da USP knockdown (Figura 4B). In secondo luogo, l'abbattimento dei vg primo e secondo USP o simultaneo atterramento di entrambi causato più riduzione del USP di quello che un singolo atterramento di USP ha fatto. Ciò potrebbe suggerire che vg inibisce la sensibilità della USP mRNAto sue dsRNA. Questo risultato è il primo a collegare Vg con i processi di RNAi. Vg è coinvolta nella difesa immunitaria di api mellifere 31 e RNAi è uno dei tanti sistemi antivirali 32 in organismi eucarioti. Studi hanno dimostrato che il processo RNAi riguarda proteine ​​argonaute che vengono conservati per tutta Eucarioti 33. È interessante notare che abbiamo già riscontrato che argonaute 3 (GB19389, piwi) è uno dei geni che regolano il miele delle api comportamento sociale in cui modulo Vg / JH svolge ruoli centrali 34. Pertanto, una spiegazione alternativa è che sopprime Vg funzioni delle proteine ​​argonaute influenzano la degradazione dell'mRNA (Figura 4A). Quando vg è downregulated, Argonautes contribuire più attivamente alla degradazione mRNA USP causato dalla sua dsRNA (Figura 4B). Infine, abbiamo trovato vg trascrizione abbondanza non è stato modificato da USP knockdown, ed è stato ridotto di vg e USP doppio atterramento al secoloe di livello simile a quello di vg unico knockdown. Questi risultati suggeriscono che l'USP non è coinvolta nell'effetto inibitorio di JH su Vg. Nel complesso, il doppio knockdown gene apparentemente è un approccio potente per aiutarci a capire di rete gene regolatore nei dettagli.

PER è un test standard per misurare la percezione gustativa di api mellifere, che è stato utilizzato come predittore per lo sviluppo di miele d'api comportamento sociale 35. Api con elevata sensibilità allo zucchero di solito inizia foraggiamento primi anni di vita e preferiscono per raccogliere il polline. Percezione gustativa può anche essere testato per predire l'effetto del trattamento sui comportamenti sociali prima di tutti gli altri studi del comportamento su larga scala vengono eseguite. Inoltre, abbiamo dimostrato che la percezione gustativa è correlato con interno stato metabolico 9 Perciò, PER può essere utilizzato per identificare i livelli di fame e sazietà. Inoltre, PER abbinato a condizioni di odore è impiegato per lo studio dell'apprendimentoe la memoria di api mellifere. Collettivamente, per saggio è una tecnica molto utile per studiare il comportamento delle api il miele e la fisiologia metabolica. Tuttavia, capite è sensibile alle modalità del trattamento 36. Ad esempio, le api che sono stati anestetizzati mediante raffreddamento o di CO 2 erano più sensibili al saccarosio rispetto ai controlli 36. PER varia anche durante il giorno ed è sensibile alle condizioni ambientali e stress. Pertanto, è molto importante per mantenere l'ambiente e procedure coerenti durante l'esperimento. In generale, finiamo PER la mattina e seguiamo lo stesso orario in giorni successivi. Noi di solito iniziare a raccogliere le api in prima mattina alle ore 8.00, e ci vogliono 3 ore per essere pronto per PER. Se esigenze PER da eseguire su più giorni, è importante finire in un breve periodo nel caso di cambiamenti dell'ambiente. PER dovrebbero essere prese in gruppi e ogni gruppo dovrebbe comprendere più di 20 api perché intervallo di almeno 2 minuti deve essere mantenuto tra diverse Concentrations di soluzioni di saccarosio. Abbiamo fatto 75-100 api per gruppo.

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Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Erin Fennern per assistere esperimento. Questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio di ricerca della Norvegia (180504, 185306 e 191699), PEW Charitable Trust, e il National Institute on Aging (NIA P01 AG22500).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GE Healthcare PCR beads in 96 well plate GE Healthcare 27-9557-01
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
RiboMax T7 RNA production system Promega P1300
Trizol LS Invitrogen 10296028
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma-Aldrich C0549
isopropyl alcohol Sigma-Aldrich I9516
Hamilton micro syringe Hamilton 80301
30G BD disposable needles BD Biosciences 305106
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
1 ml Syringe BD Biosciences 30960
Stereo dissection microscope Leica Microsystems S6D
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
Wax plate

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References

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RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)
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Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V.More

Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V. RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (77), e50446, doi:10.3791/50446 (2013).

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