Summary
ナイーブCD4コクサッキーアデノウイルス受容体のトランスジェニック発現とT細胞へのアデノウイルス遺伝子導入は、制御性T細胞分化の分子解析を可能に
Abstract
制御性T細胞（Tregの）自己にと同様、特定の外来抗原に対する免疫寛容を提供することが不可欠です。 Tregのは、TGFβとIL-2の存在下でのTCRと共刺激を用いたin vitroにおけるナイーブCD4 T細胞から生成することができる。これは、将来の治療のための巨大な潜在力を負担するが、制御分化その分子とシグナル伝達経路は不明な点が多い。
一次T細胞を異所性遺伝子発現を介して操作するが、一般的な方法は、一次抗原認識の前にT細胞の最も重要なナイーブ状態を標的に失敗することができる。ここでは、Tregの分化を誘導する前に、ナイーブCD4における異所性遺伝子のin vitroでのT細胞を表現するためのプロトコルを提供する。これは、複製欠損アデノウイルスで形質導入を適用し、その生成と生産を説明します。アデノウイルスは、大規模な挿入（最大7キロバイト）を取ることができ、高いと過渡overexpを達成するためにプロモーターを装備することができますT細胞におけるression。それらは、トランスジェニックコクサッキーアデノウイルス受容体（CAR）を発現する場合、それは効果的にナイーブマウスのT細胞を伝達する。重要なのは、感染後のT細胞はナイーブ（CD44 低 、CD62L 高い ）と安静時のまま（CD25 - 、CD69 - ）と非感染細胞に類似したTregに活性化し、分化させることができる。したがって、この方法は、初めからCD4 T細胞分化の操作を可能にする。これは、初期のTCR刺激の初期シグナル伝達事象が結局Tregの分化につながる細胞の変化を誘導するとき。その異所性遺伝子発現が既にあることを保証
Introduction
Tregは、免疫寛容を維持し、シュート免疫応答を抑制することが重要である。 Tregのは、バイスタンダーT細胞活性化を抑制する。これにより、Tregのアブレーションは、活性化T細胞1により駆動致命的な自己免疫および自己破壊につながる。 Tregのは、CD4シングルポジティブ前駆体の負の選択時に胸腺で開発が、彼 らはまた、次善の共刺激1,2と低用量の抗原刺激によるナイーブCD4 T細胞から周囲に区別することができます。周辺Tregのが腸や肺の許容範囲を提供することに関与しているのに対し、胸腺Tregのは、自己抗原に対する組織の自己免疫を抑制するように見える。これらの誘導されたTregは強力に食品や空気からの環境抗原、共生細菌、およびアレルゲン3,4含む粘膜における外来抗原の認識後にT細胞活性化を防ぐ。また、Tregのは5胎児のペプチドに母性寛容を確立すると、事前に重要であるベント移植片対宿主病6。同時に、Tregはまた、7,8腫瘍細胞の免疫監視を減衰させることによって不要な効果を媒介する。 Tregの特徴的な機能は、サブセット指定型転写因子Foxp3は、必要かつ機能9,10 Treg細胞を付与するのに十分であるフォークヘッドドメイン含有転写因子の表現である。 Foxp3の発現を誘導することができるいくつかのシグナル伝達経路が知られている。制御、調節、またはトリガするT細胞受容体に応答してTreg細胞分化を調節はあまり理解されているが、分子プロセス。
Tregのは非常に効果的にTGFβとIL-2の存在下で、11抗CD3および抗CD28抗体を用いたナイーブCD4 T細胞の刺激を介してin vitroで誘導することができる。新興Tregのは、生体内で機能しているように、Tregの分化を促進する分子の操作は、将来のための巨大な潜在力therapiを負担エス、例えば、喘息、クローン病、および移植11,12の治療。逆に、Tregの分化を阻止する分子の治療的変調は、腫瘍患者の併用治療の将来のアプローチにおいて利点を提供することができる。
in vitroでの分化アッセイにおいて T細胞サブセットの分化に関連付けられている分子の変化の説明については、尽力してきました。現時点では、検索や制御性T細胞の分化は、異所性遺伝子発現の最も一般的な方法は、ナイーブT細胞で失敗するという事実によって妨げられていることを遺伝子産物をスクリーニングするための実験的な試み。例えば、エレクトロポレーションおよびレトロウイルス形質導入は、活性化T細胞でのみ有効です。当初の予想、休止細胞において、通常効果的であるレンチウイルス形質導入、とは対照的に、サイトカイン13によりナイーブT細胞のプレ活性化が必要です。さらに、エレクトロポレーション時のcDNAまたはmRNAの移転それ自体がT細胞活性化の特徴を付与してものCa 2 +シグナル伝達を動員することができる形質膜の脱分極を含む とNFATタンパク質（未発表の観察とref 14）活性化する。 40時間 - 同様に、レトロウイルス形質導入のために、ナイーブT細胞が18のために活性化されなければならない。この間、細胞分裂の過程で核膜の崩壊が発生し、レトロウイルスベクター15のその後のゲノムに統合することができます。これらのメソッドは、したがって、ヘルパーT細胞分化の決定的な段階である抗原との初期T細胞出会い、初期の分子の規制に対処することはできません。
アデノウイルス形質導入は、ヒトコクサッキーアデノウイルス受容体（CAR）を発現するヒト細胞型の数の一時的な異所性遺伝子発現を付与することが知られている。それは、細胞の活性化または細胞周期の進行を必要とせずに進行する。 Cの表面発現ARは、アデノウイルス感染16の影響を受けやすく、マウス胸腺細胞とT細胞をレンダリングするために発見されたT細胞特異的プロモーターの下で効率的なウイルスの添付ファイルとナリ、と切り捨てバージョンCARΔ1のトランスジェニック発現に必須である。重要なのは、導入遺伝子は胸腺細胞の開発を変更したり、ナイーブCD4 のin vitroでの分化の異なるサブセットにT細胞（示されていないデータ。REF 17） ではありません。 T細胞のアデノウイルス媒介形質導入は、以前に過剰発現17,18とノックダウンアプローチ19,20のために使用された。トランスジェニックT細胞は、市販のDO11.10 TGから精製することができる;CARΔ1TG（タコニック社とref 17）。重要なのは、アデノウイルス形質導入は活性化の明らかな兆候を誘発することなく、ナイーブT細胞での目的遺伝子の高発現を可能にします。 T細胞は、ナイーブなまま（CD44 低 、CD62L 高い ）と休息（CD25 - 、CD69 - ）の後infecti上と非感染細胞に類似Treg細胞に活性化し、分化させることができる。
組換えアデノウイルスの製造は、アデノウイルスプラスミド（図1）HEK293A細胞のトランスフェクション後に達成することができる。これらのプラスミドは通常複製無能な組換えアデノウイルス21をレンダリングするために削除されたE1およびE3遺伝子と人間の5型アデノウイルスゲノムを含んでいます。彼らはせん断アデノウイルス22の安定した統合により不死化されたとしてHEK293A細胞が複製欠乏を補完する。アデノウイルスベクターは、大（〜40キロバイト）、その結果、十分に伝統的な制限酵素媒介クローニングに適していないので、我々は、ゲートウェイシステムを採用。目的の遺伝子は、最初に、簡単にラムダ組換え反応（LR）23を介して宛先アデノウイルスベクターに転送することができ、そこから小さいエントリーベクターにクローニングされる。我々はpCAGAdDuベクトルを構築し原核CCDB選択マーカー24に隣接LR部位を含む発現カセットでCAGプロモーター（ニワトリアクチンプロモーター及びCMVエンハンサー）を組み合わせることにより。この発現カセットは、ウシ成長ホルモンポリAシグナルを含有する配列に融合される真核生物の感染症マーカー強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）の共発現を可能にする内部リボソーム侵入部位（IRES）エレメントに融合される。原型CMVプロモーターがナイーブT細胞における遺伝子発現のための非常に活性化に依存するので、不利であることが見出されたので、我々は、CAGシス調節配列を選んだ。
ここで、我々は、in vitro Tregの分化と活性化（図2）ことなく、ナイーブCD4 T細胞を形質導入する方法で効率的にするためのプロトコルを提供します。方法は、異所性遺伝子発現を可能にしたり、素朴な状態で前のCD4のT細胞分化をノックダウン。それはoverexpresseの効果を試験することができT細胞サブセットのコミットメントまで初期のTCR刺激により早期にシグナル伝達事象の間に利害のD遺伝子。当社の検証実験もTh2のようなTh1細胞など他のT細胞サブセット、チューブ内径、Th17細胞、Th22、またはTFH細胞の分化における類似のアデノウイルスアプリケーションを確立するための基礎を提供する。
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Protocol
1。エントリーベクターへの目的遺伝子のクローニング
- エントリーベクターに目的の遺伝子のクローンを作成します。トポイソメラーゼ結合ベクター（ 例えば、pENTR / D-TOPO）、または制限酵素媒介によるクローニングに平滑末端ライゲーション、続いて遺伝子のPCR増幅は、この手順のために使用することができる。
2。 pCAGAdDuのデスティネーションベクタに目的の遺伝子を転送
- LR組換え（ 例えばゲートウェイLRクロナーゼII酵素ミックス）によるデスティネーションベクタにエントリーベクターから目的の遺伝子を転送します。これは、アデノウイルス発現ベクター（図1）を作成します。
- DNAを沈殿させるのPacI制限消化、中にアデノウイルス発現ベクター10μgのを線形化し、100μl当たり3μgのの濃度で水に懸濁します。線形は、Vの複製とキャプシドに必要とされるウイルスの逆方向反復（ITR）は、解放ウイルス粒子にDNA iral。
3。プライマリウイルス溶解物の生成
- シード1 6ウェルプレートの1ウェルに2ミリリットル細胞培養培地（DMEM、10％FBS、5％PenStrep）のx 10 5 HEK293Aセルおよび6細胞をインキュベート- 37℃で14時間°10％Cそれらが付着することを可能にするCO 2インキュベーター。細胞はその後、密集度約50％であるべきである。
- リポフェクション：転送のNaCl 50μM、渦短時間の94μlのにjetPEI試薬の6μlの。ボルテックスしながら100μlの線形化されたアデノウイルスベクターへの混合溶液を加え、15のために、このトランスフェクション混合インキュベート - 室温で30分。
アデノウイルス感染症のための適切なバイオセーフティの条件の下で、以下のすべての手順を実行します！
- HEK293Aセル含有十分に滴下してソリューションを分注し、37℃で細胞をインキュベート℃、10％CO 2。蛍光マーカを使用する場合は、transfeを評価視覚的に12後ction効率 - 倒立蛍光顕微鏡を用いて36時間。 3日ごとに新鮮な培地を0.5mlを加える。
- デタッチし始める拡大と丸みを帯びた細胞を用いた領域である細胞変性効果（CPE）、のための光や蛍光顕微鏡で3日間 - 毎に2をチェックします。これは、効率的なウイルスの生成を示す。全ての細胞が感染される前に72時間- CPEの広範なゾーン（図3）が発生すると、それが24になります。
- すべてのセルは、CPEの兆しを見せたが、細胞の全体的な剥離が発生する前に、（SN、3 - 、5ml）を上清と穏やかにピペッティングし、転送細胞によって細胞を剥離すると15ミリリットルのポリスチレンチューブに。
- 15ドライアイスでSNで細胞を凍結 - 20分と破裂細胞℃にその後37℃ですばやく解凍。この凍結と融解サイクル（F / TC）をさらに2回繰り返します。日以内の使用のために氷の上で主要なウイルス溶解物を維持するか-80℃で長期保存のためにそれを凍結。任意の追加F/ TCは30でウイルス力価が減少します - 50％。
4。ウイルス増幅
- シードと14センチメートルの組織培養皿に90％コンフルエントになるまでHEK293A細胞を成長させる。
- 主要なウイルス溶解物の半分（1.5〜2.5ミリリットル）で細胞に感染し、少なくとも36時間、細胞をインキュベートする。ほぼ全ての細胞を蛍光顕微鏡により決定することができるし、感染されるべきである。すでに（より濃縮IE）増幅ウイルスストックの再増幅のため、50の感染多重度（MOI）（6.3参照）でHEK293Aに感染。
- それらのすべてがCPEを示しますが、剥離前時に細胞を回収しなければならない。効率的なウイルス産生と、この状態は、感染後48時間以内に到達する。 （それは一週間程かかる場合には、4.2で説明感染に使用アデノウイルスストックの量を増やすことによって増幅の別のラウンドを考えてみましょう。）
- 50ミリリットルのポリスチレンチューブに穏やかにピペッティングし、転送細胞とSNにより細胞を切り離す。 4℃で10分、300×gで、細胞をスピンダウン
- SNを取り外し、培地またはSN（ 約 1ml）を適切な音量でペレットを再懸濁します。
- 4℃で15分間、800×gで細胞や遠心分離機を破壊する3 F / TCを実行（濃縮ウイルスライセートをIE）のウイルス粒子が含まれているSNを脱いで、そしてアリコートウイルス溶解物は-80℃で、それを格納するために℃の
5。ウイルス力価測定
- 、1mlの培地中12ウェルプレートのウェルに5シードウェルあたり10 5 A549細胞を、細胞が6時間密着させ。
- 培地で段階希釈を実行するために集中アデノウイルスの1μlの（氷上で解凍）を使用してください（1:5,000、1:10,000、1:50,000、1:100,000）とウェルあたり10μLを加える。フローサイトメトリーでゲートを調整する一つがよく感染していないままにしておきます。
- 36時間後、PBSとデタッチ細胞（ 例えばトリプシン処理によって）で洗って、SNを脱ぐ。バイオハザード予防のために、Cを固定することをお勧めしますPBS 1時間室温と洗浄で10分間PBSで100μlの4％パラホルムアルデヒドでエルボ。
- 感染マーカー発現のFACS分析を実行します。プロット感染細胞の絶対数（図4）に対して'μlのウイルス溶解液を適用'。感染の直線範囲を決定し、X = 1,000μLを用いた線形範囲で標準曲線から原液ウイルス1ml当たり価を計算します。
6。 T細胞感染
- から休息/ナイーブCD4 T細胞を単離DO11.10 TG; MACS（ナイーブCD4 + T CellアイソレーションキットII）またはFACS、ソートを使用してCARΔ1Tgマウス（CD4 + CD25-CD62L + CD44-）。
- 小規模の実験のために、96ウェル丸底プレートの1ウェル中にMOI 50を達成するために、ウイルス溶解物の適切な量をピペット。
- T細胞培地（RPMI1640、10％FBS、5％PenStrep、5％NaPyruvate、1×NEAA、必須1×MEM中の50μlの最終感染量で4×10 5 T細胞まで追加ビタミン、1×L-グルタミン、1:250,000メルカプトエタノール、10mMのHEPES）。
例：
MOI 50は3×10 5個のT細胞を感染するために使用しなければならない。 ウイルス力価は、3×10 9ミリリットル-1で
ウイルス量= MOI X T細胞数/ウイルス力価= 50×（3×10 5）/（3×10 9ミリリットル-1）= 0.005ミリリットル
注：より大きい細胞数の感染、スケール緩いカップポリスチレンチューブ（最大チューブあたりTP 3ml）中10 6ナイーブT細胞あたり165μLの感染量でMOI 50のを使って。
- 5％CO 2インキュベーター内で37℃で90分間細胞をインキュベート。
- 室温で5分間300 xgで細胞をスピンダウンし、200μlのPBSに再懸濁し、SNを脱ぐ。再び遠心し、SNを脱ぐ。
（オプション：細胞がより効率的にウイルスを削除するには、再度洗浄してもよい）
- 細胞を再懸濁し200μlのT細胞を刺激抗体がなく、IL-2又は他のサイトカインを含まない培地で37℃で40時間のためにそれらを休ませ、5％CO 2インキュベーター内°Cは、起動する前に、目的の遺伝子の発現を可能にする。
7。 T細胞の活性化と偏光
- 体積抗CD3および小試薬カップに細胞数（ 例えば、4×10 5）に等しい抗CD28結合ビーズをピペットで、PBSの10倍量を加え、2分間磁石の上に置く。上清を脱いで、200μlの偏培地（Tregのために：T細胞培地+ 1 ngの/ mlでのTGFβ、100 U / mlのIL-2）でビーズを再懸濁します。
注：細胞を、抗CD28及び抗CD3抗体で被覆された組織培養皿を用いて活性化することができる、またはオボアルブミン323-339ペプチド抗原をパルス照射されたBALB / cの脾臓細胞を用いDO11.10 T細胞受容体特異的である。
- Centrifugeは前と同じように、細胞を休ませ、200μlの偏光を含む培地抗CD3を、抗CD28抗体結合ビーズにSN再懸濁した細胞を脱ぐ。媒体を変えることなく、5％CO 2インキュベーター内で37℃で72時間インキュベートする。
8。フローサイトメトリー用のT細胞固定と染色
- 細胞を洗浄：200μlのPBSに再懸濁し、SNを脱いで、室温で5分間300 xgで細胞をスピンダウン。再び遠心し、SNを脱ぐ。それに応じて、以下のすべての洗浄の手順を実行します。
- 100μlの固定可能な死細胞の染色液で細胞を再懸濁し、4℃で30分間インキュベート℃で
- 細胞を洗浄し、100μlのPBSに再懸濁し、PBS、室温でインキュベートし、15分で100μlの4％パラホルムアルデヒドを追加します。
- 細胞を洗浄し、PBSで200μlの氷冷70％メタノール中で再懸濁し、氷上で30分間インキュベートする。
注：細胞をバイオハザード予防せず、今から治療することができます！
- 60μlのPBS + 10μgの/ mlのFcをブロック（非特異的結合をブロックする抗FCR3）60μlのマスターミックスを調製する。細胞を洗浄し、PBS +抗FCR340μlの再懸濁し、室温で15分間インキュベートする。
- 1μgのPE-結合抗Foxp3の抗体を含有するPBS +抗FCR3の20μlを添加し、よく混合し、°Cで一晩4℃でインキュベートする。
- PBSで細胞を2回洗浄し、フローサイトメーターで細胞を分析する。
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Representative Results
ウイルス産生
高いウイルス力価の生成のために、主要なウイルス産生やウイルス増幅HEK293A細胞収穫のタイミングが非常に重要です。ウイルス産生の視覚的徴候を描写蛍光及び位相コントラスト像を図3に示す。 CPEが10日インサートなしの対照pCAGAdDuベクターによる細胞のトランスフェクションHEK293A後に観察された。 CPEは、感染マーカーGFP高発現をデタッチし、展示を開始した拡大とラウンドアップセルを持つ分野の出現によって特徴付けられる。 CPEの程度は、効率的なウイルスの生成を示す。細胞培養と同様のCPEが24内に収穫することができる表示プレート - 72時間、そして生のウイルス溶解物を凍結と融解サイクルによって生成することができる。ウイルス力価は、その後等しいMOI（図4）による感染の比較を可能にするために、ウイルス溶解物の連続希釈によって決定することができる。直線範囲、T内彼回帰分析式を加え希釈していないウイルス溶解物当たり感染性粒子の数を計算するために使用することができる。この例では、xに対する力価= 1μLは≈3×10 10ミリリットル-1 30016535μlの-1です。
T細胞の活性化と分化に対するアデノウイルス感染の影響を評価
標的細胞上のアデノウイルス形質導入の効果は、IRES-GFPを（図5a）を発現するアデノウイルス対照ベクターを用いて増加するとMOIでナイーブCD4 T細胞に感染させることにより評価した。感染効率は、固定されたT細胞サンプル中のTreg細胞の分化を誘発後72時間をGFP陽性細胞を判定するFACS分析によって測定した。 GFP陽性細胞の割合は、感染に使用MOIを増加し、MOI 50で84％の感染に達した。 MOIを使用した場合、我々は、感染T細胞の非常に高い割合を取得しない50（データは図示せず）よりも大きい。もののINFEction効率が関心のある遺伝子に応じて変わる場合があり、一方は、典型的にはMOI 50で細胞の50％以上に感染することができる。 MOIでで1〜50の細胞生存率は（図5b）は影響を受けませんでした。重要なのは、TregのにナイーブT細胞の刺激と分化、非感染細胞（図5c）に比べて感染で同様であった。アデノウイルス伝達の重要な性質は、T細胞活性化を付与するか、または必要とすることなく、ナイーブと休息T細胞に感染する能力である。これは、アデノウイルス感染の有無にかかわらず、T細胞の活性化（CD25、CD69、CD44）、およびサンプル中（CD62L）ナイーブT細胞のマーカーのマーカーの解析から明らかと37℃で40時間休んで℃、5％COでC 2インキュベーター（図6）。 in vitroで T細胞による活性化抗CD3および抗CD28結合ビーズで前に、感染及び非感染T細胞は、CD25、同様に低い 、 低い CD69およびCD44 リットルであったOWが、そのナイーブと静止状態を実証CD62L 高い 、（図6、上段パネル）。 T細胞の活性化されると、感染した細胞は、活性化マーカーCD25、CD69と非感染細胞（図6、下のパネル）から、ほとんど見分けがつかないCD62Lのダウンレギュレーションのアップレギュレーションを示した。これにより、T細胞の活性化状態は、アデノウイルス感染によって変更されない。休憩なしで40時間活性化した後、20％の死細胞 - 休止期が10と比較して、増殖因子またはサイトカインの不存在に起因する細胞の60〜70％の損失に関連付けられている。 3×10 5細胞の初期細胞数を選択するときに考慮されていた。
目的の遺伝子の過剰発現レベルの評価
アデノウイルス遺伝子導入によって達成さ過剰発現量を評価するために、我々は、マイクロRNA-155（MIR-155）ナイーブT細胞における発現レベルを決定しようとした我々のmiR-155発現または対照アデノウイルスに感染したり、感染していない残っていた再。この成熟miRNAは、ナイーブT細胞の緩やかなレベルで発現されており、強力にT細胞の活性化によって誘導されるようになるので、私たちは、のmiR-155を選びました。さらに、T細胞依存性体液性応答25,26において重要な役割を有している。
microRNAの過剰発現のレベルは、定量PCRにより評価した。感染後、細胞を、40時間撹拌した休ま40時間活性化し、または活性化の40時間、続いて40時間を休ま。安静時の40時間後、のmiR-155符号化ウイルスに感染したナイーブT細胞は、対照ウイルスまたは非感染細胞（図7）を感染させた細胞と比較したmiR-155の約17倍の過剰発現を示した。これは、ほぼ一致した内因性のmiR-155程度はT細胞活性化（図7とref。25,27）の後に誘導される。かかわらず、マイルに感染内因のmiR-155のレベル、細胞のこの強力な誘導R-155アデノウイルスは依然としてウイルス感染または非感染細胞を対照と比較して起動時のmiR-155の発現の4倍の増加を示した。異所過剰発現の観察されたレベルは、他のマイクロRNA（データは示さず）と同等であった。大型インサートのため、過剰発現はあまり効果的である場合がありますのでご注意ください。
T細胞分化の解析
データ分析は、いくつかの方法で行うことができる。対照細胞（目的の遺伝子なしでベクターを用いて感染細胞）の同じGFP 正のゲートにおける分化と比較して、関心のある遺伝子（ すなわち感染細胞）のGFP 正のゲートにおける分化の分析は、実質的な相違を検出するのに十分である。対象の遺伝子のより微妙な影響を研究するために、我々は同じウェル（図8）から非感染細胞のそれと感染細胞における分化を比較した。これらは、内部のcontroとして役立つlおよび内側はよく "相対分化"を計算するために利用することができる。ウイルスが分化に影響を及ぼさない場合には、 "相対的な分化は、"理想的には1となる。私たちの手でコントロールウイルスの相対的な分化が0.9〜1.1の範囲を持っています。相対的な分化は唯一ウイルスに感染したサンプルを制御するために、関心感染サンプル遺伝子のを比較に適用する必要があります。
図1。アデノウイルス生成の概略図。エントリーベクター（pENTR）は組換えドナー部位（AttL1、AttL2）、関心の側面遺伝子を含む。デスティネーションベクタpCAGAdDuはE.でネガティブ選択のための毒素CCDB遺伝子に隣接する組換え標的部位を（ATTR1、ATTR2）が含まれています目的の遺伝子によって置き換えられた大腸菌 、LR組換えを通じて。デスティネーションベクターは、複製欠損組換えアデノウイルスを生成するために削除されたE1/E3遺伝子なしで人間の5型アデノウイルスゲノムを含んでいます。 のPacI線形はアデノウイルス遺伝子が感染生成する負担HEK293A細胞へのトランスフェクション前に反転反復（ITR）を解放アデノウイルス粒子の細胞変性効果でその結果。アデノウイルスは、凍結と融解サイクルによって産生細胞から収穫されています。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。 T細胞の感染および分化の概略図。ナイーブT細胞は、PBで洗浄し、1.5時間アデノウイルス溶解物を感染させた Sとは、37℃で40時間、T細胞培地℃、5％CO 2インキュベーター内でC言語で休んだ。次いで、細胞をTGFβとIL-2の存在下で、抗CD28及び抗CD3抗体結合ビーズを用いて72時間活性化した。固定および染色した細胞をFACSによって分析した、感染と非感染細胞におけるFoxp3の発現を測定した。
図3。線形化pCAGAdDuベクトルの3 ngのと10 5 HEK293A細胞のトランスフェクションの翌日10時CPEのアデノウイルスを産HEK293A細胞の細胞変性効果は発生。左側のパネルは、位相コントラスト画像を示し、右パネルは、緑色蛍光を示している。
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図4。 A549細胞の感染によってアデノウイルス溶解物の力価を決定する。10 5 A549細胞を、指示されたウイルス希釈で感染48時間インキュベートし、フローサイトメトリーによる感染マーカーGFPの発現について分析した。 GFP 陽性細胞の数は、使用されるウイルスの量に対してプロットされる。希釈していないウイルスの力価は、X = 1,000μLを用いた線形範囲で標準曲線から計算されます。
図5。 MOI 1におけるアデノウイルス感染- 50は、T細胞生存率又はTreg細胞の分化に影響を及ぼさなかっ tgのDO11.10から精製されたナイーブT細胞;CARΔ1Tgマウスは、異なるMOIでアデノウイルスで感染させた。90分間、PBSで洗浄し、T細胞培地中で40時間休ま。細胞を72時間偏光状態をTreg細胞で活性化した。固定および染色された細胞は死細胞色素の取り込み（b）に示すように、感染症マーカーGFP の（a）と分化マーカーFoxp3の（C）の発現について分析した。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図6。アデノウイルス感染T細胞の活性化状態を変更しない DO11.10 tgのよりナイーブT細胞;。CARΔ1Tgマウスは、90分（ライン）又は（領域）左未感染のためのMOI 50でのアデノウイルスに感染したPBSで洗浄し、 40時間休んだ。細胞をexpreについて分析した前活性化マーカーのssion（上パネル）と後（下のパネル）偏光条件をTreg細胞における活性化の40時間。
図7。 。からのmiR-155の過剰発現前とT細胞の活性化後の相対的なナイーブT細胞DO11.10 TG;CARΔ1Tgマウスは、マイクロRNA-155とMOI 50で感染された（のmiR-155）発現や制御アデノウイルス、または感染していないままに。次いで、細胞を、40時間休ま40時間アクティブに、または40時間の活性化に続いて40時間を休ませた。マイクロRNA-155の発現を定量PCRによってSnoRNA202に対して決定された。
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Discussion
ウイルスの生成と滴定
最適なトランスフェクションの結果を得るためには、線状化ベクターの質と量は、最も重要な表示されます。効率的なウイルス産生が発生すると感染症を迅速に進めていきますので、我々は文化の初期の異常増殖からプライマリーライセート生産にマイナスの効果を観察しませんでした。しかし、HEK293A細胞によるウイルス産生効率を低下させる長いインサートの影響を受けることができる。いくつかのオープンリーディングフレームは、実際にはウイルス産生を妨害することが見出された。これらのウイルス株は、典型的には、増幅のいくつかのラウンドを介して救出することができ、少数のオープンリーディングフレームは、ウイルス産生と互換性があることが見出された。 5×10 10感染性粒子/ mlの-私たちの経験から、ウイルスの増幅のための感染後48時間内にCPEの外観は典型的には、約1×10 9個のウイルスの溶解液が得られます。
ナイーブT細胞のアデノウイルス感染
ナイーブT細胞のアデノウイルス感染は、刺激前と後のT細胞の活性化状態を変更しない。これは、伝達系の初期のTCR刺激からT細胞分化を研究するための強力な実験的なツールになります。私たちは、細胞がまだナイーブで、活性化の兆しを見せていない時に、40時間のためのT細胞の '休息'感染後に目的の遺伝子を効率的に異所性発現を決定しました。これにより、後続のT細胞活性化の間に、関心のある遺伝子が過剰発現されており、すでに最初からT細胞分化に及ぼす影響を及ぼすことができることを意味する。したがって、アデノウイルス形質導入はエレクトロポレーションまたはアクティベーションを必要とし、唯一の初期TCRシグナリング15,28の後に目的の遺伝子を表現するレトロウイルス形質導入上の明確な利点を持っています。しかし、分化の後期の態様を分析しなければならず、目的遺伝子の発現は、最初のT細胞ACTIV前に必要とされていない場合ATIONは、ナイーブT細胞は、同様に直接アデノウイルス形質導入後に刺激することもできる。アデノウイルス感染は非常に効率的であるので、そのようなThy1.1又はhCD2のような他の感染のマーカーを発現するアデノウイルス二重感染を行うことにより、目的の2つの遺伝子の協力活動を研究するために拡張することができる。後者はまた、抗体の表面染色にアクセス可能であり、定着時にマーカ保存に困難を回避することができる。活性化T細胞では、しかし、アデノウイルス感染ははるかに低い効率を有し、エレクトロポレーション又はレトロウイルス形質導入法は良好であってもよい。アデノウイルスアプリケーションのもう一つの注意点は、式の過渡文字です。アデノウイルスは、細胞の核マトリックスに付着エピソームとして維持され、T細胞は、T細胞の活性化（データは示されていない。参照17）を後5〜7日以内にマーカー遺伝子の発現の喪失につながる、増殖して希釈される。さらに、アデノウイルス形質導入細胞はreadilあるyはマウスにおけるT細胞の養子移入実験では、例えば、in vivoでのその使用を制限する無傷の免疫系によって認識され、除去。アデノウイルスシステムのもう一つの潜在的なアプリケーションは、DO11.10 TGから分離されたTreg細胞への感染である可能性があります。CARΔ1TgマウスはTregの機能または系統の安定性の側面を研究する。
感染細胞にアデノウイルス効果の検証
アデノウイルス感染は、効率的であり、T細胞生存率およびTregの分化にほとんど影響を及ぼさなかった。 MOI 50で、我々はT細胞上のアデノウイルス感染の影響を観察することなく、最高の感染効率が得られた。このシステムは、典型的には対象の遺伝子の発現せずに空のアデノウイルスを用いた滴定実験により、他の細胞または分化培養条件に印加されたときと同様に確立されなければならない。などのアデノウイルス感染症は、実験の結果に影響しない場合空のアデノウイルスによる有利子アデノウイルスの遺伝子を比較すると、依然として関心の導入遺伝子の影響を明らかにすることが適切である。アデノウイルス感染の効果がない場合は、測定されたパラメータはまた、同一サンプルを感染および感染細胞との間で比較することができる。
データ解析
ここで説明した固定方法は、感染マーカーGFPと共に分化マーカーのFoxp3の同時分析を可能にする、の相対的な分化は '決定することができるので。それを考慮にウェル間のばらつきがかかるためつのサンプル内の2つの集団のこの分析は、2つのサンプル間のバルク集団の比較より微妙な影響に対する高い感度を有する。よく広い効果、分泌因子によって及ぼされる影響などが、無視することだろうがしかし、感染した細胞に固有の唯一の効果は、この方法で認識されます。相対的な分化は、それぞれに制御されなければならない分化に感染自体の影響を除外するためにコントロールに感染した細胞を含むことによって実験。高い感染率は、いくつかのサンプル間の一括比較で有利であるしながら最適な結果を得るためには、一つのサンプル内で感染していない細胞に感染するのとほぼ同等の速度は、を目指しすべきである。
結論として、 インビトロ分化プロトコルにおけると組み合わせアデノウイルスを用いたナイーブT細胞への遺伝子導入は、Treg細胞分化の分子基盤を調査するための強力なシステムである。これは知識の世代は、アレルギーや自己免疫疾患に対する治療的アプローチでTregのによって与え支配寛容性を悪用する可能性があります。
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Disclosures
著者らは、利害の対立を宣言しません。
Acknowledgments
著者は固定プロトコールの提供pCAGAdDUベクトルとオリバーゴルカを構築するためLirui杜に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| PacI | New England Biolabs | R057S | |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N | |
| HEK293A Cell Line | Invitrogen | R705-07 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 14 cm tissue culture dish | Nunc | 168381 | |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 | |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E | |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Invitrogen | 15630-056 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | |
| MEM Essential vitamin mixture (100x) | Lonza | 13-607C | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation | Invitrogen | 114-56D | |
| Recombinant Human TGF-beta 1 | R&D Systems | 240B | |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | ||
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 | |
| Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 | |
| Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 | |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
References
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