Summary
Vi gennemgår vores seneste resultater om integration af fluorescerende mikroskopi og billedbehandling flowcytometri værktøjer på en mobiltelefon ved hjælp af kompakte og omkostningseffektive opto-strømningstekniske vedhæftede filer. Disse mobiltelefon baseret mikro-analyse indretninger kan være nyttige til cytometrisk analyse, såsom at udføre forskellige celletælling opgaver samt for high-throughput screening af fx vandprøver i ressource begrænsede indstillinger.
Abstract
Fluorescerende mikroskopi og flowcytometri er meget udbredt værktøjer i biomedicinsk forskning og klinisk diagnose. Men disse enheder er generelt forholdsvis voluminøse og kostbare, hvilket gør dem mindre effektive i de ressourcemæssige begrænsede indstillinger. Til potentielt løse disse begrænsninger, har vi for nylig demonstreret integration af bred felt fluorescerende mikroskopi og billedbehandling flowcytometri værktøjer på mobiltelefoner ved hjælp af kompakte, lette vægt, og omkostningseffektive opto-strømningstekniske vedhæftede filer. I vores flowcytometri design, fluorescensmærkede celler skyllet gennem en mikrofluid kanal, der er placeret over den eksisterende mobiltelefon kameraenhed. Batteridrevne lysemitterende dioder (LED'er) er butt-koblet til siden af denne mikrofluid chip, som effektivt fungerer som en multi-mode pladebølgeleder, hvor excitationslyset ledes til ensartet excitering af fluorescerende mål. Den celle-telefonens kamera registrerer en time lapse film af de fluorescerende celler, der strømmer gennemDen mikrofluid kanal, hvor de digitale billeder af denne film behandles for at tælle antallet af de mærkede celler i målopløsningen af interesse. Ved hjælp af en lignende opto-fluidisk design, kan vi også billeder af disse fluorescensmærkede celler i statisk tilstand ved fx sandwiching de fluorescerende partikler mellem to glasplader og erobre deres fluorescerende billeder ved hjælp af mobiltelefon kamera, der kan opnå en rumlig opløsning på f.eks ~ 10 um over et meget stort field-of-view for ~ 81 mm2. Denne mobiltelefon baseret fluorescent imaging flowcytometri og mikroskopi platform kan være nyttige især i ressource begrænsede indstillinger, for eksempel tælling af CD4 + T-celler mod kontrol af HIV +-patienter eller til påvisning af vand-bårne parasitter i drikkevand.
Introduction
Mikroskopi og flow-cytometri er almindeligt anvendt teknikker 1-12 inden for biomedicinsk og videnskabelig forskning samt klinisk diagnose for optælling og karakterisering af forskellige celletyper. Imidlertid konventionelle mikroskoper og flow-cytometri instrumenter er relativt komplicerede og dyre, hvilket begrænser deres anvendelse til hovedsagelig veletablerede centrale laboratorier. For nylig har vi udviklet et kompakt og let fluorescerende billeddannelse cytometri og mikroskopi enhed integreret på en mobiltelefon, 13,14, som viser løfte til omkostningseffektivt oversætte fluorescensmikroskopi, flow-cytometri og beslægtede mikro-analyseteknikker til ressource-begrænsede miljøer for forskellige telemedicinske applikationer påvirker global sundhed.
I optofluidic flow-cytometri konfiguration (se fx figur 1C og 1D), et specialdesignet polydimethysiloxane (PDMS) baseret mikrofluid kanal er positioned foran mobiltelefon kamera-enhed, hvor lysemitterende-dioder (LED'er) er butt-koblet til kanterne af kanalen. Denne mikrofluid chip sammen med væskeprøven inde, danner en opto-strømningsteknisk planar bølgeleder (sammensat af for eksempel PDMS-væske-PDMS), således at det exciterende lys ledes til ensartet pumpe de fluorescerende mærkede prøver inde i mikro-kanalen. Fluorescensemissionen fra disse mærkede genstande, fx celler, er yderligere afbildet gennem en yderligere linse er placeret lige efter mobiltelefon kamera-enhed og er kortlagt på den mobiltelefon Complementary Metal-Oxid-(CMOS-) billedsensor. Da den fluorescerende emission opsamles vinkelret på excitationslyset sti, en billig plast absorption filter er tilstrækkelig til at fjerne spredt excitationslys og kan give en rimelig dark-field baggrund for fluorescerende billeddannelse. Ved hjælp af en lignende opto-fluidisk design, kan vi også billeder af de fluorescerende objekter i static tilstand (se figur 1A og 1B), hvor de fluorescerende partikler indlagt mellem to glasplader i stedet for strømmer gennem en mikrofluid kanal og fluorescensemissionen fra disse fluorescerende partikler bliver opfanget af mobiltelefon CMOS-billedsensor til partikeltælling og karakterisering. Med udgangspunkt i forskellige krav til ansøgningen, flowcytometri eller bred felt fluorescerende mikroskopi kan vælges. For eksempel kunne mobiltelefon flowcytometri enhed være særlig anvendelig til screening af store mængder af væskeprøver (f.eks nogle få ml) til påvisning af sjældne celler eller patogener.
I dette manuskript vi gennemgå nogle af vores seneste resultater om integration af fluorescerende mikroskopi og billedbehandling flowcytometri værktøjer på en mobiltelefon ved hjælp af kompakte og omkostningseffektive opto-strømningstekniske vedhæftede filer. Disse mobiltelefon-baseret mikro-analyse, billedbehandling cytometri og sensing platforme kunne give forskellige mulighederfor telemedicin og point-of-care diagnostik, påvirker især vores kamp mod globale sundhedsmæssige udfordringer i ressource begrænsede dele af verden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I dette afsnit introducerer vi de eksperimentelle protokoller for vores celle-telefon baseret bred felt fluorescensmikroskopi 13 og opto-fluidisk imaging cytometri platform 14. Vi vil bruge fluorescerende perler og fluorescensmærkede hvide blodlegemer til at teste disse billeddiagnostiske platforme.
A. Fremstilling af Cell-telefon baseret Wide-field fluorescerensmikroskop og Opto-fluidisk Imaging Flow Cytometer
Den celle-telefon baseret bredt felt fluorescerende mikroskop eller flowcytometer består af to hoveddele: et kamera telefon og en kompakt opto-fluidisk add-on vedhæftede fil.
1. Den kameratelefon
Mens de præsenterede teknikker er gældende for næsten enhver kamera telefon, har vi valgt Sony Erickson Aino som base for disse enheder. Denne mobiltelefon har en ~ 8 megapixel RGB CMOS-sensor monteret på det og en indbygget linse, som har en brændvidde (f 1) af ~ 4,65 mm. 2. Opto-fluidisk Attachment for Wide-field Fluorescent Microscopy
Den optiske vedhæftede fil er designet af Autodesk og udskrives af en Dimension Elite 3-D printer ved hjælp absplus termoplastisk materiale. I denne trykning proces, model og støtte materialer opvarmes i en ekstruderingshoved i printeren og deponeres lag for lag på en modellering base. Når dette trin er færdigt, kan det bærende materiale opløses og efterlader en robust 3D-model af det ønskede prototype Vores optiske fastgørelse design består af lysdioder (midterste bølgelængde ved ~ 470 nm, Digikey), en plast filter (# NT54-46, Edmund optik), en prøvebakke, og en plankonveks linse f 2 = 15 mm (# NT45-302, Edmund Optics). Alle LED'er og plastfiltre kan let ændres på grundlag af de fluoroforer 'spektre. Trinene til samling denne opto-fluidisk fastgørelse omfatter:
- Placer linsen i den vedhæftede fil inden for sit særlige linseholder position.
- Placer plastik filter på filteret og skub det ind i vedhæftede fil, eller tape plast filter foran mobiltelefon kameralinsen.
- Sæt LED-bakken i den vedhæftede fil.
- Anbring prøven objektglas i prøven bakken. Skub prøvebakke i den vedhæftede fil. Face lysdioderne mod prøven.
- Klip den vedhæftede fil på mobiltelefon, således at den ekstra linse er direkte i kontakt med mobiltelefon kameralinsen.
- Brug kontakten på den vedhæftede fil for at tænde LED.
- Billede prøven af interesse med mobiltelefon kamera enhed ved hjælp af sin "nat-tilstand".
3. Opto-fluidisk Attachment for Fluorescent Imaging Cytometry
Når der er behov for at screene store mængder af væskeprøver til påvisning af sjældne begivenheder kan optofluidic flowcytometri enhed foretrækkes. Vi kan ændre vores brede felt fluorescerende mikroskop design og konvertere det til et flowcytometer, wher en PDMS baseret mikrofluid kanal anvendes til kontinuerligt leverer væskeprøven gennem den billeddannende mængde. Den optiske vedhæftede fil er også designet af Autodesk og trykt af Dimension Elite 3-D printer. Den består også af lysdioder (center bølgelængde på ~ 470 nm, Digikey), en plast filter (# NT54-46, Edmund Optics), en prøvebakke, og en asfærisk linse (f = 4,5 mm) (produkt # C230TME-A; Thorlab). Trinene til samling denne opto-fluidisk fastgørelse omfatter:
- Placer den asfæriske linse i den vedhæftede fil.
- Placer plastik filter på filteret og skub det ind i vedhæftede fil, eller tape plast filter foran cellphone kameralinsen.
- Skub mikrofluid kanal ind i den samme opto-fluidisk vedhæftet fil.
- Klip den vedhæftede fil på mobiltelefon, således at den ekstra linse er direkte i kontakt med mobiltelefon kameralinsen.
- Brug kontakten på den vedhæftede fil for at tænde LED.
- Slut mikrofluideic kanal til sprøjtepumpen og levere den flydende prøve ind i mikrofluid anordning ved en konstant strømningshastighed.
- Optag en film af de fluorescerende celler / partikler løber gennem mikrofluid kanal ved hjælp af video-mode af mobiltelefon kamera.
B. Prøvefremstilling
4. Fremstillinq af fluorescerende mikro-partikel Samples
- Fluorescerende perler med 10 um diameter (røde perler: produkt # F8834 excitation / emission 580nm/605nm, grønne perler: produkt # F8836: excitation / emission 505nm/515nm) er købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA).
- Bland 10 gl af grønne fluorescerende kugler, 10 mikroliter af røde fluorescerende perler med 40 pi af DI vand.
- Place10 pi af denne kugle blanding på et objektglas under anvendelse af en mikropipette og sætte en anden glasplade oven på den for at en sandwich-struktur.
- Indsæt denne sandwich konstruktion i prøven bakken og skub den ind i mobiltelefon vedhæftet fil.
5. Fremstilling af fluorescensmærket hvide blodlegemer
- Tag SYTO16 nucleinsyre fluorescerende mærkning kit (# S7578, Life Technology) og phosphatbufret saltvand (PBS) ud fra køleskabet og bringe dem til stuetemperatur.
- Overfør 200 ul prøve af helblod fra EDTA-blod opsamlingsrør til 1,5 ml polystyrenrør (# 05-408-129, Fisher Scientific).
- Tilsæt 1 ml røde blodlegemer lyseringsbuffer (# R7757, Sigma-Aldrich) til 200 pl prøve af helblod og blandes.
- Efter 5 minutter centrifugeres den lyserede blodprøve og fjern supernatanten opløsning.
- Resuspender hvide blodlegemer pellet i 200 ul PBS-buffer og forsigtigt blande dem.
- Tilsættes 5 ul 1 mM SYTO16 løsning af hvide blodlegemer prøven. Pak prøven med aluminiumsfolie og inkuberes i mørke omgivelser for ~ 30 min.
- Centrifuger prøven igen. Supernatanten fjernes, og det mærkede hvide blodlegemer pellet re-Suspenderet i PBS-puffer.
- Anbring 5-10 pi mærket hvide blodlegemer flydende prøve til et dækglas, og placere et andet dækglas på toppen af prøven.
- Indsæt klemt prøve glide ind prøvebakken og image den ved hjælp af mobiltelefon fluorescerende mikroskop.
Alternativt
- Løbende levere de fluorescensmærkede hvide blodlegemer gennem en mikrofluid kanal med en automatiseret sprøjtepumpe, mens også at indfange en fluorescerende mikroskopisk film af de strømmende celler ved anvendelse af mobiltelefon kamera i video mode. Vi bør også understreges, at en bærbar batteridrevet sprøjtepumpe eller tyngdekraften kan anvendes til at drive strømmen gennem mikrofluid kanal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med vores opto-fluidisk pumpning / excitation ordning (fig. 1C og 1D), kan fluorescensmærkede celler kontinuerligt afgives til mikrofluid kanalen ved hjælp af en sprøjtepumpe mens mobiltelefon kamera registrerer en time-lapse fluorescerende mikroskopisk film af de strømmende celler. Disse fluorescerende film kan derefter hurtigt analyseret under anvendelse af kontur-detektering og sporing algoritmer 14,15 til automatisk at bestemme den absolutte tal og densiteten af de celler, der flyder gennem mikrofluid kanaler, idet funktionen af et fluorescerende imaging flow-cytometeret. Baseret på den ovenfor beskrevne platform (fig. 1C og 1D) og prøveforberedelse protokoller, viste vi nøjagtig tælling af totale hvide blod-celler (WBC'er) i humane blodprøver, opnås sammenlignelige resultater i forhold til en standard hæmatologianalysator. 14 Alternativt kan vi billedoverlejringer også de fluorescerende celler / partikleri statisk tilstand, såsom 13, som uden fluid flow, opnås en meget stor prøve field-of-view af f.eks ~ 81 mm 2 med en rumlig opløsning på ~ 10 um som vist i fx figur 2 og 3. Optiske aberration kan reduceres ved at udforme en mere kompleks linsesystem. Alternativt kan det også være delvis korrigeres ved hjælp af digital billedbehandling ved at kvalificere kilden til aberration og deres rumlige mønstre.
Fig. 1. (A) Skematisk illustration og (B) billede af en mobiltelefon baseret bred felt fluorescerende mikroskop. 13 (C) Skematisk illustration og (D)billede af en mobiltelefon baserede imaging flowcytometer. 14 Klik her for at se større figur .
. Figur 2 udførelsen af vores mobiltelefon baseret fluorescerende mikroskop 13 er karakteriseret ved billeddiagnostik fluorescerende perler (10 um diameter grønne og røde perler, rød perle excitation / emission: 580 nm/605 nm, grøn perle excitation: 505 nm/515 nm ). En god billedkvalitet opnås over en field-of-view for ~ 81 mm 2, se (A, B, C). Mod kanterne af dette centrale område-of-view, er der aberration regioner; se f.eks (DE).
Figur 3 Topbillede:. Mobiltelefonsamtaler billeder af fluorescensmærkede hvide blodlegemer 13 (A-1):. Digitalt zoomet mobiltelefon billede af fluorescensmærkede hvide blodlegemer beskåret fra toppen billede. (A-2): Trykstyrke afkodning resulterer 18 for mobiltelefon billede vist i (A-1). (A-3): Konventionel fluorescerende mikroskop (10x objektiv, NA = 0,25) sammenlignet billede af samme synsfelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har præsenteret vores seneste resultater på celle-telefon baseret bred felt fluorescerende mikroskopi og opto-fluidisk imaging flowcytometri ved hjælp af lys-vægt og kompakte opto-strømningstekniske vedhæftede filer til celle-telefon kameraer. Ved hjælp af denne platform teknologi vi filmede fluorescerende genstande, herunder mikro-partikler og mærkede hvide blodlegemer i fuldblodsprøver. Derfor kan denne kompakte og omkostningseffektive mobiltelefon baseret fluorescerende imaging værktøjssæt være nyttig til point-of-care diagnostik, specielt i ressource begrænsede områder til bekæmpelse af forskellige globale sundhedsproblemer, såsom monitorering af HIV + patienter til deres CD4 + T-lymfocytter tæller .
Udover analyse af kropsvæsker, den samme mobiltelefon-baseret opto-fluidisk cytometri platform kan også være nyttige for andre sensing behov såsom kvantificering af fluorescerende immunoassays til fx overvågning af vand / mad kvalitet i ressource-begrænsede indstillinger. Til den ende har vi for nylig demonstrated følsom, specifik og hurtig påvisning af Escherichia coli O157: H7 (E. coli) i vand og mælk prøver med samme opto-fluidisk mobiltelefon fastgørelse 16. Vi udnyttet overflade funktionaliseret glaskapillarer til specifikt og følsomt fange E. coli partikler i flydende prøver, der blev strømmet gennem hvert kapillar. Disse erobrede E. coli partikler blev yderligere mærket med kvante-dot (QD) konjugerede sekundære antistoffer. Fluorescensemissionen fra disse funktionaliserede kapillærer blev derpå påvist under anvendelse af opto-strømningstekniske mobiltelefon imaging platform og den integrerede fluorescensintensitet langs den kapillære længde blev anvendt til at beregne densiteten af det opfangede E. coli partikler i målopløsningen. Med denne opto-fluid tilgang viste vi en detektionsgrænse på ~ 5-10 CFU / ml i både vand og mælkeprøver 16.
Endelig skal vi bemærke, at afhængig af tHan ansøgning behov, kan den optiske forstørrelse og opløsning af denne platform indstilles ved at ændre f / f 2, hvor f er brændvidden af mobiltelefon kameralinsen og f 2 er brændvidden for den eksterne linse (figur 1A) . Ud over systemet forstørrelse vi også bør bemærke, at LED bakke og det tilhørende filter kan let ændres til forskellige farver for at rumme forskellige fluorophorer eller endog immunchromatografiske assays, der kan anvendes i specifikke anvendelser. 17
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Ozcan er grundlægger af en start-up virksomhed, der har til formål at kommercialisere beregningsmæssige billedbehandling og mikroskopi værktøjer.
Acknowledgments
A. Ozcan taknemmelig støtte for præsidentens Early Career Award for forskere og ingeniører (PECASE), Army Research Office (ARO) Young Investigator Award, National Science Foundation (NSF) KARRIERE Award, Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Award og National Institutes of Health (NIH) direktørens New Innovator Award DP2OD006427 fra kontoret for direktøren, National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell-phone | Sony | Sony Ericsson Aino | |
| Plano-convex lens | Edmund Optics | # NT45-302 | |
| Aspherical lens | Thorlab | # C230TME-A | |
| Filter | Edmund Optics | #NT54-46 | |
| Blue LED | Digikey | #365-1201-ND | |
| Battery | Digikey | #P032-ND | |
| Polystyrene tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Red fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8834 | |
| Green fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8836 | |
| SYTO16 nucleic acid fluorescent labeling | Life Technologies | # S7578 |
References
- Sklar, L. A. Flow Cytometry for BioTechnology. , Oxford University Press Inc. (2005).
- Nunez, R. Flow cytometry for research scientists: principle and applications. , Horizon Press. Wymondham, UK. (2001).
- Mertz, J. Introduction to optical microscopy. , Roberts and company publishers. Colorado, USA. (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nature Methods. 7, 603-614 (2010).
- Hell, S. W. Toward fluorescence nanoscopy. Nature Biotechnology. 21, 1347-1355 (2003).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 102, 13081-13086 (2005).
- Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM. Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91, 4258-4272 (2006).
- Ma, Z., Gerton, J. M., Wade, L. A., Quake, S. R. Fluorescence near-field microscopy of DNA at sub-10 nm resolution. Physical Review Letters. 97, 260801 (2006).
- Chung, E., Kim, D., Cui, Y., Kim, Y., So, P. T. Two-dimensional standing wave total internal reflection fluorescence microscopy: superresolution imaging of single molecular and biological specimens. Biophysical Journal. 93, 1747-1757 (2007).
- Greenbaum, A., Luo, W., Su, T. -W., Göröcs, Z., Xue, L., Isikman, S. O., Coskun, A. F., Mudanyali, O., Ozcan, A. Imaging without lenses: achievements and remaining challenges of wide-field on-chip microscopy. Nature Methods. 9, 889-895 (2012).
- Zhu, H., Yaglidere, O., Su, T. -W., Tseng, D., Ozcan, A. Cost-effective and compact wide-field fluorescent imaging on a cell-phone. Lab on a Chip. 11 (2), 315-322 (2011).
- Zhu, H., Mavandadi, S., Coskun, A. F., Yaglidere, O., Ozcan, A. Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone. Analytical Chemistry. 83, 6641-6647 (2011).
- Suzuki, S., Abe, K. Computer Visualand Graphics. Image Processing. 30, 32-46 (1985).
- Zhu, H., Sikora, U., Ozcan, A. Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone. Analyst. 137, 2541-2544 (2012).
- Mudanyali, O., Dimitrov, S., Sikora, U., Padmanabhan, S., Navruz, I., Ozcan, A. Integrated Rapid-Diagnostic-Test Reader Platform on a Cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), (2012).
- Candes, E. J., Romberg, J. K., Tao, T. Stable signal recovery from incomplete and inaccurate measurements. Communication of Pure and Applied Mathematics. 59, 1207-1223 (2006).
