Summary
순진 CD4 콕 사키 아데노 바이러스 수용체의 유전자 발현과 T 세포에 아데노 바이러스 유전자 전달은 규제 T 세포 분화의 분자 분석을 가능하게
Abstract
규제 T 세포 (Tregs의)는 자체뿐만 아니라 특정 외국 항원에 대한 면역 내성을 제공하기 위해 필수적입니다. Tregs의는 TGFβ와 IL-2의 존재 TCR과 공동 자극 체외 순진 CD4 T 세포에서 생성 할 수 있습니다. 이 미래의 치료를위한 엄청난 잠재력을지지하지만, 분자 신호 전달 경로 제어 차별은 대부분 알 수 있다고.
기본 T 세포는 자궁외 유전자 발현을 조작하지만, 일반적인 방법은 일차 항원 인식 이전에 T 세포의 가장 중요한 순진 상태를 대상으로 실패 할 수 있습니다. 여기, 우리는 Treg 분화를 유도하기 전에 체외에서 순진 CD4 T 세포의 이소성 유전자를 표현하는 프로토콜을 제공합니다. 그것은 복제 결핍 아데노 바이러스 전달을 적용하고 그 생성 및 생산을 설명합니다. 아데노 바이러스는 대량 삽입 (최대 7 KB) 걸릴 수 있습니다 및 높은 과도 overexp을 달성하기 위해 발기인을 장착 할 수 있습니다T 세포 ression. 그들은 형질 전환 콕 사키 아데노 바이러스 수용체 (CAR)을 표현하면 효과적으로 순진 마우스 T 세포를 transduces. 중요한 것은 감염 후 T 세포가 순진 유지 (CD44 낮은 CD62L 높은)과 휴식 (CD25 - CD69 -)과는 Tregs의에 감염되지 않은 세포와 유사한 활성화하고 차별화 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 처음부터 CD4의 T 세포 분화의 조작을 할 수 있습니다. 그것은 초기 TCR 자극의 초기 신호 이벤트가 결국 차별화를 Treg으로 이어질 세포 변화를 유도 할 때 자궁외 유전자 발현이 이미 보장합니다.
Introduction
Tregs의 면역 관용을 유지하고 지나친 면역 반응을 저해하는 중요합니다. Tregs의는 방관자 T 세포의 활성화를 억제합니다. 따라서, Tregs의의 제거가 활성화 된 T 세포 1에 의해 구동 치명적인자가 면역과 자기 파괴에 이르게한다. Tregs의는 CD4 단일 긍정적 인 전구체의 부정적인 선택시 흉선에서 개발하지만, 그들은 또한 차선의 공동 자극 1,2 낮은 복용량 항원의 자극에 따라 순진 CD4 T 세포에서 주변에 구별 할 수 있습니다. 주변 Tregs의이 용기 나 폐에 내성을 제공 연루되어있다 반면 흉선 Tregs의는 자기 항원에 대한 조직의자가 면역을 억제하는 것 같습니다. 이러한 유도 Tregs의이 유력 음식과 공기, 공생 세균 및 알레르기 3,4에서 환경 항원을 포함하여 점막 외국 항원을 인식 한 후 T 세포의 활성화를 방지합니다. 또한, Tregs의 태아 펩티드에 산모의 허용 오차 5를 구축하고 사전에 중요하다환기 이식편 대 숙주 질환 6. 동시에, Tregs의도 7,8 종양 세포의 면역 감시를 감쇠에 의해 원치 않는 효과를 중재. Tregs의의 특징 기능은 하위 - 지정하는 전사 인자 Foxp3의 필요와 기능 9,10 Treg 부여하기에 충분 포크 헤드 도메인을 포함하는 전사 인자의 표현이다. Foxp3의 발현을 유도 할 수있는 몇 가지 신호 전달 경로가 알려져있다. 하지만, 제어, 규제, 또는 트리거 T 세포 수용체에 대한 응답으로 차별화를 Treg 조절하는 분자 프로세스는 덜 잘 이해하고 있습니다.
Tregs의 매우 효율적으로 TGFβ와 IL-2 (11)의 존재 반대로 CD3와 anti-CD28 항체 순진 CD4 T 세포의 자극을 통해 체외에서 유도 할 수 있습니다. 새로운 Tregs의 생체, Treg 분화를 촉진 분자의 조작에 기능적으로 미래 therapi에 대한 엄청난 잠재력을 품는다ES 예를 들어, 천식 치료, 크론 병, 및 이식 11,12. 반대로, Treg 차별화를 차단하는 분자의 치료 변조 종양 환자의 복합 치료의 향후 접근 방법의 이점을 제공 할 수 있습니다.
체외 분화 분석에서 T 세포 부분 집합의 분화와 관련된 분자 변화에 대한 설명은 쓸모있다. 순간, 검색 또는 제어 T 세포 분화가 자궁외 유전자 발현의 가장 일반적인 방법은 순진 T 세포에서 실패한다는 사실에 의해 방해되는 유전자 제품의 화면으로 실험하려고합니다. 예를 들어, 일렉트로와 레트로 바이러스 전달이 활성화 된 T 세포에만 효과가 있습니다. 초기의 기대, 휴식 세포에서 일반적으로 효과적입니다 렌티 바이러스 전달, 대조적으로 사이토 카인 13만큼 순진 T 세포의 사전 활성화가 필요합니다. 또한, 일렉트로 동안의 cDNA 또는 발현의 전송자체가 T 세포 활성화의 기능을 부여하고 심지어 칼슘 2 + 신호를 동원 할 수 세포막의 탈분극을 포함 하고 NFAT 단백질 (미발표 관찰과 REF. 14) 활성화합니다. 40 시간 - 마찬가지로, 레트로 바이러스 전달을 위해, 순진 T 세포는 18 활성화해야합니다. 이 시간 동안, 세포 분열의 과정에서 핵 막 고장이 발생하고 레트로 바이러스 벡터 15의 후속 게놈 통합 할 수 있습니다. 이러한 방법은 따라서 헬퍼 T 세포 분화의 결정적인 단계이다 항원과 초기 T 세포 발생의 초기 분자 규제를 해결 할 수 없습니다.
아데노 바이러스 전달은 인간의 콕 사키 아데노 바이러스 수용체 (CAR)을 표현하는 인간의 세포 유형의 숫자에 과도 자궁외 유전자 발현을 부여하는 것으로 알려져있다. 그것은 세포 활성화 또는 세포주기의 진행에 대한 요구 사항없이 진행됩니다. C의 표면 발현AR 효율적인 바이러스 부착 및 국제화를 위해 필수적이며, T 세포 특이 적 프로모터에 따라 절단 된 버전 CARΔ1의 유전자 발현 아데노 바이러스 감염 16에 감염 마우스 흉선 세포 및 T 세포를 렌더링하는 발견되었다. 중요한 유전자는 흉선 세포 발달을 변경하지 않거나 순진 CD4의 체외 분화 서로 다른 하위 집합으로 셀 (데이터 표시되지; 심판 17.) 마. T 세포의 아데노 바이러스 - 매개 형질는 이전에 접근 19,20 발현 17,18에 사용되며 노크 다운되었다. 형질 전환 된 T 세포는 시판 DO11.10 TG에서 정제 될 수있다 CARΔ1 TG (코닉, 주식 회사와 REF 17.). 중요한 것은, 아데노 바이러스 전달이 활성화 명백한 증거를 유도하지 않고 순진 T 세포에 대한 관심의 유전자의 고 발현 할 수 있습니다. T 세포는 순진 유지 (CD44 낮은 CD62L 높은)과 휴식 (CD25 - CD69 -) 후 infecti에 비에 감염된 세포와 유사한 Treg으로 활성화하고 차별화 할 수 있습니다.
재조합 아데노 바이러스 생산은 아데노 바이러스 플라스미드 (그림 1) HEK293A 세포의 형질 전환 한 후 얻을 수 있습니다. 이 플라스미드는 일반적으로 복제 무능한 재조합 아데노 바이러스 21을 렌더링 삭제 E1 및 E3 유전자와 인간 유형 5 아데노 바이러스 게놈을 포함합니다. 그들은 전단 아데노 바이러스 (22)의 안정적 통합을 통해 불후의 한으로 HEK293A 세포가 복제 결핍을 보완. 아데노 바이러스 벡터가 큰 (~ 40 KB) 결과적으로 잘 기존의 제한 효소 중재 복제에 적합하지 않습니다 때문에, 우리는 게이트웨이 시스템을 채택했다. 관심의 유전자는 처음에 쉽게 람다 재조합 반응 (LR) 23를 통해 아데노 바이러스를 대상 벡터에 전송 될 수있는 작은 입력 벡터로 복제됩니다. 우리는 pCAGAdDu 벡터를 생성원핵 ccdB 선택 마커 24 측면을 노릴 LR 사이트를 포함하는 발현 카세트 CAG 프로모터 (닭 액틴 프로모터 및 CMV 증강)을 결합하여. 이 발현 카세트 소 성장 호르몬 폴리 (A) 신호를 포함하는 시퀀스 융합 진핵 세포 감염 마커 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 coexpression 수 있도록 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES) 요소가 융합되어 있습니다. 프로토 타입 CMV 프로모터가 매우 활성화에 의존하고 순진 T 세포의 유전자 발현 그러므로 불리한 것으로 발견 된 이후 우리는 CAG CIS 규제 시퀀스를 선택했다.
여기, 우리는 체외 Treg의 분화 효율을위한 프로토콜 및 활성화 (그림 2)하지 않고 순진 CD4 T 세포를 형질 도입하는 방법을 제공합니다. 방법은 자궁외 유전자 발현을 활성화하거나 순진 상태에서 위의 CD4에게 T 세포 분화를 노크. 그것은 overexpresse의 효과를 테스트 할 수 있습니다T 세포 부분 집합의 약속까지 초기 TCR 자극에 따라 초기 신호 이벤트 기간 동안 관심의 D 유전자. 우리의 검증 실험은 Th2 사이토 같은 살전 다른 T 세포 집합, Th9, Th17의, TH22, 또는 TFH 세포의 분화와 비슷한 아데노 바이러스 응용 프로그램을 구축하는 기초를 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 입력 벡터에 관심 유전자의 클로닝
- 입력 벡터로 관심의 유전자를 복제합니다. 국소 이성화 효소 결합 벡터 (예 : pENTR / D-TOPO) 또는 제한 효소 중재 복제이 절차를 사용할 수 있습니다에 무딘 엔드 내고 다음 유전자의 PCR 증폭.
2. pCAGAdDu 대상 벡터에 관심있는 유전자를 전송
- LR 재조합 (예 : 게이트웨이 LR Clonase II 효소 믹스)하여 대상 벡터에 입력 벡터의 관심의 유전자를 전송합니다. 이 아데노 바이러스 발현 벡터 (그림 1)을 생성합니다.
- , PACI 제한 다이제스트에서 아데노 바이러스 발현 벡터의 10 μg을 선형화 DNA를 침전하고 100 μL 당 μg의 농도로 물에 resuspend을. 선형화 V의 복제 및 encapsidation에 필요한 바이러스 거꾸로 반복 (ITR)를 줘라바이러스 입자에 iral DNA.
3. 기본 바이러스 해물의 생성
- 시드 1 개 6 잘 플레이트 잘 하나 2 ㎖ 세포 배양액 10 5 HEK293A 세포 (DMEM 10 % FBS, 5 % PenStrep)와 6의 세포를 배양 - 37 14 시간 10 % ° C CO 2 배양기 그들을 준수 할 수 있도록합니다. 세포는 자랄 때 약 50 %이어야한다.
- Lipofection : 전송 염화나트륨 50 μM, 소용돌이 짧게 94 μL로 jetPEI 시약 6 μL. 소용돌이로 교반하면서 100 ㎕의 선형화 된 아데노 바이러스 벡터의 혼합 용액을 추가하고 15이 형질 혼합 배양 - 실온에서 30 분.
아데노 바이러스 감염에 대한 적절한 바이오 안전성 조건에서 다음의 모든 단계를 수행합니다!
- HEK293A 세포 함유도에 적가 솔루션을 분배하고 37 세포를 품어 ° C와 10 % CO 2. 형광 마커를 사용하는 경우, transfe를 평가시각적 12 후 ction의 효율 - 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 36 시간. 신선한 매체의 0.5 ML 3 일마다 추가합니다.
- 분리하기 시작 확대와 둥근 세포 영역입니다 변성 효과 (CPE)에 대한 빛 또는 형광 현미경을 가진 3 일 - 매 2를 확인합니다. 이 효율적으로 바이러스 생성을 나타내는 것입니다. CPE의 넓은 영역 (그림 3)의 발생에 따라, 그것은 24 소요됩니다 - 72 시간 모든 세포가 감염되기 전에.
- 모든 세포는 CPE의 흔적을 보여 주지만, 세포의 전반적인 박리가 발생하기 전에, 상층와 부드러운 피펫 및 전송 세포 (SN, 3-5 ml)에 의해 세포를 분리 할 때 15 ML의 폴리스티렌 튜브.
- 15 드라이 아이스의 SN에 세포를 동결 - 20 분 파열 세포에 ° C 이후 37 신속하게 해동. 이 동결 및 해동 사이클 (F / TC)를 두 번 더 반복합니다. 일 안에 사용을 위해 얼음에 기본 바이러스 해물을 유지 또는 -80 ° C 장기 저장을 위해 동결. 추가 F/ TC 30에 의해 바이러스 역가를 줄일 수 있습니다 - 50 %.
4. 바이러스 증폭
- 씨와 14 센티미터 조직 배양 접시에 90 %의 합류로 HEK293A 세포를 성장.
- 기본 바이러스 해물 (1.5-2.5 ML)의 절반 세포를 감염 적어도 36 시간 동안 세포를 품어. 거의 모든 세포는 형광 현미경에 의해 결정 될 수있는 다음 감염해야한다. 이미 (더 집중 즉) 증폭 된 바이러스 주식의 재 증폭, 50의 감염의 다중성 (MOI) (6.3 참조) HEK293A를 감염.
- 그들 모두는 CPE를 표시하지만, 분리되기 전 세포를 수확해야한다. 효율적인 바이러스 생산이 상태는 감염 후 48 시간 이내의 거리에 있습니다. (이것은 1 주일까지 소요되는 경우, 4.2에 설명 된 감염에 사용되는 아데노 바이러스 주식의 양을 증가 증폭의 또 다른 라운드를 고려한다.)
- 50 ML의 폴리스티렌 튜브에 부드러운 피펫 및 전송 세포와 SN하여 세포를 분리. 4 10 분 ° C.에 대한 300 XG에서 세포를 스핀 다운
- SN를 제거하고 중간 SN (ca. 1 ML)의 적절한 볼륨 펠렛을 resuspend을.
- 4 ℃에서 15 분 800 XG에서 세포와 원심 분리를 방해하는 3 F / TC를 수행 (집중 바이러스 해물 즉) 바이러스 입자를 포함 SN을 벗고 나누어지는 바이러스 해물은 -80를 저장 ° C.
5. 바이러스 역가 결정
- 씨앗 10 5 A549 세포를 잘 당에 1 ML 매체와 세포가 6 시간 동안 준수하게에 12 잘 플레이트의 5 우물.
- 중간에 시리얼 희석 (1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000)을 수행하고, 잘 당 10 μl를 추가하는 집중 아데노 바이러스 (얼음에 해동) 1 μl를 사용합니다. 유동 세포 계측법에 게이트를 조정 한 잘 감염되지 않은 둡니다.
- 36 시간 후, PBS 및 분리 세포 (예를 들어, 트립신에 의해)로 씻어, SN를 벗어. 생물주의 사항은, 그것은 C를 해결하는 것이 좋습니다10 실온에서 분간 PBS 한 번에 세척을위한 PBS 100 μL 4 % 파라 포름 알데히드의 ELL 학생.
- 감염 마커 표현의 FACS 분석을 수행합니다. 플롯 감염된 세포의 절대 수 (그림 4)에 'μL 바이러스 해물 적용된'. 감염의 선형 범위를 결정하고 X = 1,000 μL를 사용하여 선형 범위의 표준 곡선으로부터 희석 바이러스의 ML 당 역가를 계산합니다.
6. T 세포 감염
- 에서 휴식 / 순진 CD4 T 세포를 분리 DO11.10 TG, MACS (나이브 CD4 + T 세포 분리 키트 II) 또는 FACS는 정렬을 사용하여 CARΔ1 TG 마우스 (CD4 + CD25-CD62L + CD44-).
- 소규모 실험, 96 - 웰 둥근 바닥 플레이트 잘 하나에 MOI 50를 달성하기 위해 바이러스 해물의 적절한 볼륨을 피펫.
- T 세포 배지에 50 μL의 최종 감염 볼륨 (RPMI1640, 10 % FBS, 5 % PenStrep, 5 % NaPyruvate, 1X NEAA, 1X MEM 필수에 4 × 10 5 T 세포를 추가비타민, 1X L-글루타민, 1:250,000 메르 캅토 에탄올, 10 MM HEPES).
예를 들면 :
MOI 50는 3 × 10 5 T 세포를 감염하는 데 사용되어야한다; 바이러스 역가가 3 × 10 9 ML -1
바이러스 양 = MOI X T / 휴대폰 번호 / 바이러스 역가 = 50 × (3 × 10 5) (3 × 10 9 ML -1) = 0.005 ML
참고 : 느슨한 컵 (튜브 당 TP 3 ML까지)와 폴리스티렌 튜브 10 6 순진 T 세포 당 165 μL의 감염 볼륨 MOI 50를 사용하여 큰 세포 수, 규모의 감염.
- 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 90 분 동안 세포를 품어.
- 상온에서 5 분 300 XG에서 세포를 스핀 다운, 200 μl의 PBS에 resuspend을 SN을 벗어. 다시 원심 분리 SN을 벗어.
(선택 사항 : 세포를보다 효율적으로 바이러스를 제거하기 위해 다시 세척 할 수있다)
- 세포를 resuspend200 μL T 세포 자극 항체가없는 및 IL-2 또는 다른 사이토 카인없이 중간 37 40 시간 동안 그들을 나머지 5 % CO 2 배양기에서 ° C가 활성화되기 전에 그 유전자의 발현을 허용합니다.
7. T 세포 활성화 및 편광
- 의 볼륨 항 CD3와 작은 시약 컵에 휴대폰 번호 (예 : 4 × 10 5)에 해당 안티 CD28 결합 비즈를 피펫, PBS의 10 배 볼륨을 추가하고 2 분 동안 자석에 올려 . 상층 액을 취하여 200 μL 편광 매체 구슬 (Tregs의 경우 : T 세포 배지 + 1 NG / ML TGFβ, 100 U / ML IL-2) resuspend을.
참고 : 셀은 또한 안티 CD28 및 안티-CD3 항체로 코팅 조직 배양 접시를 사용하여 활성화 할 수 있습니다, 또는 알부민 323-339 펩타이드 항원 펄스 조사 BALB / C 비장 세포를 사용하여 DO11.10 T 세포 수용체 특정 방식으로합니다.
- Centrifug전자는 이전과 같이 세포를 휴식, 200 포함 μL 편광 중간 항 CD3를 및 안티 CD28 항체 결합 비즈 SN과를 Resuspend 세포를 벗어. 매체를 변경하지 않고 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 72 시간 동안 배양한다.
8. T 세포 고정 및 유동 세포 계측법에 대한 염색
- 세포를 씻으 : 상온에서 5 분 300 XG에서 세포를 스핀 다운, 200 μl의 PBS에 resuspend을 SN을 벗어. 다시 원심 분리 SN을 벗어. 따라서 다음의 모든 세척 단계를 수행합니다.
- 100 μL 고칠 수 죽은 세포 염색 용액에 세포를 resuspend을 4에서 30 분 동안 품어 ° C.
- 세포를 씻으, 100 μL PBS에 resuspend을, PBS, RT에서 부화 15 분에 100 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드를 추가합니다.
- 세포를 씻으, PBS 200 μL 얼음처럼 차가운 70 % 메탄올에서 그들을 resuspend을하고 얼음에 30 분간 배양한다.
참고 : 세포 생물주의하지 않고 지금부터 취급 할 수 있습니다!
- 60 μL의 마스터 믹스 60 μL PBS + 10 ㎍ / ㎖ FC-블록 (불특정 바인딩을 차단하는 안티 FCR3). 준비 세포를 씻어 PBS + 안티 FCR3의 40 μL에서 그들을 resuspend을하고 RT에서 15 분 알을 품다.
- 20 μl를 추가 PBS + 안티 FCR3 1 μg PE-결합 방지 Foxp3의 항체를 포함, ° C 하룻밤 4에 잘 혼합 배양.
- PBS로 두 번 세포를 씻으과 흐름 cytometer에 대한 세포를 분석 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
바이러스 생산
높은 바이러스 역가의 생성의 경우, 기본 바이러스 생산 또는 바이러스 증폭 HEK293A 세포 수확의 타이밍이 중요합니다. 바이러스 생산의 시각적 징후와 대표 형광 및 위상 콘트라스트 이미지는 그림 3에 표시됩니다. CPE는 십일 삽입하지 않고 제어 pCAGAdDu 벡터 HEK293A 세포의 형질 전환 한 후 관찰 하였다. CPE는 감염 마커 GFP의 높은 발현을 분리하고 전시하기 시작 확대와 라운드 업 세포와 영역의 모양을 특징으로하고 있습니다. CPE의 범위는 효율적으로 바이러스 생성을 나타내는 것입니다. 세포 배양과 유사한 CPE는 24 시간 이내에 수확 할 수 있습니다 보여 플레이트 - 72 시간, 그리고 원시 바이러스 해물은 동결 및 융해에 의해 생성 될 수 있습니다. 바이러스 역가은 다음 (그림 4) MOI 같은과 감염의 비교를 할 수 있도록 바이러스 해물 용액을 희석하여 확인할 수 있습니다. 선형 범위를 t그는 회귀 분석 방정식 ML 희석 바이러스 해물 당 전염성 입자의 수를 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 예제에서 x에 대한 역가가 = 1 μL는 30,016,535 μL -1 ≈ 3 × 10 10 ㎖ -1입니다.
T 세포 활성화 및 분화에 아데노 바이러스 감염의 영향을 평가
표적 세포에 아데노 바이러스 전달의 효과는 IRES-GFP를 (그림 5a) 표현 아데노 바이러스 제어 벡터를 사용하여 증가 물기에와 순진 CD4 T 세포를 감염에 의해 평가되었다. 감염 효율은 차별화 Treg 유도 한 후 고정 된 T 세포 샘플에서 72 시간을 GFP 양성 세포를 결정 FACS 분석에 의해 측정 하였다. GFP 양성 세포의 비율은 MOI 감염에 사용이 증가하고 MOI 50에서 84 % 감염에 도달했습니다. MOI를 사용할 때 우리는 감염된 T 세포의 더 높은 백분율을 취득하지 않는 50 (데이터 표시되지 않음)보다 큰. 하지만 infection의 효율은 관심의 유전자에 따라 하나는 일반적으로 MOI 50에서 세포의 50 % 이상을 감염시킬 수 있습니다 다를 수 있습니다. 물기에에 1 ~ 50 세포 생존 능력은 (그림 5b) 영향을받지 않았다. 중요한 것은, Tregs의에 순진 T 세포의 자극과 차별화 감염되지 않은 세포 (그림 5C)에 비해 감염에 유사했다. 아데노 바이러스 전달의 핵심 속성은 T 세포 활성화를 부여하거나 필요없이 순진하고 휴식 T 세포를 감염 할 수있는 기능입니다. 이 T 세포 활성화 (CD25, CD69, CD44)와 함께 또는 아데노 바이러스 감염없이와 5 % CO에서 37 ° C에서 40 시간 동안 휴식 샘플 순진 (CD62L) T 세포의 마커 마커의 분석 분명하다 2 배양기 (그림 6). 체외 T 세포와 활성화 항 CD3-및 안티 CD28 결합 구슬 전에 감염과 감염되지 않은 T 세포는 유사 CD25 낮은 CD69 낮은 CD44 L이었다오우 그러나 그들의 순진과 휴식 상태를 보여 CD62L 고, (그림 6, 상단 패널). T 세포 활성화되면, 감염된 세포는 활성 마커 CD25, CD69 및 감염되지 않은 세포 (그림 6, 하단 패널)에서 거의 구별 CD62L의 downregulation은의 상향 조절을 보여 주었다. 따라서 T 세포의 활성화 상태는 아데노 바이러스 감염에 의해 변경되지 않습니다. 20 % 죽은 세포를 40 시간 휴식없이 활성화 된 후 - 휴식 단계는 10에 비해 성장 요인 또는 크린 시토 킨의 부재로 인해 세포의 60 ~ 70 %,의 손실과 연관됩니다. 3 × 10 5 세포의 초기 세포 수를 선택할 때이 고려되었다.
관심의 유전자의 과발현 수준을 평가
아데노 바이러스 유전자 전달에 의해 달성 발현의 양을 평가하기 위해, 우리는 마이크로 RNA-155 (미르-155) 순진 T 세포에서 발현 수준을 결정하는 모색하는 우리미르 - 155 표현하거나 제어 아데노 바이러스 또는 감염 남았다 감염 다시. 이 성숙한 miRNA는이 순진 T 세포에 적당한 수준에서 표현 강력하게 T 세포 활성화에 유도되기 때문에 우리는 미르-155을 선택했다. 또한, 그것은 T 세포에 의존하는 체액 성 반응 25,26에 중요한 역할을하고 있습니다.
마이크로 RNA 발현의 수준은 qPCR에 의해 평가되었다. 감염 후, 세포를 40 시간 동안 휴식 한 40 시간 동안 활성화되거나 활성화 40 시간 뒤에 40 시간을 휴식. 휴식 40 시간, 미르-155 인코딩 바이러스에 감염된 순진 T 세포는 제어 바이러스 또는 감염되지 않은 세포 (그림 7)에 감염된 세포에 비해 미르 - 155의 약 17 배 과발현을 표시 한 후. 이 거의 범위를 일치 내생 미르-155은 T 세포 활성화 (그림 7 및 REF. 25, 27 장) 후 유도되는합니다. 에 관계없이 세포 미르 - 155 레벨 내생이 강한 유도 미시간에 감염R-155 아데노 바이러스는 여전히 바이러스에 감염된 또는 감염되지 않은 세포를 제어에 비해 활성화시 미르-155의 발현에 4 배 증가를 보여 주었다. 이소성 발현의 관찰 수준은 다른 마이크로 RNA (데이터가 표시되지 않음)에 대한 비교했다. 큰 인서트, 발현이 덜 효과적 일 수도 있습니다.
T 세포 분화 분석
데이터 분석은 여러 가지 방법으로 수행 할 수 있습니다. 제어 세포 (이자의 유전자없이 벡터를 사용하여 감염된 세포)의 같은 GFP 긍정적 게이트의 분화에 비해 관심의 유전자 (감염된 세포 즉)의 GFP 긍정적 게이트 분화의 분석은 상당한 차이를 감지하기에 충분합니다. 그 유전자의 더 미묘한 효과를 연구하기 위해, 우리는 같은 우물 (그림 8)에서 감염되지 않은 세포의 감염 세포의 분화를 비교했다. 이러한 내부 관제사 역할L과는 잘 안에 "상대적으로 차별화"를 계산하기 위해 활용할 수 있습니다. 바이러스가 분화에 영향이없는 경우, "상대적으로 차별화"이상적 일 것입니다. 우리의 손으로 컨트롤 바이러스에 대한 상대적 차별은 0.9 ~ 1.1의 범위를 가지고 있습니다. 상대 차별화는 바이러스에 감염된 샘플을 제어하는 관심에 감염된 샘플을 유전자의 비교에 적용되어야한다.
그림 1. 아데노 바이러스 세대의 도식 표현. 입력 벡터 (pENTR)는 재조합 기증자 사이트 (AttL1, AttL2), 그 측면 유전자를 포함하고 있습니다. 대상 벡터 pCAGAdDu는 E.에서 음의 선택에 대한 독소 CcdB 유전자 측면을 노릴 재조합 대상 사이트 (attr1의, AttR2)를 포함 관심의 유전자에 의해 대체됩니다 대장균,LR 재조합을 통해. 대상 벡터는 복제 결핍 재조합 아데노 바이러스를 생성하기 위해 삭제 된 E1/E3 유전자가없는 사람 5 형 아데노 바이러스 게놈을 포함하고 있습니다. Paci 고무 선형화가 아데노 바이러스 유전자가 감염 생성하는 부담 HEK293A 세포로 형질 전환하기 전에 거꾸로 반복 (ITR)을 줘라 아데노 바이러스 입자의 세포 변성 효과가 결과. 아데노 바이러스는 냉동과 해동 사이클에 의해 생산 세포에서 수확된다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. T 세포 감염과 분화의 개략도. 나이브 T 세포는 PB로 세척, 1.5 시간 동안 아데노 바이러스 해물 감염된 S와 37에서 40 시간 동안 T 세포 매체 ° 5 % CO 2 배양기에서 C에서 휴식. 세포는 다음 TGFβ와 IL-2의 존재에 안티 CD28 및 안티-CD3 항체 결합 구슬을 사용하여 72 시간 동안 활성화되었다. 고정 및 스테인드 세포는 FACS로 분석되었고, 감염된 대 비 감염된 세포에 Foxp3의 발현을 측정 하였다.
그림 3. 변성 선형 pCAGAdDu 벡터의 3 NG 10 5 HEK293A 세포의 형질 다음날 10시 CPE의 아데노 바이러스 생산 HEK293A 세포를. 발생 효과. 왼쪽 패널의 위상 콘트라스트 이미지를 보여줍니다, 오른쪽 패널은 녹색 형광을 보여줍니다.
55/50455fig4highres.jpg "SRC ="/ files/ftp_upload/50455/50455fig4.jpg "/>
그림 4. A549 세포의 감염에 의해 아데노 바이러스 해물의 역가를 결정. 10 5 A549 세포, 표시된 바이러스 희석에 감염된 48 시간 동안 배양 및 유동 세포 계측법에 의한 감염 마커 GFP의 발현을 분석 하였다. GFP 양성 세포의 수는 사용 된 바이러스의 양에 그려집니다. 희석 바이러스의 역가가 X = 1,000 μL를 사용하여 선형 범위의 표준 곡선으로부터 계산됩니다.
그림 5. MOI 1에서 아데노 바이러스 감염 - 50 T 세포의 생존 또는 Treg의 분화에 영향을주지 않습니다 나이브 T 세포는 DO11.10 TG에서 정제, CARΔ1 TG 마우스는 다른 물기에에서 아데노 바이러스에 감염되었다.90 분, PBS로 세척 T 세포 배지에서 40 시간 동안 휴식. 세포는 72 시간 동안 편광 상태를 Treg에서 활성화되었다. 고정 및 스테인드 세포는 죽은 세포 염료의 결합 (B), 감염 마커 GFP (A)와 분화 마커 Foxp3의 (C)의 발현을 분석 하였다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 6. 아데노 바이러스 감염은 T 세포의 활성화 상태를 변경하지 않습니다 DO11.10 TG에서 나이브 T 세포;. CARΔ1 TG 마우스는 90 분 (선) 또는 (지역) 왼쪽 감염에 대한 MOI 50에서 아데노 바이러스에 감염 PBS로 세척 하였다 40 시간 동안 휴식. 세포는 간편 체크인을 분석 하였다활성 마커 전 (상단 패널)와 편광 상태를 Treg의 활성화 후 (아래 패널) 40 시간의 (투약) 소지.
그림 7. .에서 미르 - 155 과발현 이전과 T 세포 활성화 후 상대 나이브 T 세포 DO11.10 TG; CARΔ1 TG 마우스는 마이크로 RNA-155와 MOI 50시 감염 (미르-155) 표현 또는 컨트롤 아데노 바이러스 또는 감염 떠났다. 세포는 다음 40 시간 동안 휴식을 40 시간 동안 활성화 또는 40 시간 활성화 한 다음 40 시간을 휴식했다. 마이크로 RNA-155의 발현을 qPCR에 의해 SnoRNA202를 기준으로 결정되었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
바이러스 생성 및 적정
최적의 형질 결과, 선형화 된 벡터의 질과 양이 가장 중요 나타납니다. 감염이 빠르게 번 효율적인 바이러스 생산이 발생 진행할 것이기 때문에 우리는 문화의 초기 전면에 자라 난의 기본 해물 생산에 부정적인 영향을 관찰하지 않았다. 그러나 HEK293A 세포에 의해 바이러스 생산 효율을 감소 긴 삽입에 의해 영향을받을 수 있습니다. 일부 오픈 읽기 프레임은 실제로 바이러스의 생산을 방해 발견되었다. 이 바이러스 주식은 일반적으로 증폭 여러 라운드를 통해 구조 될 수 있으며, 단 몇 오픈 읽기 프레임은 바이러스 제품과 호환되지 않는 것으로 밝혀졌다. 5 × 10 10 감염성 입자 / ML - 우리의 경험에서, 바이러스 증폭 감염 후 48 시간 이내에 CPE의 모양은 일반적으로 약 1 × 10 9 바이러스 해물을 얻을 것입니다.
나이브 T 세포의 아데노 바이러스 감염
순진 T 세포의 아데노 바이러스 감염은 자극 전후에 T 세포의 활성화 상태를 변경하지 않습니다. 이 전달 시스템의 초기 TCR 자극에서 T 세포 분화 연구를위한 강력한 실험 도구가 있습니다. 셀이 여전히 순진하고 활성화의 징후를 표시하지 않을 때 우리는 효과적인 자궁 감염 후 그 유전자의 발현 시간이 40 시간 동안 T 세포의 '휴식'을 결정했다. 이 이후의 T 세포 활성화 동안 관심의 유전자가 이미 과발현되어 있고 처음부터 T 세포 분화에 미치는 영향력을 행사할 수 있다는 것을 의미합니다. 따라서, 아데노 바이러스 전달은 일렉트로 또는 정품 인증이 필요하고 단지 초기 TCR 신호 15,28 이후 관심의 유전자를 표현하는 레트로 바이러스 전달에 비해 분명한 장점이 있습니다. 분화의 후반 부분을 분석되어야하며, 경우, 그 유전자의 발현은 초기 T 세포 액티브 전에 필요하지 않습니다ATION는 순진 T 세포뿐만 아니라 아데노 바이러스 전달 후 직접 자극 할 수있다. 아데노 바이러스 감염은 매우 효율적이기 때문에, 그러한 Thy1.1 또는 hCD2 같은 다른 감염 마커를 표현하는 아데노 바이러스와 이중 감염을 수행하여 그 두 유전자의 협력 활동을 연구하기 위해 확장 할 수 있습니다. 후자는 또한 항체 표면 염색에 액세스 할 수 있으며 고정하는 동안 마커 보존에 어려움을 피할 수 있습니다. 활성화 된 T 세포에서, 그러나, 아데노 바이러스 감염이 훨씬 낮은 효율을 가지고 있으며, 일렉트로 또는 레트로 바이러스 전달 방법은 유리한 수 있습니다. 아데노 바이러스 응용 프로그램에 대한 또 다른주의해야 할 점은 표현의 과도 문자입니다. 아데노 바이러스는 세포의 핵 매트릭스에 부착 episome로 유지되고 T 세포는 T 세포 활성화 (데이터 표시되지. REF 17) 후 5 ~ 7 일 이내에 마커 유전자 발현의 손실로 이어지는 확산으로 희석 될 것입니다. 또한, 세포가 readil 있습니다 아데노 바이러스 - 형질y는 마우스 T 세포의 입양 전송 실험에서, 예를 들면, 생체 내에서의 사용을 제한하는 손상 면역 체계에 의해 인식 및 제거. 아데노 바이러스 시스템의 또 다른 잠재적 인 응용 프로그램 DO11.10 TG에서 분리 된 Treg 세포의 감염 수 있었다; CARΔ1 TG 마우스는 Treg 기능이나 혈통의 안정성 측면을 연구 할 수 있습니다.
감염된 세포에 아데노 바이러스 효과 검증
아데노 바이러스 감염은 효율적이고 T 세포의 생존과 Treg 차별화에 거의 영향이 없었다. MOI 50에서, 우리는 T 세포에 아데노 바이러스 감염의 부작용을 준수하지 않고 최적의 감염 효율을 얻었다. 이 시스템은 일반적으로 관심의 유전자의 발현없이 빈 아데노 바이러스를 사용하여 적정 실험에 의해 다른 세포 배양 또는 분화 조건에 적용 할 때마다 유사하게 설정해야합니다. 같은 아데노 바이러스 감염은 실험의 결과에 영향을 미치지 않는 경우빈 아데노 바이러스와이자 아데노 바이러스의 유전자의 비교는 여전히 관심의 전송 유전자의 영향을 발견하는 것이 적절하다. 아데노 바이러스 감염의 효과가없는 경우, 측정 매개 변수는 동일한 샘플의 감염과 감염된 세포 사이에 비교 될 수있다.
데이터 분석
여기에 설명 된 고정 방법은 감염 마커 GFP와 함께 분화 마커 Foxp3의의 동시 분석이 가능, '상대 차별화'가 결정될 수 있도록. 이 계정에 잘에 잘 변형 걸리므 하나의 샘플에서 두 집단이 분석은 두 샘플 사이의 대량 인구 비교보다 미묘한 효과에 대한 높은 감도를 가지고 있습니다. 잘 차원 효과, 분비 요인에 의해 가해 예를 들어, 영향은 무시 될 것입니다 반면, 감염된 세포에 내재 만 효과는,이 메소드에 의해 인식됩니다. 상대 차별화 각각 제어해야차별화에 감염 자체의 효과를 제외 제어에 감염된 세포를 포함하여 실험. 높은 감염률 여러 샘플 사이에 일괄 비교에 유리한 동안 최적의 결과를 위해, 하나의 샘플에서 감염되지 않은 세포에 감염의 거의 동등한 속도는을 목적으로해야한다.
체외 분화 프로토콜의 결합 아데노 바이러스를 사용하여 순진 T 세포로 결론 유전자 전달에 차별화를 Treg의 분자 기초를 조사 할 수있는 강력한 시스템입니다. 이 지식의 생성은 알레르기와자가 면역 질환에 대한 치료 적 접근에 Tregs의에 의해 수여 지배적 인 허용을 악용 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이익에 대한 갈등을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 고정 프로토콜의 제공에 pCAGAdDU 벡터와 올리버 고르 카 구축을위한 Lirui 뒤 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| PacI | New England Biolabs | R057S | |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N | |
| HEK293A Cell Line | Invitrogen | R705-07 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 14 cm tissue culture dish | Nunc | 168381 | |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 | |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E | |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Invitrogen | 15630-056 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | |
| MEM Essential vitamin mixture (100x) | Lonza | 13-607C | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation | Invitrogen | 114-56D | |
| Recombinant Human TGF-beta 1 | R&D Systems | 240B | |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | ||
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 | |
| Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 | |
| Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 | |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
References
- Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
- Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
- Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
- Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
- Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
- Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
- Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
- Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).
- Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
- Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).
- Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).
- Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
- Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
- Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4 (2002).
- Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
- Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
- Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
- Thai, T. -H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
- Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
- Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
- Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).
