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Neuroscience

RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel ( Published: July 25, 2013 doi: 10.3791/50446
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1School of Life Sciences, Arizona State University, 2Department of Chemistry, Biotechnology, and Food Science, Norwegian University of Life Sciences

Summary

Neste protocolo, descrevemos duas estratégias que suprimem simultaneamente dois genes (gene knockdown double) em abelhas. Em seguida, apresentamos como usar a resposta de extensão probóscide (PER) ensaio para estudar o efeito do gene knockdown duplo em mel de abelha percepção gustativa.

Abstract

Este vídeo demonstra novas técnicas de interferência de RNA (RNAi), que downregulate dois genes simultaneamente em abelhas usando RNA (dsRNA) injeções de cadeia dupla. Ele também apresenta um protocolo de resposta extensão probóscide (PER) ensaio para medir a percepção gustativa.

Knockdown gene RNAi mediado é uma técnica eficaz diminuindo a expressão de genes-alvo. Esta técnica é geralmente utilizada para a manipulação de um único gene, mas tem limitações para detectar interações e efeitos conjuntas entre genes. Na primeira parte deste vídeo, apresentamos duas estratégias para bater simultaneamente até dois genes (chamados gene knockdown duplo). Mostramos as duas estratégias são capazes de suprimir efetivamente dois genes, vitelogenina (VG) e ultraspiracle (USP), que estão em um ciclo de feedback regulador. Esta abordagem gene knockdown dupla pode ser usada para dissecar inter-relações entre genes e podem ser prontamente aplicadasdiferentes espécies de insetos.

A segunda parte deste vídeo é uma demonstração de tromba extensão resposta ensaio (PER), em abelhas produtoras de mel após o tratamento de gene knockdown dupla. O ensaio PER é um teste padrão para medir a percepção gustativa em abelhas produtoras de mel, que é um indicador chave para o quão rápido amadurecimento comportamental de uma abelha de mel é. Maior percepção gustativa de abelhas ninho indica maior desenvolvimento comportamental, que é muitas vezes associada a uma idade mais precoce de início do forrageamento e forrageamento especialização em pólen. Além disso, por ensaio pode ser aplicado para identificar estados metabólicos de saciedade ou a fome em abelhas de mel. Finalmente, por ensaio combinado com diferentes estímulos emparelhamento de odor para o condicionamento as abelhas também é amplamente utilizada para estudos de aprendizagem e memória em abelhas de mel.

Introduction

Interferência de RNA (RNAi) é baseada em ARN o silenciamento pós-transcricional que ocorre em uma ampla variedade de organismos eucarióticos. O processo de RNAi é desencadeada por RNA (dsRNA) precursores double-stranded endógenos ou exógenos. O dsRNA ativa a proteína ribonuclease Dicer que liga e corta o dsRNA de pequenos fragmentos (20-25 pb). Em seguida, os pequenos fragmentos de ARNdc de um guia de reconhecimento e de clivagem de mRNAs complementares por proteínas Argonaute, um componente catalítico do RNA induzida por complexo silenciamento (RISC) 1. Nos mamíferos, dsRNAs mais de 30 nt, ativar uma resposta antiviral (resposta interferon, IFN), que leva à degradação inespecífica de RNA transcrições 2. No entanto, os longos dsRNAs têm provado ser eficazes e específicos no insectos já que existe uma falta de este IFN 3.

Longos dsRNAs têm sido utilizados para regulação negativa dos genes alvo em diferentes espécies de insectos. As abelhas são um dos pionorganismos insectos EER em que as funções de muitos genes importantes no desenvolvimento e comportamento foram revelados usando ARNdc 4,5. Vários métodos de entrega de dsRNA foram realizados em abelhas: Alimentação dsRNA downregulates eficiente expressão do gene alvo em larvas de abelhas 6, enquanto a injeção dsRNA é uma abordagem eficaz para knockdown do gene em embriões de mel de abelha 4 e abelhas adultas 7,8.

Efeitos knockdown do gene exibidos pela aplicação de dsRNA de insetos são transitórias e localizadas. Estudos têm demonstrado que ambas as injecções de dsRNA abdominais e torácicas injecções dsRNA suprimir eficazmente a expressão do gene alvo em células de gordura corporal abdominal de insectos 9,10. DsRNA é injetado na cavidade abdominal e torácica e células de gordura corporal são capazes de assumir o dsRNA da hemolinfa, onde as células são banhadas 10. No entanto, os genes de outros órgãos, tais como o cérebro, ovários e não pode ser alvo de qualquerinjeções abdominal ou torácica. A fim de visar genes no cérebro da abelha do mel, a injecção de ARNcd cérebro também tem sido realizada, o que influencia de forma eficaz a expressão do gene alvo em áreas cerebrais locais 11. Aqui, nós só documentar injeção dsRNA abdominal, que é mais comumente usado em abelhas adultas.

RNAi tem sido utilizado principalmente para atingir um único gene e tem sido uma ferramenta poderosa para revelar a função do gene. No entanto, qualquer gene não está isolada das outras, é em redes reguladoras complexas. Uma chave para a compreensão de um processo biológico é dissecar como os genes interagem uns com os outros, o que requer manipulações simultâneas de múltiplos genes, em vez de um único gene knockdown. Em linhagens de células de mamíferos, os cientistas conseguiram inibir simultaneamente dois ou três genes por meio de sistemas de entrega de 12 ou multi-microRNA (miRNA) projeta hairpin 13. Mas, em insetos, vários knockdowns genes ainda não foram testados. Aqui, nós present estratégias de injeção diferentes, que podem atingir um gene knockdown dupla. Nós alvo dois genes: vitelogenina (vg), que codifica um precursor da proteína da gema e ultraspiracle (USP), que codifica um receptor putativo para a hormona juvenil (HA), pode servir como um factor de transcrição de mediação de respostas a JH 14 em abelhas de mel. Vg e JH regular o outro em um ciclo de realimentação 15 e estão envolvidos em mel de abelha comportamental regra 9. Usando o gene knockdown dupla, que perturbam tanto Vg e vias de JH, e descobrir como eles afetam conjuntamente o comportamento das abelhas de mel e fisiologia e como vg, usp e JH interagir 9.

Percepção gustativa é um preditor comportamental para mel de abelha comportamento social 16. Em termos de desenvolvimento comportamental, abelhas ninho com alta percepção gustativa comportamentalmente maduro rápidos, e geralmente de forragem no início da vida e preferem coletar pólen 16,17. Embora m regulamentarecanismos subjacentes percepção gustativa ainda não estão claros, os estudos mostraram que a percepção gustativa está ligada ao metabolismo de energia interna 9, secreção hormonal 18,19 e biogenética amina caminhos 20. Ambos Vg e JH são importantes reguladores hormonais modulando a percepção gustativa 7,21. No laboratório, a uma variação da percepção gustativa em abelhas de mel pode ser avaliada testando a resposta extensão tromba (PER) para diferentes soluções de sacarose. Cada abelha é testada tocando tanto suas antenas com uma gota de água, seguido por uma série ascendente de concentração de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% de sacarose. A resposta positiva é observado se a abelha estende totalmente seus tromba quando uma gota de água ou sacarose é tocado a cada antena. Com base no número de respostas positivas para as soluções, o nível de percepção gustativa de cada indivíduo pode ser determinada 16. No entanto, a aplicação do PER não se limita a medir gpercepção ustatory. O PER é também um método eficaz para testar o estado metabólico de abelhas, tais como a saciedade vs fome. As abelhas com maiores respostas a sacarose são mais faminto em geral (Wang e Amdam, dados não publicados). Além disso, o paradigma PER também pode ser utilizado na aprendizagem e na memória associativa em abelhas de mel. Neste caso, as abelhas serão treinados para associar a presença de água de sacarose, com um odor. Quando as abelhas aprender a associação, apenas a presença do odor pode evocar uma resposta positiva tromba sem premiar os com sacarose a 22,23. Neste vídeo, vamos mostrar como realizar PER para avaliar a percepção gustativa, que tem sido relacionada com vg e usp knockdown casal em um estudo anterior 9.

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Protocol

Parte 1: RNAi mediado pelo gene knockdown dupla

1. dsRNA Synthesis

  1. Iniciadores do projeto de dsRNAs segmentação vg, usp e um controle de gene que codifica a proteína verde fluorescente (GFP), que não está no genoma da abelha do mel: primers foram desenhados utilizando o software online gratuitamente Primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/ ) .
  2. síntese de dsRNA para vg, usp e GFP: use RiboMax T7 sistema de produção de RNA da Promega para transcrição in vitro.
  3. dsRNA purificação:
    1. Desnaturação e renaturação: aqueça o dsRNA a 85 ° C por 5 minutos e deixe esfriar em temperatura ambiente por 1 hora.
    2. DNase tratamento I: adicione 1 mL DNase I em cada reação dsRNA e misturá-los sacudindo os tubos. Incubar durante 15 min a 37 ° C.
    3. Adicionar 150 mL de água livre de nuclease e 750 mL TRIZOL - LS em cada reação, e misture-as delicadamente por inverting do tubo. Incubar as amostras durante 5 min a 30 ° C.
    4. Adicionar 200 ul de clorofórmio para cada amostra. Misturar vigorosamente durante 20 segundos. Centrifugar as amostras durante 15 min a 12.000 xg, a 4 ° C.
    5. Transferir a fase sobrenadante de cada tubo novo e adicionar 500 mL de álcool isopropílico para cada tubo. Misture invertendo o tubo. Incube-se a mistura durante 20 min a -20 ° C. Centrifugar durante 10 min a 12.000 xg, a 4 ° C.
    6. Remover o sobrenadante e utilizar 1.000 ul de 75% de etanol para lavar o sedimento. Após centrifugação o tubo durante 5 min a 7500 xg, a 4 ° C, o ar seco do ARNdc pelete, e usar água livre de nuclease para dissolver o sedimento. A fim de assegurar a eficácia do gene da sub-regulação, a concentração deve ser cerca de ARNdc 9 -10 ug / uL.

2. Injeção de dsRNA Abdominal

Para gene knockdown dupla, existem duas estratégias: 1) injeção única: mix dsRNA de dois genes e inject-se a mistura, 2) dois dias de injecção: injectar o primeiro dsRNA alvo um gene no primeiro dia, e injectar a segunda ARNdc nos mesmos abelhas no segundo dia.

  1. Frio recentemente surgiram abelhas em um 4 ° C geladeira por 1-2 min. Quando as abelhas são imobilizadas, montar 3-4 abelhas em paralelo em placas de Petri cheias de cera sólida, com pinos de insetos cruzaram entre seus abdomens e thoraces.
  2. Relaxar as abelhas novamente em um 4 ° C geladeira. Certifique-se de que as abelhas são completamente imóvel. Demora cerca de 1-2 min. As abelhas devem olhar solto. Se as abelhas se enrolado ou contorcidos, que significa que eles são arrefecidas muito tempo que deve ser evitado. Tempo Livre demais provoca uma elevada mortalidade, mas imobilização completa é importante porque qualquer movimento aumenta o tamanho da ferida e mortalidade.
  3. Coloque uma agulha descartável 30 G (BD) em um micro seringa Hamilton. Take 3 dsRNA mL e verifique se não há nenhuma bolha de ar na seringa. A agulha é inserida para um lado do abdómen para evitar damaging órgãos internos. Pressione o êmbolo da seringa, lentamente para permitir que o ARNdc ser absorvida. Uma vez que o dsRNA é muito viscosa, que leva 2-3 segundos para ser completamente expelido da seringa. Após completamente empurrando o êmbolo para baixo, deixando a agulha na ferida para 4-5 seg. Observe as abelhas por 3-5 seg após as injeções. Se uma gota de hemolinfa vazamentos da ferida, descartar a abelha.
  4. Use cores diferentes para marcar seus thoraces correspondentes a diferentes tratamentos. Neste ponto, se a estratégia de injeção única foi utilizada, as abelhas podem ser colocados de volta em uma colônia depois de 1 hora de observação. No entanto, se a estratégia de injecção de dois dias foi utilizado, após a injecção com o primeiro dsRNA, as abelhas devem ser colocados numa gaiola de malha de cilindro com mel fornecido na parte lateral e ser mantido numa incubadora a 34 ° C e 80% de humidade .
  5. No segundo dia, siga os passos 2.2 e 2.3 para relaxar as abelhas nas gaiolas de malha e montá-los em placas de cera. Realizar as injecções com a segunda ARNdc como é descrileito na etapa 2.4.
  6. Deixe que as abelhas se recuperar em temperatura ambiente por 1 hora e apresentá-los em uma colônia.

Nota: Os efeitos Knockdown pode ser detectado por RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) e transferência western. Em geral, a eficácia knockdown varia e depende de muitos fatores. Em nosso estudo, o gene knockdown dupla pode ser detectado de 7 dias após as injeções individuais e injeções de dois dias.

Parte 2: narigudo extensão resposta ensaio (PER)

1. Coleta de abelhas da colmeia

No dia 6 após as injeções, coleta de abelhas tratadas da colônia sem o uso de um fumante. Coletar as abelhas em gaiolas cilindro de malha de metal. Mantenha três abelhas em cada gaiola.

2. Abelhas de montagem para PER

Frio as abelhas a 4 ° C até serem completamente imobilizado. Monte cada abelha verticalmente em um tubo de plástico especialmente projetado para PER. Mantenha o abdômen dentro do tubo por using dois pequenos pedaços de fita, e manter a cabeça para fora do tubo. Coloque os tubos em um rack com duas fileiras de colunas pequenas de plástico, e atribuir a cada tubo (abelha) com um número de identificação. Em seguida, coloque as abelhas tratadas nas prateleiras em uma incubadora (34 ° C e 80% de umidade) e mantê-los na incubadora por 2 horas.

3. Preparando uma série de sacarose Water Solutions

Prepare a 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% e 30% de água, soluções de sacarose e carregar as soluções para as seringas com agulhas de 15-20.

4. Por ensaio

Toque a antena da abelha com uma gota de solução a 0% (água), seguido de 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% e 30% de água, soluções de sacarose. Testar todas as abelhas com água primeiro e permitir que pelo menos dois minutos, como o intervalo entre cada solução é utilizada. Por isso, costumamos ter pelo menos 20 abelhas para cada tentativa. Se uma abelha estende totalmente seus tromba, uma resposta positiva é contado.

5.Gerenciamento de Dados

Soma-se o total de respostas positivas para cada indivíduo para a pontuação resposta gustativa (GRS). Realizar uma análise estatística adequada sobre os dados.

Parte 3. Validação knockdown Gene

Corpos gordos são dissecados a partir de um outro conjunto de abelhas tratadas idade de 7 dias. Um procedimento padrão Trizol é utilizado para a extracção de RNA, que é seguido pelo tratamento com DNase I 24. Vg e expressão do gene da USP é analisado por um de dois passos de qRT-PCR. Actina é usado como um gene de referência, uma vez que tem expressões estáveis ​​em tecidos diferentes das abelhas. Publicada em tempo real para os iniciadores de PCR e o gene vg USP são utilizados nesta experiência 24. Os dados são analisados ​​usando o método de delta-delta CT 25.

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Representative Results

Tanto o single-injeção e dois dias de injeção de estratégias reduziu significativamente vg (One-way ANOVA, p <0,001) (Figura 2A) e USP (One-way ANOVA, p <0,001) (Figura 2B) níveis de transcrição em abelhas seis dias depois do ARNdc foi injectada. A supressão da USP transcrição usando a única injecção com uma mistura de ARNdc e ​​a injecção de dois dias com vg primeiro e segundo USP (vg / USP) foi significativamente mais baixa do que a injecção de dois dias com USP primeira e segunda vg (USP / vg) (análise post-hoc, mistura p vs usp / vg = 0,013, p vg / USP vs usp / vg = 0,019).

O GRS nas abelhas duplas knockdown foi significativamente maior do que as abelhas de controlo de GFP (teste t de Student, p = 0,0496) (Figura 3).


Figura 1. Fluxograma da interferência de RNA (RNAi) / resposta extensão probóscide (PER) ensaio. Quatro grupos de 50 abelhas recém-emergidas foram injetados com double-stranded RNA (dsRNA) de vitelogenina (VG) e ultraspiracle (USP), por meio de diferentes estratégias de combinação ou com dsRNA do gene da proteína verde fluorescente (GFP), que não existe no genoma da abelha. As abelhas foram colocados de volta para a colméia após as injeções, e foram coletadas após 6 dias. Dezesseis abelhas por grupo foram coletadas para validação knockdown gene usando PCR em tempo real, e trinta por grupo foram para a resposta extensão probóscide (PER) ensaio. O "GFP dsRNA 'indica que as abelhas injetadas com dsRNA de GFP, o' vg + mistura da USP indica que as abelhas eminjetada com vg e USP mistura dsRNA, o 'vg / USP' indica as abelhas injectados com ARNcd vg, no primeiro dia, depois foram injectados com a USP ARNdc no segundo dia, o "USP / vg 'indica as abelhas injectados com usp em ARNdc No primeiro dia, e injectados com ARNcd vg, no segundo dia.

Figura 2
Figura 2. Gene dupla validação knockdown usando PCR em tempo real. Entrar transformado valor relativo mRNA (média ± SEM) no corpo de gordura abdominal das abelhas tratadas. O valor relativo de ARNm foi calculada usando o método de delta-delta CT. (A) Expressão Vg 6 dias após as injecções de dsRNA. As transcrições vg foi significativamente baixo-regulado por três duplas k abordagens nockdown (One-way ANOVA, p <0,001). (B) expressão Usp seis dias após as injeções de dsRNA. As transcrições usp foram significativamente reduzidos por três abordagens knockdown duplas (One-way ANOVA, p <0,001). No entanto, a expressão USP nas abelhas injectados com a mistura de ARNdc e ​​vg / USP, foi muito menor do que aquela em que as abelhas injectados com USP / vg (análise post-hoc, p mistura comparada USP / vg = 0,013, p vg / usp vs USP / vg = 0,019), indicando que pode ser um vg principal reguladora no circuito regulador vg e JH. O "RQ" indica o nível de quantificação relativa dos transcritos do gene alvo. As diferentes letras acima das barras denotam diferenças significativas entre os grupos de tratamento.

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Figura 3. Pontuação resposta gustativa (GRS) usando resposta extensão probóscide (PER) do ensaio. As abelhas que foram injetados com vg e usp mistura dsRNA tiveram maior GRS que os controles GFP, o que indica que eles eram mais sensíveis a sacarose. As letras diferentes acima das barras indicam diferenças significativas entre os grupos de tratamento (teste t de Student, p = 0,0496).

Figura 4
Figura 4. Redes de genes regulatórios possíveis revelou usando vg e usp dupla abordagem knockdown. Hormônio juvenil (JH) é produzido no cérebro de abelhas e secretada à hemolinfa. Vitelogenina (Vg) é um precursor da proteína da gema produzida pelas células de gordura corporal. Vg e JH estão em um ciclo de feedback regular fisiologia metabólicagia, a percepção gustativa, ea idade de início de forrageamento e forrageamento preferência das abelhas. Estudos sugerem que ultraspiracle (USP) é um receptor putativo de JH e pode servir como um factor de transcrição. Nosso knockdown dupla de vg e usp revelou vg desempenha um papel central na relação entre vg, usp e JH 1.. Encontramos dupla knockdown de vg e usp causou um aumento maior no JH que um vg único knockdown, e uma usp único knockdown não induziu qualquer alteração no JH. Ele sugere que Vg não só inibe a produção de HA, mas inibe a resposta de feedback de JH para a USP knockdown (A). Em knockdowns duplas, o aumento dramático de resultados de produção de JH uma inibição reduzida de Vg causada por vg knockdown e uma resposta compensatória a uma reduzida transdução JH causada pela USP knockdown (B). 2. Encontrámos uspabundância transcrição foi mais reduzida em usp dsRNA quando vg era primariamente ou simultaneamente downregulated, sugerindo vg suprime a sensibilidade da usp mRNAto seu dsRNA. Como pode vg estar envolvido em RNA de interferência (RNAi)? Vg regula mel de abelha imunológico de defesa e RNAi é uma parte do sistema imunológico inato antiviral. Nosso estudo anterior mostra argonaute 3 (GB19389, piwi), um importante componente do RNA induzida pelo complexo silenciamento (RISC), é um dos genes candidatos que influenciam mel de abelha comportamento social (percepção gustativa, a idade de início de forrageamento e forrageamento preferência), que é controlado pelo módulo Vg / JH. Assim, uma possibilidade é que as proteínas podem suprimir Vg Argonaute que afectam a actividade de RISC (A). Quando vg é downregulated, usp dsRNA é capaz de degradar de forma mais eficiente usp mRNA (B) 3.. Nosso estudo duplo knockdown também revela que a USP faznão mediar efeito inibitório do JH sobre a produção de Vg na gordura corporal porque nenhum único knockdown usp afeta vg transcrição abundância, nem double vg e usp knockdown provoca redução de vg transcrições. Clique aqui para ver a figura maior .

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Discussion

Nosso estudo é o primeiro esforço para bater simultaneamente até dois genes em insetos adultos. Nossos resultados mostram que as duas estratégias de dsRNA injeção (injeção única e injeção de dois dias) são eficazes para a supressão gene casal e silenciamento gênico simultânea de vg e usp pode ser testado seis dias após as injeções de dsRNA em abelhas 8,9. No entanto, a eficácia knockdown gene varia em diferentes espécies de insetos, dependendo do nível de transcrição do gene alvo, as taxas de turnover de proteína e eficiência de absorção dsRNA por células ou órgãos. Além disso, o efeito de RNAi é dependente da dose. Encontramos uma abelha recém-surgido poderia aceitar 4 dsRNA mL, mas a mortalidade aumentou rapidamente, se mais de 4 dsRNA mL foi injetado. Assim, a estratégia de injecção de dois dias pode ser mais adequada do que a injecção única de uma experiência que requer maior quantidade de volume de injecção.

Aqui, o gene knockdown double 9

Por exemplo Vg e JH estão em um ciclo de feedback regular mel de abelha fisiologia 9 e maturação comportamental 26,27. Estudos anteriores demonstraram que vg knockdown do gene pode aumentar o nível de JH em ​​abelhas de mel 28, que a aplicação tópica de JH pode reduzir a expressão vg 29. Além disso, estudos têm sugerido USP é um receptor putativo de JH, e pode mediar as respostas a JH como um factor de transcrição de 14,30. No entanto, como vg modula JH título e se usp está envolvido na regulação do vg por JH ainda são pouco compreendidos. Usando a abordagem dupla knockdown, descobrimos inter-relações detalhadas entre vg, usp e JH ( vg desempenha um papel central entre vg, usp e JH. Elevado grau de Vg não só inibe a produção de JH 15, mas inibe a resposta reacções sistemáticas de USP knockdown (Figura 4A). Em vg ea USP abelhas duplas knockdown, a produção de JH foi aumentado mais 9 do que no vg knockdowns individuais. Uma explicação possível é que o aumento dramático da HA em knockdowns duplas resulta de uma redução significativa do efeito negativo do Vg no JH causada por vg knockdown e uma resposta compensatória a uma reduzida transdução JH causada pela USP knockdown (Figura 4B). Em segundo lugar, knockdown de vg primeiro e segundo usp ou knockdown simultânea de ambos causou mais redução da usp do que um único knockdown da USP fez. Isto pode sugerir que vg inibe a sensibilidade da USP mRNAto seus dsRNA. Este resultado é o primeiro a ligação com os processos de Vg RNAi. Vg está envolvido na defesa imunológica em abelhas de mel 31 e RNAi é um dos muitos sistemas antivirais 32 em organismos eucarióticos. Estudos têm mostrado que o processo de RNAi envolve Argonaute proteínas que são conservadas ao longo Eucariotes 33. Curiosamente, já havia descoberto que argonaute 3 (GB19389, piwi) é um dos genes candidatos que regulam mel de abelha comportamento social no qual módulo Vg / JH desempenha um papel central 34. Por isso, uma explicação alternativa é que Vg suprime funções das proteínas que influenciam a degradação do mRNA Argonaute (Figura 4A). Quando vg é downregulated, Argonautes contribuir mais activamente para usp degradação do mRNA causado pela sua dsRNA (Figura 4B). Finalmente, encontramos vg transcrição abundância não foi alterado pela USP knockdown, e foi reduzido em vg e usp knockdown duplo no the nível semelhante ao que, vg único knockdown. Estes resultados sugerem que a USP não está envolvido no efeito inibidor de JH em ​​Vg. No geral, o gene knockdown dupla aparentemente é uma abordagem poderosa para nos ajudar a entender rede gene regulador em detalhes.

PER é um teste padrão para medir a percepção gustativa em abelhas, que tem sido usado como um indicador para o desenvolvimento de mel de abelha comportamento social 35. Abelhas com alta sensibilidade ao açúcar geralmente começam forrageamento cedo na vida e preferem coletar pólen. Percepção gustativa também pode ser testado para prever o efeito do tratamento sobre os comportamentos sociais antes de quaisquer outros estudos de comportamento em grande escala são realizadas. Além disso, mostrámos que a percepção gustativa está correlacionada com o estado metabólico interno 9 Assim, por pode ser utilizada para identificar os níveis de fome e de saciedade. Além disso, POR emparelhado com condições de odor é empregue para estudar aprendizageme memória em abelhas de mel. Coletivamente, por ensaio é uma técnica muito útil para estudar o comportamento das abelhas de mel e fisiologia metabólica. No entanto, PER é sensível a métodos de manipulação 36. Por exemplo, as abelhas que estavam anestesiados pelo frio ou CO 2 foram mais sensíveis à sacarose do que os controles 36. PER também varia durante o dia e é sensível às condições ambientais, e de stress. Portanto, é muito importante para manter o ambiente e procedimentos consistentes durante a experiência. Em geral, nós terminamos PER pela manhã e seguem o mesmo horário em dias seguintes. Costumamos iniciar a coleta de abelhas em manhã às 8:00 da manhã, e leva 3 horas para ficar pronto para PER. Se por necessidades para ser executada em vários dias, isso é importante para terminar em um curto período, no caso das alterações do ambiente. PER deve ser feita em grupos e cada grupo deverá incluir mais de 20 abelhas, porque intervalo de pelo menos 2 minutos tem de ser mantido entre os diferentes concentrations de soluções de sacarose. Nós fizemos 75-100 abelhas por grupo.

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Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Erin Fennern para auxiliar experimento. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa da Noruega (180504, 185306 e 191699), PEW Charitable Trust, eo Instituto Nacional do Envelhecimento (NIA P01 AG22500).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GE Healthcare PCR beads in 96 well plate GE Healthcare 27-9557-01
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
RiboMax T7 RNA production system Promega P1300
Trizol LS Invitrogen 10296028
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma-Aldrich C0549
isopropyl alcohol Sigma-Aldrich I9516
Hamilton micro syringe Hamilton 80301
30G BD disposable needles BD Biosciences 305106
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
1 ml Syringe BD Biosciences 30960
Stereo dissection microscope Leica Microsystems S6D
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
Wax plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)
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Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V.… More

Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V. RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (77), e50446, doi:10.3791/50446 (2013).

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