Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

RNAi-medierad Dubbel Gene Knockdown och Smaklig Perception Mätning honungsbin ( Published: July 25, 2013 doi: 10.3791/50446

Summary

I detta protokoll, beskriver vi två strategier som samtidigt undertrycka två gener (dubbel gen knockdown) i honungsbin. Därefter presenterar vi hur man använder snabel förlängningen svar (PER) analys för att studera effekten av dubbla gen knockdown på honungsbiet smak uppfattning.

Abstract

Denna video demonstrerar nya tekniker för RNA-interferens (RNAi) som nedreglerar två gener samtidigt i honungsbin med dubbelsträngat RNA (dsRNA) injektioner. Den presenterar också ett protokoll om snabel förlängning svar (PER) analys för att mäta smak uppfattning.

RNAi-medierad gen knockdown är en effektiv teknik downregulating uttryck målgenen. Denna teknik används vanligtvis för enstaka genmanipulation, men det finns begränsningar för att upptäcka interaktioner och gemensamma effekter mellan gener. I den första delen av denna video presenterar vi två strategier för att samtidigt slå ner två gener (kallas dubbel gen knockdown). Vi visar båda strategierna har möjlighet att effektivt undertrycka två gener, vitellogenin (vg) och ultraspiracle (USP), som är i en reglerande återkopplingsslinga. Denna dubbla gen knockdown tillvägagångssätt kan användas för att dissekera sambanden mellan gener och kan lätt tillämpas iolika insektsarter.

Den andra delen av den här videon är en demonstration av snabel förlängning svar (PER) analys i honungsbin efter behandling av dubbel gen knockdown. Den per analys är ett standardtest för att mäta smak uppfattning i honungsbin, vilket är en viktig prediktor för hur snabbt en honungsbiet beteendemässiga mognad är. Större smak uppfattning om boet bin indikerar ökad beteendemässig utveckling som ofta förknippas med en tidigare ålder vid debut av födosök och födosök specialisering i pollen. Dessutom kan per analys tillämpas för att identifiera metabola tillstånd av mättnad eller hunger på honungsbin. Slutligen, per analys kombinerat med parning olika lukt stimuli för konditionering bina är också allmänt används för inlärning och studier minne i honungsbin.

Introduction

RNA-interferens (RNAi) är RNA-baserad posttranskriptionell geners uttryck, som förekommer i en mängd olika eukaryota organismer. Processen av RNAi utlöses av endogena eller exogena dubbelsträngade RNA (dsRNA) prekursorer. Den dsRNA aktiverar Dicer ribonukleas protein som binder och klyver dsRNA till små fragment (20-25 bp). Då de små fragment av dsRNA guiden ett erkännande och klyvning av komplementära mRNA genom argonaute proteiner, en katalytisk komponent av RNA-inducerad tysta komplex (RISC) 1. I däggdjur dsRNAs längre än 30 nt, aktivera en antiviral respons (interferon respons, IFN) vilket leder till ospecifik nedbrytning av RNA-transkript 2. Dock har långa dsRNAs visat sig vara effektiv och specifik i insekter eftersom det finns en brist på denna IFN 3.

Långa dsRNAs har använts för nedreglering av målgener i olika insektsarter. Honungsbin är en av pionEER insekt organismer i vilka funktioner många viktiga gener i utveckling och beteende har visat genom att använda dsRNA 4,5. Flera dsRNA leverans metoder har utförts på honungsbin: dsRNA utfodring effektivt nedreglerar uttryck målgenen i honungsbiet larver 6, medan dsRNA injektion är en effektiv metod för gen knockdown i embryon honungsbiet 4 och vuxna bin 7,8.

Gen knockdown effekter uppvisas med tillämpning dsRNA till insekter är övergående och lokaliserade. Studier har visat att både buk dsRNA injektioner och bröstkorg injektioner dsRNA effektivt undertrycka uttryck målgenen i bukfett kroppens celler av insekter 9,10. DsRNA injiceras i buken och bröstkorg håligheter och fettceller kroppen ska kunna ta upp dsRNA från hemolymph där cellerna badas 10. Emellertid kan gener i andra organ, såsom äggstockar och hjärnan, som inte riktas antingenbuken eller bröstkorg injektioner. För att rikta gener i honungsbiet hjärnan, har hjärna injektion av dsRNA också utförts, som effektivt påverkar uttryck målgenen i lokala områden i hjärnan 11. Här dokumenterar vi bara buken dsRNA injektion som är mer vanligt förekommande hos vuxna honungsbin.

RNAi har främst använts för att rikta en enda gen och har varit ett kraftfullt verktyg för att avslöja genfunktionen. Dock är varje gen inte isolerat från andra, är det i komplexa regulatoriska nätverk. En nyckel för att förstå en biologisk process är att dissekera hur gener samverkar med varandra, vilket kräver samtidiga manipulationer av flera gener snarare än en enda gen knockdown. I däggdjurscellinjer, har forskare lyckats samtidigt hämma två eller tre gener med hjälp av leveranssystem 12 eller multi-mikroRNA (miRNA) hårnål design 13. Men i insekter, multipla gener knockdowns är fortfarande oprövad. Här, presentation vit olika injektion strategier som kan uppnå en dubbel gen knockdown. Vi riktar två gener: vitellogenin (VG), som kodar för en äggula proteinprekursor och ultraspiracle (USP) som kodar för en förmodad receptor för juvenila hormon (JH) och kan fungera som en transkriptionsfaktor medla svar till JH 14 i honungsbin. Vg och JH reglerar varandra i en återkoppling 15 och är involverade i honungsbiet beteendevetenskaplig regel 9. Använda den dubbla gen knockdown, vi stör både Vg och JH vägar, och upptäck hur de gemensamt påverka beteendet honungsbiet och fysiologi och hur vg, USP och JH interagera 9.

Smak uppfattning är en beteendevetenskaplig prediktor för honungsbiet socialt beteende 16. I termer av beteendemässig utveckling, kapsla bin med hög smak uppfattning beteendemässigt mogna fort, och oftast foder tidigt i livet och föredrar att samla in pollen 16,17. Även om reglerande mechanisms underliggande smak uppfattning är fortfarande oklart, studier har visat att smak uppfattning är kopplad till inre energi metabolisms 9, hormonell utsöndring 18,19 och biogenetisk amin banorna 20. Både Vg och JH är viktiga hormonella regulatorer modulerar smak uppfattning 7,21. I laboratoriet kan en variation av smak uppfattning i honungsbin utvärderas genom att testa snabel förlängningen svar (PER) till olika sackaroslösningar. Varje bee testas genom att röra båda hennes antenner med en droppe av vatten följt av en stigande koncentration serie av 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% sackaros. Ett positivt svar noterades om ett bi helt sträcker sina snabel när en vattendroppe eller sackaros vidrörs till varje antenn. Baserat på antalet positiva svar på de lösningar, kan den smak uppfattning för varje individ bestämmas 16. Dock är tillämpningen av PER ej begränsade till att mäta gustatory uppfattning. Den PER är också en effektiv metod för att testa metaboliskt tillstånd av bin såsom mättnad kontra hunger. Bina med större svar på sackaros är hungrigare i allmänhet (Wang och Amdam, opublicerade data). Vidare kan den PER paradigmet också användas i associativ inlärning och minne hos honungsbin. I detta fall bin kommer att utbildas för att associera närvaron av sackaros vatten med en lukt. När bina lär föreningen kan endast förekomsten av lukt framkalla en positiv snabel svar utan att belöna dem med sackaros 22,23. I den här videon visar vi hur du utför PER utvärdera smak uppfattning som har samband med VG och USP dubbel knockdown i en tidigare studie 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Del 1: RNAi-medierad dubbel gen knockdown

Ett. dsRNA Syntes

  1. Design primers av dsRNAs riktade VG, USP och en kontroll gen som kodar för grönt fluorescerande protein (GFP), som inte finns i honungsbiet genomet: primers utformades med hjälp av online-fri programvara primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/ ) .
  2. dsRNA syntes för VG, USP och GFP: användning RiboMax T7 RNA produktionssystem från Promega för in vitro transkription.
  3. dsRNA rening:
    1. Denaturering och renaturering: värm dsRNA till 85 ° C under 5 min och låt den svalna vid rumstemperatur under 1 timme.
    2. DNas I-behandling: tillsätt 1 pl DNas I i varje dsRNA reaktion och blanda dem genom att ställa rören. Inkubera i 15 minuter vid 37 ° C.
    3. Tillsätt 150 l nukleasfritt vatten och 750 pl TRIzol - LS i varje reaktion, och försiktigt blanda dem med inverting röret. Inkubera proverna under 5 min vid 30 ° C.
    4. Tillsätt 200 l kloroform till varje prov. Blanda kraftigt i 20 sek. Centrifugera proverna i 15 min vid 12.000 xg vid 4 ° C.
    5. Överför supernatanten fas till varje nytt rör och tillsätt 500 | il isopropylalkohol i varje rör. Blanda dem genom att vända röret. Inkubera blandningen i 20 min vid -20 ° C. Centrifugera det under 10 minuter vid 12.000 xg vid 4 ° C.
    6. Avlägsna supernatanten och använda 1000 | il 75% etanol för att tvätta pelleten. Efter centrifugering av röret i 5 minuter vid 7500 xg vid 4 ° C, lufttorka dsRNA pelleten, och använda sterilt vatten för att lösa upp pelleten. För att säkerställa effektiviteten av genen nedreglering bör dsRNA koncentrationen vara omkring 9 -10 pg / pl.

2. dsRNA Abdominal Injektion

För dubbel gen knockdown finns det två strategier: 1) enda injektion: blanda dsRNA av två gener och injeCT blandningen, 2) två-dagars injektion: injicera den första dsRNA riktar en gen på den första dagen, och injicera den andra dsRNA i samma bin på den andra dagen.

  1. Chill framkom nyligen bin i ett 4 ° C kylskåp i 1-2 min. När bina är immobiliserade, montera 3-4 bin parallellt på petriskålar fulla av fast vax med insekter stift korsade mellan deras magar och thoraces.
  2. Chill bina igen i ett 4 ° C kylskåp. Säkerställ bina är helt orörligt. Det tar ca 1-2 min. Bina bör titta löst. Om bina blir krusat eller förvridna, betyder det att de kyls för lång vilket bör undvikas. Kylning för mycket orsakar hög dödlighet, men fullständig immobilisering är viktigt eftersom varje förflyttning ökar storleken av såret och dödlighet.
  3. Sätt en engångs 30 G nål (BD) på en Hamilton micro spruta. Ta 3 pl dsRNA och se till att det inte finns någon luftbubbla i sprutan. Nålen sätts in på en sida av buken för att undvika damaging inre organ. Tryck kolven långsamt så att dsRNA att absorberas. Eftersom dsRNA är mycket trögflytande, det tar 2-3 sekunder att helt ut från sprutan. Efter helt trycka ned kolven, lämna nålen i såret för 4-5 sek. Beakta bin för 3-5 sek efter injektionerna. Om en hemolymph droppe läcker från såret, kassera biet.
  4. Använd olika färger för att markera sina thoraces motsvarar olika behandlingar. Vid denna punkt, om den enda injektion strategi användes, kan bina placeras tillbaka till en koloni efter 1 tim observation. Men om två dagar injektion strategi användes, efter att ha injicerats med den första dsRNA, bör bina placeras i en cylinder mesh bur med honung levereras på sidan och hållas i en inkubator vid 34 ° C och 80% luftfuktighet .
  5. På den andra dagen, följ stegen 2.2 och 2.3 för att kyla bina i mesh burar och montera dem på vax plattor. Utför injektioner med andra dsRNA som det är describädd i steg 2.4.
  6. Låt bina återhämta vid rumstemperatur under 1 h och införa dem i en koloni.

Obs: knockdown effekter kan detekteras genom kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) och western blotting. Generellt sett skiljer knockdown effekt och beror på många faktorer. I vår studie, kan den dubbla gen knockdown detekteras 7 dagar efter enstaka injektioner och två dagars injektioner.

Del 2: Proboscis förlängning svar (PER) analys

Ett. Samla Bin från Hive

På dag 6 efter injektionerna, samla behandlade bin från kolonin utan att använda en rökare. Samla bin i cylinder metallnät burar. Håll 3 bin i varje bur.

2. Montering Bees för PER

Chill bina vid 4 ° C tills de är helt orörlig. Montera varje bi vertikalt i ett plaströr speciellt utformad för Per. Håll buken inuti röret genom using två små tejpbitar, och hålla huvudet sticker ut ur röret. Placera rören på ett rack med två rader av små plast kolumner, och tilldela varje rör (bi) med ett ID-nummer. Lägg sedan behandlade bina på racken i en inkubator (34 ° C och 80% luftfuktighet) och hålla dem i inkubatorn under 2 timmar.

Tre. Förbereda en serie lösningar Sackaros Vatten

Förbered 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% och 30% sackaroslösningar vatten och ladda lösningar i sprutor med 15-20 g nålar.

4. Per analys

Tryck biets antenn med en droppe av 0%-lösning (vatten) följt av 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% och 30% sackaroslösningar vatten. Testa alla bin med vatten först och att minst två minuter som intervallet mellan varje lösning används. Därför har vi oftast minst 20 bin för varje försök. Om ett bi fullt sträcker sina snabel, är ett positivt svar räknas.

Fem.Data Management

Summera de totala positiva svar för varje individ för smak svar värdering (GRS). Utför en lämplig statistisk analys på data.

Del 3. Gene knockdown validering

Fett kroppar dissekeras från en annan uppsättning av 7 dagars behandlade gamla bin. En standard Trizol förfarande används för RNA-extraktion, vilket följs av DNas I-behandling 24. Vg och USP genuttryck analyseras av en tvåstegs QRT-PCR. Aktin används som en referens gen eftersom den har stabila uttryck i olika vävnader av honungsbin. Publicerade realtids-PCR-primrar för vg och USP-genen används i detta experiment 24. Data analyseras med hjälp av Delta-Delta CT metod 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Både singel-injektionen och två-dag-injektion strategier minskade signifikant VG (envägs ANOVA, p <0,001) (Figur 2A) och USP (envägs ANOVA, p <0,001) (Figur 2B) avskrift nivåer i honungsbin sex dagar efter dsRNA injicerades. Förtrycket av USP transkript med hjälp av enkel injektion med dsRNA blandningen och tvådagars injektion med VG först och USP sekund (VG / USP) var betydligt lägre än de två-dagars injektion med USP första och VG sekund (USP / VG) (Post-hoc-analys, p blandning vs USP / VG = 0,013, p vg / USP vs USP / VG = 0,019).

GRS i dubbel knockdown bina var betydligt högre än GFP kontroll bin (Student T-test, p = 0,0496) (Figur 3).


Figur 1. Flödesschema av RNA-interferens (RNAi) / snabel förlängning respons (PER) analys. Fyra grupper om 50 nyligen framkom bin injicerades med dubbelsträngat RNA (dsRNA) i vitellogenin (vg) och ultraspiracle (USP) med hjälp av olika kombination av strategier eller med dsRNA av grönt fluorescerande protein (GFP) genen som inte existerar i honungsbiet genomet. Bina placerades tillbaka till en bikupa efter injektionerna, och samlades efter 6 dagar. Sexton bin per grupp samlades för gen knockdown validering med hjälp av realtids-PCR, och trettio per grupp var för snabel förlängning svar (PER) analys. Den "GFP dsRNA" anger bina injicerats med GFP dsRNA, den "VG + USP blandning 'indikerar bina iomloppstiden med VG och USP dsRNA blandningen, den "vg / USP" anger bina injicerats med VG dsRNA på den första dagen, sedan injiceras med USP dsRNA på den andra dagen, den "USP / vg 'indikerar bina injicerats med USP dsRNA på den första dagen, och injicerades med vg dsRNA på den andra dagen.

Figur 2
Figur 2. Dubbel gen knockdown validering genom att använda Real-time PCR. Logga omvandlas mRNA relativt värde (medelvärde ± SEM) i bukfettet kroppen av de behandlade bina. MRNA relativa värdet beräknades med användning av Delta-Delta-CT-metoden. Sex dagar efter det att dsRNA injektioner (A) Vg uttryck. VG-transkript var kraftigt ned-regleras av tre dubbla k nockdown metoder (envägs ANOVA, p <0,001). (B) Usp uttryck 6 dagar efter dsRNA injektioner. USP transkripten signifikant reducerad med tre dubbla knockdown tillvägagångssätt (envägs ANOVA, p <0,001). Dock var USP uttryck i bina injicerats med dsRNA blandningen och vg / USP betydligt lägre än i de bin som injicerats med USP / VG (Post-hoc-analys, p blandning vs USP / VG = 0,013, p vg / USP vs USP / VG = 0,019), vilket indikerar att VG kan vara en primär regulator i VG och JH reglerande slingan. Den "RQ" anger relativ kvantifiering nivå av avskrifter målgenen. De olika bokstäver ovanför staplarna markerar signifikanta skillnader mellan behandlingsgrupperna.

ig3.jpg "/>
Figur 3. Gustatory respons värdering (GRS) genom att använda snabel förlängning respons (PER) analys. Bina som injicerades med vg och USP dsRNA Blandningen hade högre GRS än GFP-kontroller, vilket indikerar att de var mer känsliga för sackaros. De olika bokstäver ovanför staplarna markerar signifikanta skillnader mellan behandlingsgrupperna (Student T-test, p = 0,0496).

Figur 4
Figur 4. Möjliga reglergen nätverk avslöjat med hjälp VG och USP dubbel knockdown tillvägagångssätt. Juvenile hormon (JH) produceras i honungsbiet hjärnan och utsöndras till hemolymph. Vitellogenin (VG) är en äggula proteinprekursor produceras av feta celler i kroppen. Vg och JH är i en återkopplingsslinga som reglerar metabolisk physiolnik, smak uppfattning, och åldern vid uppkomsten av födosök och födosök önskemål av honungsbin. Studier tyder på att ultraspiracle (USP) är en förmodad receptor för JH och kan fungera som en transkriptionsfaktor. Vår dubbla knockdown av VG och USP har avslöjat VG spelar centrala roller i relationen mellan VG, USP och JH. 1. Vi hittade dubbelt knockdown av VG och USP orsakade en större ökning av JH än en VG enda knockdown, och en USP enda knockdown medförde inte någon förändring i JH. Det antyder att Vg inte bara hämmar JH produktion, men hämmar en återkoppling svar JH USP knockdown (A). I dubbel knockdowns, orsakade den dramatiska ökningen av JH produktionsresultat från en minskad hämning från Vg från VG knockdown och en kompensatorisk reaktion på en reducerad JH transduktion orsakad av USP knockdown (B). 2. Vi hittade USPavskrift överflöd var mer minskas med USP dsRNA när VG var främst eller samtidigt nedregleras, vilket tyder vg dämpar känsligheten för USP mRNAto sin dsRNA. Hur kan VG vara involverade i RNA-interferens (RNAi)? Vg reglerar honungsbiet immunförsvar och RNAi är en del av antiviral medfödda immunförsvaret. Vår tidigare studie visar argonaute 3 (GB19389, Piwi), en viktig del av RNA-inducerad tysta komplex (RISC), är en av kandidatgener som påverkar honungsbiet socialt beteende (smak uppfattning, ålder vid insjuknandet födosök och födosök preferens), vilket är kontrolleras av Vg / JH-modulen. Därför är en möjlighet att Vg kan undertrycka argonaute proteiner som påverkar aktiviteten av RISC (A). När vg är nedregleras, är USP dsRNA kunna mer effektivt bryta ned USP mRNA (B). 3. Vår dubbla knockdown studie visar också att USP görinte medierar inhibitoriska effekten av JH på Vg produktionen i fettet kroppen eftersom varken enda USP knockdown påverkar vg avskrift överflöd, inte heller dubbla vg och USP knockdown orsakar ytterligare minskning av vg transkript. Klicka här för att visa en större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vår studie är den första försök att samtidigt slå ner två gener hos vuxna insekter. Våra resultat visar att de två strategierna för dsRNA injektioner (enstaka injektion och två dagars injektion) är effektiva för dubbla gensuppression, och samtidig geners uttryck av VG och USP kan testas 6 dagar efter dsRNA injektioner i bin 8,9. Dock varierar gen knockdown effekt i olika insektsarter beroende på avskrift nivå målgen, protein klassar omsättning och dsRNA upptag effektivitet genom celler eller organ. Dessutom är effekten av RNAi dosberoende. Vi hittade en nyligen framkom bee väl kunde acceptera 4 pl dsRNA, men dödligheten snabbt ökas om mer än 4 pl dsRNA injicerades. Därför kan de två-dagars injektion strategi vara mer passande än den enda injektion för ett experiment som kräver större mängd injektion volym.

Här, den dubbla genen knockdown 9

Till exempel Vg och JH är i en återkoppling reglerar honungsbiet fysiologi 9 och beteendemässig mognad 26,27. Tidigare studier har visat att vg gen knockdown kan öka JH nivå i honungsbin 28, medan lokal applicering av JH kan minska vg uttryck 29. Dessutom har studier tydde USP är en förmodad receptor för JH, och kan förmedla svaren till JH som en transkriptionsfaktor 14,30. Men hur VG modulerar JH titer och om USP är involverat i regleringen av VG av JH är fortfarande dåligt kända. Använda den dubbla knockdown tillvägagångssätt, har vi upptäckt detaljerade sambanden mellan VG, USP och JH ( VG spelar en central roll bland vg, USP och JH. Hög Vg inte bara hämmar JH produktion 15, men hämmar en systematisk återkoppling svar på USP knockdown (Figur 4A). I VG och USP dubbla bin knockdown, var JH produktionen ökat mer 9 än i vg enstaka knockdowns. En möjlig förklaring är att den dramatiska ökningen av JH i dubbla knockdowns resultat från en betydande minskning av den negativa effekten av Vg på JH orsakad av VG knockdown och en kompensatorisk reaktion på en reducerad JH transduktion orsakad av USP knockdown (Figur 4B). Andra knockdown av vg första och USP andra eller samtidig knockdown av både orsakat mer reduktion av USP än vad en enda knockdown av USP gjorde. Detta kan tyda på att VG hämmar känslighet USP mRNAto sina dsRNA. Detta resultat är den första att koppla Vg med RNAi-processer. VG är involverad i immunförsvaret i honungsbin 31 och RNAi är ett av många antivirala system 32 i eukaryota organismer. Studier har visat att RNAi processen innebär argonaute proteiner som är konserverade genom hela Eukaryotes 33. Intressant nog fann vi tidigare att argonaute 3 (GB19389, Piwi) är en av kandidatgener som reglerar honungsbiet socialt beteende där Vg / JH-modulen spelar centrala roller 34. Därför är en alternativ förklaring som Vg undertrycker funktioner argonaute proteiner påverkar mRNA nedbrytning (Figur 4A). När VG är nedregleras, Argonautes mer aktivt bidra till USP mRNA nedbrytning orsakad av dess dsRNA (Figur 4B). Slutligen fann vi vg avskrift överflöd inte ändrades av USP knockdown, och den har minskat med VG och USP dubbel knockdown på the samma nivå som vid VG enda knockdown. Dessa resultat tyder på att USP inte är inblandad i den hämmande effekten av JH på Vg. Totalt sett är det dubbelt gen knockdown tydligen en kraftfull metod för att hjälpa oss att förstå reglerande gen nätverk i detaljerna.

PER är en standard analys för att mäta smak uppfattning i honungsbin, som har använts som en prediktor för utveckling av honungsbiet socialt beteende 35. Bin med hög känslighet för socker brukar börja föda tidigt i livet och föredrar att samla in pollen. Smak uppfattning kan också testas för att förutsäga behandlingseffekt på sociala beteenden innan några andra storskaliga beteende studier utförs. Dessutom har vi visat att gustatory uppfattning är korrelerad med intern metaboliskt tillstånd 9 Därför PER kan utnyttjas för att identifiera mättnad och nivåer hunger. Dessutom är Per paras med lukt villkor används för att studera lärandeoch minne i honungsbin. Kollektivt per analys är en mycket användbar teknik för att studera beteende honungsbiet och metabola fysiologi. Men PER känsligt att hantera metoder 36. Till exempel var bin som sövdes genom kylning eller CO2 mer lyhörda för sackaros än kontroller 36. PER varierar också under dagen och är känslig för miljöförhållanden och stress. Därför är det mycket viktigt att hålla miljön och villkor som är förenliga under experimentet. I allmänhet, avslutar vi PER på morgonen och följer samma schema i följande dagarna. Vi brukar börja samla bin i tidigt på morgonen klockan 8:00, och det tar 3 timmar att göra sig redo för Per. Om PER måste utföras över flera dagar, är det viktigt att avsluta det under en kort period om miljön förändras. PER bör tas i grupper och varje grupp bör innehålla mer än 20 bin eftersom minst 2-minuters intervall måste hållas mellan olika concentrations av sackaros lösningar. Vi har gjort 75-100 bin per grupp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Erin Fennern för att hjälpa experiment. Detta arbete har finansierats av Vetenskapsrådet i Norge (180504, 185.306 och 191699), Pew Charitable Trust, och National Institute on Aging (NIA P01 AG22500).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GE Healthcare PCR beads in 96 well plate GE Healthcare 27-9557-01
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
RiboMax T7 RNA production system Promega P1300
Trizol LS Invitrogen 10296028
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 Sigma-Aldrich C0549
isopropyl alcohol Sigma-Aldrich I9516
Hamilton micro syringe Hamilton 80301
30G BD disposable needles BD Biosciences 305106
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
1 ml Syringe BD Biosciences 30960
Stereo dissection microscope Leica Microsystems S6D
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
Wax plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).
  2. Shi, Y. Mammalian RNAi for the masses. Trends Genet. 19, 9-12 (2003).
  3. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  4. Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif. Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).
  5. Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC Biotechnol. 3, 1 (2003).
  6. Patel, A. The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development. PLoS ONE. 6, e509 (2007).
  7. Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera). Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).
  8. Wang, Y., et al. Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein. PLoS Genet. 6, e1000896 (2010).
  9. Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees. PLoS Genet. 8, e1002779 (2012).
  10. Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos. J. Vis. Exp. (5), e215 (2007).
  11. Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
  12. Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs. Electron J. Biotechnol. 19, 13 (2006).
  13. Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown. Biotech. 41, 59-63 (2006).
  14. Ament, S. A., et al. The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression. PLoS Genet. 8, e1002596 (2012).
  15. Amdam, G. V., Omholt, S. W. The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis. J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).
  16. Pankiw, T., Page, R. E. Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees. Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).
  17. Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality. Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).
  18. Jaycox, E. R. Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae). J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).
  19. Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic. Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).
  20. Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees. Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).
  21. Robinson, G. E. Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production. J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).
  22. Giurfa, M., Malun, D. Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees. Lear Memory. 11, 294-302 (2004).
  23. Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.). Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).
  24. Wang, Y., et al. PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals. PLoS ONE. 4, e4899 (2009).
  25. Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries. J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).
  26. Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits. Nature. 439, 76-78 (2006).
  27. Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E. Hormones, Brain and Behavio. Pfaff, D., et al. , Elsevier Academic Press. (2009).
  28. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).
  29. Corona, M. juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).
  30. Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).
  31. Amdam, G. V., et al. Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees. Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).
  32. Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. RNA interference: antiviral weapon and beyond. World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).
  33. Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).
  34. Hunt, G. J. Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense. Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).
  35. Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience. J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).
  36. Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).

Tags

Neurovetenskap genetik beteende neurobiologi molekylärbiologi kemi biokemi biologi (allmänt) genetik (djur och växter) djur biologi RNA-interferens RNAi dubbelsträngat RNA dsRNA dubbel gen knockdown vitellogenin gen , Ultraspiracle genen, Vitellogenin protein Vg ultraspiracle protein USP grönt fluorescerande protein GFP smak uppfattning snabel förlängning svar PER honungsbin, Djurmodell analys
RNAi-medierad Dubbel Gene Knockdown och Smaklig Perception Mätning honungsbin (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V.More

Wang, Y., Baker, N., Amdam, G. V. RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (77), e50446, doi:10.3791/50446 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter