Summary
Wij evalueren onze recente resultaten op de integratie van fluorescentie microscopie en beeldvorming flowcytometrie tools op een mobiele telefoon met behulp van compacte en kosteneffectieve opto-vloeibare bijlagen. Deze mobiele telefoon op basis van micro-analyse-apparaten kan nuttig zijn voor cytometrische analyse, zoals het uitvoeren van diverse cellen tellen taken alsook voor high-throughput screening van bijvoorbeeld watermonsters in resource minder instellingen.
Abstract
Fluorescentie microscopie en flowcytometrie worden veel gebruikt gereedschap in biomedisch onderzoek en de klinische diagnose. Maar deze apparaten zijn over het algemeen relatief omvangrijk en kostbaar, waardoor ze minder effectief in de resource minder instellingen. Om mogelijk aan te pakken deze beperkingen, hebben we onlangs aangetoond dat de integratie van de wide-field fluorescentie microscopie en beeldvorming flowcytometrie tools op mobiele telefoons met behulp van compacte, lichtgewicht, en kosteneffectieve opto-vloeibare bijlagen. In onze flowcytometrie design, fluorescent gelabelde cellen doorgespoeld een microfluïdisch kanaal dat zich boven de bestaande mobiele telefoon camera unit. Batterijen light-emitting diodes (LEDs) zijn gekoppeld met stompe de zijkant van deze microfluïdische chip, die effectief werkt als een multi-mode plaat golfgeleider, waar het excitatielicht wordt geleid gelijkmatig prikkelen de fluorescerende targets. De mobiele telefoon camera registreert een time lapse film van de fluorescerende cellen die doorde microfluïdische kanalen, waar de digitale beelden van deze film worden verwerkt om het aantal gelabelde cellen tellen in de doeloplossing plaats. Met behulp van een soortgelijke opto-vloeibare ontwerp, kunnen we ook beeld van deze fluorescent gelabelde cellen in statische modus door bijvoorbeeld daartussen de fluorescerende deeltjes tussen twee glazen dia's en het vastleggen van hun fluorescerende beelden met behulp van de mobiele telefoon camera, die een ruimtelijke resolutie van bijvoorbeeld kan bereiken ~ 10 urn over een zeer groot beeldveld gezien ~ 81 mm 2. Deze mobiele telefoon gebaseerd fluorescerende beeldvorming flow cytometrie en microscopie platform kan met name nuttig zijn in resource beperkte instellingen, voor bijvoorbeeld het tellen van CD4 + T-cellen in de richting van de controle van HIV + patiënten of voor de detectie van watergedragen parasieten in het drinkwater.
Introduction
Microscopie en flow-cytometrie worden veel gebruikt technieken 1-12 in biomedisch en wetenschappelijk onderzoek, alsmede de klinische diagnose voor tellen en karakterisatie van verschillende celtypes. Echter, conventionele microscopen en flow-cytometrie instrumenten relatief complex en duur, wat hun gebruik beperkt tot voornamelijk gevestigde centrale laboratoria. Onlangs hebben we een compacte en lichte fluorescerende beeldvorming cytometrie en microscopie apparaat geïntegreerd op een mobiele telefoon, 13,14 waaruit blijkt belofte om kosten-effectief te vertalen fluorescentie microscopie, flow-cytometrie en aanverwante micro-analyse technieken om met beperkte middelen omgevingen voor verschillende telemedicine toepassingen van invloed zijn wereldwijde gezondheid.
In de optofluidic flow-cytometrie configuratie (zie bijvoorbeeld Figuur 1C en 1D), een op maat ontworpen polydimethysiloxane (PDMS) gebaseerd microfluïdische kanaal is positioned voor de mobiele telefoon camera-eenheid, waarbij lichtgevende diodes (LEDs) zijn butt-gekoppeld met de randen van het kanaal. Deze microfluïdische chip samen met het vloeistofmonster binnen vormt een opto-vloeibare planaire golfgeleider (bestaande uit bijvoorbeeld PDMS-liquid-PDMS) zodanig dat het excitatielicht wordt geleid gelijkmatig pomp het fluorescent gemerkte specimens in het micro-kanaal. De fluorescentie emissie van deze gelabelde objecten, bijv. cellen, wordt verder afgebeeld door middel van een extra lens rechts geplaatst na de mobiele telefoon camera-unit en wordt afgebeeld op de mobiele telefoon Complementary Metal-Oxide Semiconductor-(CMOS) beeldsensor. Aangezien de fluorescente emissie loodrecht verzameld om de excitatie lichtpad een goedkoop plastic absorptiefilter voldoende is om het verstrooide excitatielicht verwijderen en kan een goede dark-field achtergrond nodig fluorescerende beeldvorming. Met behulp van een soortgelijke opto-vloeibare ontwerp, kunnen we ook het imago van de fluorescerende objecten in statIC (zie figuur 1A en 1B), waarbij de fluorescerende deeltjes tussen twee glazen objectglaasjes plaats van die door een microfluïdisch kanaal en de fluorescente emissie van deze fluorescerende deeltjes worden opgevangen door de mobiele telefoon CMOS beeldsensor deeltjestelling en karakterisering. Gebaseerd op verschillende toepassingen, flowcytometrie of breedveld fluorescentiemicroscopie kan worden gekozen. Zo kunnen mobiele telefoon flowcytometrie inrichting zijn bijzonder nuttig voor het screenen van grote hoeveelheden vloeistof monsters (bijv. een paar ml) voor de detectie van zeldzame cellen of pathogenen.
In dit manuscript bespreken we een aantal van onze recente resultaten op de integratie van fluorescentie microscopie en beeldvorming flowcytometrie tools op een mobiele telefoon met behulp van compacte en kosteneffectieve opto-vloeibare bijlagen. Deze mobiele telefoon op basis van micro-analyse, beeldvorming cytometrie en sensing platforms kunnen bieden diverse mogelijkhedenvoor telegeneeskunde en point-of-care diagnostiek, in het bijzonder van invloed zijn onze strijd tegen de wereldwijde gezondheidsproblemen in resource beperkte gebieden van de wereld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In dit hoofdstuk introduceren we de experimentele protocollen voor onze mobiele telefoon op basis wide-field fluorescentie microscopie 13 en opto-vloeibare beeldvorming cytometrie platform 14. Wij zullen fluorescerende kralen en fluorescent gelabelde witte bloedcellen om deze beeldvorming platforms te testen.
A. Bereiding van de mobiele telefoon op basis Wide-field fluorescentie microscoop en opto-vloeibare Imaging Flow Cytometer
De mobiele telefoon op basis wide-field fluorescentie microscoop of flowcytometer bestaat uit twee grote delen: een camera telefoon en een compacte opto-vloeibare add-on attachment.
1. De Camera Phone
Terwijl de gepresenteerde technieken zijn van toepassing op vrijwel elke telefoon met camera, hebben we gekozen voor Sony Erickson Aino als de basis voor deze apparaten. Deze mobiele telefoon heeft een ~ 8 megapixel RGB CMOS sensor is geïnstalleerd en een ingebouwde lens met een brandpuntsafstand (f 1) van ~ 4,65 mm heeft. 2. Opto-vloeibare Attachment voor Wide-field fluorescentie microscopie
De optische bevestiging is ontworpen door Autodesk en wordt gedrukt door een Dimension Elite 3-D printer met behulp van ABSplus thermoplastisch materiaal. In dit drukproces, zijn model en ondersteunende materialen verwarmd in een extrusiekop binnen de printer en zijn neergeslagen laag voor laag op een modellering basis. Wanneer deze stap is voltooid, kan het dragermateriaal worden opgelost, waardoor een robuust 3D model van het gewenste prototype Onze optische bevestiging ontwerp bestaat uit LEDs (centrale golflengte bij ~ 470 nm, Digikey), een plastic filter (# NT54-46, Edmund optica), een monsterblad en een platbolle lens f 2 = 15 mm (# NT45-302, Edmund Optics). Alle lampjes en plastic filters kunnen eenvoudig worden gewijzigd op basis van de fluoroforen 'spectra. De stappen voor het monteren van het opto-vloeibare bevestiging zijn onder andere:
- Plaats de lens in het hulpstuk op zijn specifieke lenshouder positie.
- Plaats het plastic filter op de filter en schuif het in de bijlage, of tape het plastic filter voor de mobiele telefoon camera lens.
- Plaats de LED lade in de bijlage.
- Het monster glas dia's in de steekproef lade. Schuif het monster lade in de bijlage. Het gezicht van de LED's in de richting van het monster.
- Klem de bevestiging op de mobiele telefoon, zodat de extra lens direct in contact met de mobiele telefoon camera lens.
- Gebruik de schakelaar op de gehechtheid aan het inschakelen van de LED's.
- Afbeelding van het monster van belang met de mobiele telefoon camera-unit met behulp van de "nachtmodus".
3. Opto-vloeibare Attachment voor fluorescerende beeldvorming Cytometry
Wanneer er behoefte aan grote hoeveelheden vloeistof monsters screenen voor de detectie van zeldzame gebeurtenissen kan optofluidic flowcytometrie apparaat de voorkeur. We kunnen de draagwijdte van onze wide-field fluorescentie microscoop ontwerp en omzetten in een flowcytometer, whier een PDMS gebaseerde microfluïdische kanaal gebruikt om het vloeibare monster continu leveren door het beeldvormend volume. De optische bevestiging is ook ontworpen door Autodesk en gedrukt door Dimension Elite 3-D printer. Het bestaat ook uit LED's (centrale golflengte bij ~ 470 nm, Digikey), een kunststof filter (# NT54-46, Edmund Optics), een monster lade en een asferische lens (f = 4,5 mm) (product # C230TME-A; Thorlab). De stappen voor het monteren van het opto-vloeibare bevestiging zijn onder andere:
- Plaats de asferische lens in de bijlage.
- Plaats het plastic filter op de filter en schuif het in de bijlage, of tape het plastic filter voor de mobiele telefoon camera lens.
- Schuif de microfluïdische kanaal in dezelfde opto-vloeibare bijlage.
- Klem de bevestiging op de mobiele telefoon zodanig dat de extra lens direct in contact met de mobiele telefoon camera lens.
- Gebruik de schakelaar op de gehechtheid aan het inschakelen van de LED's.
- Sluit de microfluidischic kanaal naar de spuitpomp en leveren het vloeistofmonster in de microfluïdische apparaat met een constante stroomsnelheid.
- Leg een filmpje van de fluorescerende cellen / deeltjes die door de microfluïdische kanaal met behulp van de video-modus van de mobiele telefoon camera.
B. Monstervoorbereiding
4. Bereiding van Fluorescent Micro-deeltjes Samples
- TL-kralen met een diameter van 10 micrometer (rode kralen: product # F8834 excitatie / emissie 580nm/605nm; groene kralen: product # F8836: excitatie / emissie 505nm/515nm) worden ingekocht bij Invitrogen (Carlsbad, CA).
- Mix 10 ui groene fluorescerende kralen, 10 pl rode fluorescerende kralen met 40 ui DI water.
- Place10 pi van dit mengsel kraal op een glasplaatje met een micropipet en zet een glasplaatje bovenop aan een sandwich structuur.
- Plaats deze sandwich-structuur in het monster lade en schuif deze in de mobiele telefoon bijlage.
5. Voorbereiding van fluorescent gelabelde witte bloedcellen
- Neem SYTO16 nucleïnezuur fluorescente labeling kit (# S7578, Life Technology) en fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) uit de koelkast en breng ze op kamertemperatuur.
- Breng 200 pi volbloedmonster van EDTA bloedafname tot 1,5 ml polystyreenbuis (# 05-408-129, Fisher Scientific).
- Voeg 1 ml rode bloedcellen lyseren buffer (# R7757, Sigma-Aldrich) aan de 200 ul volbloedmonster en meng.
- Na 5 minuten gecentrifugeerd gelyseerde bloedmonster en verwijder het supernatant oplossing.
- Resuspendeer de witte bloedcellen pellet in 200 ui PBS-buffer en meng ze.
- Voeg 5 ul 1 mM SYTO16 oplossing voor de witte bloedcellen monster. Wikkel het monster met aluminiumfolie en incubeer in het donker omgeving voor ~ 30 minuten.
- Weer Centrifugeer het monster. Supernatant wordt verwijderd en de gemerkte witte bloedcellen pellet wordt opnieuwGesuspendeerd in PBS-buffer.
- Plaats 5-10 pi gemerkte witte bloedcellen vloeistofmonster een dekglas en plaats een tweede dekglas op de bovenzijde van het monster.
- Plaats de ingeklemd monster dia in het monster lade en beeld met behulp van de mobiele telefoon fluorescentiemicroscoop.
Alternatief
- Voortdurend leveren de fluorescent gelabelde witte bloedcellen door middel van een microfluïdische kanaal met behulp van een geautomatiseerd injectiepomp, terwijl ook het vastleggen van een fluorescerende microscopische film van de stromende cellen met behulp van de mobiele telefoon camera in de videomodus. We moeten ook benadrukken dat een draagbare batterijen spuitpomp of zwaartekracht kan worden gebruikt om de stroom rijden door de microfluïdische kanaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met onze opto-vloeibare pompen / excitatie schema (figuur 1C en 1D), kan fluorescent gelabelde cellen continu worden geleverd in de microfluïdische kanaal met behulp van een spuitpomp, terwijl de mobiele telefoon camera registreert een time-lapse fluorescerende microscopische film van de stromende cellen. Deze fluorescente films kunnen vervolgens snel worden geanalyseerd met contour-detectie en tracking algoritmes 14,15 om automatisch de absolute aantal en de dichtheid van de cellen die door de microfluïdische kanalen, waarbij de functie van een fluorescerende beeldvorming flow-cytometer. Gebaseerd op de hierboven beschreven platform (Figuren 1C en 1D) en monstervoorbereiding protocollen toonden we nauwkeurige telling van totale witte bloedcellen (WBC) in menselijke bloedmonsters, vergelijkbare resultaten met een genormaliseerde hematologie analyzer. Alternatief 14 kunnen we Ook het imago van de fluorescerende cellen / deeltjesin statische modus, 13 zodat zonder vloeibare stroom, een zeer grote steekproef beeldveld gezien bijv. ~ 81 mm 2 met een ruimtelijke resolutie van ~ 10 urn zoals weergegeven in bijvoorbeeld figuren 2 en 3 bereiken. Bronnen van optische aberratie worden verminderd door het ontwerpen van een meer complex lenssysteem. Als alternatief kan ook gedeeltelijk worden gecorrigeerd door digitale beeldverwerking doordat zij de bron van de afwijking en de ruimtelijke patronen.
Figuur 1. (A) Schematische illustratie en (B) Foto van een mobiele telefoon gebaseerde breedveld fluorescentiemicroscoop. 13 (C) Schematische illustratie en (D)afbeelding van een mobiele telefoon op basis van beeldvorming flowcytometer. 14 Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
. Figuur 2 De prestaties van onze mobiele telefoon op basis van fluorescentie microscoop 13 wordt gekenmerkt door beeldvorming fluorescerende kralen (10 micrometer diameter groene en rode kralen, rode kraal excitatie / emissie: 580 nm/605 nm, groen kraal excitatie: 505 nm nm/515 ). Een fatsoenlijke beeldkwaliteit wordt bereikt over een veld-of-view van ~ 81 mm 2, zie (A, B, C). Naar de randen van deze centrale field-of-view, zijn er Geaberreerd regio's; zie bijvoorbeeld (DE).
Figuur 3 Top beeld:. Mobiele telefoon beelden van fluorescent gelabelde witte bloedcellen 13 (A-1):. Digitaal op wordt ingezoomd mobiele telefoon beeld van fluorescent gelabelde witte bloedcellen bijgesneden vanaf de bovenste afbeelding. (A-2): Druksterkte decoderen resultaten 18 voor de mobiele telefoon weergegeven in (A-1). (A-3): Conventionele fluorescentiemicroscoop (10x objectief, NA = 0,25) vergeleken beeld van hetzelfde gezichtsveld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij hebben gepresenteerd onze recente resultaten op mobiele telefoon op basis wide-field fluorescentie microscopie en opto-vloeibare beeldvorming flow cytometrie met behulp van licht-gewicht en compacte opto-vloeibare bijlagen mobiele telefoon camera's. Met behulp van dit platform technologie die wij afgebeeld fluorescerende voorwerpen met inbegrip van micro-deeltjes en gelabeld witte bloedcellen in volbloedmonsters. Daarom kan deze compacte en kosteneffectieve mobiele telefoon op basis van fluorescerende beeldvorming toolset nuttig zijn voor point-of-care diagnostiek, in het bijzonder in resource beperkte regio's voor de bestrijding van diverse mondiale gezondheidsproblemen, zoals monitoring van HIV + patiënten voor hun CD4 + T-lymfocyten .
Naast de analyse van lichaamsvloeistoffen, dezelfde mobiele telefoon op basis van opto-vloeibare cytometrie platform kan ook nuttig zijn voor andere sensing behoeften, zoals kwantificering van fluorescerende immunoassays voor bijvoorbeeld monitoring van de water / voedselkwaliteit in gebieden met beperkte middelen. Met dit doel hebben we onlangs demonstrated gevoelig, specifiek en snelle detectie van Escherichia coli O157: H7 (E. coli) in water en melk met gebruikmaking van dezelfde opto-vloeibare mobiele telefoon bijlage 16. We gebruik gemaakt van oppervlakte-gefunctionaliseerde glazen capillairen om specifiek en gevoelig te vangen E. coli deeltjes in vloeibare monsters die werden gevlogen door elk capillair. Deze gevangen E. coli deeltjes werden verder voorzien van quantum-dot (QD) geconjugeerde secundaire antilichamen. De fluorescentie-emissie van deze gefunctionaliseerde capillairen werd vervolgens gedetecteerd met de opto-vloeibare mobiele telefoon imaging platform en de geïntegreerde fluorescentie-intensiteit langs de capillaire lengte werd gebruikt om de dichtheid van de gevangen E. schatten coli deeltjes in de doeloplossing. Met deze opto-vloeibare benadering hebben we aangetoond een detectielimiet van ~ 5-10 CFU / ml in zowel water en melkmonsters 16.
Tot slot moeten we er rekening mee dat afhankelijk van thij toepassingsbehoeften kan de optische vergroting en resolutie van dit platform worden afgestemd door het veranderen f / f 2, waarbij f de brandpuntsafstand van de mobiele telefoon cameralens en f2 is de brandpuntsafstand van de lens externe (Figuur 1A) . In aanvulling op het systeem vergroting, moeten we ook rekening mee dat de LED-lade en de bijbehorende filter kan gemakkelijk worden veranderd in verschillende kleuren om tegemoet voor verschillende fluoroforen of zelfs immunochromatografisch testen die gebruikt kunnen worden in specifieke toepassingen. 17
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr Ozcan is de oprichter van een start-up bedrijf dat zich richt op commercialiseren computationele beeldvorming en microscopie tools.
Acknowledgments
A. Ozcan zeer erkentelijk voor de steun van de Presidentiële Early Career Award voor wetenschappers en ingenieurs (PECASE), leger Bureau Onderzoek (ARO) Young Investigator Award, National Science Foundation (NSF) Career Award, Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Award en National Institutes of Health (NIH) Nieuwe Innovator Director's Award DP2OD006427 van het Bureau van de directeur van het National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell-phone | Sony | Sony Ericsson Aino | |
| Plano-convex lens | Edmund Optics | # NT45-302 | |
| Aspherical lens | Thorlab | # C230TME-A | |
| Filter | Edmund Optics | #NT54-46 | |
| Blue LED | Digikey | #365-1201-ND | |
| Battery | Digikey | #P032-ND | |
| Polystyrene tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Red fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8834 | |
| Green fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8836 | |
| SYTO16 nucleic acid fluorescent labeling | Life Technologies | # S7578 |
References
- Sklar, L. A. Flow Cytometry for BioTechnology. , Oxford University Press Inc. (2005).
- Nunez, R. Flow cytometry for research scientists: principle and applications. , Horizon Press. Wymondham, UK. (2001).
- Mertz, J. Introduction to optical microscopy. , Roberts and company publishers. Colorado, USA. (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nature Methods. 7, 603-614 (2010).
- Hell, S. W. Toward fluorescence nanoscopy. Nature Biotechnology. 21, 1347-1355 (2003).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 102, 13081-13086 (2005).
- Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM. Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91, 4258-4272 (2006).
- Ma, Z., Gerton, J. M., Wade, L. A., Quake, S. R. Fluorescence near-field microscopy of DNA at sub-10 nm resolution. Physical Review Letters. 97, 260801 (2006).
- Chung, E., Kim, D., Cui, Y., Kim, Y., So, P. T. Two-dimensional standing wave total internal reflection fluorescence microscopy: superresolution imaging of single molecular and biological specimens. Biophysical Journal. 93, 1747-1757 (2007).
- Greenbaum, A., Luo, W., Su, T. -W., Göröcs, Z., Xue, L., Isikman, S. O., Coskun, A. F., Mudanyali, O., Ozcan, A. Imaging without lenses: achievements and remaining challenges of wide-field on-chip microscopy. Nature Methods. 9, 889-895 (2012).
- Zhu, H., Yaglidere, O., Su, T. -W., Tseng, D., Ozcan, A. Cost-effective and compact wide-field fluorescent imaging on a cell-phone. Lab on a Chip. 11 (2), 315-322 (2011).
- Zhu, H., Mavandadi, S., Coskun, A. F., Yaglidere, O., Ozcan, A. Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone. Analytical Chemistry. 83, 6641-6647 (2011).
- Suzuki, S., Abe, K. Computer Visualand Graphics. Image Processing. 30, 32-46 (1985).
- Zhu, H., Sikora, U., Ozcan, A. Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone. Analyst. 137, 2541-2544 (2012).
- Mudanyali, O., Dimitrov, S., Sikora, U., Padmanabhan, S., Navruz, I., Ozcan, A. Integrated Rapid-Diagnostic-Test Reader Platform on a Cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), (2012).
- Candes, E. J., Romberg, J. K., Tao, T. Stable signal recovery from incomplete and inaccurate measurements. Communication of Pure and Applied Mathematics. 59, 1207-1223 (2006).
