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Immunology and Infection

La transducción adenoviral de células T CD4 + naïve a estudiar la diferenciación Treg

doi: 10.3791/50455 Published: August 13, 2013

Summary

Adenoviral la transferencia génica en células T con la expresión transgénica del receptor de adenovirus Coxsackie ingenuo CD4 permite el análisis molecular de la diferenciación de células T reguladoras

Abstract

Las células T reguladoras (Treg) son esenciales para proporcionar la tolerancia inmune a auto, así como a ciertos antígenos extraños. Tregs puede ser generada a partir ingenuas CD4 en las células T in vitro con TCR-y co-estimulación en presencia de TGF y la IL-2. Esto tiene un enorme potencial para las terapias futuras, sin embargo, las moléculas y vías de señalización que la diferenciación de control son en gran parte desconocidos.

Las células T primarias se pueden manipular a través de la expresión del gen ectópico, pero los métodos comunes no atacan el estado ingenua más importante de la célula T antes del reconocimiento al antígeno primario. Aquí, ofrecemos un protocolo para expresar genes ectópicos de células T naive CD4 in vitro antes de inducir la diferenciación de Treg. Se aplica la transducción con el adenovirus de replicación deficiente y explica su generación y producción. El adenovirus puede tardar hasta grandes inserciones (hasta 7 kb) y se puede equipar con los promotores para lograr una alta y transitorios Sobreexpresión en las células T. Se transduce eficazmente las células T de ratones ingenuos si expresan un receptor de adenovirus Coxsackie transgénico (CAR). Es importante destacar que, después de la infección las células T permanecen ingenua (CD44 bajo, CD62L alta) y en reposo (CD25 -, CD69 -) y se pueden activar y diferenciarse en células T reguladoras similares a las células no infectadas. Por lo tanto, este método permite la manipulación de la diferenciación de células T CD4 desde sus inicios. Se asegura de que la expresión del gen ectópico ya está en su lugar cuando los eventos de señalización temprana de la estimulación inicial TCR induce cambios celulares que finalmente conducen a la diferenciación de Treg.

Introduction

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Tregs son cruciales para mantener la tolerancia inmunológica y para amortiguar la respuesta inmune rebasamiento. Treg suprimen la activación de células T espectador. En consecuencia, la ablación de células T reguladoras conduce a la autoinmunidad fatal y la autodestrucción impulsado por las células T activadas 1. Desarrollar células T reguladoras en el timo durante la selección negativa de células CD4-positivas precursores sola, pero también puede diferenciar en la periferia de las células T naive CD4 tras la estimulación de antígeno con dosis baja subóptima 1,2 co-estimulación. Tímico células T reguladoras parece suprimir la autoinmunidad tejido contra antígenos propios, mientras que periférica células T reguladoras han sido implicados en el suministro de la tolerancia en el intestino o el pulmón. Estos inducida por células T reguladoras potentemente prevenir la activación de células T tras el reconocimiento de los antígenos extraños en la mucosa, incluyendo antígenos ambientales de los alimentos y el aire, las bacterias comensales, y los alérgenos 3,4. Además, células T reguladoras son cruciales para establecer la tolerancia materna a la fetal péptidos 5 y preventilación de la enfermedad de injerto contra huésped 6. Al mismo tiempo, células T reguladoras también median efectos no deseados mediante la atenuación de la vigilancia inmune de las células tumorales 7,8. La característica más distintiva de células T reguladoras es la expresión del subconjunto-especificando Foxp3 factor de transcripción, un factor de transcripción que contiene el dominio tenedor-cabeza que es necesario y suficiente para conferir función 9,10 Treg. Se sabe que algunas vías de señalización que pueden inducir la expresión de Foxp3. Sin embargo, los procesos moleculares que controlan, regulan o modulan Treg diferenciación en respuesta a la activación del receptor de células T son menos conocidos.

Tregs puede ser inducida de manera muy eficaz in vitro a través de la estimulación de las células T ingenuas CD4 con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en la presencia de TGF y la IL-2 11. A medida que el Tregs emergentes son funcionales in vivo, la manipulación de moléculas que promueven la diferenciación Treg lleva un enorme potencial para el futuro therapies, por ejemplo, el tratamiento del asma, la enfermedad de Crohn, y el trasplante 11,12. Por el contrario, la modulación terapéutica de las moléculas para bloquear la diferenciación de Treg puede proporcionar beneficio para futuros enfoques de tratamiento combinado de pacientes con tumores.

En ensayos de diferenciación in vitro han sido instrumentales para la descripción de los cambios moleculares que están asociados con T diferenciación subconjunto de células. Por el momento, los intentos experimentales para buscar en pantalla o para los productos de genes que controlan la diferenciación de células T se ve obstaculizada por el hecho de que los métodos más comunes de la expresión génica ectópico no en las células T vírgenes. Por ejemplo, la electroporación y la transducción retroviral sólo son eficaces en las células T activadas. En contraste con las expectativas iniciales, la transducción lentiviral, que es normalmente eficaz en las células en reposo, requiere pre-activación de las células T ingenuas por citocinas 13. Además, la transferencia de ADNc o ARNm durante la electroporaciónimplica la despolarización de la membrana plasmática, que a su vez confiere características de activación de células T e incluso puede movilizar Ca 2 + señalización y activar las proteínas NFAT (observaciones no publicadas y ref. 14). Del mismo modo, para la transducción retroviral, las células T vírgenes tienen que activarse para 18 - 40 horas. Durante este tiempo, la ruptura de la membrana nuclear en el curso de la división celular se produce y permite la integración genómica posterior del vector retroviral 15. Estos métodos por lo tanto no son capaces de hacer frente a la temprana regulación molecular de encuentro de células T con el antígeno inicial, que es la fase decisiva de la diferenciación de células T ayudante.

Transducción adenoviral es conocido para conferir expresión génica ectópica transitoria en un número de tipos de células humanas que expresan el receptor de adenovirus Coxsackie humano (CAR). Se procede sin requisito para la activación de las células o la progresión del ciclo celular. La expresión en la superficie de CAR es esencial para la fijación del virus y la internalización eficiente, y la expresión transgénica de la versión truncada CARΔ1 bajo un promotor de células T específica fue encontrado para hacer timocitos de ratón y células T susceptibles a la infección adenoviral 16. Es importante destacar que, el transgén no altera desarrollo de los timocitos o en la diferenciación in vitro de células T CD4 + naïve en diferentes subconjuntos (datos no mostrados; 17 ref.). Adenovirus mediada por la transducción de las células T se utilizó anteriormente para la sobreexpresión 17,18 y knock-down enfoques 19,20. Las células T transgénicas pueden purificarse a partir comercialmente disponible DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. y 17 ref.). Es importante destacar que, transducción adenoviral permite una alta expresión de un gen de interés en células T vírgenes sin inducir signos evidentes de activación. Las células T permanecen ingenua (CD44 baja, CD62L alta) y descanso (CD25 -, CD69 -) después infectien y se puede activar y diferenciado en Treg similares a las células no infectadas.

La producción de adenovirus recombinantes se puede lograr después de la transfección de las células con plásmidos HEK293A adenovirales (Figura 1). Estos plásmidos contienen típicamente el genoma del adenovirus tipo 5 humano con genes E1 y E3 eliminados para hacer que los adenovirus recombinantes de replicación incompetente 21. Células HEK293A complementan la deficiencia de replicación, ya que han sido inmortalizados a través de la integración estable de adenovirus cortado 22. Desde vectores adenovirales son grandes (~ 40 kb) y por lo tanto no es apropiado para la enzima de restricción mediada por clonación tradicional, empleamos el sistema de puerta de enlace. El gen de interés se clonó inicialmente en un vector de entrada más pequeña, de la que se pueden transferir fácilmente en el vector adenoviral de destino a través de reacción de recombinación lambda (LR) 23. Hemos construido el vector pCAGAdDumediante la combinación del promotor CAG (promotor de actina de pollo y el potenciador de CMV) con un casete de expresión que contiene sitios LR que flanquean el marcador de selección ccdB procariota 24. Este casete de expresión está fusionado a un sitio de entrada interna del ribosoma (IRES) elemento que permite la coexpresión de la proteína eucariota infección marcador verde fluorescente mejorada (eGFP), que está fusionado a una secuencia que contiene la hormona de crecimiento bovino poli (A)-señal. Elegimos los CAG cis-secuencias reguladoras, ya que se encontró que el promotor de CMV prototípico para ser altamente dependiente de la activación y por lo tanto, desfavorable para la expresión génica en las células T vírgenes.

Aquí, proporcionamos un protocolo para la eficiente en la diferenciación de Treg in vitro y un método para transducir células naive T CD4 sin activación (Figura 2). El método permite la expresión génica ectópico o derribar CD4 precedentes diferenciación de las células T en el estado ingenuo. Se permite probar el efecto de un overexpressed gen de interés durante los primeros eventos de señalización a la estimulación TCR inicial hasta el compromiso de T subconjunto de células. Nuestros experimentos de validación también proporcionan la base para establecer la aplicación de adenovirus similar en la diferenciación de otros subconjuntos de células T tales como Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, o células Tfh.

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Protocol

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1. La clonación de un gen de interés en un vector de entrada

  1. Clonar el gen de interés en un vector de entrada. Amplificación por PCR del gen seguido por ligación de extremos romos en un vector de la topoisomerasa-acoplado (por ejemplo pENTR / D-TOPO) o la enzima de restricción mediada por clonación puede ser usada para este procedimiento.

2. Transferencia del gen de interés en la pCAGAdDu Destino vectorial

  1. La transferencia del gen de interés a partir del vector de entrada en el vector de destino por LR recombinación (por ejemplo, puerta de enlace LR Clonase II mezcla de enzimas). Esto creará el vector de expresión adenoviral (Figura 1).
  2. Alineado de 10 ug del vector de expresión adenoviral en una digestión de restricción PacI, precipitar el ADN y se resuspende en agua a una concentración de 3 g por 100 l. Linealización libera las repeticiones invertidas virales (ITR), que son necesarios para la replicación y encapsidación de la VDNA iral en partículas virales.

3. Generación del lisado de virus primaria

  1. Semilla 1 x 10 5 células HEK293A en 2 ml de medio de cultivo celular (DMEM, FBS al 10%, 5% PenStrep) en un pocillo de una placa de 6 pocillos y se incuban las células durante 6 - 14 horas a 37 ° C en un 10% CO 2 incubadora para permitir que se adhieran. Las células deben ser entonces en aproximadamente 50% de confluencia.
  2. La lipofección: Transferencia de 6 l de reactivo jetPEI en 94 l de 50 mM de NaCl, agitar brevemente. Añadir la solución mixta a 100 l vector de adenovirus linealizado mientras agitación e incubar esta mezcla de transfección durante 15 - 30 min a temperatura ambiente.

Realice todos los pasos siguientes en las condiciones de bioseguridad apropiadas para la infección por adenovirus!

  1. Dispensar la solución gota a gota sobre la célula que contiene así HEK293A y se incuban las células a 37 ° C y CO 2 al 10%. Cuando se utiliza un marcador de fluorescencia, evaluar la transfeeficiencia cción visualmente después de 12 a 36 horas utilizando un microscopio de fluorescencia invertido. Añadir 0,5 ml de medio fresco cada 3 días.
  2. Compruebe cada 2 - 3 días con un microscopio de luz o fluorescencia para efectos citopáticos (CPE), que son áreas con células alargadas y redondeadas que comienzan a desprenderse. Esto es indicativo de la generación eficiente de virus. Tras la aparición de zonas más amplias de la CPE (Figura 3), que se llevará a 24-72 horas antes de que todas las células están infectadas.
  3. Cuando todas las células muestran signos de ECP, pero antes de que se produce un desprendimiento total de las células, separar las células por pipeteo suave y de transferencia de las células con el sobrenadante (SN, 3 - 5 ml) a un tubo de poliestireno de 15 ml.
  4. Congelar las células en el SN en hielo seco durante 15 - 20 min y descongelar rápidamente a 37 ° C después de la ruptura de las células. Repita este-y--ciclo de congelación-descongelación (C / TC) dos veces más. Mantenga el lisado de virus de la primaria en hielo para el uso dentro de un día o congelar a -80 ° C para almacenamiento a largo plazo. Cualquier F adicional/ TC reducirá el título del virus por 30 - 50%.

4. Virus Amplification

  1. Semilla y crecer células HEK293A a 90% de confluencia en una placa de cultivo de 14 cm de tejido.
  2. Infectar las células con medio de lisado de virus de la primaria (1.5 - 2,5 ml) y se incuban las células durante al menos 36 horas. Casi todas las células deben ser infectados a continuación, que puede determinarse por microscopía de fluorescencia. Para la re-amplificación de un stock de virus ya amplificada (es decir, más concentrada), HEK293A infectar a una multiplicidad de infección (MOI) de 50 (véase el apartado 6.3).
  3. Las células deben ser cosechados cuando todos ellos muestran CPE, pero antes de la separación. Con la producción eficiente del virus este estado se alcanza dentro de las 48 horas después de la infección. (Si se tarda hasta una semana, considerar otra ronda de amplificación mediante el aumento de la cantidad de acciones adenovirus utilizado para la infección se ha descrito en el punto 4.2.)
  4. Separar las células por pipeteo suave y células de transferencia y SN a un tubo de poliestireno de 50 ml. Girar las células hacia abajo a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
  5. Retire el SN y resuspender el sedimento en un volumen adecuado de medio o SN (aprox. 1 ml).
  6. Realizar 3 F / CT para romper las células y centrifugar a 800 xg durante 15 min a 4 ° C. Quítese la SN que contiene las partículas de virus (es decir, el lisado de virus concentrado), y alícuota del lisado de virus para almacenarlo a -80 ° C.

5. El título de virus Determinación

  1. Semillas 10 5 A549 células por pocillo en 5 pozos de una placa de 12 pocillos en 1 ml de medio y dejar que las células se adhieran durante 6 horas.
  2. Usar 1 l de adenovirus concentrada (descongelado en hielo) para realizar una dilución en serie en medio (1:5.000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) y añadir 10 l por pocillo. Deja un pozo sin infectar para ajustar la compuerta en la citometría de flujo.
  3. Después de 36 horas, quite la SN, lavar con PBS y las células de desconexión (por ejemplo, mediante tratamiento con tripsina). Para las precauciones de seguridad, se recomienda fijar cells en 100 l de paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min a temperatura ambiente y lavado con PBS una vez.
  4. Realizar un análisis FACS de la expresión de marcadores infección. Parcela 'l de lisado viral aplica' contra el número absoluto de células infectadas (Figura 4). Determinar el intervalo lineal de la infección y calcular el título por ml de virus de la sin diluir de la curva estándar por encima del intervalo lineal con x = 1000 l.

6. T infección de la célula

  1. Aislar las células T CD4 naive / reposo de DO11.10 tg; tg CARΔ1 utilizando MACS (T celda de aislamiento Kit II ingenuo CD4 +) o FACS clasificación (CD4 + CD25-CD62L + CD44-).
  2. Para los experimentos a pequeña escala, una pipeta un volumen apropiado de lisado viral para alcanzar una MOI de 50 en un pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo.
  3. Añadir hasta 10 5 células T 4 x en un volumen final de la infección de 50 l en medio de células T (RPMI 1640, FBS al 10%, 5% PenStrep, 5% NaPyruvate, NEAA 1x, 1x MEM esencialvitamina, 1x L-glutamina, 1:250.000 mercaptoetanol, 10 mM de HEPES).
    Ejemplo:
    El Ministerio del Interior de 50 se utilizará para infectar 3 10 5 células T x; el título viral es 3 x 10 9 ml -1
    Volumen Virus MOI = x número de células T / título viral = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 9 ml -1) = 0.005 ml

Nota: para la infección del número de células grandes, escala hasta el uso de una MOI de 50 en un volumen infección de 165 l por 10 6 células T ingenuas en un tubo de poliestireno con la taza floja (hasta tp 3 ml por tubo).

  1. Se incuban las células durante 90 minutos a 37 ° C en el 5% de CO 2 incubadora.
  2. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, quite SN, resuspender en 200 l de PBS. Se centrifuga de nuevo y quitar SN.

(Opcional: las células se pueden lavar de nuevo para eliminar el virus de la manera más eficiente)

  1. Resuspender las célulasen 200 l de medio de células T sin anticuerpos estimulantes y sin IL-2 o de otras citoquinas y descanse durante 40 horas a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora para permitir la expresión del gen de interés antes de la activación.

7. Activación de las células T y la polarización

  1. Pipeta un volumen de anti-CD3 y anti-CD28 bolas acoplados a que es igual al número de células (por ejemplo, 4 x 10 5) en una taza pequeña reactivo, añadir el volumen 10 veces mayor de PBS y ponerlos en un imán durante 2 minutos . Retirar el sobrenadante y resuspender las perlas en 200 medio de polarización l (para células T reguladoras: medio de células T + 1 ng / ml de TGF, 100 U / ml de IL-2).

Nota: Las células también se pueden activar utilizando placas de cultivo tisular recubiertas con anti-CD28 y anti-CD3 anticuerpos, o de una manera específica del receptor de células T DO11.10 usando irradiados esplenocitos BALB / c pulsadas con péptido antígeno ovoalbúmina 323-339.

  1. Centrifuge la apoyó las células como antes, quitar la Resuspender las células SN y en 200 l de medio de polarización que contiene anti-CD3 y anti-CD28 de anticuerpos acoplados a perlas. Incubar durante 72 horas a 37 ° C en el 5% de CO 2 incubadora sin cambiar medio.

8. T fijación de células y tinción para citometría de flujo

  1. Lavar las células: Centrifugar las células a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, quite SN, resuspender en 200 l de PBS. Se centrifuga de nuevo y quitar SN. Realice todas las siguientes etapas de lavado en consecuencia.
  2. Resuspender las células en 100 l solución de tinción de células muertas puede arreglar y se incuba durante 30 min a 4 ° C.
  3. Lavar las células, se resuspenden en 100 l de PBS, añadir 100 ml de paraformaldehído al 4% en PBS, incubar 15 min a TA.
  4. Lavar las células, resuspender en 200 l de metanol enfriado con hielo 70% en PBS y se incuba durante 30 min en hielo.

Nota: Las celdas pueden ser tratados a partir de ahora sin precaución biohazard!

  1. Preparar 60 l master-mix de 60 l de PBS + 10 mg / ml Fc-block (anti-FCR3 para bloquear la unión inespecífica). Lavar las células, resuspender en 40 l de PBS + anti-FCR3 e incubar 15 min a TA.
  2. Añadir 20 l de PBS + anti-FCR3 que contiene 1 g de PE-junto anticuerpo anti-Foxp3, mezclar bien y se incuba a 4 ° C durante la noche.
  3. Lavar las células dos veces en PBS y analizar las células en un citómetro de flujo.

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Representative Results

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Producción Virus

Para la generación de altos títulos de virus, el tiempo de cosecha de células HEK293A en la producción de virus primario o amplificación del virus es crucial. Representativos imágenes de contraste de fase fluorescentes y con signos visuales de la producción de virus se muestran en la Figura 3. El CPE se observaron 10 días después de la transfección de células HEK293A con pCAGAdDu vector de control sin inserto. CPE se caracteriza por la aparición de áreas con células alargadas y de ida y hasta que comienzan a separar y presentar una alta expresión del marcador de GFP infección. El grado de CPE es indicativa de la generación eficiente de virus. Placas de cultivo de células que muestran CPE similar puede ser cosechada dentro de 24 - 72 horas, y un lisado de virus en bruto pueden ser generados por los ciclos de congelación-y-descongelación. El título del virus se puede determinar mediante dilución en serie del lisado del virus para permitir la comparación de las infecciones con un igual MOI (Figura 4). Dentro de la gama lineal, tél ecuación de análisis de regresión se puede utilizar para calcular el número de partículas infecciosas por ml de lisado de virus sin diluir. En el ejemplo, el título para x = 1 l es 30016535 l -1 ≈ 3 x 10 10 ml -1.

Evaluación del impacto de la infección por adenovirus en la activación de las células T y la diferenciación

Los efectos de la transducción de adenovirus en las células diana han sido evaluadas por infectar ingenuo células T CD4 con el aumento de las MOI utilizando un vector adenoviral de control que sólo expresa IRES-GFP (Figura 5a). La eficacia de la infección se midió mediante análisis FACS para determinar las células GFP positivas en las muestras de células T fijos 72 h después de la inducción de la diferenciación de Treg. La tasa de células positivas para GFP aumentó con la MOI usado para la infección y alcanzó el 84% de infección a una MOI de 50. No obtenemos porcentajes mucho más altos de células T infectadas utilizando las MOI mayor que 50 (datos no mostrados). Aunque infeeficiencia cción puede variar dependiendo de el gen de interés, uno típicamente pueden infectar más de 50% de las células a una MOI de 50. En MOI entre 1 y 50 de la viabilidad celular no se vio afectada (Figura 5b). Es importante destacar que, la estimulación y diferenciación de células T vírgenes en células T reguladoras fue similar en los infectados en comparación con las células no infectadas (Figura 5c). Una propiedad clave de la transducción de adenovirus es su capacidad de infectar a las células T vírgenes y de reposo sin conferir o que requieren la activación de células T. Esto es evidente a partir del análisis de los marcadores de activación de células T (CD25, CD69, CD44) y el marcador de células T ingenuas (CD62L) en las muestras con o sin infección por adenovirus y descansando durante 40 horas a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora (Figura 6). Antes de la activación in vitro de células T con anti-CD3 y anti-CD28 bolas acoplados, las células T infectadas y no infectadas fueron igualmente bajo CD25, CD69 y CD44 bajo low pero de alto CD62L, lo que demuestra su estado ingenuo y en reposo (Figura 6, paneles superiores). Tras la activación de células T, las células infectadas mostraron regulación positiva de la activación de los marcadores CD25, CD69 y CD62L regulación a la baja de casi indistinguibles de las células no infectadas (Figura 6, paneles inferiores). Por lo tanto, el estado de activación de las células T no se ve alterado por la infección por adenovirus. La fase de reposo se asocia con la pérdida de 60 a 70% de las células debido a la ausencia de factores de crecimiento o citoquinas, en comparación con 10 - 20% las células muertas de 40 horas después de la activación sin descansar. Esto se ha tenido en cuenta la hora de elegir el número inicial de células de las células 3 x 10 5.

La evaluación de la sobreexpresión Nivel de un gen de interés

Con el fin de evaluar la cantidad de sobreexpresión logrado mediante transferencia génica adenoviral, hemos tratado de determinar el microRNA-155 (miR-155) los niveles de expresión en las células T ingenuas quevolver a infectarse con miR-155 que expresan o control adenovirus o se dejaron sin infectar. Elegimos miR-155 ya que este miARN madura se expresa en niveles moderados en las células T vírgenes y se vuelve fuertemente inducida después de la activación de células T. Además, tiene un papel crucial en la respuesta humoral de células T dependientes de 25,26.

El nivel de sobreexpresión microRNA fue evaluada por qPCR. Después de la infección, las células se dejaron reposar durante 40 horas, se activan durante 40 horas, o descansaban 40 horas seguido de 40 horas de la activación. Después de 40 horas de reposo, las células T naive infectados con el virus de miR-155 que codifica muestra una sobreexpresión de aproximadamente 17 veces de miR-155 en comparación con las células infectadas con el virus de control o células no infectadas (Figura 7). Esto casi coincidía con la medida en que la endógena miR-155 se induce después de la activación de células T (Figura 7 y ref. 25,27). A pesar de esta fuerte inducción de la endógena miR-155 niveles, las células infectadas con miR-155 adenovirus todavía mostraba sobre aumento de cuatro veces en la expresión de miR-155 tras la activación en comparación con las células control infectadas con el virus o no infectado. El nivel observado de sobreexpresión ectópica fue comparable para otros microARN (datos no mostrados). Tenga en cuenta que para las grandes inserciones, la sobreexpresión puede ser menos efectiva.

Análisis de la diferenciación de células T

El análisis de los datos se puede realizar de varias maneras. Análisis de la diferenciación en la puerta segura de GFP de un gen de interés (es decir, en las células infectadas) en comparación con la diferenciación en la misma puerta de GFP positiva de las células de control (células infectadas utilizando un vector sin el gen de interés) es suficiente para detectar diferencias sustanciales. Para estudiar los efectos más sutiles de un gen de interés, hemos comparado la diferenciación en las células infectadas con el de células no infectadas de la misma así (Figura 8). Estos sirven como un contro internol, y se puede utilizar para calcular la "diferenciación relativa" dentro de un pozo. Si un virus no tiene ningún efecto sobre la diferenciación, la "diferenciación relativa" ideal será 1. La diferenciación relativa para el control de virus en nuestras manos tiene un rango de 0,9 a 1,1. Diferenciación relativa sólo se debe aplicar a la comparación de genes de muestras de interés-infectadas con muestras de control infectadas por virus.

Figura 1
Figura 1. Vectores de entrada representación esquemática de la generación de adenovirus. (PENTR) contienen sitios de donantes de recombinación (AttL1, attL2), que flanquean un gen de interés. El vector de destino pCAGAdDu contiene los sitios diana de recombinación (attr1, attr2) que flanquean el gen de la toxina CcdB para la selección negativa en E. coli, que se reemplaza por el gen de interésa través de recombinación LR. El vector de destino también contiene un genoma de adenovirus tipo 5 humano sin E1/E3 genes, que se han suprimido para generar adenovirus recombinantes con replicación deficiente. PacI linealización libera repeticiones invertidas (ITR) antes de la transfección en células HEK293A que llevan los genes adenovirales para generar infecciosa partículas de adenovirus que provocan efectos citopáticos. Adenovirus se extrae de las células que producen los ciclos de congelación y de descongelación. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

La figura 2
Figura 2. Representación esquemática de la infección de células T y la diferenciación. Células T vírgenes fueron infectadas con un lisado de adenovirus durante 1,5 h, se lavó con PB S y reposó en el medio de las células T durante 40 horas a 37 ° C en el 5% de CO 2 incubadora. Después las células se activan durante 72 horas utilizando el anticuerpo anti-CD28 y anti-CD3 de anticuerpos acoplados a perlas en presencia de TGF y la IL-2. Las células fijadas y teñidas se analizaron mediante FACS, y se determinó la expresión de Foxp3 en las células infectadas en comparación con los no infectados.

Figura 3
Figura 3. El efecto citopático del adenovirus células productoras HEK293A. Aparición de CPE en diez días después de la transfección de 10 5 células HEK293A con 3 ng de vector linealizado pCAGAdDu. El panel izquierdo muestra la imagen de contraste de fase, el panel de la derecha muestra la fluorescencia verde.

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La Figura 4. Determinar el título de los lisados ​​de adenovirus por la infección de las células A549. 10 5 células A549 se infectaron con el virus de la dilución indicada, se incubaron durante 48 horas y se analizaron para la expresión de la infección marcador de GFP mediante citometría de flujo. El número de células positivas GFP se representa frente a la cantidad de virus utilizada. El título de virus sin diluir se calcula a partir de la curva estándar por encima del intervalo lineal con x = 1000 l.

La figura 5
Figura 5. La infección por adenovirus a una MOI de 1 - 50 no tiene efecto sobre la viabilidad de células T o la diferenciación de células T vírgenes Treg purificada a partir de DO11.10 tg; ratones tg CARΔ1 se infectaron con adenovirus en diferentes MOI.durante 90 min, se lavaron con PBS y reposó durante 40 h en medio de células T. Las células se activan en Treg condiciones de polarización durante 72 horas. Las células fijadas y teñidas se analizaron para la incorporación de tinte de células muertas (b), la expresión de la infección marcador GFP (a) y del Foxp3 marcador de diferenciación (c). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

La figura 6
La Figura 6. La infección por adenovirus no altera el estado de activación de las células T de las células T vírgenes DO11.10 tg;. CARΔ1 TG ratones fueron infectados con adenovirus a una MOI de 50 durante 90 min (líneas) o no infectadas izquierdo (zonas), se lavaron con PBS y se descansado durante 40 h. Las células se analizaron para Expresi ó n de marcadores de activación antes (paneles superiores) y después (paneles inferiores) 40 hr de la activación Treg en condiciones de polarización.

La figura 7
Figura 7. . Naive relativos miR-155 sobreexpresión antes y después de la activación de células T de las células T DO11.10 tg; ratones tg CARΔ1 se infectaron a una MOI de 50 con microARN-155 (miR-155) que expresan o el control de adenovirus, o hacia la izquierda no infectada. Las células fueron luego descansaron durante 40 horas, se activan durante 40 horas, o descansaban 40 horas seguido de 40 horas de activación. La expresión del microRNA-155 se determinó en relación a SnoRNA202 por qPCR.

Figura 8
(es decir, las células infectadas) positivas GFP se expresó en relación con el porcentaje de células Foxp3 + en las células negativas (no infectado) y GFP. Diferenciación relativa es igual a 1, si el gen sobreexpresado de interés no tuvo efecto sobre la diferenciación de Treg. Los valores superiores a 1 indican un efecto promotor de la diferenciación, mientras que los valores inferiores a 1 indican un efecto inhibidor.

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Virus Generación y Titulación

Para obtener resultados óptimos de transfección, la calidad y la cantidad de vector linealizado parecen más importantes. No se observaron efectos negativos en la producción primaria de lisado de un crecimiento excesivo inicial del cultivo ya que la infección se procederá rápidamente una vez que se produce la producción de virus eficiente. Sin embargo, la producción de virus por las células HEK293A puede verse afectado por las inserciones largas que disminuyen la eficiencia. Algunos marcos de lectura abierta se encontraron en realidad para interferir con la producción de virus. Estas poblaciones virales normalmente pueden ser rescatados a través de varias rondas de amplificación, y se encontraron sólo unos marcos de lectura abiertos a ser incompatibles con la producción de virus. A partir de nuestra experiencia, la aparición de CPE dentro de 48 horas después de la infección para la amplificación del virus será típicamente producir un lisado viral de aproximadamente 1 × 10 9 - 5 x 10 10 partículas infecciosas / ml.

La infección adenoviral de células T naive

Infección adenoviral de células T vírgenes no cambia el estado de activación de las células T antes y después de la estimulación. Esto hace que el sistema de transducción de una poderosa herramienta experimental para el estudio de la diferenciación de células T de TCR-estimulación inicial sobre. Hemos determinado la expresión ectópica eficiente de genes de interés después de la infección y el 'descanso' de las células T de 40 horas, en un momento en que la célula sigue siendo ingenua y no muestra signos de activación. Esto significa que durante la posterior activación de células T, el gen de interés ya se sobreexpresa y puede ejercer su influencia en la diferenciación de células T desde el principio. Por lo tanto, la transducción adenoviral tiene una clara ventaja sobre electroporación o transducción retroviral que requieren activación y expresar un gen de interés sólo después de la señalización de TCR 15,28 inicial. Sin embargo, si se analizan y aspectos finales de la diferenciación de la expresión del gen de interés no se requiere antes de la primera célula de actividad Tción, las células T ingenuas puede también ser estimulado directamente después de la transducción adenoviral. Dado que la infección viral es muy eficiente, se puede extender a estudiar las actividades de cooperación de los dos genes de interés mediante la realización de las infecciones dobles con adenovirus que expresan otros marcadores de infección tales como Thy1.1 o hCD2. El último también es accesible a tinción de la superficie de anticuerpos y puede eludir dificultades en la preservación marcador durante la fijación. En las células T activadas, sin embargo, la infección adenoviral tiene una eficiencia mucho más baja, y la electroporación o los métodos de transducción retroviral puede ser favorable. Otra advertencia para la aplicación de adenovirus es el carácter transitorio de expresión. Adenovirus se mantiene como un episoma unido a la matriz nuclear de la célula y se diluyó como las células T proliferan, lo que lleva a la pérdida de la expresión del gen marcador dentro de los cinco a siete días después de la activación de células T (datos no mostrados;. Ref 17). Además, las células transducidas por adenovirus son readily reconocida y eliminada por un sistema inmune intacto, lo que limita su uso in vivo, por ejemplo, en experimentos de transferencia adoptiva de células T en el ratón. Otra aplicación potencial del sistema adenoviral podría ser la infección de las células Treg aisladas de DO11.10 tg; CARΔ1 ratones tg para estudiar la función de Treg o los aspectos de estabilidad linaje.

Validación de los Efectos de adenovirus en las células infectadas

La infección por adenovirus fue eficiente y casi no tenía influencia sobre la viabilidad de células T y la diferenciación Treg. En una MOI de 50, se obtuvo la mejor eficacia de la infección sin la observación de efectos adversos de la infección por adenovirus en las células T. Esto tiene que ser establecido de manera similar cada vez que el sistema se aplica a otro cultivo de células o condiciones de diferenciación, típicamente por experimentos de titulación utilizando adenovirus vacío sin la expresión del gen de interés. Si la infección adenoviral, como tal, no afecta el resultado del experimento,la comparación de los genes de adenovirus que devenga intereses con adenovirus vacío sigue siendo adecuada para descubrir los efectos del gen transferido de interés. Si no hay ningún efecto de la infección adenoviral, el parámetro medido también puede ser comparado entre células no infectadas e infectadas de la misma muestra.

Análisis de Datos

El método de fijación descrito aquí permite un análisis simultáneo del marcador de Foxp3 diferenciación junto con el marcador de GFP infección, por lo que un 'diferenciación relativa' se puede determinar. Este análisis de las dos poblaciones dentro de una muestra tiene mayor sensibilidad para los efectos sutiles que las comparaciones de población masiva entre dos muestras, ya que tiene variaciones acomodado muy en cuenta. Sin embargo, sólo los efectos intrínsecos a las células infectadas serán reconocidos por este método, mientras que los efectos bien de ancho, por ejemplo, influencias ejercidas por un factor secretado, se pueden despreciar. Diferenciación relativa debe ser controlado en cadaexperimento mediante la inclusión de las células de control infectadas para excluir los efectos de la infección por sí mismo en la diferenciación. Para un resultado óptimo, un ritmo casi igual de infección a las células no infectadas dentro de una muestra debe ser dirigido por, mientras que las tasas de infección más altas son favorables en comparación a granel entre varias muestras.

En conclusión, la transferencia de genes en las células T vírgenes utilizando adenovirus en combinación con protocolos de diferenciación in vitro es un potente sistema para investigar las bases moleculares de la diferenciación de Treg. Esto puede permitir la generación de conocimiento para explotar la tolerancia dominante conferida por células T reguladoras en los enfoques terapéuticos contra enfermedades alérgicas y autoinmunes.

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Disclosures

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Lirui Du para construir el vector pCAGAdDU y Oliver Gorka para la prestación del protocolo de fijación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix Invitrogen 11791020
PacI New England Biolabs R057S
jetPEI Polyplus-transfection 101-10N
HEK293A Cell Line Invitrogen R705-07
A549 ATCC CCL-185
6-well plates BD Falcon 353046
14 cm tissue culture dish Nunc 168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr Taconic Farms Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II Miltenyi Biotech 130-094-131
DMEM Invitrogen 41966-052
FBS PAN Biotech 1502-P110704
PenStrep Invitrogen 15140-122
RPMI 1640 Lonza BE12-167F
NaPyruvate Lonza BE13-115E
NEAA 100x Lonza BE13-114E
L-Glutamine Invitrogen 25030
HEPES Buffer Solution (1 M) Invitrogen 15630-056
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x) Lonza 13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation Invitrogen 114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1 R&D Systems 240B
Proleukin S (18 x 106IE) Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Invitrogen L-23105
Mouse BD Fc BlockT BD Pharmingen 553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE eBioscience 12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay Roche Applied Biosystems 4427975
LightCycler 480 Probes Master Roche Applied Biosystems 04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Roche Applied Biosystems 4366596

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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La transducción adenoviral de células T CD4 + naïve a estudiar la diferenciación Treg
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Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation. J. Vis. Exp. (78), e50455, doi:10.3791/50455 (2013).More

Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation. J. Vis. Exp. (78), e50455, doi:10.3791/50455 (2013).

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