Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

RNAi-mediert Double Gene Knockdown og Gustatory Perception Måling i Honey Bees ( Published: July 25, 2013 doi: 10.3791/50446
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1School of Life Sciences, Arizona State University, 2Department of Chemistry, Biotechnology, and Food Science, Norwegian University of Life Sciences

Summary

I denne protokollen beskriver vi to strategier som samtidig undertrykker to gener (dobbel genet knockdown) i honningbier. Deretter presenterer vi hvordan du bruker snabel forlengelse respons (PER) analyse for å studere effekten av dobbel genet knockdown på honningbie gustatory oppfatning.

Abstract

Denne videoen viser nye teknikker av RNA interferens (RNAi) som downregulate to gener samtidig i honningbier bruker dobbel-strandet RNA (dsRNA) injeksjoner. Den presenterer også en protokoll av snabel forlengelse respons (PER) analysen for å måle gustatory oppfatning.

RNAi-mediert genet knockdown er en effektiv teknikk downregulating target genuttrykk. Denne teknikken brukes vanligvis for enkelt genmanipulering, men det har begrensninger for å oppdage interaksjoner og felles effekter mellom gener. I første del av denne videoen presenterer vi to strategier for å samtidig slå ned to gener (kalles dobbelt genet knockdown). Vi viser er begge strategier i stand til effektivt å undertrykke to gener, Vitellogenin (VG) og ultraspiracle (USP), som er i et regulerende feedback-loop. Denne doble genet knockdown innstilling kan brukes for å dissekere sammenhengen mellom gener og kan lett anvendes iforskjellige insektarter.

Den andre delen av denne videoen er en demonstrasjon av snabel forlengelse respons (PER) analysen i honningbier etter behandlingen av dobbelt genet knockdown. Den PER analysen er en standard test for å måle gustatory oppfatning i honning bier, som er en viktig prediktor for hvor fort en honningbie sin atferdsmessige modning er. Greater gustatory oppfatning av reir bier indikerer økt atferdsmessige utvikling som ofte er forbundet med en tidligere alder ved utbruddet av beite og beite spesialisering i pollen. I tillegg kan PER analysen anvendes for å identifisere metabolske tilstander av metning eller sult i honning bier. Til slutt, PER analysen kombinert med sammenkobling ulike lukt stimuli for condition biene er også mye brukt for læring og hukommelse studier i honningbier.

Introduction

RNA interferens (RNAi) er RNA-baserte post-transkripsjonell genet stanse, som forekommer i en rekke forskjellige eukaryote organismer. Prosessen med RNAi utløses av endogene eller eksogene dobbelt-trådet RNA (dsRNA) forløpere. Den dsRNA aktiverer ribonuklease protein Dicer som binder og kløyver dsRNA til små fragmenter (20-25 bp). Da de små fragmenter av dsRNA guiden en anerkjennelse og spalting av komplementære mRNA ved Argonaute proteiner, en katalytisk komponent av RNA-induced Slå kompleks (RISC) 1. I pattedyr, dsRNAs lengre enn 30 nt, aktivere en antiviral respons (interferon respons, IFN) som fører til uspesifikke degradering av RNA transkripsjoner to. Men har lange dsRNAs vist seg å være effektiv og spesifikk i insekter siden det er mangel på denne IFN tre.

Lange dsRNAs har blitt brukt for downregulation av målet gener i forskjellige insektarter. Honningbier er en av pionEER insekt organismer der funksjoner av mange viktige gener i utvikling og atferd har blitt avslørt ved hjelp dsRNA 4,5. Flere dsRNA levering metoder har blitt utført i honningbier: dsRNA fôring effektivt nedregulerer target genuttrykk i honningbie larver 6, mens dsRNA injeksjon er en effektiv metode for genet knockdown i honningbie embryoer fire og voksne bier 7,8.

Genet knockdown effekter utstilt ved å bruke dsRNA til insekter er forbigående og lokalisert. Studier har vist at både abdominal dsRNA injeksjoner og thorax dsRNA injeksjoner effektivt undertrykke target genuttrykk i abdominal fett celler i kroppen av insekter 9,10. DsRNA injiseres i mage-og thorax hulrom og fett celler i kroppen er i stand til å ta opp den dsRNA fra hemolymfe hvor cellene er badet 10.. Imidlertid kan gener i andre organer, som for eksempel eggstokkene og hjerner, ikke bli målrettet av entenabdominal eller thorax injeksjoner. For å målrette gener i honningbie hjernen, har hjernen injeksjon av dsRNA også blitt utført, noe som effektivt påvirker target genuttrykk i lokale hjerneområder 11. Her har vi bare dokumentere abdominal dsRNA injeksjon som er mer vanlig hos voksne honningbier.

Rnai har primært vært brukt for å målrette et enkelt gen og har vært et kraftig verktøy for å avsløre gen-funksjon. Imidlertid er en hvilken som helst gen som ikke isolerte fra hverandre, og det er i komplekse regulatoriske nettverk. En nøkkel til å forstå en biologisk prosess er å dissekere hvordan gener samhandler med hverandre, noe som krever samtidige manipulasjoner av flere gener snarere enn et enkelt gen knockdown. I pattedyrcellelinjer, har forskere lykkes i å samtidig hemme to eller tre gener ved hjelp av leveringssystemer 12 eller multi-mikroRNA (miRNA) hårnål design 13. Men i insekter, flere genet knockdowns er fortsatt uprøvd. Her presentasjon vit forskjellige injeksjon strategier som kan oppnå en dobbel genet knockdown. Vi målretter to gener: Vitellogenin (VG) som koder for et protein forløper eggeplomme, og ultraspiracle (USP) som koder for en antatt reseptor for juvenilt hormon (JH) og kan tjene som en transkripsjonsfaktor mediere responser i JH 14 i honning bier. Vg og JH regulere hverandre i en tilbakekoblingssløyfe 15 og er involvert i honningbie atferdsmessige regulering 9.. Ved hjelp av den doble genet knockdown, vi forstyrre både Vg og JH trasé, og oppdage hvordan de i fellesskap påvirke honningbie atferd og fysiologi og hvordan vg, usp og JH samhandle ni.

Gustatory oppfatning er et atferdsmessig prediktor for honningbie sosial atferd 16. I form av atferdsmessige utvikling, hekker bier med høy gustatory oppfatning behaviorally modne raskt, og vanligvis grovfôr tidlig i livet, og foretrekker å samle pollen 16,17. Selv regulatoriske mechanisms underliggende gustatory oppfatning er fortsatt uklart, har studier vist at gustatory oppfatning er knyttet til interne energi metabolisms 9, hormonelle sekret 18,19 og biogenetic amin veier 20. Både VG og JH er viktige hormonelle regulatorer modulerende gustatory oppfatning 7,21. I laboratoriet, kan en variant av gustatory persepsjon i honning bier bli evaluert ved å teste snabel forlengelse respons (PER) til forskjellige sukrose-løsninger. Hver bie testes ved å berøre begge hennes antenner med en dråpe med vann fulgt av en stigende konsentrasjon serie av 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% sukrose. En positiv respons er kjent hvis en bie fullt strekker hennes snabel når en dråpe vann eller sukrose er berørt til hver antenne. Basert på antallet av positive respons på løsninger, kan den gustatory oppfatning nivå av hver enkelt bestemmes 16. Imidlertid er anvendelsen av PER ikke begrenset til måling gustatory oppfatning. PER er også en effektiv metode for å teste den metabolske tilstand av bier som metning vs sult. Biene med større respons på sukrose er sulten generelt (Wang og Amdam, upubliserte data). Videre kan PER paradigmet også brukes i assosiative læring og hukommelse i honning bier. I dette tilfellet bier vil bli trent til å assosiere tilstedeværelse av sukrose vann med en lukt. Når biene lære foreningen kan bare tilstedeværelsen av lukt fremkalle en positiv snabel respons uten å belønne dem med sukrose 22,23. I denne videoen viser vi hvordan du utfører PER å vurdere gustatory oppfatning som har vært knyttet til vg og usp dobbel knockdown i en tidligere studie ni.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Del 1: RNAi-mediert dobbel genet knockdown

En. dsRNA Synthesis

  1. Design primere av dsRNAs rettet mot vg, usp og en kontroll genet grønn fluorescens protein (GFP) som ikke er i honningbie genomet: primere ble utformet ved hjelp av online gratis programvare Primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/ ) .
  2. dsRNA syntese for vg, usp og GFP: bruk RiboMax T7 RNA produksjonssystem fra Promega for in vitro transkripsjon.
  3. dsRNA rensing:
    1. Denaturering og renaturering: varme den dsRNA til 85 ° C i 5 minutter og la det avkjøles ved romtemperatur i 1 time.
    2. DNase I behandling: legg en ul DNase jeg inn hver dsRNA reaksjon og bland dem ved å sveipe rørene. Inkuber i 15 min ved 37 ° C.
    3. Tilsett 150 ul nukleasefritt vann og 750 ul Trizol - LS i hver reaksjon, og forsiktig bland dem med inverting røret. Inkuber prøvene i 5 min ved 30 ° C.
    4. Tilsett 200 ul kloroform til hver prøve. Bland kraftig i 20 sek. Sentrifuger prøvene i 15 min ved 12.000 x g. ved 4 ° C.
    5. Overfør supernatanten fase til hver nye rør og tilsett 500 mL isopropanol i hvert rør. Bland dem ved å snu røret. Inkuber blandingen i 20 min ved -20 ° C. Sentrifuger det i 10 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C.
    6. Fjern supernatanten og bruke 1,000 mL 75% etanol for å vaske pelleten. Etter sentrifugering av røret i 5 min ved 7500 x g ved 4 ° C, lufttørker dsRNA pellet, og bruk nuclease fritt vann for å oppløse pelleten. For å sikre at effekten av genet nedregulering, bør konsentrasjonen være rundt dsRNA 9 -10 ug / mL.

2. dsRNA Abdominal Injection

For dobbel genet knockdown, er det to strategier: 1) enkelt injeksjon: mix dsRNA av to gener og inject av blandingen, 2) to-dagers injeksjon: injisere den første dsRNA målretting ett gen på den første dagen, og injisere den andre dsRNA inn i de samme bier på den andre dagen.

  1. Chill nylig dukket bier i en 4 ° C kjøleskapet i 1-2 min. Når biene er immobilisert, montere 3-4 bier i parallell på petriskåler full av solid voks med insekt pins krysset mellom de underlivet og thoraces.
  2. Chill biene igjen i en 4 ° C kjøleskap. Sørg for at biene er helt immobile. Det tar ca 1-2 min. Biene skal se løs. Hvis biene blir krøllete eller forvridd, betyr det at de er kjølt altfor lenge som bør unngås. Kjøling for mye forårsaker høy dødelighet, men fullstendig immobilisering er viktig da enhver bevegelse øker størrelsen av såret og dødelighet.
  3. Sett en disponibel 30 G kanyle (BD) på en Hamilton micro sprøyte. Ta 3 ul dsRNA og sørge for at det ikke er luftbobler i sprøyten. Nålen er satt inn til en side av abdomen for å unngå skaging indre organer. Trykk sprøytestempelet langsomt for å tillate at dsRNA for å bli absorbert. Siden dsRNA er svært tyktflytende, tar det 2-3 sekunder for å være helt ut av sprøyten. Etter helt å trykke ned stempelet, la nålen i såret for 4-5 sek. Observere bier for 3-5 sek etter injeksjoner. Hvis en hemolymph dråpe lekkasjer fra såret, forkaste bee.
  4. Bruk forskjellige farger for å markere sine thoraces svarer til ulike behandlinger. På dette tidspunkt hvis det enkelt injeksjon strategien ble anvendt, kan biene plasseres tilbake i en koloni etter 1 time observasjon. Men hvis de to-dagers injeksjon strategi ble anvendt, etter å ha blitt injisert med den første dsRNA, bør biene plasseres i en sylinder mesh bur med honning leveres på siden, og holdes i en inkubator ved 34 ° C og 80% luftfuktighet .
  5. På den andre dagen, følg trinn 2.2 og 2.3 til chill bier i mesh bur og montere dem på voks plater. Utføre injeksjoner med det andre dsRNA som det er beskreseng i trinn 2.4.
  6. La biene utvinne ved romtemperatur i 1 time og innføre dem i en koloni.

Merk: Knockdown effekter kan oppdages ved kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) og western blotting. Generelt varierer knockdown effekt og avhenger av mange faktorer. I vår studie, kan den doble genet knockdown bli oppdaget 7 dager etter enkle injeksjoner og to-dagers injeksjoner.

Del 2: Snabel forlengelse respons (PER) assay

En. Samle Bees fra Hive

På dag seks etter injeksjoner, samle behandlede bier fra kolonien uten å bruke en røyker. Samle bier i metall mesh sylinder bur. Hold 3 bier i hver merd.

2. Montering Bees for PER

Chill biene ved 4 ° C til de er helt immobilisert. Monter hver bie vertikalt i et plastrør spesialdesignet for PER. Hold magen inne i røret ved using to små biter av tape, og holde hodet stikker ut av røret. Sett rørene på et stativ med to rader av små plast kolonner, og gi hver tube (bee) med et ID-nummer. Deretter settes behandlede bier på stativer inn i en inkubator (34 ° C og 80% fuktighet) og holde dem i inkubatoren i 2 timer.

3. Forbereder en Series of Sukrose Water Solutions

Forbered 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% og 30% sukrose vannoppløsninger og laste de løsninger i sprøyter med 15-20 G nåler.

4. PER analysen

Berør bie antenne med en dråpe med 0% løsning (vann) etterfulgt av 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% og 30% sukrose vannoppløsninger. Test alle bier med vann først og tillate minst to minutter, da intervallet mellom hver løsning tas i bruk. Derfor, vi vanligvis har minst 20 bier for hvert forsøk. Hvis en bie fullt strekker hennes snabel, er en positiv respons telles.

5.Data Management

Oppsummere de totale positive svar for hver enkelt for gustatory respons score (GRS). Utføre en passende statistisk analyse av dataene.

Del 3. Genet knockdown validering

Fat legemer er skåret fra et annet sett av 7-dager gamle behandlede bier. En standard prosedyre TRIzol brukes for RNA-ekstraksjon, som er etterfulgt av DNase I behandlingen 24.. Vg og USP genekspresjon blir analysert av en to-trinns QRT-PCR. Actin blir brukt som en referanse-genet, siden den har en stabil uttrykk i forskjellige vev av honningbier. Publisert real-time PCR primere for vg og usp genet er brukt i dette eksperimentet 24. Data ble analysert ved hjelp av Delta-Delta CT metode 25..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Både single-injeksjon og to-dagers-injeksjon strategier betydelig redusert vg (One-way ANOVA, p <0,001) (Figur 2A) og usp (One-way ANOVA, p <0,001) (figur 2B) karakterutskrift nivåer i honningbier seks dager etter dsRNA ble injisert. Undertrykkelse av usp transkripsjon ved å bruke enkelt injeksjon med dsRNA blandingen og den to-dagers injeksjon med vg først og usp andre (vg / USP) var signifikant lavere enn de to-dagers injeksjon med usp først og vg andre (USP / vg) (Post-hoc analyse, p blanding vs USP / vg = 0,013, p vg / USP vs USP / vg = 0.019).

Den røde flekken i den doble knockdown bier var betydelig høyere enn de GFP kontroll bier (Student t-test, p = 0,0496) (figur 3).


Figur 1. Flytskjema av RNA interferens (RNAi) / snabel forlengelse respons (PER) analysen. Fire grupper av 50 nylig oppståtte bier ble injisert med dobbel-strandet RNA (dsRNA) av vitellogenin (vg) og ultraspiracle (USP) ved hjelp av ulike kombinasjoner strategier eller med dsRNA av grønn fluorescens protein (GFP) genet som ikke eksisterer i honningbie genom. Biene ble plassert tilbake til en bikube etter injeksjoner, og ble samlet etter 6 dager. Seksten bier per gruppe ble samlet for genet knockdown validering ved hjelp av real-time PCR, og tretti per gruppe var for snabel forlengelse respons (PER) analysen. The 'GFP dsRNA "indikerer biene injisert med GFP dsRNA, det' vg + usp blanding" indikerer biene ianslått med vg og usp dsRNA blanding, det 'vg / USP "indikerer biene injisert med vg dsRNA på den første dagen, deretter injisert med usp dsRNA på den andre dagen, det' USP / vg" indikerer biene injisert med usp dsRNA på den første dagen, og injisert med vg dsRNA på den andre dagen.

Figur 2
Figur 2. Double genet knockdown validering ved hjelp av real-time PCR. Logg forvandlet mRNA relative verdi (gjennomsnitt ± SEM) i abdominal fett kroppen av de behandlede bier. Den mRNA relativ verdi ble beregnet ved hjelp av Delta-Delta CT metode. (A) Vg uttrykk 6 dager etter dsRNA injeksjoner. VG transkripsjoner ble betydelig nedregulert av tre doble k nockdown tilnærminger (enveis ANOVA, p <0,001). (B) USP uttrykk seks dager etter at dsRNA injeksjoner. USP transkripsjoner ble signifikant redusert med tre doble knockdown tilnærminger (enveis ANOVA, p <0,001). Imidlertid var usp uttrykk i biene injisert med dsRNA blandingen og vg / USP mye lavere enn i biene injisert med USP / vg (Post-hoc analyse, p blanding vs USP / vg = 0,013, p vg / USP vs USP / vg = 0.019), noe som indikerer at vg kan være en primær regulator i vg og JH regulatoriske loop. The 'RQ "indikerer relativ kvantifisering nivå av målet genet transkripsjoner. De ulike bokstaver over barer betegne signifikante forskjeller mellom behandlingsgruppene.

ig3.jpg "/>
Figur 3. Gustatory respons score (GRS) ved å bruke snabel forlengelse respons (PER) analysen. Biene som ble injisert med vg og usp dsRNA blanding hadde høyere GRS enn GFP kontroller, noe som indikerer at de var mer følsomme for sukrose. De ulike bokstaver over barer betegne signifikante forskjeller mellom behandlingsgruppene (Student t-test, p = 0,0496).

Figur 4
Figur 4. Mulige regulatoriske genet nettverk avslørt ved hjelp av vg og usp dobbel knockdown tilnærming. Juvenile hormon (JH) er produsert i honningbie hjernen og skilles til hemolymph. Vitellogenin (Vg) er en eggeplomme protein forløper produsert av fett celler i kroppen. Vg og JH er i en feedback loop som regulerer metabolske Physiollogi, gustatory oppfatning, og debutalder for beite og beite preferanse for honningbier. Studier tyder på at ultraspiracle (USP) er en antatt reseptor for JH, og kan tjene som en transkripsjonsfaktor. Vår dobbel knockdown av vg og usp har avdekket vg spiller sentrale roller i forholdet mellom vg, usp og JH. En. Vi fant dobbelt knockdown av vg og usp forårsaket en større økning i JH enn en vg enkelt knockdown, og en usp enkelt knockdown induserte ikke noen endring i JH. Det tyder på at Vg hemmer ikke bare JH produksjon, men hemmer en tilbakemelding reaksjon av JH til USP knockdown (A). I doble knockdowns, forårsaket den dramatiske økningen av JH produksjonsresultater fra en redusert hemming fra Vg etter vg knockdown og en kompensatorisk respons til en redusert JH transduction forårsaket av usp knockdown (B). 2. Vi fant uspavskrift overflod ble mer redusert med usp dsRNA når vg var primært eller samtidig downregulated, noe som tyder vg undertrykker følsomheten usp mRNAto sin dsRNA. Hvordan kan vg være involvert i RNA interferens (RNAi)? Vg regulerer honningbie immunforsvar og RNAi er en del av antiviral medfødte immunsystemet. Vår forrige undersøkelse viser argonaute 3 (GB19389, piwi), en viktig del av RNA-induced Silencing kompleks (RISC), er en av kandidat gener som påvirker honningbie sosial atferd (gustatory oppfatning, debutalder beite og beite preferanse), som er kontrollert av Vg / JH-modulen. Derfor, er en mulighet for at Vg kan undertrykke Argonaute proteiner som påvirker aktiviteten av RISC (A). Når vg er downregulated, er USP dsRNA stand til mer effektivt degradere usp mRNA (B). 3. Vårt dobbeltrom knockdown studie avslører også at USP gjørikke megle hemmende effekten av JH på Vg produksjon i fettet kroppen fordi verken enkelt USP knockdown påvirker vg avskrift overflod, eller dobbel vg og usp knockdown fører til ytterligere reduksjon av vg transkripsjoner. Klikk her for å se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vår studie er den første innsats for å samtidig slå ned to gener hos voksne insekter. Våre resultater viser at de to strategier for dsRNA injeksjoner (enkelt injeksjon og to dagers injeksjon) er effektive for den doble genet undertrykkelse, og samtidig genet stanse VG og USP kan testes 6 dager etter dsRNA injeksjoner i bier 8,9. Imidlertid varierer genet knockdown effekt i forskjellige insektarter avhengig transkripsjon nivå mål gen, protein omsetning priser og dsRNA opptak effektiviteten av celler eller organer. I tillegg er effekten av RNAi doseavhengig. Vi fant en nylig dukket bee kan godt akseptere fire ul dsRNA, men dødeligheten økt raskt hvis mer enn fire ul dsRNA ble injisert. Derfor kan de to-dagers injeksjon strategi være mer egnet enn den enkelt injeksjon til et eksperiment som krever høyere mengde av injeksjonsvolumet.

Her dobbel genet knockdown 9

For eksempel Vg og JH er i en feedback loop regulering honningbie fysiologi 9 og atferdsmessige modning 26,27. Tidligere studier har vist at vg genet knockdown kan øke JH nivå i honningbier 28, mens lokal applikasjon av JH kan redusere vg uttrykk 29. I tillegg har studier antydet USP er en antatt reseptor for JH, og kan mediere responser i JH som en transkripsjonsfaktor 14,30. Men hvordan vg modulerer JH titer og om usp er involvert i reguleringen av vg av JH er fremdeles dårlig forstått. Ved hjelp av den doble knockdown tilnærming, har vi oppdaget detaljerte sammenhenger mellom vg, usp og JH ( vg spiller en sentral rolle blant vg, usp og JH. Høyt nivå av Vg ikke bare hemmer JH produksjon 15, men hemmer en systematisk tilbakemelding respons på usp knockdown (Figur 4A). I vg og USP doble knockdown bier, ble JH produksjonen økte mer 9 enn i vg enkelt knockdowns. En mulig forklaring er at den dramatiske økningen av JH i doble knockdowns resultater fra en betydelig reduksjon i den negative effekten av Vg på JH forårsaket av vg knockdown og en kompensatorisk respons til en redusert JH transduction forårsaket av usp knockdown (Figur 4B). Dernest knockdown av vg først og usp andre eller samtidig knockdown av både forårsaket mer reduksjon av usp enn hva en enkelt knockdown av usp gjorde. Dette kan tyde på at vg hemmer følsomheten usp mRNAto sine dsRNA. Dette resultatet er den første til å lenke Vg med RNAi prosesser. Vg er involvert i immunforsvaret i honningbier 31 og RNAi er en av mange antivirale systemer 32 i eukaryote organismer. Studier har vist at rnai prosessen innebærer Argonaute proteiner som er bevart gjennom hele Eukaryoter 33. Interessant, vi tidligere funnet at argonaute 3 (GB19389, piwi) er en av kandidat gener som regulerer honningbie sosial atferd der Vg / JH-modulen spiller sentrale roller 34. Derfor er det et alternativ forklaring at Vg undertrykker funksjoner av Argonaute proteiner som påvirker mRNA degradering (figur 4A). Når vg er downregulated, Argonautes mer aktivt bidra til usp mRNA degradering forårsaket av sin dsRNA (Figur 4B). Til slutt fant vi vg transkripsjon overflod ble ikke endret ved USP knockdown, og det ble redusert med vg og usp dobbel knockdown på the lignende nivå som ved vg enkelt knockdown. Disse resultatene tyder på at usp ikke er involvert i den hemmende effekten av JH på Vg. Totalt sett er dobbel genet knockdown tilsynelatende en kraftig tilnærming for å hjelpe oss å forstå regulatoriske genet nettverk i detaljer.

PER er en standard test for å måle gustatory oppfatning i honningbier, som har vært brukt som en prediktor for utvikling av honningbie sosial atferd 35. Bier med høy følsomhet for sukker vanligvis starter beite tidlig i livet, og foretrekker å samle pollen. Gustatory oppfatning kan også bli testet for å forutsi behandlingseffekt på sosial atferd før noen andre store atferd studier er utført. I tillegg har vi vist at gustatory i signalet er korrelert med innvendig metabolske tilstand 9. Derfor PER kan benyttes til å identifisere metning og sult nivåer. Videre er PER paret med lukt forholdene ansatt for å studere læringog hukommelse hos honningbier. Kollektivt, PER-analysen er en veldig nyttig teknikk for å studere honningbie atferd og metabolske fysiologi. Imidlertid er PER følsomme for håndtering metoder 36.. For eksempel var bier som var bedøvet av chilling eller CO 2 mer lydhør overfor sukrose enn kontroller 36. PER varierer også i løpet av dagen og er følsomme for miljøforhold og stress. Derfor er det meget viktig å holde miljøet og prosedyrer konsistente under forsøket. Generelt, ferdig vi PER om morgenen og følger samme timeplan i følgende dagene. Vi pleier å begynne å samle bier i tidlig morgen på 8:00, og det tar tre timer å få klar for PER. Hvis per behov kan utføres i flere dager, er det viktig å fullføre den i en kort periode i tilfelle miljøet endres. PER bør tas i grupper og hver gruppe bør inneholde mer enn 20 bier fordi minst to-minutters intervall må holdes mellom forskjellige concentrations av sukrose løsninger. Vi har gjort 75-100 bier per gruppe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Erin Fennern for å bistå eksperiment. Dette arbeidet ble finansiert av Norges forskningsråd Norge (180504, 185306 og 191699), PEW Charitable Trust, og National Institute on Aging (NIA P01 AG22500).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GE Healthcare PCR beads in 96 well plate GE Healthcare 27-9557-01
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
RiboMax T7 RNA production system Promega P1300
Trizol LS Invitrogen 10296028
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma-Aldrich C0549
isopropyl alcohol Sigma-Aldrich I9516
Hamilton micro syringe Hamilton 80301
30G BD disposable needles BD Biosciences 305106
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
1 ml Syringe BD Biosciences 30960
Stereo dissection microscope Leica Microsystems S6D
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
Wax plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).
  2. Shi, Y. Mammalian RNAi for the masses. Trends Genet. 19, 9-12 (2003).
  3. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  4. Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif. Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).
  5. Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC Biotechnol. 3, 1 (2003).
  6. Patel, A. The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development. PLoS ONE. 6, e509 (2007).
  7. Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera). Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).
  8. Wang, Y., et al. Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein. PLoS Genet. 6, e1000896 (2010).
  9. Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees. PLoS Genet. 8, e1002779 (2012).
  10. Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos. J. Vis. Exp. (5), e215 (2007).
  11. Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
  12. Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs. Electron J. Biotechnol. 19, 13 (2006).
  13. Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown. Biotech. 41, 59-63 (2006).
  14. Ament, S. A., et al. The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression. PLoS Genet. 8, e1002596 (2012).
  15. Amdam, G. V., Omholt, S. W. The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis. J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).
  16. Pankiw, T., Page, R. E. Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees. Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).
  17. Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality. Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).
  18. Jaycox, E. R. Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae). J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).
  19. Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic. Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).
  20. Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees. Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).
  21. Robinson, G. E. Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production. J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).
  22. Giurfa, M., Malun, D. Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees. Lear Memory. 11, 294-302 (2004).
  23. Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.). Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).
  24. Wang, Y., et al. PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals. PLoS ONE. 4, e4899 (2009).
  25. Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries. J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).
  26. Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits. Nature. 439, 76-78 (2006).
  27. Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E. Hormones, Brain and Behavio. Pfaff, D., et al. , Elsevier Academic Press. (2009).
  28. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).
  29. Corona, M. juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).
  30. Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).
  31. Amdam, G. V., et al. Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees. Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).
  32. Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. RNA interference: antiviral weapon and beyond. World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).
  33. Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).
  34. Hunt, G. J. Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense. Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).
  35. Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience. J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).
  36. Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).

Tags

Nevrovitenskap genetikk Behavior nevrobiologi molekylærbiologi kjemi biokjemi biologi (generelt) genetikk (dyr og planter) dyr biologi RNA-interferens rnai double stranded RNA dsRNA dobbel genet knockdown vitellogenin genet , Ultraspiracle genet, Vitellogenin protein Vg ultraspiracle protein USP grønn fluorescens protein GFP gustatory oppfatning snabel forlengelse respons PER honningbier, Dyremodell assay
RNAi-mediert Double Gene Knockdown og Gustatory Perception Måling i Honey Bees (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V.… More

Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V. RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (77), e50446, doi:10.3791/50446 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter