Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

Published: August 13, 2013 doi: 10.3791/50455
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Molecular Immunology, Helmholtz Zentrum München

Summary

העברת גני adenoviral לתוך CD4 נאיבי תאי T מהונדס עם ביטוי של הקולטן אדנווירוס Coxsackie מאפשרת ניתוח המולקולרי של התמיינות תאי T רגולטורים

Abstract

תאי T רגולטוריים (Tregs) הם חיוניים כדי לספק סובלנות חיסונית עצמי, כמו גם לאנטיגנים זרים מסוימים. יכול להיות שנוצר Tregs מתאי T מסוג CD4 נאיביים במבחנה עם TCR-ושיתוף גירוי בנוכחות TGFβ ו-IL-2. זה נושא פוטנציאל עצום לטיפולים עתידיים, לעומת זאת, המולקולות ומסלולי איתות שבידול שליטה הם במידה רבה לא ידועים.

ניתן להשפיע תאי T עיקריים דרך ביטוי גנים מחוץ לרחם, אך שיטות נפוצות אינן מצליח למקד את המדינה הנאיבית החשובה ביותר של תא T לקראת הכרת אנטיגן העיקרית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לבטא גנים מחוץ לרחם בתאי T מסוג CD4 נאיביים במבחנה לפני גרימת בידול Treg. היא חלה התמרה עם אדנווירוס כפול המחסר ומסבירה הדור והייצור שלה. אדנווירוס יכול לקחת עד מחדיר גדול (עד 7 קילו) והוא יכול להיות מצויד עם יזמים כדי להשיג overexp הגבוהה והחולףression בתאי T. זה למעשה transduces תאי T עכבר נאיביים אם הם מבטאים רצפטור אדנווירוס Coxsackie מהונדס (מכונית). חשוב מכך, לאחר הדבקת תאי T נשארים נאיביים (CD44 נמוך, CD62L גבוהה) ומנוחה (CD25 -, CD69 -) ויכול להיות מופעל ומובחן לTregs דומה לתאים שאינם נגועים. לכן, שיטה זו מאפשרת מניפולציה של CD4 התמיינות תאי T מראשיתו. זה מבטיח כי ביטוי גנים מחוץ לרחם כבר נמצא במקום כאשר אירועי איתות ראשונים של גירוי TCR הראשוני גורם לשינויים תאיים שסופו של דבר יובילו לבידול Treg.

Introduction

Tregs הם חיוניים כדי לשמור על סבילות חיסונית ולצנן את התגובות חיסוניות להחטיא. Tregs לדכא הפעלת תא T עובר אורח. כתוצאה מכך, אבלציה של Tregs מובילה לאוטואימוניות הקטלנית והרס עצמי מונעת על ידי תאי T מופעל 1. Tregs להתפתח בבלוטת התימוס במהלך סלקציה שלילית של CD4 מבשרים אחת חיובי, אבל הם גם יכולים להבחין בפריפריה מתאי T מסוג CD4 תמימים על גירוי אנטיגן במינון נמוך עם 1,2 שיתוף הגירוי הכי מוצלח. נראה הרתי Tregs לדכא אוטואימוניות רקמה נגד-אנטיגנים עצמיים, ואילו ההיקפי Tregs היו מעורב במתן סובלנות במעי או הריאה. המושרה Tregs אלה potently למנוע הפעלת תא T לאחר הכרה של אנטיגנים זרים ברירית, כולל אנטיגנים סביבתיים ממזון והאוויר, חיידקי commensal, ואלרגנים 3,4. בנוסף, Tregs הם קריטיים להקמת סובלנות אימהית לעובר 5 פפטידים ומראשמחלת שתל נגד מארח פורקן 6. במקביל, גם Tregs לתווך לוואי בלתי רצוי על ידי הפחתת ערך מעקב חיסונית של תאים סרטניים 7,8. תכונת ההיכר של Tregs היא הביטוי של-משנה ציון FOXP3 גורם השעתוק, גורם שעתוק המכיל תחום המזלג בראש, כי הוא הכרחי ומספיק להעניק Treg פונקציה 9,10. כמה מסלולי איתות שיכול לגרום ביטוי FOXP3 ידועים. עם זאת, התהליכים המולקולריים השליטה, להסדיר, או לווסת Treg בידול בתגובה לקולטן תא T מפעילה הם הבינו פחות טובים.

יכול מאוד יעיל להיגרם Tregs במבחנה על ידי הגירוי של תאי T מסוג CD4 נאיביים עם נוגדנים אנטי CD3 ואנטי CD28 בנוכחות TGFβ ו-IL-2 11. כTregs מתעורר הם פונקציונליים in vivo, המניפולציה של מולקולות המקדמות בידול Treg נושא פוטנציאל עצום לעתיד therapies, למשל, טיפול באסתמה, מחלת Crohns, והשתלת 11,12. לעומת זאת, אפנון טיפולי של מולקולות כדי לחסום בידול Treg עשוי לספק תועלת בגישות עתידיות של טיפול המשולב של חולי סרטן.

במבחני בידול במבחנה כבר סייע לתיאור של שינויים מולקולריים הקשורים להתמיינות תאי T משנה. באותו הרגע, ניסיונות ניסיוניים לחיפוש או מסך למוצרי גן שהתמיינות תאי T שליטה הם הקשו על ידי העובדה שהשיטות הנפוצות ביותר של ביטוי גנים מחוץ לרחם להיכשל בתאי T נאיביים. לדוגמה, electroporation ותמרת retroviral הם יעילים רק בתאי T מופעלים. בניגוד לציפיות ראשוניות, תמרת lentiviral, שהוא בדרך כלל יעיל בתאי מנוחה, דורשת מראש הפעלה של תאי T נאיביים ידי ציטוקינים 13. יתר על כן, ההעברה של cDNA או mRNA במהלך electroporationכרוך בשלילת קוטביות של קרום הפלזמה, שהיא עצמה מעניקה תכונות של הפעלת תאי T ואולי אף לגייס Ca 2 + איתות ולהפעיל את חלבוני NFAT (תצפית ושופט שלא פורסם. 14). באופן דומה, לתמרת retroviral, תאי T הנאיביים צריכים להיות מופעלים עבור 18 - 40 שעות. במהלך תקופה זו, הפירוט של קרום הגרעין במהלך חלוקת תא מתרחש, ומאפשר לשילוב הגנומי הבא של וקטור retroviral 15. שיטות אלה אינם מסוגלים להתמודד עם הרגולציה המולקולרית המוקדמת של מפגש ראשוני עם תא T אנטיגן, המהווה את השלב המכריע של התמיינות תאי T מסייע.

התמרה adenoviral ידועה להעניק ביטוי גנים מחוץ לרחם חולף במספר סוגי תאים האנושיים המבטאים את הקולטן אדנווירוס Coxsackie האנושי (מכונית). הוא ממשיך ללא דרישה להפעלת תא או התקדמות מחזור התא. משטח הביטוי של גAR הוא חיוני לקובץ מצורף וירוס יעיל והפנמה, וביטוי מהונדס של הגרסה המקוצצת CARΔ1 תחת אמרגן תא ספציפי T נמצא כדי להבהיר thymocytes העכבר ותאי T הרגישים לזיהום adenoviral 16. חשוב לציין, transgene אינו משנה thymocyte פיתוח או בבידול מבחנה של CD4 תאי T נאיבי לתוך תת שונים (מידע לא מוצג; נ"צ 17.). התמרה אדנווירוס בתיווך של תאי T ששימש בעבר לביטוי יתר 17,18 ועקום למטה גישות 19,20. יכולים להיות מטוהרים תאי T המהונדס מזמין מסחרי DO11.10 TG; CARΔ1 TG (Taconic, Inc ונ"צ 17.). חשוב לציין, התמרה adenoviral מאפשרת ביטוי גבוה של גן של עניין בתאי T נאיביים ללא גרימת סימנים ברורים של הפעלה. תאי ה-T נשארים נאיביים (CD44 נמוך, CD62L גבוהה) ומנוחה (CD25 -, CD69 -) לאחר infectiוביכול להיות מופעל ומובחן לTreg דומה לתאים שאינם נגועים.

ייצור של adenoviruses רקומביננטי יכול להיות מושגת לאחר transfection של תאי HEK293A עם פלסמידים adenoviral (איור 1). פלסמידים אלה מכילים בדרך כלל את הגנום האנושי אדנווירוס מסוג 5 עם גני E1 ו-E3 שנמחקו כדי להבהיר adenoviruses רקומביננטי שכפול פסול 21. תאי HEK293A להשלים מחסור שכפול כפי שהם כבר הונצחו באמצעות שילוב יציב של אדנווירוס טעון 22. מאז וקטורי adenoviral גדולים (~ 40 KB) וכתוצאה מכך לא מתאים גם לשיבוט בתיווך אנזים הגבלה מסורתי, אנחנו עובדים במערכת השער. הגן של עניין הוא משובט תחילה לתוך וקטור כניסה קטן יותר, שממנו ניתן להעביר אותו בקלות לתוך וקטור יעד adenoviral דרך תגובת רקומבינציה מבדה (LR) 23. אנחנו בניתי את וקטור pCAGAdDuעל ידי שילוב של אמרגן CAG (אמרגן אקטין עוף ומשפר CMV) עם קלטת ביטוי המכילה אתרי LR איגוף סמן בחירת ccdB procaryotic 24. קלטת ביטוי זה התמזגה לאתר פנימי כניסה הריבוזום (IRES) רכיב המאפשר coexpression של החלבון אוקריוטים זיהום הסמן המשופר הירוק הניאון (eGFP), אשר התמזג רצף המכיל הורמון גדילת פולי השור () אות. אנחנו בחרנו את רצפי cis-הרגולציה חטיבת כלי טיס, שכן אמרגן CMV prototypic נמצא להיות מאוד הפעלה תלויה ושלילי ולכן לביטוי גנים בתאי T נאיביים.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול להתמיינות יעילה בTreg מבחנה ושיטה לtransduce תאי T מסוג CD4 תמימים ללא הפעלה (איור 2). השיטה מאפשרת ביטוי אקטופי גן או להפיל מסוג CD4 שקדמו התמיינות תאי T במצב הנאיבי. זה מאפשר לבחון את ההשפעה של overexpresseגן ד של ריבית במהלך אירועי איתות ראשונים על גירוי ראשוני TCR עד מחויבות משנה תא T. ניסויי האימות שלנו גם מספקים את הבסיס להקמת יישום דומה באדנווירוס הבידול של תת קבוצות אחרות כגון תאי T Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, או תאי TFH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שיבוט של גן של עניין לוקטור כניסה

  1. לשבט את הגן של עניין לוקטור כניסה. ההגברה PCR של הגן ואחרי קשירה בוטה סוף לתוך וקטור topoisomerase מצמידים (למשל pENTR / D-TOPO) או הגבלת אנזים בתיווך שיבוט עשוי לשמש להליך זה.

2. העברת הגן של עניין לוקטור יעד pCAGAdDu

  1. להעביר את הגן של עניין מוקטור כניסתו לוקטור היעד על ידי רקומבינציה LR (מיקס למשל Gateway LR Clonase השני אנזים). הפעולה זו תיצור וקטור ביטוי adenoviral (איור 1).
  2. Linearize 10 מיקרוגרם של וקטור ביטוי adenoviral בפאצ'י הגבלה לעכל, לזרז את ה-DNA וresuspend אותו במים בריכוז של 3 מיקרוגרם לכל 100 μl. ינאריזציה משחררת את החזרות ההפוכות נגיפיות (ITR), אשר נדרשות לשכפול וencapsidation של Vה-DNA iral לחלקיקי נגיף.

3. דור של lysate הווירוס היסודי

  1. זרעי 1 x 10 5 תאי HEK293A ב2 תרבות תקשורת סלולרי מ"ל (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) באחד טוב של 6 גם צלחת ודגירת התאים עבור 6-14 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב10% CO 2 באינקובטור כדי לאפשר להם לדבוק. לאחר מכן תאים צריכים להיות בכ -50% confluency.
  2. Lipofection: העברת 6 μl של מגיב jetPEI ל94 μl של 50 מיקרומטר NaCl, בקצרה מערבולת. מוסיף את הפתרון המעורב עד 100 וקטור אדנווירוס ינארית μl תוך vortexing ודגירת תמהיל transfection זה במשך 15 - 30 דקות בטמפרטורת חדר.

לבצע את כל הפעולות הבאות בתנאים המתאימים biosafety לזיהום אדנווירוס!

  1. לוותר על פתרון dropwise על התא המכיל גם HEK293A ודגירת התאים ב 37 ° C ו-CO 2 10%. בעת שימוש בסמן פלואורסצנטי, להעריך transfection יעילות חזותי לאחר 12-36 שעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. הוסף 0.5 מ"ל של מדיום חדש כל 3 ימים.
  2. בדקו כל 2 - 3 ימים עם מיקרוסקופ אור או הקרינה לתופעות cytopathic (CPE), שהם אזורים עם תאים מוגדלים ומעוגלים שמתחילים לניתוק. זה מעיד על דור וירוס יעיל. על המופע של אזורים רחבים יותר של CPE (איור 3), זה ייקח 24-72 שעות לפני שכל התאים נגועים.
  3. כאשר כל התאים להראות סימנים של CPE, אבל לפני ניתוק כולל של תאים מתרחש, לנתק את התאים על ידי pipetting העדין ותאים עם העברת supernatant (SN, 3 - 5 מ"ל) לצינור פוליסטירן 15 מ"ל.
  4. להקפיא את התאים בSN על קרח יבש במשך 15 - 20 דקות ולהפשיר אותם במהירות על 37 מעלות צלזיוס לאחר מכן לקרע התאים. חזור על הקפאה והפשרה, מחזור זה (נ / TC) פעמיים נוספות. שמור lysate הווירוס העיקרי על קרח לשימוש תוך יום או להקפיא אותו ב -80 מעלות צלזיוס במשך אחסון לטווח ארוך. כל F נוסף/ TC יפחית את כייל הנגיף על ידי 30 - 50%.

4. הגברה וירוס

  1. זרעים ולגדל תאי HEK293A למפגש 90% על צלחת תרבית רקמת ס"מ 14.
  2. להדביק את התאים עם מחצית lysate הווירוס העיקרי (1.5-2.5 מ"ל) ודגירת התאים במשך לפחות 36 שעות. כמעט כל התאים צריכים להיות נגועים לאחר מכן, כפי שניתן לקבוע על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עבור מחדש ההגברה של מניות וירוס כבר מוגבר (כלומר מרוכז יותר), להדביק HEK293A בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 50 (ראה 6.3).
  3. תאים צריכים להיות בצור כאשר כל אחד מהם מראים CPE אבל לפני הניתוק. עם ייצור וירוס יעיל מצב זה הוא הגיע בתוך 48 שעות לאחר הדבקה. (אם זה לוקח עד שבוע, לשקול סיבוב נוסף של הגברה על ידי הגדלת כמות מניות אדנווירוס משמשת לזיהום המתואר ב4.2.)
  4. לנתק את התאים על ידי pipetting העדין והעברת תאים וSN לצינור פוליסטירן 50 מ"ל. ספין למטה תאים ב XG 300 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
  5. הסר את SN וresuspend גלולה בהיקף מתאים של מדיום או SN (1 מיליליטר בקירוב).
  6. בצע 3 F / TC לשבש את התאים ו צנטריפוגות ב XG 800 במשך 15 דקות ב 4 ° C. תוריד את מספר סידורי המכיל את חלקיקי הנגיף (כלומר lysate הנגיף המרוכז), וaliquot lysate הווירוס לאחסן אותו ב -80 ° C.

5. קביעת כייל נגיף

  1. זרעים 10 5 תאים לכל A549 גם ל5 בארות של צלחת 12 גם במדיום 1 מ"ל ולתת לתאים לדבוק 6 שעות.
  2. השתמש μl 1 של אדנווירוס המרוכז (מופשר על קרח) לביצוע דילול סדרתי במדיום (1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000) ולהוסיף 10 μl בכל טוב. להשאיר אחד גם נגוע להתאים gating בcytometry הזרימה.
  3. לאחר 36 שעות, תוריד את מספר סידורי, לשטוף עם תאי PBS ולנתק (לדוגמה על ידי trypsinization). לקבלת הוראות בטיחות Biohazard, מומלץ לתקן גאמות בparaformaldehyde 4% μl 100 ב PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ולשטוף עם PBS פעם אחת.
  4. לבצע ניתוח FACS של ביטוי זיהום סמן. עלילה 'lysate הנגיפי μl ייושם כנגד המספר המוחלט של תאים נגועים (איור 4). לקבוע את הטווח ליניארי של זיהום ולחשב לכל מ"ל של כייל נגיף חי מהעקומה הסטנדרטית על פני הטווח ליניארי באמצעות x = 1,000 μl.

6. זיהום תא T

  1. בודד תאי T מסוג CD4 תמימים / מנוחה מDO11.10 TG; עכברי TG CARΔ1 באמצעות MACS (מסוג CD4 + T הנאיבי צינוק ערכה השני) או FACS מיון (מסוג CD4 + CD25-CD44-CD62L +).
  2. לניסויים בקנה מידה קטנה, פיפטה נפח מתאים של lysate הנגיפי כדי להשיג משרד הפנים של 50 לאחד גם צלחת תחתונה 96, גם סיבוב.
  3. הוסף עד 4 x 10 5 תאי T בנפח סופי זיהום של 50 μl במדיום תא T (RPMI1640, 10% FBS, PenStrep 5%, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x ממ חיוניויטמין, 1x-L-גלוטמין, 1:250,000 mercaptoethanol, 10 HEPES מ"מ).
    לדוגמה:
    משרד הפנים של 50 ישמשו להדביק 3 x 10 5 תאי T; כייל הנגיף הוא 3 X 10 9 מ"ל -1
    נפח וירוס = משרד הפנים x T מספר תא / כייל נגיף = 50 x (3 x 10 5) / (3 x מיליליטר -1 10 9) = 0.005 מ"ל

הערה: לזיהום של מספרים סלולריים גדולים יותר, בקנה מידה של דבר באמצעות משרד הפנים של 50 בהיקף זיהום של 165 μl לכל 10 6 תאי T נאיביים בצינור קלקר עם כוס רופפת (עד 3 מ"ל לכל צינור TP).

  1. דגירה תאים עבור 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור.
  2. ספין למטה תאים ב XG 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, תוריד את מספר סידורי, resuspend ב200 PBS μl. צנטריפוגה שוב ותוריד את מספר סידורי.

(אופציונלי: התאים עלולים להישטף שוב כדי להסיר את הווירוס באופן יעיל יותר)

  1. תאי Resuspendב200 בינונית μl תא T בלי גירוי נוגדנים וציטוקינים אחרים בלי IL-2 או לנוח ו 40 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור כדי לאפשר ביטוי של הגן של עניין לפני ההפעלה.

7. הפעלת תא T וקיטוב

  1. פיפטה בנפח של אנטי CD3-וחרוזים אנטי CD28 מצמידים ששווים למספר התא (לדוגמה: 4 x 10 5) לתוך כוס מגיב קטנה, להוסיף נפח של פי 10 של PBS ולשים אותם על מגנט במשך 2 דקות . קח את supernatant ו resuspend את חרוזי 200 בינוני קיטוב μl (לTregs: בינונית + T תא TGFβ ng / 1 מ"ל, 100 U / ml IL-2).

הערה: ניתן גם להפעיל תאים באמצעות תרבות מנות רקמות מצופות בנוגדנים נגד CD28 ואנטי CD3, או באופן ספציפי לקולטן תא T DO11.10 באמצעות splenocytes BALB / ג מוקרן פעם עם אנטיגן ovalbumin 323-339 פפטיד.

  1. Centrifugהדואר נח תאים כמו קודם, תוריד את תאי resuspend SN וב200 בינונית μl קיטוב המכילים אנטי CD3-וחרוזים-CD28 נוגדן אנטי מצמידים. דגירה של 72 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור ללא שינוי בינונית.

8. קיבוע תא T ומכתים עבור cytometry הזרימה

  1. שטוף תאים: ספין למטה תאים ב XG 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, תוריד את מספר סידורי, resuspend ב200 PBS μl. צנטריפוגה שוב ותוריד את מספר סידורי. לבצע את כל שלבי הכביסה הבאים בהתאם.
  2. Resuspend התאים בתמיסת 100 μl ניתן לתקן מת תא מכתים ודגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C.
  3. שטוף תאים, resuspend ב100 PBS μl, להוסיף paraformaldehyde 4% μl 100 PBS, 15 דקות לדגור על RT.
  4. שטוף תאים, resuspend אותם במתנול 70% μl 200 קר כקרח PBS ו דגירה למשך 30 דקות על קרח.

הערה: ניתן לטפל בתאים מעתה והלאה ללא אמצעי זהירות Biohazard!

  1. הכן 60 אדון ותמהיל של 60 μl μl PBS + 10 מיקרוגרם / מיליליטר FC-בלוק (אנטי FCR3 לחסום מחייב נוקבים). שטוף תאים, resuspend אותם 40 μl של PBS + אנטי FCR3 ודגירת 15 דקות ב RT.
  2. הוסף 20 μl של PBS + אנטי FCR3 המכיל נוגדני 1 מיקרוגרם PE-מצמידים אנטי FOXP3, מערבב היטב ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה.
  3. שטפו תאים פעמים PBS ולנתח תאים בcytometer זרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ייצור וירוס

עבור דור של titers וירוס גבוה, העיתוי של מסיק תא HEK293A בייצור וירוס ראשוני או הגברה וירוס הוא קריטי. תמונות עם ניגודיות ניאון ושלב נציג עם סימנים חזותיים של ייצור נגיף מוצגות באיור 3. CPE נצפו 10 ימים לאחר transfection של תאי HEK293A עם וקטור שליטת pCAGAdDu ללא הוספה. CPE מאופיין על ידי ההופעה של אזורים עם תאים מוגדלים ועיגול לטובה שמתחילים לנתק ולהציג ביטוי גבוה של ה-GFP סמן הזיהום. היקף CPE מעיד על דור וירוס יעיל. צלחות תרבית תאים המראים CPE הדומה ניתן לקצור בתוך 24-72 שעות, וlysate וירוס גלם יכולים להיות שנוצרו על ידי מחזורי הקפאה והפשרה--. כייל הנגיף אז יכול להיות נקבע על ידי דילול סדרתי של lysate הווירוס על מנת לאפשר השוואה של זיהומים עם משרד הפנים שווה (איור 4). בטווח ליניארי, לאהוא משוואת ניתוח רגרסיה ניתן להשתמש כדי לחשב את מספר החלקיקים זיהומיות לlysate וירוס חי מ"ל. בדוגמא, כייל עבור x = 1 הוא 30,016,535 μl μl -1 ≈ 3 x 10 10 מ"ל -1.

בוחן את ההשפעה של זיהום Adenovirus על הפעלת תאי T והתמיינות

את ההשפעות של התמרה אדנווירוס על תאי המטרה נבדקו על ידי הדבקה של תאי T מסוג CD4 נאיביים עם MOIs הגדלת באמצעות וקטור שליטת adenoviral שמבטא רק IRES-GFP (איור 5 א). יעילות הזיהום נמדדה על ידי FACS ניתוח קביעת תאי GFP חיוביים בדגימות תאי T קבועות 72 שעות לאחר גיוס של Treg בידול. שיעור תאי GFP החיוביים גדל עם משרד הפנים המשמשים לזיהום וזיהום הגיע% 84 במשרד פן 50. אנחנו לא לקבל אחוזים גבוהים יותר של תאי T נגועים בעת שימוש במשרד פנים יותר מ -50 (מידע לא מוצג). למרות infeיעילות ction עשויה להשתנות בהתאם לגן של עניין, בדרך כלל אחד יכול להדביק יותר מ -50% מהתאים במשרד פן 50. בMOIs בין 1 ל 50 כדאיות התא לא נפגעה (איור 5). חשוב לציין, הגירוי וההתמיינות של תאי T נאיביים לTregs היה דומה בנגוע בהשוואה לתאים שאינם נגועים (איור 5 ג'). מאפיין מרכזי של התמרה אדנווירוס הוא יכולתו להדביק תאי T נאיביים ומנוחה מבלי להתייעץ או דורשים הפעלת תא T. זה ברור מהניתוח של סמנים של הפעלת תאי T (CD25, CD69, CD44) והסמן של נאיבי (CD62L) תאי T בדגימות עם או בלי זיהום אדנווירוס ונח ל40 שעות ב 37 ° C ב 5% CO 2 באינקובטור (איור 6). לפני הפעלה במבחנת תא T עם אנטי CD3-וחרוזים אנטי CD28 מצמידים, תאי T הנגועים הנגועים היו דומים CD25 נמוך, CD69 L נמוך וCD44אוו אבל גבוה CD62L, הוכחת המצב הנאיבי ומנוחה שלהם (איור 6, פנלים עליונים). עם הפעלת תא T, את התאים הנגועים הראו upregulation של הפעלת הסמנים CD25, CD69 וdownregulation של CD62L כמעט שאין להבחין בין תאים נגועים (איור 6, לוחות נמוכים). לפיכך, מצב ההפעלה של תאי T לא משתנה על ידי זיהום אדנווירוס. שלב המנוחה קשור לאובדן של 60 עד 70% מהתאים, בהעדרם של גורמי גדילה או ציטוקינים, בהשוואה ל 10 - 20% תאים מתים 40 שעות לאחר הפעלה ללא מנוחה. זה נלקח בחשבון בעת בחירת מספר התא הראשוני של 3 x 10 5 תאים.

הערכת רמת ביטוי היתר של גן של עניין

על מנת להעריך את כמות ביטוי יתר מושגת על ידי העברת גני adenoviral, אנחנו ביקש לקבוע את רמות ביטוי בתאי T נאיביים microRNA-155 (miR-155) שאנחנומחדש נגוע miR-155-לבטא או אדנווירוס שליטה או נותרו נגוע. אנחנו בחרנו miR-155 מאז מירנה הבוגרת זה בא לידי ביטוי ברמות מתונות בתאי T נאיביים והופכת להיות מושרה בחום על הפעלת תא T. יתרה מזאת, יש לו תפקיד מכריע בT תגובות 25,26 תא תלויה הלחות.

רמת ביטוי יתר microRNA הוערכה על ידי qPCR. לאחר הדבקה, תאים היו נחו במשך 40 שעות, הופעלו עבור 40 שעות, או 40 שעות נחו ואחרי 40 שעות של הפעלה. אחרי 40 שעות מנוחה, תאי T הנאיביים הנגועים miR-155 וירוס קידוד מוצגים ביטוי יתר של פי כ 17 של miR-155 בהשוואה לתאים נגועים בנגיף או תאי בקרה שאינם נגועים (איור 7). זה כמעט תאם את המידה שבה miR-155 אנדוגני מושרה לאחר הפעלת תא T (איור 7 ונ"צ. 25,27). ללא קשר לאינדוקציה החזקה הזה של אנדוגני miR-155 רמות, תאים נגועים במיילR-155 אדנווירוס עדיין הראה על עלייה של פי ארבעה בביטוי של miR-155 עם הפעלה לעומת שליטה תאים נגוע בנגיף או שאינם נגועים. הרמה שנצפתה ביטוי יתר של חוץ רחמי הייתה דומה למייקרו RNA האחרים (מידע לא מוצג). יש לציין כי למוסיף גדול, ביטוי יתר עשוי להיות פחות יעיל.

ניתוח של התמיינות תאי T

ניתוח הנתונים יכול להתבצע במספר דרכים. ניתוח של בידול בשער GFP החיובי של גן של עניין (כלומר בתאים הנגועים) בהשוואה לבידול באותו שער GFP החיובי של תאי בקרה (תאים נגועים בשימוש בוקטור ללא גן של עניין) הוא מספיק כדי לזהות הבדלים משמעותיים. ללמוד השפעות עדינות יותר של גן של עניין, יש לנו לעומת הבידול בתאים נגועים עם זה של תאים שאינם נגועים מאותו היטב (איור 8). אלו משמשים כCONTRO פנימייכול להיות מנוצל ליטר וכדי לחשב את "בידול היחסי" בתוך באר. אם וירוס אין כל השפעה על בידול, "הבידול היחסי" יהיה 1 באופן אידיאלי. יש הבידול יחסית לוירוס שליטה בידיים שלנו טווח של 0.9-1.1. בידול יחסי צריך להיות מיושם רק להשוואה בין גנים של דגימות עניין נגועים לשלוט דגימות נגועים בנגיף.

איור 1
איור 1. וקטורי כניסת ייצוג סכמטי של דור אדנווירוס. (pENTR) מכילים אתרי רקומבינציה תורם (AttL1, AttL2), אשר אגף גן של עניין. יעד הווקטור pCAGAdDu מכיל את אתרי יעד רקומבינציה (AttR1, AttR2) איגוף גן CcdB רעל לסלקציה שלילית בE. coli, אשר הוחלף על ידי הגן של ענייןבאמצעות רקומבינציה LR. וקטור היעד מכיל גם אדנווירוס מסוג 5 הגנום אנושי ללא E1/E3 גנים, שנמחק כדי ליצור adenoviruses רקומביננטי הכפול מחסר. ינאריזציה פאצ'י משחררת חוזרת הפוך (ITR) לפני transfection לHEK293A תאים הנושאים את הגנים adenoviral ליצור זיהומית חלקיקי adenovirus כי תוצאה לוואי cytopathic. אדנווירוס שנקטפו מהתאים המייצרים על ידי מחזורי הקפאה והפשרה--. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2
איור 2. ייצוג סכמטי של זיהום תא T והתמיינות. תאי T נאיביים היו נגוע בlysate אדנווירוס ל1.5 שעות, שטף עם PB S ונח במדיום תא T עבור 40 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור. התאים ולאחר מכן הופעלו על 72 שעות באמצעות חרוזים נוגדן מצמידים אנטי CD3 אנטי CD28 ובנוכחות TGFβ ו-IL-2. תאים קבועים ומוכתמים נותחו על ידי FACS, והביטוי של FOXP3 בתאים נגועים לעומת הלא נגועים היה נחוש.

איור 3
איור 3. השפעת cytopathic של אדנווירוס תאים מייצרי HEK293A. מופע של CPE בעשרה ימים לאחר transfection של 10 5 תאי HEK293A עם 3 ng של וקטור pCAGAdDu לינארית. הלוח השמאלי מציג את התמונה לעומת השלב, הפנל הימני מראה את הקרינה הירוקה.

55/50455fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50455/50455fig4.jpg "/>
איור 4. קביעת כייל של lysates adenovirus על ידי זיהום של תאי A549. A549 10 5 תאים נגועים בנגיף דילול המצוין, טופח במשך 48 שעות ונותחו לביטוי של ה-GFP סמן הזיהום על ידי cytometry הזרימה. מספר תאי GFP החיוביים הוא זמם נגד כמות הנגיף בשימוש. כייל של וירוס חי מחושב מהעקומה הסטנדרטית על פני הטווח ליניארי באמצעות x = 1,000 μl.

איור 5
איור 5. יש 50 אין כל השפעה על כדאיות תא T או בידול Treg תאי T נאיביים מטוהרים מDO11.10 TG - זיהום באדנווירוס פנים של 1; עכברי TG CARΔ1 נדבקו באדנווירוס MOIs שונה.עבור 90 דקות, לשטוף עם PBS ונח במשך 40 שעות במדיום תא T. תאים הופעלו בTreg תנאי הקיטוב עבור 72 שעות. תאים קבועים ומוכתמים נותחו לשילוב של צבע תאים מת (ב), ביטוי של זיהום סמן GFP (א) ושל FOXP3 סמן הבידול (ג). לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 6
איור 6. זיהום אדנווירוס אינו משנה את מצב ההפעלה של תאי T תאי T נאיביים מDO11.10 TG;. CARΔ1 עכברי TG היו נגועים באדנווירוס במשרד פנים של 50 דקות עבור 90 (קווים) או נגוע שמאל (אזורים), נשטפו עם PBS ו נח במשך 40 שעות. תאים נותחו לexpression של סמני הפעלה לפני פנלים (עליונים) ו40 לשעה (לוחות נמוכים) אחרי של הפעלה בתנאי Treg הקיטוב.

איור 7
איור 7. תאי T נאיביים יחסית miR-155 ביטוי יתר לפני ואחרי הפעלת תא T מDO11.10 TG;. עכברי TG CARΔ1 היו נגועים במשרד פנים של 50 עם microRNA-155 (miR-155), או להביע אדנווירוס שליטה, או עזב נגוע. תאים היו אז נחו במשך 40 שעות, הופעלו עבור 40 שעות, או 40 שעות נחו ואחרי הפעלת שעה 40. ביטוי של microRNA-155 נקבע ביחס לSnoRNA202 ידי qPCR.

איור 8
כלומר תאים נגועים) GFP חיוביים בא לידי ביטוי ביחס לשיעור FOXP3 + תאים בתאים שליליים (הלא נגועים) GFP. בידול יחסי שווה 1, אם היה לי גן ביטוי היתר של עניין אין כל השפעה על Treg בידול. ערכים מעל 1 מצביעים על השפעת קידום על בידול, ואילו ערכים מתחת 1 מצביעים על השפעה מעכבת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דור וירוס וטיטרציה

לקבלת תוצאות אופטימליות transfection, האיכות והכמות של וקטור לינארית מופיעות חשוב ביותר. אנו לא צופים השפעה שלילית על ייצור lysate עיקרי מצמיחת יתר ראשונית של התרבות מאז הזיהום ימשיך במהירות ברגע ייצור וירוס יעיל מתרחש. עם זאת, ייצור נגיף על ידי תאי HEK293A יכול להיות מושפע ממוסיף ארוך שמפחיתים את היעילות. כמה מסגרות קריאה פתוחות למעשה נמצאו להפריע לייצור וירוס. בדרך כלל ניתן הצילו מניות נגיפיות אלה באמצעות מספר סיבובים של הגברה, ורק כמה מסגרות קריאה פתוחות נמצאו בקנה אחד עם ייצור וירוס. מניסיוננו, הופעתו של CPE בתוך 48 שעות לאחר הדבקה להגברת וירוס בדרך כלל תניב lysate נגיפי של כ 1 x 09-05 אוקטובר 10 x 10 / מ"ל חלקיקים מזהמים.

זיהום adenoviral של תאי T נאיביים

זיהום adenoviral של תאי T נאיביים אינו משנה את מצב ההפעלה של תאי T לפני ואחרי הגירוי. זה הופך את המערכת לתמרת כלי ניסיוני רב עוצמה ללימוד התמיינות תאי T מTCR-גירוי ראשוני ב. יש לנו קבענו ביטוי יעיל מחוץ לרחם של הגנים של עניין לאחר הדבקה ו'מנוחה 'של תאי T עבור 40 שעות, בזמן שבו התא הוא עדיין תמים ולא מראה סימנים של הפעלה. משמעות הדבר היא כי בעת הפעלת תא T שלאחר מכן, את הגן של עניין כבר overexpressed והוא יכול להפעיל את השפעתה על התמיינות תאי T מההתחלה. לפיכך, יש התמרה adenoviral יתרון ברור על פני electroporation או התמרה retroviral שדורש הפעלה ולהביע את גן של עניין רק לאחר איתות ראשונית TCR 15,28. עם זאת, אם היבטים מאוחרים של בידול יהיה מנותחים והביטוי של הגן של עניין לא נדרש לפני ראשוני תא T Activation, תאי T נאיביים יכולים להיות מגורה וכן מייד לאחר התמרה adenoviral. מאז זיהום adenoviral הוא יעיל מאוד, זה יכול להיות מורחב ללימודי פעילויות משותפות של שני הגנים של עניין על ידי ביצוע זיהומים כפולים עם adenoviruses המבטאים סמני זיהום אחרים, כגון Thy1.1 או hCD2. האחרון הוא גם נגיש למשטח מכתים נוגדן ועשוי לעקוף את הקשיים בשימור סמן בקיבעון. בתאי T מופעלים, לעומת זאת, יש זיהום adenoviral יעילות נמוכה בהרבה, וelectroporation או שיטות תמרת retroviral עשויה להיות חיובית. אזהרה נוספת ליישום אדנווירוס היא הדמות חולפת ביטוי. אדנווירוס נשמר כepisome מחובר למטריצה ​​הגרעינית של התא וידולל כתאי T מתרבים, מה שמוביל לאובדן של ביטוי סמן גנטי בתוך חמישה עד שבעה ימים לאחר הפעלת תא T (מידע לא מוצג;. נ"צ 17). בנוסף, אדנווירוס-transduced תאי readilמוכר Y ובוטל על ידי מערכת חיסון ללא פגע, אשר מגבילה את השימוש בו in vivo, למשל, בניסויי העברת מאמצת של תאי T בעכבר. יישום נוסף פוטנציאל של מערכת adenoviral יכול להיות הזיהום של תאי Treg שבודדו מDO11.10 TG; CARΔ1 עכברי TG ללמוד לתפקד Treg או היבטי יציבות שושלת.

אימות של אפקטי אדנווירוס על תאים נגועים

זיהום אדנווירוס היה יעיל וכמעט שלא השפיע על כדאיות תא T והתמיינות Treg. במשרד פנים של 50, השגנו יעילות הזיהום הטובה ביותר ללא התבוננות השפעות שליליות של זיהום אדנווירוס על תאי T. זה צריך להיות באופן דומה הוקם בכל פעם שהמערכת מיושמת לתרבית תאים או מצב אחרים בידול, בדרך כלל על ידי ניסויים בשימוש בטיטרציה אדנווירוס הריק ללא ביטוי של הגן של עניין. אם זיהום adenoviral ככזה אינו משפיע על התוצאות של הניסוי,ההשוואה של גן של אדנווירוס נושא ריבית עם אדנווירוס הריק היא עדיין מתאימה לחשוף תופעות של הגן הועבר של עניין. במידה ואין השפעה של זיהום adenoviral, הפרמטר שנמדד יכול להיות גם בהשוואה בין תאים נגועים ונגועים באותו המדגם.

ניתוח נתונים

שיטת הקיבוע המתוארת כאן מאפשרת ניתוח בו זמנית של FOXP3 סמן הבידול יחד עם סמן GFP הזיהום, ולכן ניתן לקבוע "בידול יחסי". יש ניתוח זה של שתי אוכלוסיות בתוך דגימה אחת רגישות גבוהה יותר להשפעות עדינות יותר מאוכלוסייה בתפזורת השוואות בין שתי דגימות, שכן הוא לוקח וריאציות לגם כן בחשבון. עם זאת, רק השפעות מהותיות לתאים נגועים תוכרנה על ידי שיטה זו, ואילו השפעות רחבות היטב, השפעות כגון המופעלות על ידי גורם מופרש, היו מוזנחת. בידול יחסי צריך להיות מבוקר בכל אחדניסוי על ידי שליטה כולל תאים נגועים שלא לכלול השפעות של זיהום עצמו על בידול. לקבלת תוצאות אופטימליות, שיעור כמעט שווה להידבק לתאים נגועים בתוך דגימה אחת צריך להיות מכוון ל, בעוד ששיעורי זיהום גבוהים יותר הם חיוביים בהשוואות בין מספר דגימות בתפזורת.

לסיכום, העברת גנים לתוך תאי T נאיביים באמצעות אדנווירוס בשילוב עם פרוטוקולי בידול במבחנה היא מערכת רב עוצמה כדי לחקור את הבסיס המולקולרי של Treg בידול. זה עשוי לאפשר לדור של ידע לנצל את הסובלנות הדומיננטית שמעניקה Tregs בגישות טיפוליות נגד מחלות אלרגיות ומחלות אוטואימוניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגוד העניינים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לLirui דו לבניית וקטור pCAGAdDU ואוליבר גורקה למתן פרוטוקול הקיבעון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix Invitrogen 11791020
PacI New England Biolabs R057S
jetPEI Polyplus-transfection 101-10N
HEK293A Cell Line Invitrogen R705-07
A549 ATCC CCL-185
6-well plates BD Falcon 353046
14 cm tissue culture dish Nunc 168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr Taconic Farms Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II Miltenyi Biotech 130-094-131
DMEM Invitrogen 41966-052
FBS PAN Biotech 1502-P110704
PenStrep Invitrogen 15140-122
RPMI 1640 Lonza BE12-167F
NaPyruvate Lonza BE13-115E
NEAA 100x Lonza BE13-114E
L-Glutamine Invitrogen 25030
HEPES Buffer Solution (1 M) Invitrogen 15630-056
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x) Lonza 13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation Invitrogen 114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1 R&D Systems 240B
Proleukin S (18 x 106IE) Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Invitrogen L-23105
Mouse BD Fc BlockT BD Pharmingen 553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE eBioscience 12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay Roche Applied Biosystems 4427975
LightCycler 480 Probes Master Roche Applied Biosystems 04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Roche Applied Biosystems 4366596

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
  2. Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
  3. Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
  4. Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
  5. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  6. Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
  7. Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
  8. Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
  9. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  10. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  11. Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
  12. Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).
  13. Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
  14. Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).
  15. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).
  16. Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
  17. Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
  18. Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4 (2002).
  19. Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
  20. Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
  21. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
  22. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
  23. Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
  24. Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
  25. Thai, T. -H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
  26. Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
  27. Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
  28. Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).

Tags

אימונולוגיה גיליון 78 ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית רפואה ההנדסה ביו רפואית Bioengineering זיהום גנטיקה מיקרוביולוגיה וירולוגיה לימפוציטים מסוג T לימפוציטים מסוג T מסוג CD4 חיובי תקינה תקינה Adenoviruses אנושית מיקרו RNA אנטיגנים בידול T-לימפוציטים טכניקות העברת גנים התמרה גנטי Transfection adenovirus העברת גנים microRNA ביטוי יתר להפיל תאי T מסוג CD4, תא T רגולטורים וירוס תא זרימה cytometry
התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warth, S. C., Heissmeyer, V.… More

Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation. J. Vis. Exp. (78), e50455, doi:10.3791/50455 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter