Summary
Adenoviral genöverföring till naiva CD4 T-celler med transgen uttryck av Coxsackie adenovirus receptor möjliggör molekylär analys av reglerande T-cell differentiering
Abstract
Regulatoriska T-celler (Tregs) är väsentliga för att ge immuntolerans att själv liksom till vissa främmande antigener. Tregs kan genereras från naiva CD4 T-celler in vitro med TCR-och co-stimulering i närvaro av TGFp och IL-2. Det bär en enorm potential för framtida terapier, men de molekyler och signalvägar som styr differentiering är till stor del okända.
Primära T-celler kan manipuleras genom ektopisk genuttryck, men vanliga metoder misslyckas med att rikta den viktigaste naiva tillstånd hos T-cellen före primär antigenigenkänning. Här ger vi ett protokoll för att uttrycka ektopisk gener i naiva CD4 T-celler in vitro innan inducera Treg differentiering. Det gäller transduktion med replikering-adenovirus och förklarar sin generation och produktion. Adenoviruset kan ta upp stora insert (upp till 7 kb) och kan utrustas med promotorer för att uppnå hög och övergående OVEREXPression i T-celler. Den omvandlar effektivt naiva celler mus T om de uttrycker en transgen Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Viktigt efter infektion T-cellerna förblir naiv (CD44 låg, CD62L hög) och vila (CD25 -, CD69 -) och kan aktiveras och differentieras i Tregs liknande icke-infekterade celler. Således möjliggör denna metod manipulation av CD4 T-cell differentiering från dess allra första början. Det garanterar att ektopisk genuttryck är redan på plats när tidiga signalering händelser i det ursprungliga TCR stimulering inducerar cellförändringar som så småningom leder till Treg differentiering.
Introduction
Tregs är avgörande för att bibehålla immun tolerans och att dämpa överskridande immunsvar. Tregs undertrycka bystander T-cellaktivering. Följaktligen leder ablation av Tregs till dödlig autoimmunitet och självförstörelse drivs av aktiverade T-celler 1. Tregs utvecklas i tymus under negativ selektion av CD4 singel-positiva prekursorer, men de kan också skilja i periferin från naiva CD4 T celler vid låg dos antigenstimulering med suboptimal samstimulering 1,2. Thymic Tregs verkar undertrycka vävnad autoimmunitet mot självantigener, medan perifera Tregs har varit inblandade i att ge tolerans i tarm eller lunga. Dessa inducerade Tregs förhindra potent T-cell aktivering efter erkännande av utländska antigener i slemhinnan, inklusive miljömässiga antigener från mat och luft, bakteriefloran, och allergener 3,4. Dessutom Tregs är avgörande för att fastställa moderns tolerans mot foster peptider 5 och att prevent graft-versus-host sjukdom 6. Samtidigt, Tregs medla även oönskade effekter genom dämpning immunövervakning av tumörceller 7,8. Det kännetecknande inslag i Tregs är ett uttryck för den delmängd-ange transkriptionsfaktor Foxp3, en gaffel-head domän innehållande transkriptionsfaktor som är nödvändig och tillräcklig för att ge Treg funktion 9,10. Vissa signalvägar som kan inducera Foxp3 uttryck är kända. Emellertid är de molekylära processer som styr, reglerar, eller modulerar Treg differentiering som svar på T-cellreceptor utlöser mindre väl förstådd.
Tregs kan mycket effektivt induceras in vitro genom stimulering av naiva CD4 T-celler med anti-CD3 och anti-CD28-antikroppar i närvaro av TGFp och IL-2 11. Som den framväxande Tregs är funktionella in vivo, manipulering av molekyler som främjar Treg differentiering bär en enorm potential för framtida therapies, till exempel, vid behandling av astma, Crohns sjukdom, och transplantation 11,12. Omvänt kan terapeutisk modulering av molekyler för att blockera Treg differentiering ger nytta i framtida strategier för kombinerad behandling av tumör patienter.
In vitro differentiering analyser har varit avgörande för att beskriva molekylära förändringar som är förknippade med T-cell delmängd differentiering. Just nu, experimentella försök att söka eller skärm för genprodukter som styr T-cell differentiering försvåras av det faktum att de vanligaste metoderna för ektopisk genuttryck misslyckas i naiva T-celler. Till exempel, elektroporering och retroviral transduktion är endast effektivt i aktiverade T-celler. I motsats till de ursprungliga förväntningarna, lentiviral transduktion, vilket typiskt är effektivt i vilande celler, kräver föraktivering av naiva T-celler genom cytokiner 13. Vidare överföring av cDNA eller mRNA under elektroporationinvolverar depolarisering av plasmamembranet, som själv ger funktioner i T-cellaktivering och kan även mobilisera Ca 2 +-signalering och aktivera NFAT proteiner (opublicerad observation och ref. 14). Likaså för retroviral transduktion, de naiva T-celler måste aktiveras för 18 - 40 tim. Under denna tid sker fördelningen av det nukleära membranet under celldelning och möjliggör efterföljande genomisk integration av retrovirusvektorn 15. Dessa metoder är därför inte kunde behandlas den tidiga molekylära regleringen av initial T-cell möte med antigen, vilket är den avgörande fasen av hjälpar-T-cell-differentiering.
Adenoviral transduktion är känt för att ge övergående ektopisk genuttryck i ett antal humana celltyper som uttrycker den humana Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Det fortsätter utan krav på cell aktivering eller cell-cykel progression. Ytan expression av CAR är nödvändigt för en effektiv virus kvarstad och internalisering, och transgena uttryck för den stympade versionen CARΔ1 enligt en T-cell-specifika promotorn befanns göra mustymocyter och T-celler som är mottagliga för adenovirus infektion 16. Huvudsakligen ändrar transgenen inte tymocyt utveckling eller in vitro differentiering av naiva CD4 T-celler in i olika undergrupper (data visas ej, ref 17.). Adenovirus-medierad transduktion av T-celler har tidigare använts för överuttryck 17,18 och knock-down-strategier 19,20. De transgena T-celler kan renas från kommersiellt tillgänglig DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. och ref 17.). Viktigt ger adenoviral transduktion högt uttryck av en gen av intresse i naiva T-celler utan att inducera tydliga tecken på aktivering. De T-celler förblir naiv (CD44 låg, CD62L hög) och vila (CD25 -, CD69 -) efter Infectipå och kan aktiveras och differentieras i Treg liknande icke-infekterade celler.
Produktion av rekombinanta adenovirus kan uppnås efter transfektion av HEK293A celler med adenovirala plasmider (figur 1). Dessa plasmider innehåller oftast den mänskliga typen 5 adenovirusgenomet med E1 och E3 gener borttagna för att göra rekombinanta adenovirus replikationsinkompetent 21. HEK293A celler kompletterar replikering brist som de har förevigats genom en stabil integration av klippt adenovirus 22. Eftersom adenovirusvektorer är stora (~ 40 kb) och följaktligen inte väl lämpade för traditionell restriktionsenzym-medierad kloning, använde vi Gateway systemet. Genen av intresse initialt klonas in i en mindre inträde vektor, från vilken den lätt kan överföras till den adenovirala vektorn destinationen via lambda rekombinationsreaktion (LR) 23. Vi konstruerade pCAGAdDu vektorgenom att kombinera CAG-promotorn (kyckling aktin promotor och CMV-förstärkare) med en expressionskassett innehållande LR flankerar det prokaryota ccdB selektionsmarkör 24. Denna expressionskassett är fuserad till ett internt ribosominträdesställe (IRES) element som möjliggör samexpression av den eukaryota infektion markör förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP), som är sammansmält med en sekvens innehållande bovint poly tillväxthormon (A)-signalen. Vi valde de CAG cis-regulatoriska sekvenser, eftersom den prototypiska CMV-promotorn befanns vara starkt aktivering-beroende och därför ogynnsamma för genuttryck i naiva T-celler.
Här ger vi ett protokoll för effektiv in vitro Treg differentiering och en metod för att transducera naiva CD4 T-celler utan aktivering (Figur 2). Metoden möjliggör ektopisk genuttryck eller riva föregående CD4 T-cell differentiering på naiva tillståndet. Den tillåter att testa effekten av en overexpressed gen av intresse under tidiga signalering händelser efter initial TCR stimulering tills T-cell delmängd engagemang. Våra validering experiment ger också grunden för att upprätta liknande adenovirus ansökan i differentieringen av andra T-cell undergrupper såsom Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, eller TFH celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Kloning av en gen av intresse i en post Vector
- Klona genen av intresse in i en post vektor. PCR-amplifiering av genen följt av trubbig ände-ligering till en topoisomeras-kopplad vektor (t.ex. pENTR / D-TOPO) eller restriktionsenzym-förmedlad kan kloning användas för detta förfarande.
2. Överföra den intressanta genen in i pCAGAdDu destinationsvektorn
- Överför den intressanta genen från posten vektorn i destinationen vektor av LR rekombination (t.ex. Gateway LR Clonase II Enzyme Mix). Detta kommer att skapa adenovirus expressionsvektorn (Figur 1).
- Linjärisera 10 ^ g av den adenovirala expressionsvektorn i en Pacl restriktionsdigerering, fälla ut DNA och återsuspendera den i vatten vid en koncentration av 3 | ig per 100 | il. Linearization frigör de virala inverterade upprepningar (ITR), som krävs för replikering och inkapsling av viral DNA in i viruspartiklar.
Tre. Generation av Primär Virus Lysate
- Seed 1 x 10 5 HEK293A celler i 2 ml kultur cellmediet (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) i en brunn i en 6-brunnars platta och inkubera cellerna under 6-14 timmar vid 37 ° C i en 10% CO 2 inkubator för att tillåta dem att vidhäfta. Celler bör då vara cirka 50% konfluens.
- Lipofektion: Överföring 6 pl jetPEI reagens i 94 pl 50 iM NaCl, skaka snabbt. Lägg den blandade lösningen till 100 pl linjäriserad adenovirusvektor under virvling och inkubera denna transfektion mix för 15 till 30 min vid rumstemperatur.
Utför alla följande steg under tillämplig biosafety villkoren för adenovirus infektion!
- Fördela lösningen droppvis på HEK293A cell-innehållande brunn och inkubera cellerna vid 37 ° C och 10% CO2. Vid användning av en fluorescens markör, utvärdera transfeInsatser effektivitet visuellt efter 12 till 36 h med ett inverterat fluorescensmikroskop. Tillsätt 0,5 ml av färskt medium var 3 dagar.
- Kontrollera varje 2 - 3 dagar med en ljus eller fluorescens mikroskop för cytopatiska effekter (CPE), som är områden med förstorade och rundade celler som börjar lossna. Detta är ett tecken på effektiv virus generation. Vid förekomst av bredare zoner CPE (Figur 3), kommer det att ta 24 - 72 tim innan alla celler är infekterade.
- När alla celler visar tecken på CPE, men innan en total avlossning av celler inträffar lossa cellerna genom försiktig pipettering och celler överföring med supernatanten (SN, 3 - 5 ml) till en 15 ml polystyrenrör.
- Frys cellerna i SN på torr is under 15-20 min och tina dem snabbt vid 37 ° C efteråt att brista cellerna. Upprepa denna freeze-och-tö-cykeln (F / TC) två gånger. Håll den primära virus lysat på is för användning inom en dag eller frysa den vid -80 ° C för långtidsförvaring. Eventuella ytterligare F/ TC kommer att minska virustitern med 30 - 50%.
4. Virus Amplifiering
- Seed och växa HEK293A celler till 90% sammanflytning på en 14 cm vävnadsodlingsplatta.
- Infektera cellerna med hälften av primärluften viruset lysatet (1,5-2,5 ml) och inkubera cellerna under minst 36 tim. Nästan alla celler bör infekterade då, vilket kan bestämmas genom fluorescensmikroskopi. För re-förstärkning av en redan förstärkt (dvs. mer koncentrerad) virus lager, infektera HEK293A vid en mångfald av infektion (MOI) av 50 (se 6.3).
- Celler bör skördas när alla av dem visar CPE men före avskiljandet. Med effektiv virus produktion detta tillstånd uppnås inom 48 timmar efter infektion. (Om det tar upp till en vecka, överväga en annan runda av förstärkning genom att öka mängden av adenovirus lager som används för infektionen som beskrivs i 4.2.)
- Lossa cellerna genom försiktig pipettering och celler överföring och SN till en 50 ml polystyrenrör. Snurra cellerna ner vid 300 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna SN och återsuspendera pelleten i en lämplig volym av medelhög eller SN (ca 1 ml).
- Utför 3 F / TC att sönderdela cellerna och centrifugera vid 800 xg under 15 minuter vid 4 ° C. Ta av SN som innehåller viruspartiklar (dvs. koncentrerade virus lysat), och delprov viruset lysatet att lagra den vid -80 ° C.
Fem. Virustiter Bestämning
- Seed 10 5 A549-celler per brunn i 5 brunnar i en 12-brunnar i 1 ml medium och låta cellerna fästa under 6 timmar.
- Använd 1 pl koncentrerad adenovirus (tinas på is) för att utföra en seriespädningen medium (1:5000, 1:10000, 1:50000, 1:100,000) och tillsätt 10 ìl per brunn. Lämna en brunn infekterade att justera slussning i flödescytometri.
- Efter 36 timmar, ta av SN, tvätta med PBS och demontera celler (t.ex. genom trypsinisering). För biohazard försiktighetsåtgärder rekommenderas att fixa cells i 100 | il 4% paraformaldehyd i PBS under 10 min vid rumstemperatur och tvätta med PBS en gång.
- Utför en FACS analys av infektion markör uttryck. Plot 'il viral lysat tillämpas "mot det absoluta antalet infekterade celler (Figur 4). Bestäm den linjära skalan för infektion och beräkna titer per ml outspätt virus från standardkurva över det linjära området med x = 1,000 il.
6. T cellinfektion
- Isolera naiva / vilande CD4 T-celler från DO11.10 tg, CARΔ1 Tg möss med MACS (naiva CD4 + T Cell Isolation Kit II) eller FACS sortering (CD4 + CD25-CD62L + CD44-).
- För småskaliga experiment, pipettera en lämplig volym av viralt lysat för att uppnå en MOI av 50 i en brunn i en 96-brunnars rundbottnad platta.
- Lägg upp till 4 x 10 5 T-celler i en slutlig infektion volym av 50 ml i T-cell medium (RPMI1640, 10% FBS, 5% PenStrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM Essentialvitamin, 1x L-Glutamin, 1:250,000 Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
Exempel:
En MOI av 50 skall användas för att infektera 3 x 10 5 T-celler; virustiter är 3 x 10 9 ml -1
Virus volym = MOI x T-cell nummer / virustiter = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 9 ml -1) = 0,005 ml
Obs: för infektion av större cellantal, skala upp med en MOI av 50 i en infektion volym på 165 l per 10 6 naiva T-celler i ett polystyrenrör med lös kupa (upp tp 3 ml per rör).
- Inkubera cellerna för 90 min vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Centrifugera ner cellerna vid 300 xg under 5 minuter vid rumstemperatur, ta av SN, återsuspendera i 200 pl PBS. Centrifugera igen och ta av SN.
(Valfritt: cellerna kan tvättas igen för att ta bort viruset mer effektivt)
- Återsuspendera cellernai 200 ^ T-cell medium utan stimulerande antikroppar och utan IL-2 eller andra cytokiner och vila dem för 40 h vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator för att möjliggöra expression av genen av intresse före aktivering.
7. T-cellsaktivering och polarisation
- Pipettera en volym av anti-CD3-och CD28-kopplade pärlor som är lika med antalet celler (t.ex. 4 x 10 5) i en liten reagens kopp, tillsätt den 10-faldig volym av PBS och lägg dem på en magnet för 2 min . Ta bort supernatanten och suspendera pärlorna i 200 ^ polariserande medium (Tregs: T-cell medium + 1 ng / ml TGF, 100 U / ml IL-2).
Obs: Celler kan även aktiveras med hjälp vävnadskulturskålar belagda med anti-CD28 och anti-CD3-antikroppar, eller i en DO11.10 T-cellreceptor-specifikt sätt med hjälp av bestrålade BALB / c-splenocyter pulserade med ovalbumin 323-339 peptidantigen.
- Centrifuge det vilade celler som tidigare, ta av SN och suspendera cellerna i 200 ^ polariserande medium innehållande anti-CD3-och CD28-antikropp-kopplade pärlor. Inkubera under 72 h vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator utan att ändra medium.
8. T Cell fixering och infärgning för flödescytometri
- Tvätta celler: Spinn ner cellerna vid 300 xg under 5 minuter vid rumstemperatur, ta av SN, återsuspendera i 200 pl PBS. Centrifugera igen och ta av SN. Utför alla följande tvättsteg i enlighet därmed.
- Resuspendera cellerna i 100 | il fixable döda cellfärgning lösning och inkubera under 30 min vid 4 ° C.
- Tvätta celler, återsuspendera i 100 pl PBS, tillsätt 100 | il 4% paraformaldehyd i PBS, inkubera 15 min vid RT.
- Tvätta celler, återsuspendera dem i 200 | il iskall 70% metanol i PBS och inkubera under 30 minuter på is.
Obs: Celler kan behandlas från och med nu utan Biohazard försiktighet!
- Förbered 60 pl master-blandning av 60 | il PBS + 10 | ig / ml Fc-blocket (anti-FCR3 att blockera ospecifik bindning). Tvätta celler, återsuspendera dem i 40 pl PBS + anti-FCR3 och inkubera 15 min vid RT.
- Tillsätt 20 pl PBS + anti-FCR3 innehållande 1 ^ g PE-kopplade antikroppar mot Foxp3 antikropp, blanda väl och inkubera vid 4 ° C över natten.
- Tvätta cellerna två gånger i PBS och analysera celler på en flödescytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virusproduktion
För generering av höga virustitrar, är tidpunkten för HEK293A cellskörd i primär virus produktion eller virusamplifiering avgörande. Representativa fluorescerande och faskontrast bilder med visuella tecken på virus produktion visas i figur 3. CPE observerades 10 dagar efter transfektion av HEK293A celler med en kontroll pCAGAdDu vektorn utan insats. CPE kännetecknas av uppkomsten av områden med förstorade och rund-up celler som börjar lossna och uppvisar hög expression av infektionen markör GFP. Omfattningen av CPE är ett tecken på effektiv virus generation. Cell odlingsplattor visar liknande CPE kan skördas inom 24 - 72 timmar, och en rå virus lysat kan genereras genom frys-och-tö cykler. Den virustiter kan sedan bestämmas genom serieutspädning av viruset lysatet för att tillåta jämförelse av infektioner med en lika MOI (Figur 4). Inom det linjära intervallet, than regressionsanalys ekvation kan användas för att beräkna antalet infektiösa partiklar per ml outspätt virus lysat. I exemplet, titern för x = 1 | il är 30.016.535 il -1 ≈ 3 x 10 10 ml -1.
Utvärdera effekterna av adenovirusinfektion på T-cell aktivering och differentiering
Effekterna av adenovirus transduktion på målceller har utvärderats genom att infektera naiva CD4 T-celler med ökande MOI med en adenoviral styrvektor som endast uttrycker IRES-GFP (Figur 5a). Infektionen effektivitet mättes genom FACS-analys bestämma GFP-positiva celler i fasta T cellprover 72 timmar efter induktion av Treg differentiering. Frekvensen av GFP-positiva celler ökade med MOI användes för infektion och nådde 84% infektion med ett MOI på 50. Vi erhåller inte mycket högre procentsatser av infekterade T-celler vid användning MOI större än 50 (data ej visade). Även InfeInsatser effektivitet kan variera beroende på den intressanta genen, kan ett typiskt infektera mer än 50% av cellerna vid ett MOI av 50. Vid MOIs mellan 1 och 50 cellviabiliteten inte påverkades (figur 5b). Huvudsakligen var stimuleringen och differentieringen av naiva T-celler in tregs liknande i den infekterade jämfört med de icke-infekterade celler (fig 5c). En viktig egenskap hos adenovirus transduktion är dess förmåga att infektera naiva och vilande T-celler utan att ge eller kräva T-cell aktivering. Detta är uppenbart från en analys av markörer för T-cellaktivering (CD25, CD69, CD44) och markören av naiva (CD62L) T-celler i prover med eller utan adenovirusinfektion och vila under 40 timmar vid 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator (Figur 6). Före in vitro T-cell aktivering med anti-CD3-och CD28-kopplade pärlor, var infekterade och icke-infekterade T-celler liknande CD25 låg, CD69 låg och CD44 Low men CD62L hög, visar deras naiva och vilotillstånd (Figur 6, övre paneler). Vid T-cellaktivering, visade de infekterade cellerna uppreglering av aktiveringen markörer CD25, CD69 och nedreglering av CD62L nästan omöjlig att skilja från icke-infekterade celler (fig 6, nedre fälten). Således är aktiveringsstatus av T-celler inte förändras av adenovirusinfektion. Den vilofasen är associerad med förlusten av 60-70% av cellerna på grund av frånvaron av tillväxtfaktorer eller cytokiner, jämfört med 10 - 20% döda celler 40 h efter aktivering utan att vila. Detta togs med i beräkningen när man väljer det initiala cellantalet av 3 x 10 5 celler.
Utvärdera Överexpression nivå av en gen av intresse
För att utvärdera mängden överuttryck uppnås genom adenoviral genöverföring, sökte vi att bestämma microRNA-155 (MIR-155) uttrycksnivåer i naiva T-celler som vire infekterade med miR-155-uttryckande eller kontroll adenovirus eller lämnades infekterade. Vi valde miR-155 eftersom denna mogna miRNA uttrycks på måttliga nivåer i naiva T-celler och blir starkt induceras vid T-cell aktivering. Dessutom har det en avgörande roll i T-cell-beroende humorala svar 25,26.
Nivån av microRNA överuttryck utvärderades med qPCR. Efter infektion fick cellerna vila under 40 h, som aktiverats för 40 h, eller vilade 40 h följt av 40 h av aktivering. Efter 40 h vila, de naiva T-celler infekterade med miR-155 kodar viruset visade en ungefär 17-faldigt överuttryck av MIR-155 jämfört med celler infekterade med kontrollvirus eller icke-infekterade celler (fig 7). Detta nästan matchade den utsträckning i vilken den endogena miR-155 induceras efter T-cellaktivering (fig. 7 och ref. 25,27). Oavsett detta starka induktion av den endogena miR-155 nivåer, celler infekterade med miR-155 adenovirus visade fortfarande ca fyra-faldig ökning i uttryck av MIR-155 vid aktivering jämfört med kontroll virusinfekterade eller icke infekterade celler. Den observerade nivån av ektopisk överexpression var jämförbar för andra microRNAs (data ej visade). Observera att för stora insatser, kan överuttryck vara mindre effektiva.
Analys av T-celldifferentiering
Den dataanalys kan utföras på flera sätt. Analys av differentiering i GFP positiva styret hos en gen av intresse (dvs. i de infekterade celler) jämfört med differentiering i samma GFP positiva porten av kontrollceller (infekterade celler med användning av en vektor utan gen av intresse) är tillräckligt för att upptäcka väsentliga skillnader. För att studera mer subtila effekter av en gen av intresse, har vi jämförde differentieringen i infekterade celler med den hos icke-infekterade celler från samma brunn (Figur 8). Dessa tjänar som en intern control och kan utnyttjas för att beräkna den "relativa differentiering" inuti en brunn. Om ett virus har ingen effekt på differentiering kommer "relativa differentiering" helst vara 1. Den relativa differentiering för kontroll viruset i våra händer har en räckvidd på 0,9 till 1,1. Relativ differentiering bör endast tillämpas för att jämföra gen-intresse-infekterade prover för att kontrollera virus-infekterade prover.
Figur 1. Schematisk representation av adenovirus generation. Entry vektorer (pENTR) innehåller rekombinationsställena donor (AttL1, attL2), vilka flankerar en gen av intresse. Destinationen vektor pCAGAdDu innehåller rekombinationsställena mål (attr1, attR2) flankerar genen toxin CCDB för negativ selektion i E. coli, som ersätts med genen av intressegenom LR rekombination. Destinationen vektorn innehåller också en mänsklig typ 5 adenovirusgenomet utan E1/E3 gener, som har tagits bort för att generera replikationsdefekt rekombinanta adenovirus. PacI linjärisering frigör inverterade upprepningar (ITR) innan transfektion in HEK293A celler som bär de adenovirusgener att generera smittsamt adenoviruspartiklar som resulterar i cytopatiska effekter. Adenovirus skördas från producerande celler genom frysning-och-tö cykler. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Schematisk representation av T-cell-infektion och-differentiering. Naiva T-celler infekterades med ett adenovirus lysat i 1,5 h, tvättades med PB S och vilade i T-cell-medium under 40 h vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. Cellerna aktiverades sedan under 72 timmar med användning av anti-CD28 och anti-CD3-antikropp-kopplade pärlor i närvaro av TGFp och IL-2. Fasta och färgade celler analyserades med FACS, och uttrycket av Foxp3 i infekterade respektive icke-infekterade celler bestämdes.
Figur 3. Cytopathic effekten av adenovirus-producerande HEK293A celler. Förekomst av CPE på dag tio efter transfektion av 10 5 HEK293A celler med 3 ng lineariserad pCAGAdDu vektor. Den vänstra panelen visar bilden faskontrast, visar den högra panelen grön fluorescens.
55/50455fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50455/50455fig4.jpg "/>
Figur 4. Fastställande titern av adenovirus lysat genom infektion av A549-celler. 10 5 A549-celler infekterades med det angivna viruset utspädning, inkuberades under 48 h och analyserades med avseende på uttryck av infektionen markör GFP genom flödescytometri. Antalet GFP-positiva celler är avsatt mot den använda mängden virus. Titern av outspädd virus beräknas från standardkurvan över det linjära området med x = 1000 | il.
Figur 5. Adenovirus infektion med ett MOI på 1-50 har ingen effekt på T-cell-livskraft eller Treg differentiering naiva T-celler renades från DO11.10 tg; CARΔ1 tg möss infekterades med adenovirus vid olika MOIs.under 90 min, tvättades med PBS och vilade under 40 timmar i T-cell-medium. Celler aktiverades i Treg polariserande betingelser under 72 timmar. Fasta och färgade celler analyserades för inkorporering av döda celler färgämne (b), uttryck av infektionen markör GFP (a) och differentieringsmarkör Foxp3 (c). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 6. Adenovirus infektion ändrar inte aktiveringsstatus av T-celler Naiva T-celler från DO11.10 tg,. CARΔ1 tg möss infekterades med adenovirus med ett MOI på 50 under 90 min (linjer) eller vänster oinfekterade (områden), tvättades med PBS och vilade under 40 timmar. Celler analyserades för expression av aktiveringsmarkörer före (övre fält) och efter (lägre paneler) 40 tim av aktivering i Treg polariserande förhållanden.
Figur 7. . Relativa miR-155 överuttryck före och efter T-cellaktivering Naiva T-celler från DO11.10 tg; CARΔ1 tg möss infekterades med ett MOI på 50 med microRNA-155 (MIR-155)-uttryckande eller kontroll adenovirus, eller lämnas uninfected. Celler fick sedan vila under 40 h, som aktiverats för 40 h, eller vilade 40 h följt av 40 h aktivering. Uttryck av mikroRNA-155 bestämdes relativt SnoRNA202 av qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virus Generation och titrering
För optimala transfektion resultat, kvalitet och mängd linjäriserad vektor verkar viktigast. Vi observerade inte negativa effekter på primär lysate produktion från en initial överväxt av kulturen eftersom smittan kommer snabbt vidare när effektiv virus produktionen sker. Däremot kan virusproduktion genom HEK293A celler påverkas av långa skär som minskar effektiviteten. Vissa öppna läsramar faktiskt funnit att störa virus produktion. Dessa virala lager kan normalt räddas genom flera omgångar av förstärkning, och endast några öppna läsramar befanns vara oförenlig med virus produktion. Från vår erfarenhet, kommer utseendet på CPE inom 48 timmar efter infektion för virusamplifiering ger vanligtvis en viral lysat av ca 1 x oktober 09-05 x 10 10 infektiösa partiklar / ml.
Adenoviral Infektion av naiva T-celler
Adenoviral infektion av naiva T-celler ändrar inte aktiveringen status av T-celler före och efter stimulering. Detta gör transduktion systemet ett kraftfullt experimentell verktyg för att studera T-cell differentiering från initial TCR-stimulering på. Vi har bestämt effektiv ektopisk uttryck av gener av intresse efter infektion och "vila" av T-celler för 40 timmar, vid en tidpunkt när cellen är fortfarande naiv och inte visar tecken på aktivering. Detta innebär att under den efterföljande T-cellaktivering, är genen av intresse redan överuttryckt och kan utöva sitt inflytande över T-cell differentiering från början. Således har adenoviral transduktion en klar fördel jämfört med elektroporering eller retroviral transduktion som kräver aktivering och uttrycka en gen av intresse först efter initial TCR signalering 15,28. Men om sena aspekter av differentiering skall analyseras och uttryck av genen av intresse inte krävs innan första T-cell aktivation, kan naiva T-celler samt stimuleras direkt efter adenoviral transduktion. Eftersom adenovirus infektion är mycket effektiv, kan det utökas till att studera samarbetet i två gener av intresse genom att utföra dubbla infektioner med adenovirus som uttrycker andra infektion markörer såsom Thy1.1 eller hCD2. Det senare är också tillgänglig för antikroppar yta färgning och kan kringgå svårigheter markör konservering under fixeringen. I aktiverade T-celler har emellertid adenoviral infektion en mycket lägre effektivitet, och elektroporering eller retrovirala metoder transduktion kan vara gynnsamma. En annan varning för adenovirus ansökan är den övergående karaktär uttryck. Adenovirus bibehålls som en episom fäst till den nukleära matrisen av cellen och kommer att spädas såsom T-celler föröka sig, vilket leder till förlust av markörgenuttryck inom fem till sju dagar efter T-cellaktivering (data ej visade,. Ref 17). Dessutom, adenovirus-transducerade celler är readily erkännas och elimineras genom ett intakt immunsystem, vilket begränsar dess användning in vivo, t ex i adoptiv överföring experiment av T-celler i musen. En annan potentiell tillämpning av den adenovirala system kan vara infektion av Treg celler isolerade från DO11.10 tg, CARΔ1 Tg-möss för att studera Treg funktion eller härstamning aspekter stabilitet.
Validering av Adenovirus Effekter på infekterade celler
Adenovirus infektion var effektiva och hade nästan ingen påverkan på T-cell-livskraft och Treg differentiering. Vid en MOI av 50, erhöll vi den bästa infektionseffektivitet utan iakttagande av negativa effekter av adenovirusinfektion på T-celler. Detta måste på liknande sätt fastställas när systemet tillämpas på andra cellodling eller differentiering tillstånd, typiskt genom titrering experiment som använder tomma adenovirus utan uttryck av genen av intresse. Om det adenovirala infektionen som sådan påverkar resultatet av experimentet,jämförelse av genen av räntebärande adenovirus med tomma adenovirus är fortfarande lämpligt att avslöja effekterna av den överförda genen av intresse. Om det inte finns någon effekt av adenoviral infektion, kan den uppmätta parametern också jämföras mellan oinfekterade och infekterade celler av samma prov.
Data Analysis
Fixeringen här beskrivna metoden medger samtidiga analysen av differentieringsmarkör Foxp3 tillsammans med infektionen markör GFP, så ett "relativt differentiering" kan bestämmas. Denna analys av två populationer inom ett prov har högre känslighet för subtila effekter än bulkpopulation jämförelser mellan två prover, eftersom det tar väl till såväl variationer i beaktande. Men endast effekter inneboende till infekterade celler erkännas av denna metod, medan väl breda effekter, t.ex. påverkan som utövas av en utsöndrad faktor, skulle försummas. Relativ differentiering bör kontrolleras i varjeexperiment genom att ta kontroll-infekterade celler för att utesluta effekter av infektionen på differentiering. För bästa resultat bör en nästan lika stor andelen smittade till icke-infekterade celler i ett prov eftersträvas, medan högre infektion klassar är gynnsamma i bulk jämförelser mellan flera prover.
Sammanfattningsvis genöverföring till naiva T-celler med adenovirus kombinerat med in vitro differentiering protokoll är ett kraftfullt system för att utreda den molekylära grunden för Treg differentiering. Detta kan göra det möjligt att generera kunskap för att utnyttja den dominerande tolerans följer av Tregs i terapeutiska metoder mot allergiska och autoimmuna sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Lirui Du för att konstruera pCAGAdDU vektor och Oliver Gorka för tillhandahållande av fixeringen protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| PacI | New England Biolabs | R057S | |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N | |
| HEK293A Cell Line | Invitrogen | R705-07 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 14 cm tissue culture dish | Nunc | 168381 | |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 | |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E | |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Invitrogen | 15630-056 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | |
| MEM Essential vitamin mixture (100x) | Lonza | 13-607C | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation | Invitrogen | 114-56D | |
| Recombinant Human TGF-beta 1 | R&D Systems | 240B | |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | ||
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 | |
| Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 | |
| Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 | |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
References
- Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
- Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
- Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
- Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
- Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
- Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
- Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
- Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).
- Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
- Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).
- Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).
- Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
- Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
- Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4 (2002).
- Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
- Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
- Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
- Thai, T. -H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
- Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
- Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
- Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).
