Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T

Published: August 13, 2013 doi: 10.3791/50455

Summary

Naif CD4 Coxsackie adenovirüs reseptör transgenik ekspresyonu ile T-hücreleri içine adenoviral gen transferi düzenleyici T hücre farklılaşmasının moleküler analiz sağlar

Abstract

Düzenleyici T hücreleri (Tregs) kendini hem de bazı yabancı antijenlere karşı bağışıklık dayanıklılık sağlamak için gereklidir. Tregs TGFβ ve IL-2 varlığında TCR-ve ko-stimülasyonu ile in vitro olarak naif CD4 + T hücrelerinden elde edilebilir. Bu, gelecekteki tedaviler için büyük bir potansiyel taşıyan, ancak, moleküller ve sinyal yolları kontrol farklılaşma büyük ölçüde bilinmemektedir olduğunu.

Primer T hücrelerinde ektopik gen ifadesi yoluyla manipüle, ancak yaygın yöntemler primer antijen tanıma önce, T hücresinin en önemli naif durumuna hedef başarısız olabilir. Burada, Treg farklılaşma oluşturulmadan önce in vitro naif CD4 T hücrelerinde ektopik genleri ifade etmek için bir protokol sağlar. Bu çoğaltma eksikliği adenovirüs ile iletim yapar ve onun üretim ve üretim açıklar. Adenovirüs büyük ekler (en fazla 7 kb) kadar sürebilir ve yüksek ve geçici Hsplm ulaşmak için rehberleri ile donatılmış olabilirT hücrelerinde yansıması. Bir transgenik Coxsackie adenovirüs reseptör (SYR) ifade ise etkili naif fare T hücreleri transduces. Önemlisi, enfeksiyon sonrası T hücreleri naif kalır (CD44 düşük, CD62L yüksek) ve dinlenme (CD25 -, CD69 -) ve Tregs içine enfekte olmayan hücrelere benzer aktif ve ayırt edilebilir. Bu yüzden, bu yöntem, en başından beri CD4 T hücre farklılaşmasının manipülasyon sağlar. Bu ilk TCR stimülasyon erken sinyal olaylar sonunda farklılaşma Treg içine kurşun hücresel değişiklikler neden zaman bu ektopik gen ifadesinin yer zaten olmasını sağlar.

Introduction

Tregs immün tolerans korumak ve aşılmaz bağışıklık yanıtları kırmak için çok önemlidir. Tregs seyirci T hücre aktivasyonu bastırmak. Sonuç olarak, Tregs ablasyon aktive T hücreleri 1 ile tahrik ölümcül otoimmünite ve kendi kendini yok yol açar. Tregs CD4 tek pozitif öncüleri olumsuz seçimi sırasında timus gelişebilir, ama onlar da optimal ortak stimülasyon 1,2 ile düşük doz antijen stimülasyonu üzerine naif CD4 T hücreleri çevre içinde ayırt edebilirsiniz. Periferik Tregs bağırsak ve akciğer hoşgörü sağlayan suçlanmıştır ise timik Tregs, kendini antijenlere karşı doku otoimmünite bastırmak gibi görünüyor. Bu bağlı Tregs kuvvetli gıda ve hava, ortakçı bakteri ve alerjenleri 3,4 çevresel antijenleri dahil olmak üzere mukozada yabancı antijenleri, tanınması sonra T hücre aktivasyonu engeller. Buna ek olarak, Tregs fetal peptidler için anne toleransı 5 kurmak ve önceden için çok önemlihavalandırma graft-versus-host hastalığı 6. Aynı zamanda, aynı zamanda 7,8 Tregs tümör hücrelerinin immün gözetim alçaltarak istenmeyen etkilere aracılık eder. Tregs damgasını özelliği alt-belirterek transkripsiyon faktörü Foxp3, gerekli ve fonksiyon 9,10 Treg görüşmek için yeterli bir çatal başlı etki alanı içeren transkripsiyon faktörü ifadesidir. Foxp3 ifade neden bazı sinyal yolları bilinmektedir. Bununla birlikte, kontrol, düzenler ya da tetikleyici T hücresi reseptörüne tepki olarak farklılaşma Treg modüle ettiğini moleküler süreçlerin daha iyi anlaşılmıştır.

Tregs çok etkili TGFβ ve IL-2, 11 varlığında, anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile naif CD4 + T hücrelerinin uyarılması ile in vitro olarak uyarılabilir. Gelişmekte olan Tregs in vivo, Treg farklılaşma teşvik moleküllerin manipülasyon fonksiyonel olduğu gibi gelecekte therapi için büyük bir potansiyel taşımaktadıres, örneğin, astım, Crohn hastalığı, transplantasyon ve 11,12. Tersine, Treg farklılaşma engellemek için moleküllerin tedavi modülasyonu tümör hastaların kombine tedavi gelecekteki yaklaşımlar fayda sağlayabilir.

In vitro farklılaşma tayinlerde T hücre alt farklılaşma ile ilişkili moleküler değişikliklerin açıklaması için vesile olmuştur. Şu anda, ara ya da kontrol T hücre farklılaşmasını ektopik gen ifadesinin en yaygın yöntemler naif T-hücrelerinde başarısız olması nedeniyle engellenmektedir bu gen ürünlerinin taranması için deneysel çalışır. Örneğin, elektroporasyon ve retroviral transdüksiyon aktive edilmiş T-hücrelerinde etkilidir. Ilk beklentileri, dinlenme hücreler tipik olarak etkilidir lentiviral transdüksiyon, aksine, sitokinler 13 tarafından naif T hücrelerinin ön aktivasyon gerektirir. Ayrıca, elektroporasyon sırasında cDNA veya mRNA 'devrikendisi T hücre aktivasyonunun özellikleri kazandırır ve hatta Ca2 + sinyali harekete geçirebilir plazma zar, depolarizasyon içerir ve NFAT proteinler (yayınlanmamış gözlem ve ref. 14) etkinleştirin. 40 saat - Benzer şekilde, retroviral transdüksiyon için, naif T hücreleri 18 için aktif olmak zorunda. Bu süre boyunca, hücre bölünmesi sırasında nükleer membran arıza meydana ve retroviral vektör 15'in sonraki genomik entegrasyon için izin verir. Bu yöntemler bu nedenle yardımcı T hücre farklılaşmasının belirleyici aşamasıdır antijen ile ilk T hücre karşılaşma erken moleküler düzenleme ele mümkün değildir.

Adenoviral transdüksiyon, insan adenovirüs Coxsackie reseptörü (CAR) ifade, insan hücre tipleri arasında bir dizi geçici ektopik gen ekspresyonunu vermek bilinmektedir. Bu hücre aktivasyonu ya da hücre döngüsü ilerlemesi için gerek kalmadan devam eder. C yüzey ekspresyonuAR etkili bir virüs bağlanma ve içselleştirilmesi için gerekli olan ve bir T hücre-spesifik promotör altında kesilmiş versiyonunu CARΔ1 transgenik ekspresyonu adenoviral enfeksiyon 16 ile duyarlı bir fare timositleri ve T hücre oluşturmak bulunmuştur. Önemli olarak, transgen timosit gelişimi değiştirmeyen veya naif CD4 in vitro farklılaşma, farklı alt-grup halinde hücreleri (veriler gösterilmemiştir; ref 17.) T. T hücrelerinin Adenovirüs aracılı transdüksiyon önce yaklaşımlar 19,20 aşırı 17,18 için kullanılan ve knock-down oldu. Transgenik T hücreleri ticari olarak temin DO11.10 TG arıtılabilir; CARΔ1 TG (Taconic, Inc ref 17).. Önemli olarak, Adeno transdüksiyon aktivasyon belirgin belirtileri neden olmadan naif T-hücrelerinde, bir ilgi geninin yüksek sağlar. T hücreleri naif kalır (CD44 düşük, CD62L yüksek) ve dinlenme (CD25 -, CD69 -) sonra enfeksiyonuve enfekte olmayan hücrelere benzer Treg içine aktif ve ayırt edilebilir.

Rekombinant adenovirüsleri üretimi adenoviral plazmidi (Şekil 1) ile HEK293A hücre sırasında transfeksiyonundan sonra elde edilebilir. Bu plazmid genellikle çoğaltma-beceriksiz rekombinant adenovirüs 21 işlemek için silinir E1 ve E3 genleri ile insan tipi 5 adenovirüs genomu içerir. Onlar makaslanmış adenovirüs 22 istikrarlı entegrasyonu ile ölümsüzleştirdi edilmiş olarak HEK293A hücre çoğaltma eksikliği tamamlıyor. Adenoviral vektörlerin büyük (~ 40 kb) ve dolayısıyla iyi geleneksel kısıtlama enzim aracılı klonlama için uygun olmadığı için, biz Ağ Geçidi sistemi istihdam. İlgi konusu genin başlangıçta kolaylıkla lambda Rekombinasyon reaksiyonu (LR) 23 yoluyla hedef adenoviral vektörü içine transfer edilebilir daha küçük bir giriş vektörü içine klonlanır. Biz pCAGAdDu vektör inşaprokaryotik ccdb seçim işaretleyici 24 yan LR siteleri içeren bir ekspresyon kaseti ile CAG promoteri (tavuk aktin promotörü ve CMV artırıcı) birleştirerek. Bu ifade kaseti, büyükbaş hayvan büyüme hormonu poli (A) sinyal içeren bir diziye kaynaşmış olan ökaryotik enfeksiyon marker gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) arasında ekspresyonuna izin veren bir dahili ribozom giriş bölgesi (IRES) öğesi için eritilerek birleştirilir. Prototipik CMV promoteri yüksek aktivasyon bağımlı ve naif T hücrelerinde gen ekspresyonu için bu nedenle elverişsiz olduğu bulunmuştur beri, CAG cis-düzenleyici sekanslar seçtik.

Burada, in vitro Treg farklılaşmasında etkili bir protokol ve etkinleştirme (Şekil 2) olmadan naif CD4 + T hücrelerinin transdüksiyonu için bir yöntem sağlar. Yöntemi ektopik gen ekspresyonu sağlayan ya da naif devlet önceki CD4 T hücre farklılaşması yıkmak. Bir overexpresse etkisini test edilmesine olanak sağlarT hücre alt bağlılık kadar ilk TCR uyarılması üzerine erken sinyal olaylar sırasında ilgi d gen. Bizim doğrulama deneyleri de Th2 gibi Th1 gibi diğer T hücre alt grupları, TH9, Th17, Th22 veya TFH hücrelerin farklılaşması benzer adenovirüs uygulama kurmak için temel sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Girdi Vektör içine İlgi Çekici Gen Klonlanması

  1. Bir giriş vektörü, ilgi konusu gen klonlama. Bir topoizomeraz çiftli vektör (örneğin pentr / D-TOPO) veya kısıtlama enzim aracılı klonlama bu işlem için kullanılabilir içine kör uç ligasyonu ile takip geninin PCR amplifikasyonu.

2. PCAGAdDu hedef vektörü içine, ilgi konusu gen aktarma

  1. LR rekombinasyon (örneğin Ağ Geçidi LR Clonase II enzim Mix) tarafından hedef vektör girmesinden vektör ilgi gen aktarın. Bu adenovirüs ekspresyon vektörü (Şekil 1) oluşturur.
  2. , Bir Paci restriksiyon sindirimi içinde adenoviral sentezleme vektörü 10 ug linearize DNA hızlandırabilir ve 100 ul başına 3 ug 'lik bir konsantrasyonda su içinde süspansiyon haline getirin. Doğrusallaştırma v çoğaltma ve encapsidation için gerekli olan viral ters tekrarlar (Re), açığaVirüs partiküllerinin içine Iral DNA yapısı.

3. Birincil Virüs Lizat üretimi

  1. Tohum 1 x 6-plaka de bir 2 ml hücre kültür ortamı içinde 10 5 HEK293A hücreleri (DMEM,% 10 FBS,% 5 PenStrep) ve 6 için hücre inkübe - 37 ° 14 saat, bir% 10 ° C CO 2 inkübatör onlara uymak için izin vermek. Daha sonra hücreler konfluense yaklaşık olarak en az% 50 olmalıdır.
  2. Lipofeksiyon: Transferi NaCl 50 mcM, vorteks kısaca 94 ul içine jetPEI reaktif 6 ul. Vorteks 100 ul doğrusallaştırılmış adenovirüs vektörüne karışık çözelti eklenir ve 15 için transfeksiyon karışımı inkübe - oda sıcaklığında 30 dak.

Adenovirüs enfeksiyonu için uygun biyogüvenlik koşulları altında aşağıdaki adımları uygulayın!

  1. HEK293A hücre içeren iyi üzerinde damla damla çözüm koyun ve 37 hücreleri inkübe ° C ve% 10 CO 2. Flöresanlı bir işaretleyici kullanırken, transfe değerlendirmekgörsel 12'den sonra ction verimliliği - ters bir floresan mikroskop kullanılarak 36 saat. Taze ortam içinde 0.5 ml 3 günde ekleyin.
  2. Ayırmak başlar genişlemiş ve yuvarlak hücreler ile alanlardır sitopatik etkileri (CPE), bir ışık veya floresan mikroskop ile 3 gün - her 2 kontrol edin. Bu, etkili bir virüs üretimi göstergesidir. CPE daha geniş bölgeleri (Şekil 3) ortaya çıkması üzerine, bu 24 alacak - 72 saat tüm hücreleri enfekte önce.
  3. Tüm hücreleri CPE belirtileri gösteriyor, ancak hücrelerin genel bir dekolmanı meydana gelmeden önce, süpernatant ile Nazik pipetleme ve transfer hücreleri (SN, 3 - 5 ml) ile hücreleri ayırmak zaman 15 ml polistiren tüp.
  4. 15 kuru buz üzerinde SN hücreleri Freeze - 20 dakika ve kopma hücrelere ° C daha sonra 37 hızlı bir şekilde çözülme. Bu donma-ve-çözülme döngüsü (F / TC) iki kez daha tekrarlayın. Bir gün içinde kullanım için buz üzerinde birincil virüs lizat tutun veya -80 ° C uzun süreli depolama için dondurma. Her türlü ilave F/ TC 30, virüsün titresi azaltacaktır - 50%.

4. Virüs Amplifikasyon

  1. Tohum ve 14 cm doku kültürü çanak% 90 izdiham HEK293A hücreleri büyür.
  2. Birincil virüs lizatı (1,5-2,5 mL) yarısı ile hücreleri enfekte edebilir ve en az 36 saat boyunca hücrelerin inkübe. Hemen hemen bütün hücrelerin floresans mikroskobu ile tespit edilebilir, daha sonra enfekte edilmelidir. Zaten (daha konsantre yani) amplifiye virüs stokunun yeniden güçlendirme için, 50 enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) (6.3) de HEK293A enfekte.
  3. Hepsi CPE gösterir ama dekolmanı önce zaman Hücreler hasat edilmelidir. Verimli virüs üretimi ile bu durum enfeksiyondan sonra 48 saat içinde ulaşılır. (Bu bir hafta kadar sürerse, 4.2 açıklanan enfeksiyon için kullanılan adenovirüs stok miktarını artırarak amplifikasyon bir tur düşünün.)
  4. 50 ml'lik bir tüp polistiren için nazik pipetleme ve transfer hücreleri ve SN hücreleri ayırmak. 4 10 dakika ° C için 300 xg'de hücreleri aşağı Spin
  5. SN çıkarın ve orta veya Sn (yaklaşık 1 mi) arasında uygun bir hacimde pelletini.
  6. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj hücreleri ve bozmaya 3 K / TC gerçekleştirme (Konsantre virüs lizat yani) virüs partikülleri içeren SN çıkarmak ve kısım virüs lizat -80 saklayın ° C

5. Virüs titresi Belirlenmesi

  1. Tohum 10 5 A549 hücre başına kuyuya 1 ml orta ve hücreler 6 saat uymak izin bir 12 plaka 5 kuyu.
  2. Ortam içinde bir seri dilüsyon (1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000) yapmak ve oyuk başına 10 ul kadar konsantre edildi adenovirüs (buz üzerinde çözündürüldü) 1 ul kullanımı. Akım sitometri olarak yolluk ayarlamak için bir de bulaşmamış bırakın.
  3. 36 saat sonra, PBS ve ayırmak hücreleri (örneğin trypsinization tarafından) ile yıkayın, SN çıkarmak. Biohazard önlemler için, bu c düzeltmek için tavsiye edilir10 dakika oda sıcaklığında ve bir kez PBS ile yıkama için 100 ul PBS içinde% 4 paraformaldehid arşın.
  4. Enfeksiyon işaretleyici ifade FACS analizi yapın. Arsa enfekte hücrelerin mutlak sayısı (Şekil 4) karşı 'ul viral lizat Seç'. Enfeksiyon doğrusal aralığı belirlemek ve x = 1.000 ul kullanarak lineer aralığında standart eğriden sulandırılmamış virüs ml'si başına titreyi hesaplamak.

6. T Hücre Enfeksiyon

  1. Den dinlenme / naif CD4 T hücreleri izole DO11.10 tg; MACS (Naif CD4 + T hücre izolasyonu Seti II) veya FACS sıralama kullanarak CARΔ1 tg fareler (CD4 + CD25-CD62L + CD44-).
  2. Küçük ölçekli deneyler için, bir 96-gözenekli yuvarlak tabanlı bir plaka içine iyi bir MOI 50 elde etmek için viral lizat uygun bir hacmi pipetle.
  3. T hücre ortamı içinde 50 ul son hacim enfeksiyonu (RPMI1640,% 10 FBS,% 5 PenStrep,% 5 NaPyruvate, 1x NEAA, 1x gerekli MEM içinde 4 x 10 5 T hücre ile toplayınvitamini, 1x L-glutamin, 1:250,000 merkaptoetanol, 10 mM HEPES).
    Örnek:
    Bir İçişleri Bakanlığı 50 3 x 10 5 T hücreleri enfekte için kullanılır; viral titresi, 3 x 10 ml 9 -1
    Virüs hacmi = İçişleri Bakanlığı x T / hücre sayısı / viral titresi = 50 x (3 x 10 5) (3 x 10 9 ml -1) = 0.005 ml

Not: gevşek fincan (tüp başına tp 3 ml kadar) bir polistiren tüp içinde 10 6 naif T hücreleri başına 165 ul bir enfeksiyon hacminde bir İçişleri Bakanlığı 50 kullanılarak daha büyük hücre sayıları, ölçek enfeksiyon için.

  1. % 5 CO2 kuluçka makinesinde 37 ° C 'de 90 dakika boyunca inkübe hücreleri.
  2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri aşağı Spin, 200 ul PBS içinde tekrar süspansiyon SN, çıkarmak. Tekrar santrifüj ve SN çıkarmak.

(İsteğe bağlı: hücreleri daha etkin virüs kaldırmak için tekrar yıkanabilir)

  1. Tekrar süspansiyon hücreleri200 ul T hücresi uyarıcı antikor olmayan ve IL-2 veya başka bir sitokin olmadan, orta ve 37 ° C'de 40 saat boyunca dinlenmeye bir% 5 CO2 inkübatöründe ° C aktivasyonundan önce, ilgi konusu gen ekspresyonunu sağlamak için.

7. T Hücre Aktivasyon ve Polarizasyon

  1. Bir hacim, anti-CD3-ve küçük bir kap içine reaktif hücre sayısı (örneğin, 4 x 10 5) karşılık gelen bir anti-CD28 çiftli boncuk Pipet, PBS 10 kat hacim ekleyin ve 2 dakika için bir mıknatıs üzerine koyun . Süpernatantı alın ve 200 ul ortam içinde polarize boncuklar (Treg: T hücre ortamı + 1 ng / ml 'TGFβ, 100 U / ml IL-2) tekrar süspansiyon haline getirin.

Not: Hücreler aynı zamanda, anti-CD28 ve anti-CD3 antikorları ile kaplı doku kültür kaplarında kullanılarak aktive edilebilir, ya da ovalbumin 323-339 peptit antijen ile doldurulan ışınlanmış BALB / c splenositleri kullanılarak DO11.10 T hücre reseptör-özgül.

  1. Centrifuge daha önce olduğu gibi hücreleri dinlenmiş, 200 içeren ul polarize orta anti-CD3-ve anti-CD28-antikor birleştiğinde boncuk SN ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak. Orta değiştirmeden% 5 CO 2 inkübatör 37 ° C de 72 saat inkübe edin.

8. T Hücre Sabitleme ve Sitometrisi için Boyama

  1. Hücreleri yıkayın: Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri aşağı Spin, 200 ul PBS içinde tekrar süspansiyon SN, çıkarmak. Tekrar santrifüj ve SN çıkarmak. Buna göre tüm aşağıdaki yıkama adımları uygulayın.
  2. 100 ul tamir edilebilir ölü hücre boyama çözeltisi içinde hücrelerin yeniden süspanse edin ve 4 de 30 dakika boyunca inkübe ° C.
  3. Hücre yıkayın, 100 ul PBS içinde tekrar süspansiyon, PBS, oda sıcaklığında inkübe edin, 15 dakika içinde 100 ul% 4 paraformaldehid ekleyin.
  4. Yıkama hücreleri, PBS içinde 200 ul buz gibi soğuk bir% 70 metanol içinde onları tekrar süspansiyon ve buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin.

Not: Hücreler biyolojik tehlike önlem olmadan şu andan itibaren tedavi edilebilir!

  1. 60 ul ana-karışımı 60 ul PBS + 10 ug / ml Fc bloğu (spesifik olmayan bağlanma bloke etmek için anti-FCR3). Hazırlanması Yıkama hücreleri, PBS + anti-FCR3 40 ul bunları tekrar süspansiyon ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
  2. 20 ul ekleyin PBS + anti-FCR3 1 mg PE-birleştiğinde anti-Foxp3 antikoru içeren, ° C gece boyunca 4 de iyice karıştırın ve kuluçkaya yatmaktadır.
  3. PBS içinde iki kez hücreleri yıkayın ve bir akış sitometresinde hücreleri analiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Virüs Üretim

Yüksek virüs titreleri üretimi için, birincil virüs üretimi veya virüs amplifikasyon HEK293A hücre hasat zamanlaması çok önemlidir. Virüs üretim görsel işaretleri ile Örnek fluoresan ve faz kontrast görüntüleri Şekil 3 'de gösterilmiştir. CPE 10 gün parçası olmayan bir kontrol pCAGAdDu vektörü ile HEK293A hücre sırasında transfeksiyonundan sonra gözlenmiştir. CPE enfeksiyon işaretleyici GFP yüksek ifade ayırmak ve sergilemeye başlar genişlemiş ve yuvarlak-up hücreleri ile alanların görünümünü ile karakterizedir. CPE ölçüde etkili bir virüs üretimi göstergesidir. Hücre kültürü benzer CPE 24 içinde hasat edilebilir gösteren levhalar - 72 saat ve bir ham virüs lizat donma-ve-çözülme döngüleri ile oluşturulabilir. Virüs titresi sonra (Şekil 4) Mol eşit olan enfeksiyonlar karşılaştırma yapmak için, virüs lizatı seri seyreltme ile tespit edilebilir. Lineer aralığı, T 'ye dahilo regresyon analizi denklemi ml sulandırılmamış virüs lizat başına bulaşıcı parçacıkların sayısını hesaplamak için kullanılabilir. Bu örnekte, x için titre = 1 ul 30.016.535 ul -1 ≈ 3 x 10 mi 10 -1.

T Hücre Aktivasyon ve Farklılaşma üzerinde Adenovirüs enfeksiyonu Etkisi değerlendirilmesi

Hedef hücreler üzerindeki adenovirüs transdüksiyon etkileri sadece IRES-GFP (Şekil 5A) ifade eden bir adenoviral vektör kontrolü kullanarak artan nem ile naif CD4 + T hücrelerinin enfekte edilmesi suretiyle değerlendirilmiştir. Enfeksiyon verim farklılaşma Treg indüksiyonundan sonra sabit T hücre numuneleri içinde 72 saat GFP pozitif hücrelerin belirlenmesi FACS analizi ile ölçüldü. GFP pozitif hücrelerin oranı İB enfeksiyonu için kullanılan ile yükseltilir ve İB 50% 84 enfeksiyon ulaşmıştır. İB kullanırken de enfekte olmuş T hücrelerinin daha yüksek yüzdeleri elde değil 50 (veriler gösterilmemiştir) daha yüksek. Rağmen infection verim ilgilenilen genin bağlı olarak, bir tipik bir MOI 50 de hücrelerin% 50'den fazla bulaşabilir değişebilir. MoIS az 1 ila 50, hücre canlılığı (Şekil 5b) etkilenmedi. Önemli olarak, Tregs içine naif T hücrelerinin uyarılması ve farklılaşma olmayan enfekte hücreleri (Şekil 5c) ile karşılaştırıldığında enfekte benzerdi. Adenovirüs transdüksiyon bir anahtar özelliği T hücre aktivasyonu veriyor veya gerektirmeden naif ve dinlenme T hücreleri enfekte yeteneğidir. Bu T hücre aktivasyonu (CD25, CD69, CD44) ve ya adenovirüs enfeksiyonu olmadan ve% 5 CO 37 ° C de 40 saat dinlenme örneklerinde naif (CD62L) T hücrelerinin marker belirteçlerin analiz açıktır 2 inkübatör (Şekil 6). , In vitro T hücre aktivasyonu, anti-CD3 ve anti-CD28 çiftli boncuk önce, enfekte olmuş ve enfekte olmamış T-hücrelerinde CD25 benzer şekilde düşük, düşük CD69 ve CD44 L idiow ama naif ve dinlenme devlet gösteren CD62L yüksek, (Şekil 6, üst panel). T hücre aktivasyonu üzerine, enfekte hücrelerin aktivasyon belirteçleri CD25, CD69 ve enfekte olmamış hücreler (Şekil 6, alt panel) neredeyse ayırt edilemez CD62L ile infekte bir upregülasyonu gösterdi. Bu nedenle, T-hücreleri aktivasyonu durumunu adenovirüslerin tarafından değiştirilmez. % 20 ölü hücreler 40 saat dinlenme olmadan aktivasyonu sonrası - dinlenme aşaması 10 ile karşılaştırıldığında, büyüme faktörleri ve sitokinlerin yokluğunda nedeniyle hücrelerin 60-70% arasında kaybı ile ilişkilidir. 3 x 10 5 hücre ilk hücre sayısı seçerken bu dikkate alınmıştır.

İlgi Çekici Bir Gen aşırı ekspresyonu düzeyi değerlendirilmesi

Adenoviral gen transferi ile elde aşırı miktarını değerlendirmek amacıyla, mikro RNA-155 (miR-155) naif T-hücrelerinde ifade seviyelerini belirlemek için aranan kimiR-155-ifade veya kontrol adenovirüs ya da enfekte olmayan kalmıştı bulaşmış yeniden. Bu olgun miRNA naif T hücrelerinde orta düzeyde ifade edilir ve güçlü T hücre aktivasyonu üzerine neden olur çünkü biz miR-155 seçti. Ayrıca, T-hücresi bağımlı humoral tepkiler 25,26 önemli bir role sahiptir.

MikroRNA aşırı ekspresyonu seviyesi QPCR ile değerlendirildi. Enfeksiyondan sonra, hücreler, 40 saat boyunca dinlenmiş 40 saat için aktive veya aktivasyon 40 saat ve ardından 40 saat dinlendirilir. Dinlenme 40 saat, miR-155 kodlama virüsü ile enfekte naif T hücreleri kontrol virüs ya da non-enfeksiyonlu hücreler (Şekil 7) ile enfekte olmuş hücrelere kıyasla miR-155 arasında yaklaşık 17 kat aşırı sonra gösterilir. Bu neredeyse ölçüde eşleşen endojen miR-155 T hücre aktivasyonu (Şekil 7 ve ref. 25,27) sonra neden olduğu için. Ne olursa olsun hücreler, miR-155 düzeyleri endojen bu güçlü indüksiyon mi bulaşmışR-155 adenovirüs hala virüs ile enfekte ya da enfekte olmayan hücrelere kontrol grubuna göre aktivasyon üzerine miR-155 ifade dört kat artış gösterdi. Ektopik ekspresyonu arasında gözlenen seviyesi başka mikroRNA (veriler gösterilmemiştir) için benzer ölçülerde idi. Büyük uçlar için, aşırı az etkili olabileceğini unutmayın.

T Hücre Farklılaşma Analizi

Veri analizi çeşitli şekillerde gerçekleştirilebilir. Kontrol hücreleri (ilgi geni olmadan bir vektör ile enfekte olmuş hücreler) ve aynı GFP pozitif kapısı farklılaşma ile karşılaştırıldığında, ilgili gen (enfekte olmuş hücrelerde gibi) olan GFP pozitif geçit farklılaşma analizi, önemli farklılıklar tespit etmek için yeterlidir. Ilgi çekici bir genin daha ince etkilerini incelemek için, aynı zamanda (Şekil 8) enfekte olmayan hücreler ile enfekte olan hücrelerde farklılaşma karşılaştırmıştır. Bu bir iç contro olarak görevL ve bir de iç "göreli farklı" hesaplamak için kullanılabilir. Bir virüs farklılaşma üzerinde bir etkisi varsa, "göreceli farklılaşma" ideal 1 olacaktır. Elimizde kontrol virüs için göreceli farklılaşma 0.9 ila 1.1 bir dizi vardır. Bağıl farklılaşma sadece virüs bulaşmış örnekleri kontrol etmek için faiz-enfekte örnekleri gen karşılaştırılması uygulanmalıdır.

Şekil 1
Şekil 1. Adenovirüs nesil şematik gösterimi. Giriş vektörleri (pentr) rekombinasyon donör (AttL1, AttL2), ilgi yan bir gen içerir. Hedef vektör pCAGAdDu E. negatif seçimi için toksin ccdb gene komşu rekombinasyon hedef siteleri (AttR1, AttR2) içerir İlgi konusu genin değiştirilir coliLR rekombinasyon yoluyla. Hedef vektör de çoğaltma eksikliği rekombinant adenovirüs oluşturmak için silindi E1/E3 genler olmadan bir insan tipi 5 adenovirüs genomunun, içerir. Paci lineerleştirme adenoviral genler enfeksiyon oluşturmak için ayı HEK293A hücrelere transfeksiyon önce ters tekrarlar (Re) çıkarır adenovirüs partikülleri sitopatik etkiler ile sonuçlanan. Adenovirüs dondurma-ve-çözülme döngüleri ile üreten hücrelerden hasat edilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. T hücre enfeksiyonu ve farklılaşma şematik gösterimi. Naif T hücreleri PB ile yıkandı, 1.5 saat boyunca bir adenovirüs ile enfekte edilmiştir lizat S ve 37 40 saat T hücre orta °% 5 CO 2 inkübatör C dinlenmiş. Hücreler daha sonra TGFβ ve IL-2 varlığında, anti-CD28 ve anti-CD3 antikoru çiftli boncuklar kullanılarak 72 saat süre ile aktifleştirilmiştir. Sabit ve lekeli hücreler FACS ile analiz edilmiştir, ve enfekte karşı enfekte olmayan hücrelerde Foxp3 ifadesi tespit edilmiştir.

Şekil 3,
Şekil 3,. Sitopatik Lineerleştirilmiş pCAGAdDu vektör 3 ng ile 10 5 HEK293A hücre transfeksiyon gün sonra onda CPE adenovirüs üreten HEK293A hücreleri. Oluşumu etkisi. Sol panelde faz kontrast görüntü gösterir, sağ panel yeşil floresan gösterir.

55/50455fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50455/50455fig4.jpg "/>
Şekil 4. A549 hücreleri enfekte ederek adenovirüs lizatları titresi belirlenmesi. 10 5 A549 hücreleri, belirtilen virüs ile enfekte seyreltme, 48 saat süreyle inkübe edildi ve akış sitometrisi ile enfeksiyon marker GFP tanımı bakımından analiz edildi. GFP pozitif hücrelerin sayısı, kullanılan virüs miktarı karşı çizilir. Seyreltilmemiş virüsün titresi, x = 1.000 ul kullanarak lineer aralığında standart eğriden hesaplanmıştır.

Şekil 5,
Şekil 5,. Bir İçişleri Bakanlığı 1 de adenovirüs enfeksiyonu - 50 T hücre canlılığı veya Treg farklılaşma üzerinde bir etkisi yoktur Naif T hücreleri DO11.10 tg arınmış; CARΔ1 tg fareler farklı Mois de adenovirüs ile enfekte edildi.90 dakika boyunca PBS ile yıkanır, ve T hücre ortamı içinde 40 saat dinlendirilir. Hücreler 72 saat polarize koşulları Treg aktive edildi. Sabit ve lekeli hücrelerin ölü hücre boya dahil edilmesi (b), enfeksiyon işaretleyici GFP (a) ve farklılaşma işaretleyici Foxp3 (c) ifadesi için analiz edildi. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 6,
6 Şekil. Adenovirüslerin T hücrelerinin aktivasyonu durumunu değiştirmez DO11.10 TG naif T hücreleri;. CARΔ1 TG fareler, 90 dakika (çizgiler) ya da (alanlar) sol enfekte olmamış bir MOI 50 de adenovirüs ile enfekte PBS ile yıkandı ve 40 saat dinlenmiş. Hücreler expre için analiz edildiaktivasyon işaretleri önce (üst panel) ve polarize koşulları Treg aktivasyon sonra (alt panel) 40 saat içinde ssion.

Şekil 7
Şekil 7. . Den miR-155 aşırı öncesi ve T hücre aktivasyonu sonra Bağıl Naif T hücreleri DO11.10 tg; CARΔ1 tg fareler microRNA-155 ile İçişleri Bakanlığı 50 de enfekte edildi (miR-155)-ifade veya kontrol adenovirüs, ya da enfekte edilmeden bırakılmıştır. Hücreler daha sonra, 40 saat dinlendirilir 40 saat için aktive ya da 40 saat aktivasyonu takiben 40 saat dinlendirilir edildi. MikroRNA-155 ekspresyonu qPCR SnoRNA202 göre belirlendi.

Şekil 8,
pozitif (yani enfekte hücreleri) Foxp3 yüzdesine göre ifade edilmiştir + hücreleri GFP negatif (enfekte olmayan) hücreleri. Ilgi aşırı ekspresyona uğramış gen farklılaşma Treg üzerinde bir etkisi olsaydı Bağıl farklılaşma, 1 eşittir. 1 Aşağıdaki değerleri bir inhibitör etki gösterir ise 1 Yukarıdaki değerler, farklılaşma üzerinde bir teşvik etkisi gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Virüs Üretimi ve Titrasyon

En iyi sonuçları elde etmek için transfeksiyon, Doğrusallaştırılmış vektör kalitesi ve miktarı en önemli görünmektedir. Enfeksiyon hızla bir kez verimli virüs üretimi oluşur devam edecek beri kültürün bir başlangıç ​​büyüme primer lizat üretim üzerinde olumsuz etkileri gözlenmedi. Ancak, HEK293A hücreler tarafından virüs üretimi verimliliği azaltmak uzun ekler etkilenebilir. Bazı açık okuma çerçeveleri aslında virüs üretimini engelleyebilir bulunmuştur. Bu viral stoklar, tipik olarak amplifikasyon birkaç mermi kurtarılmış edilebilir ve sadece birkaç açık okuma çerçeveleri virüs üretimi ile uyumlu olduğu bulunmuştur. 5 x 10 10 bulaşıcı partikül / ml - Bizim deneyim, virüs amplifikasyon için enfeksiyon sonrası 48 saat içinde CPE görünümünü tipik olarak 1 x 10 9 viral bir lizat verecektir.

Naif T hücrelerinin adenoviral Enfeksiyon

Naif T hücreleri adenoviral enfeksiyon uyarılmadan önce ve sonra T-hücrelerinin aktivasyonu durumu değişmez. Bu iletim sisteminde ilk TCR-stimülasyonu T hücre farklılaşması eğitim için güçlü bir deneysel araçtır. Hücre hala naif ve aktivasyon belirtileri göstermez biz verimli ektopik enfeksiyon sonrası ilgi genlerin ifadesi ve bir seferde 40 saat T hücreleri, 'dinlenme' tespit ettik. Bu, daha sonra T-hücresi aktivasyonu esnasında, ilgilenilen genin aşırı ifade edilir ve daha önce başından T hücre farklılaşması üzerindeki etki anlamına gelir. Böylece, adenoviral iletim elektroporasyon veya aktivasyon gerektirmez ve sadece ilk TCR sinyal 15,28 sonra ilgi bir gen ifade retroviral iletimi üzerinde açık bir avantaja sahiptir. Farklılaşma geç açıdan analiz edilecektir Bununla birlikte, ilgilenilen genin ifadesi ilk T hücresi aktivite önce gerekli değildirtirme, naif T hücreleri de adenoviral iletim hemen sonra uyarılmış olabilir. Adenovirüs enfeksiyonu çok verimli olduğu için, bu tür Thy1.1 veya hCD2 gibi diğer enfeksiyon belirteçleri ifade adenovirüs ile çift enfeksiyonları yaparak ilgi iki genin ortak faaliyetlerini incelemek için uzatılabilir. Ikincisi de antikor yüzey boyama için erişilebilir ve sabitleme sırasında işaretleyici korunmasında zorluklar aşmak olabilir. Aktive edilmiş T-hücreleri ise, adenoviral enfeksiyon çok daha düşük bir etkinliğe sahip ve elektroporasyon ya da retroviral transdüksiyon yöntemler avantajlı olabilir. Adenovirüs uygulama için Başka bir uyarı ifade geçici karakteridir. Adenovirüs hücresinin nükleer matrikse bağlı bir epizom olarak korunur ve T-hücreleri T-hücresi aktivasyonu (veriler gösterilmemiştir.; Ref 17) sonra, 5-7 gün içinde marker geni ifade kaybına yol açan, çoğalırlar olarak seyreltilmiş olacaktır. Buna ek olarak, hücre readil olan adenovirüs-transduseY fare T hücrelerinin adoptif transfer deneyleri, örneğin, in vivo olarak kullanımını sınırlar bozulmamış bir bağışıklık sistemi tarafından tanınan ve ortadan kaldırılmıştır. Adenoviral Sistemin bir diğer potansiyel uygulama DO11.10 tg izole Treg hücrelerin enfeksiyon olabilir; CARΔ1 tg fareler Treg fonksiyonu ya da soy istikrar yönlerini incelemek için.

Enfekte Hücre Adenovirüs Etkileri Doğrulama

Adenovirüs enfeksiyonu verimli ve T hücre canlılığı ve Treg farklılaşma neredeyse hiç etkisi vardı. Bir İçişleri Bakanlığı 50, biz T hücreleri üzerinde adenovirüs enfeksiyonu yan etkileri göz önüne alınmadan en iyi enfeksiyon verimi elde. Bu sistem, genellikle ilgi konusu genin ekspresyonu olmadan boş adenovirüs kullanarak titrasyon deneyleri ile, başka bir hücre kültürü veya farklılaşma durumu için her uygulandığında benzer şekilde tesis edilmesi gerekir. Gibi adenovirüs enfeksiyonu, deney sonucunu etkiler iseBoş adenovirüs ile faiz getiren adenovirüs geninin karşılaştırılması hala ilgi aktarılan genin etkilerini ortaya çıkarmak için uygundur. Adenoviral enfeksiyon hiçbir etkisi yoktur, ölçülen parametre de aynı numunenin enfekte edilmemiş ve enfekte olmuş hücreler arasında kıyaslanabilir.

Veri Analizi

Burada açıklanan tespit yöntemi enfeksiyon marker GFP ile birlikte farklılaşma işaretleyici Foxp3 eşzamanlı bir analizine izin verir, bir 'göreli farklılaşmayı tespit edilebilmesi. Bu dikkate iyi için-iyi varyasyonlar sürdüğü bir örnek içinde iki nüfus Bu analiz, iki örnek arasındaki toplu nüfus karşılaştırmalar daha ince etkileri için daha yüksek duyarlılığa sahiptir. Iyi çapında etkileri, bir salgılanan faktör tarafından uygulanan örneğin etkiler, ihmal olacaktır Ancak, enfekte hücrelere içsel sadece etkileri, bu yöntemle tanınacaktır. Bağıl farklılaşma her kontrol edilmelidirfarklılaşma enfeksiyon kendisinin etkilerini dışlamak için kontrol enfekte hücreleri dahil ederek deney. Yüksek enfeksiyon oranları birkaç örnek arasında toplu karşılaştırmalar olumlu ise en iyi sonucu elde etmek için, bir örnek içinde enfekte olmamış hücrelere enfekte neredeyse eşit oranda, için hedeflenmelidir.

In vitro farklılaşma protokolleri ile birlikte adenovirüs kullanarak naif T hücrelerine Sonuç, gen transferi farklılaşma Treg moleküler temelini araştırmak için güçlü bir sistemdir. Bu bilginin üretimi alerjik ve otoimmün hastalıklara karşı tedavi yaklaşımları içinde Tregs doğan baskın tolerans yararlanmak için izin verebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.

Acknowledgments

Yazarlar tespit protokolünün sağlanması için pCAGAdDU vektör ve Oliver Gorka oluşturmak için Lirui Du teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix Invitrogen 11791020
PacI New England Biolabs R057S
jetPEI Polyplus-transfection 101-10N
HEK293A Cell Line Invitrogen R705-07
A549 ATCC CCL-185
6-well plates BD Falcon 353046
14 cm tissue culture dish Nunc 168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr Taconic Farms Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II Miltenyi Biotech 130-094-131
DMEM Invitrogen 41966-052
FBS PAN Biotech 1502-P110704
PenStrep Invitrogen 15140-122
RPMI 1640 Lonza BE12-167F
NaPyruvate Lonza BE13-115E
NEAA 100x Lonza BE13-114E
L-Glutamine Invitrogen 25030
HEPES Buffer Solution (1 M) Invitrogen 15630-056
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x) Lonza 13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation Invitrogen 114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1 R&D Systems 240B
Proleukin S (18 x 106IE) Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Invitrogen L-23105
Mouse BD Fc BlockT BD Pharmingen 553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE eBioscience 12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay Roche Applied Biosystems 4427975
LightCycler 480 Probes Master Roche Applied Biosystems 04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Roche Applied Biosystems 4366596

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
  2. Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
  3. Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
  4. Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
  5. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  6. Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
  7. Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
  8. Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
  9. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  10. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  11. Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
  12. Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).
  13. Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
  14. Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).
  15. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).
  16. Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
  17. Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
  18. Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4 (2002).
  19. Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
  20. Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
  21. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
  22. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
  23. Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
  24. Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
  25. Thai, T. -H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
  26. Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
  27. Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
  28. Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).

Tags

İmmünoloji Sayı 78 Hücresel Biyoloji Moleküler Biyoloji Tıp Biyomedikal Mühendisliği Biyomühendislik Enfeksiyon Genetik Mikrobiyoloji Viroloji T-lenfositler Mevzuat CD4-pozitif T-lenfositler Mevzuat Adenovirüsler İnsan MicroRNA antijenleri Farklılaşma T-Lenfosit Gen Transferi Teknikleri İletimi Genetik Transfeksiyon Adenovirüs gen transferi mikro RNA aşırı,, CD4 T hücreleri yıkmak düzenleyici T hücre virüs hücre akım sitometri
Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warth, S. C., Heissmeyer, V.More

Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation. J. Vis. Exp. (78), e50455, doi:10.3791/50455 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter