Summary
Adenoviral de transferência do gene em células T CD4 naive com a expressão transgénica do receptor de adenovirus Coxsackie possibilita a análise molecular da diferenciação de células T reguladoras
Abstract
As células T reguladoras (Tregs) são essenciais para proporcionar a auto-tolerância imunológica, bem como para certos antigénios estranhos. Tregs podem ser gerados a partir de células T CD4 + naive in vitro com TCR-e co-estimulação na presença de TGF-p e IL-2. Isso tem um enorme potencial para futuras terapias, no entanto, as moléculas e vias de sinalização que a diferenciação de controle são em grande parte desconhecidos.
As células T primárias podem ser manipulados através da expressão ectópica de genes, mas os métodos comuns não conseguem atingir a mais importante do estado ingénuo da célula T antes do reconhecimento do antigénio primário. Aqui, nós fornecemos um protocolo para expressar genes ectópicas nas células T CD4 ingênuas in vitro antes de induzir a diferenciação Treg. Aplica-se a transdução com o adenovírus deficiente em replicação e explica a sua geração e produção. O adenovirus pode demorar até inserções grandes (até 7 kb), e podem ser equipadas com os promotores para alcançar alta e transitória OVEREXPression nas células T. Ele efetivamente transduz células T rato ingênuos se expressar um receptor adenovírus Coxsackie transgênicos (CAR). Importante, após a infecção, as células T permanecem ingénuo (CD44 baixa, alta CD62L) e de repouso (CD25 -, CD69 -), e podem ser activadas e diferenciadas em Tregs semelhante a células não infectadas. Assim, este método permite a manipulação de diferenciação de células T CD4 desde o seu início. Ele garante que a expressão gênica ectópica já está em vigor quando os eventos de sinalização início da estimulação inicial TCR induz alterações celulares que, eventualmente, levar em Treg diferenciação.
Introduction
Tregs são cruciais para manter a tolerância imunológica e diminuir as respostas imunes overshooting. Tregs suprimem a ativação de células T espectador. Por conseguinte, a ablação de Tregs conduz à autoimunidade fatal e auto-destruição dirigida por células T activadas 1. Tregs desenvolvem-se no timo durante a selecção negativa de células T CD4-positivos precursores única, mas também podem diferenciar na periferia das células T CD4 + naive com a estimulação de antigénio de baixa dose com 1,2 subóptima de co-estimulação. Tímico Tregs parecem suprimir a auto-imunidade de tecidos, contra auto-antigénios, enquanto periférica Tregs têm sido implicadas no fornecimento de tolerância no intestino ou do pulmão. Estes induzida Tregs potencialmente prevenir a ativação de células T após o reconhecimento de antígenos estranhos na mucosa, incluindo antígenos ambientais dos alimentos e do ar, bactérias comensais, e alérgenos 3,4. Além disso, as Tregs são cruciais para estabelecer a tolerância aos péptidos materna e fetal 5 préventilação doença do enxerto-versus-hospedeiro 6. Ao mesmo tempo, também Tregs mediar efeitos indesejados por meio da atenuação de vigilância imunitária de células tumorais 7,8. O recurso marca de Tregs é a expressão do subconjunto-especificar o fator de transcrição Foxp3, um fator de transcrição contendo domínio fork-cabeça que é necessário e suficiente para conferir função Treg 9,10. Algumas vias de sinalização que podem induzir a expressão de Foxp3 é conhecido. No entanto, os processos moleculares que controlam, regulam, modulam ou Treg diferenciação em resposta ao receptor de células T desencadeamento forem menos bem compreendidas.
Tregs pode muito eficazmente ser induzida in vitro através da estimulação das células T CD4 + naive com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 na presença de TGF-p e IL-2 11. Como o Tregs emergentes são funcionais in vivo, a manipulação de moléculas que promovem a diferenciação de Treg tem um enorme potencial para futuro therapies, por exemplo, o tratamento de asma, doença de Crohn, e transplante de 11,12. Por outro lado, a modulação terapêutica de moléculas para bloquear a diferenciação Treg podem proporcionar benefícios em futuras abordagens de tratamento combinado dos pacientes com tumor.
Em ensaios de diferenciação in vitro têm sido fundamentais para a descrição de alterações moleculares que estão associados com a diferenciação subconjunto de células T. No momento, as tentativas experimentais para pesquisa ou na tela para produtos de genes que controlam a diferenciação de células T são dificultados pelo facto de que os métodos mais comuns de expressão do gene ectópico falhar em células T naive. Por exemplo, a transdução retroviral, electroporação e só são eficazes em células T activadas. Em contraste com as expectativas iniciais, transdução lentiviral, que é tipicamente eficaz em células em repouso, requer pre-activação de células T naive por citocinas 13. Além disso, a transferência de cDNA ou mRNA durante electroporaçãoenvolve a despolarização da membrana plasmática, que se confere características de activação das células T e pode mesmo mobilização de Ca2 + sinalização e ativar proteínas NFAT (observação e ref inédito. 14). Da mesma forma, para a transdução retroviral, as células T virgens tem que ser ativado para 18 - 40 hr. Durante este tempo, a ruptura da membrana nuclear durante a divisão celular ocorrer e permite a subsequente integração do genoma do vector retroviral 15. Estes métodos não são, portanto, capazes de dirigir a regulação molecular inicial do encontro de células T inicial com o antigénio, que é a etapa determinante de diferenciação da célula T helper.
Transdução adenoviral é conhecido para conferir a expressão do gene ectópico transitória em um número de tipos de células humanas que expressam o receptor para o adenovírus humano de Coxsackie (CAR). Procede sem necessidade de activação celular ou na progressão do ciclo celular. A expressão de superfície de CRA é essencial para a ligação e internalização do vírus eficiente, e a expressão transgénica da versão truncada CARΔ1 sob um promotor específico de células-T foi encontrada para processar timócitos de ratinho e as células T sensíveis a infecção adenoviral 16. Mais importante, o transgene não se alterar o desenvolvimento de timócitos ou a diferenciação in vitro de células T CD4 + naive em subconjuntos diferentes (dados não mostrados; Ref. 17.). Adenovírus mediada transdução de células T foi usado anteriormente para superexpressão 17,18 e knock-down abordagens 19,20. As células T transgénicas podem ser purificados a partir comercialmente disponível DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. e ref 17.). Importante, a transdução adenoviral permite uma elevada expressão de um gene de interesse em células T virgens sem induzir sinais óbvios de activação. As células T permanecer ingênuo (CD44 baixo, CD62L high) e de repouso (CD25 -, CD69 -) após infectiem e podem ser activadas e diferenciadas em Treg semelhante a células não infectadas.
Produção de adenovírus recombinantes pode ser conseguida após a transfecção de células com plasmídeos HEK293A adenovirais (Figura 1). Estes plasmídeos contêm, tipicamente, o adenovírus tipo 5 do genoma humano com os genes E1 e E3 eliminados para processar os adenovírus recombinantes de replicação incompetente 21. Células HEK293A complementar a deficiência de replicação como eles foram imortalizados através da integração estável de adenovírus cortado 22. Como vectores adenovirais são grandes (~ 40 kb) e, consequentemente, não é adequado para a clonagem da enzima de restrição mediada tradicional, utilizou-se o sistema Gateway. O gene de interesse é, inicialmente, clonado num vector de entrada mais pequena, a partir da qual ele pode ser facilmente transferido para o vector adenoviral de destino por via da reacção de recombinação lambda (LR) 23. Construímos o pCAGAdDu vectorcombinando o promotor CAG (promotor de actina de galinha e intensificador de CMV), com uma cassete de expressão contendo LR locais flanqueando o marcador procariota selecção ccdB 24. Esta cassete de expressão está fundido com um local de entrada interno do ribossoma (IRES), elemento que permite a co-expressão do marcador de infecção melhorada proteína fluorescente verde eucariota (eGFP), que está fundido com uma sequência que contém a hormona de crescimento bovina poli (A) do sinal. Escolhemos as sequências de cis-reguladoras CAG, uma vez que o promotor de CMV prototípico foi encontrado para ser altamente dependente da activação e, portanto, desfavorável para a expressão de genes em células T naive.
Aqui, nós fornecemos um protocolo eficiente para a diferenciação Treg vitro e um método para a transdução de células T CD4 naive sem activação (Figura 2). O método permite a expressão gênica ectópica ou derrubar CD4 anteriores diferenciação de células T no estado ingênuo. Ele permite testar o efeito de uma overexpressed gene de interesse durante os eventos de sinalização início após a estimulação inicial até TCR compromisso subconjunto de células T. Nossos experimentos de validação também fornecem a base para estabelecer a aplicação adenovírus semelhante na diferenciação de outros subgrupos de células T, como Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, ou células TFH.
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Protocol
1. A clonagem de um gene de interesse num vector de entrada
- Clonar o gene de interesse num vector de entrada. A amplificação por PCR do gene seguido por ligação blunt-end num vector de topoisomerase acoplado (por exemplo, pENTR / D-TOPO) ou enzima de restrição mediada clonagem pode ser utilizado para este procedimento.
2. Transferir o gene de interesse para o pCAGAdDu Destino Vector
- Transferência do gene de interesse a partir do vector de entrada no vector de destino por LR recombinação (por exemplo, mistura de Gateway LR Clonase Enzima II). Isto irá criar o vector de expressão de adenovírus (Figura 1).
- Linearizar 10 ug do vector de expressão de adenovírus numa digestão de restrição PacI, precipitar o ADN e ressuspender em água a uma concentração de 3 ug por 100 ul. A linearização liberta as repetições invertidas virais (ITRs), que são necessários para a replicação e encapsidação do vADN Iral em partículas de vírus.
3. A geração do vírus lisado Primária
- Semente de 1 x 10 5 células HEK293A em 2 ml de meio de cultura celular (DMEM, 10% FBS, 5% de PenStrep) em um poço de uma placa de 6 poços e incubar as células durante 6-14 horas a 37 ° C num 10% incubadora de CO 2 para permitir que adiram. As células devem ser, em seguida, a cerca de 50% de confluência.
- A lipofecção: Transferência 6 ul de reagente jetPEI em 94 ul de 50 mM de NaCl, de forma breve vórtice. Adicionar a solução da mistura de 100 ul vector de adenovírus linearizado enquanto vórtex e incubar essa mistura de transfecção durante 15 - 30 min à temperatura ambiente.
Executar todas as etapas nas condições de biossegurança adequadas para infecção adenovírus!
- Dispensar a solução gota a gota sobre a célula contendo HEK293A bem e incubar as células a 37 ° C e 10% de CO 2. Quando se utiliza um marcador de fluorescência, avaliar a transfeeficiência cção visualmente após 12-36 horas usando um microscópio de fluorescência invertido. Adicionar 0,5 ml de meio fresco a cada 3 dias.
- Verifique a cada 2 - 3 dias com um microscópio de luz ou de fluorescência para efeitos citopáticos (CPE), que são áreas com células ampliadas e arredondadas que começam a destacar. Isto é indicativo de geração de vírus eficiente. Após a ocorrência de zonas mais amplas de CPE (Figura 3), vai demorar 24-72 horas antes de todas as células são infectadas.
- Quando todas as células apresentam sinais de CPE, mas antes de uma separação total das células ocorre, separar as células por pipetagem suave e transferência de células com o sobrenadante (SN, 3-5 mL) para um tubo de poliestireno de 15 ml.
- Congelar as células no SN em gelo seco durante 15 - 20 min e descongelar-los rapidamente a 37 ° C depois da ruptura das células. Repetir este-e-ciclo congelação-descongelação (F / CT) mais duas vezes. Manter o lisado de vírus primário em gelo para o uso dentro de um dia ou de congelar a -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Qualquer F adicional/ TC irá reduzir o título de vírus por 30 - 50%.
4. Amplification vírus
- Sementes e crescer as células HEK293A a 90% de confluência num prato de 14 cm de tecido de cultura.
- Infectar as células com metade do lisado de vírus principal (1.5 - 2,5 ml) e incubar as células durante pelo menos 36 horas. Quase todas as células infectadas devem ser, em seguida, o que pode ser determinado por microscopia de fluorescência. Para a re-amplificação de um stock de virus já amplificado (ou seja, mais concentrado), infectar HEK293A a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 50 (ver 6.3).
- As células devem ser colhidas quando todos eles mostram CPE, mas antes de desapego. Com a produção de vírus eficiente este estado é alcançado dentro de 48 horas após a infecção. (Se demorar até uma semana, considerar uma outra rodada de amplificação, aumentando a quantidade de estoque adenovírus usado para a infecção descrito no ponto 4.2.)
- Retire as células por pipetagem suave e células de transferência e SN para um tubo de poliestireno de 50 ml. Girar células para baixo a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Remover o SN e ressuspender o sedimento em um volume apropriado de meio ou SN (ca. 1 mL).
- Realizar 3 F / CT perturbar as células e centrifugar a 800 xg durante 15 min a 4 ° C. Retire a SN que contém as partículas virais (isto é, o lisado de vírus concentrado), e do lisado de vírus aliquota para armazená-lo a -80 ° C.
5. Vírus Titer Determinação
- Semente 10 5 células A549 por cavidade em cinco poços de uma placa de 12 poços em 1 ml de meio e deixar as células aderir durante 6 horas.
- Use 1 ul de adenovírus concentrado (descongeladas em gelo) para realizar uma diluição em série em meio (1:5.000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) e adicionam-se 10 ul por poço. Deixar um poço não infectado para ajustar o gating em citometria de fluxo.
- Após 36 horas, retire a SN, lave com células PBS e detach (por exemplo, por tripsinização). Para precauções de risco biológico, é recomendado para corrigir cells em 100 uL de paraformaldeído 4% em PBS durante 10 min à temperatura ambiente e lavagem com PBS uma vez.
- Faça uma análise FACS de expressão do marcador da infecção. Plot 'ul de lisado viral aplicado »contra o número absoluto de células infectadas (Figura 4). Determinar o intervalo linear da infecção e calcular o título de vírus por ml não diluído a partir da curva padrão no intervalo linear utilizando x = 1.000 ul.
6. Infecção celular T
- Isolar células T CD4 naive / descanso de DO11.10 tg; camundongos tg CARΔ1 usando MACS (Naive CD4 + T Cell Isolation Kit II) ou FACS classificação (CD4 + CD25-CD62L-CD44 +).
- Para as experiências de pequena escala, pipetar um volume adequado de lisado viral para obter um MOI de 50 para um poço de uma placa de 96 poços de fundo redondo.
- Adicionar até 4 x 10 5 células T num volume final de infecção de 50 ul, em meio de células T (RPMI 1640, 10% de FBS, 5% de PenStrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM Essencialvitamina, 1x L-glutamina, 1:250.000 mercaptoetanol, HEPES 10 mM).
Exemplo:
Uma MOI de 50 será utilizado para infectar 3 x 10 5 células T; o título viral é de 3 x 10 9 mL1
Vírus de volume = MOI x número de células T / título viral = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 9 ml -1) = 0.005 ml
Nota: para a infecção do número de células maiores, ampliar usando um MOI de 50 em um volume de infecção de 165 mL por 10 6 células T virgens em um tubo de poliestireno com o copo solta (até tp 3 ml por tubo).
- Incubar as células durante 90 min a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora.
- Gire as células a 300 xg por 5 min à temperatura ambiente, tire SN, ressuspender em 200 mL PBS. Centrifugar novamente e tirar SN.
(Opcional: as células podem ser lavadas outra vez para remover o vírus de forma mais eficiente)
- Ressuspender as célulasem 200 ul de meio de células T sem os anticorpos estimulantes e sem IL-2 ou outras citocinas e descanse por 40 horas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora para permitir a expressão do gene de interesse antes da activação.
7. Ativação de células T e Polarização
- Pipetar um volume de anti-CD3 e anti-CD28 contas acoplados que é igual ao número de células (por exemplo, 4 x 10 5) em um copo pequeno de reagente, adicionar o volume 10 vezes maior de PBS e colocá-los em um ímã para 2 min . Retire o sobrenadante e ressuspender as esferas em 200 ul de meio de polarização (Tregs: meio de células T + 1 ng / ml de TGF-p, com 100 U / ml de IL-2).
Nota: As células também pode ser activado usando pratos de cultura de tecidos revestidas com anticorpos anti-CD28 e anti-CD3, ou de uma forma específica do receptor de células T usando DO11.10 irradiados BALB / c esplenócitos pulsadas com o péptido de ovalbumina 323-339 antigénio.
- Centrifuge descansou a células de antes, tirar o SN e Ressuspender as células em 200 mL meio de polarização contendo anti-CD3 e anti-CD28-anticorpo acoplado contas. Incubar durante 72 horas a 37 ° C numa incubadora de 5% de CO 2, sem alterar médio.
8. T fixação das células e coloração para Citometria de Fluxo
- Lave as células: Gire as células a 300 xg por 5 min à temperatura ambiente, tire SN, ressuspender em 200 mL PBS. Centrifugar novamente e tirar SN. Executar todas as etapas de lavagem em conformidade.
- Ressuspender as células em 100 ul de solução de coloração de células fixável mortos e incubar durante 30 min a 4 ° C.
- Lavar as células, ressuspender em 100 ul de PBS, adicionar 100 uL de paraformaldeído 4% em PBS, incubar 15 min a RT.
- Lavar as células, ressuspender em 200 ul deles gelada metanol a 70% em PBS, e incubar durante 30 min em gelo.
Nota: As células podem ser tratadas a partir de agora, sem precauções de risco biológico!
- Preparar 60 ul mestre de mistura de 60 ul de PBS + 10 ug / ml de Fc-bloco (anti-FCR3 para bloquear a ligação inespecífica). Lavar as células, ressuspender-los em 40 ul de PBS + anti-FCR3 e incubar 15 min a RT.
- Adicionar 20 ul de PBS + anti-FCR3 contendo 1 ug de PE-anti-anticorpo acoplado Foxp3, misturar bem e incubar a 4 ° C durante a noite.
- Lave as células duas vezes em PBS e analisar as células de um citómetro de fluxo.
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Representative Results
A produção de vírus
Para a geração de títulos elevados de vírus, o período de colheita de células HEK293A na produção de vírus ou de amplificação de primário de vírus é crucial. Representativos fluorescentes e as imagens de contraste de fase com os sinais visuais de produção de vírus estão apresentados na Figura 3. O CPE, foram observadas 10 dias após a transfecção de células com um HEK293A pCAGAdDu vector de controlo sem inserção. CPE são caracterizadas pelo aparecimento de zonas com células aumentadas e round-up que começam a separar e exibem expressão elevada da infecção marcador GFP. A extensão do CPE é indicativo de geração de vírus eficiente. Placas de cultura de células que mostram CPE semelhante pode ser colhida dentro de 24 - 72 h, e um lisado de vírus em bruto pode ser gerado por ciclos de congelação-e-descongelação. O título de vírus pode então ser determinada por diluição em série do vírus ligado para permitir a comparação de infecções com um MOI igual (Figura 4). Dentro da gama linear, tele equação da análise de regressão pode ser usada para calcular o número de partículas infecciosas por ml de lisado de vírus não diluído. No exemplo, o título para x = 1 ul é 30016535 ul -1 ≈ 3 x 10 10 mL -1.
Avaliando o impacto da infecção pelo adenovírus em ativação de células T e Diferenciação
Os efeitos da transdução de adenovirus em células alvo foram avaliadas pela infecção de células T CD4 + naive com MOIs crescentes utilizando um vector de controlo de adenovírus que expressa apenas IRES-GFP (Figura 5a). A eficiência da infecção foi medida por análise FACS determinação células GFP positivas em amostras de células T fixos de 72 h após a indução da diferenciação Treg. A taxa de células GFP positivas aumentou com a MOI utilizado para a infecção e atingiu 84% da infecção a um MOI de 50. Não obtenção de muito mais elevadas percentagens de células T infectadas pelo uso MOI superior a 50 (dados não mostrados). Apesar de inferioridadecção eficiência pode variar dependendo do gene de interesse, pode-se infectar tipicamente mais de 50% das células a um MOI de 50. No MOIs entre 1 e 50 a viabilidade celular não foi afetada (Figura 5b). Importante, a estimulação e a diferenciação de células T naive em Tregs foi semelhante no infectados em comparação com as células não-infectadas (Figura 5c). Uma propriedade fundamental da transdução de adenovírus é a sua capacidade de infectar as células T virgens e de descanso sem conferir ou exigir a ativação de células T. Isto é evidente a partir da análise dos marcadores de activação das células T (CD25, CD69, CD44) e o marcador de células T ingénuas (CD62L) em amostras com ou sem infecção com adenovírus e repouso de 40 horas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora (Figura 6). Antes da activação in vitro de células T com anti-CD3 e anti-CD28 grânulos acoplados, as células T infectadas e não infectadas foram similarmente baixa CD25, CD69 e CD44 l acessívelow, mas de alta CD62L, demonstrando seu estado ingênuo e de repouso (Figura 6, painéis superiores). Após activação das células T, as células infectadas mostraram a sobre-regulação de marcadores de activação CD25, CD69 e regulação negativa de CD62L quase indistinguíveis das células não infectadas (Figura 6, painéis inferiores). Assim, o estado de activação das células T não é afectada por infecção com adenovírus. A fase de repouso está associada com a perda de 60 a 70% das células, devido à ausência de factores de crescimento ou citocinas, em comparação com 10 - 20% de células mortas após 40 horas de activação sem descanso. Isso foi levado em conta ao escolher o número de 3 x 10 5 células célula inicial.
Avaliando a superexpressão nível de um gene de interesse
A fim de avaliar a quantidade de sobre-expressão conseguido por transferência do gene adenoviral, procurou-se determinar a microRNA-155 (miR-155), os níveis de expressão em células T ingénuas queestá infectado com o miR-155-expressar ou adenovírus controle ou foram deixados não infectado. Escolhemos o miR-155 uma vez que este miRNA maduro é expresso em níveis moderados em células T naive e torna-se fortemente induzida por activação de célula T. Além disso, tem um papel crucial em dependentes de célula T resposta humoral 25,26.
O nível de sobre-expressão de microRNA foi avaliada por qPCR. Após a infecção, as células foram descansou por 40 horas, ativado por 40 horas, ou descansado 40 horas seguidas por 40 horas de ativação. Após 40 horas de repouso, as células T ingénuas infectadas com vírus de miR-155 que codifica exibidos uma superexpressão de aproximadamente 17 vezes de miR-155 em comparação com células infectadas com vírus ou células de controlo não infectados (Figura 7). Isto corresponde quase a extensão em que o miR-155 endógeno é induzida após activação de células T (Figura 7 e ref. 25,27). Independentemente desta forte indução da endógeno miR-155 níveis, as células infectadas com milhasR-155 de adenovirus ainda mostrou aumento de cerca de quatro vezes na expressão de miR-155 em comparação com o controlo de activação de células infectadas com vírus ou não infectada. O nível de sobre-expressão ectópica observada era comparável para outros microRNAs (dados não mostrados). Por favor, note que para grandes inserções, a superexpressão pode ser menos eficaz.
Análise da diferenciação de células T
A análise dos dados pode ser realizada de várias maneiras. Análise de diferenciação no portão GFP positivo de um gene de interesse (isto é, nas células infectadas) em relação à diferenciação no mesmo portão GFP positivo das células de controlo (células infectadas, utilizando um vector, sem gene de interesse) é suficiente para detectar diferenças substanciais. Para estudar os efeitos mais subtis de um gene de interesse, comparamos a diferenciação em células infectadas com o das células não infectadas do mesmo poço (Figura 8). Estes servem como um contro internol e pode ser utilizado para calcular a "diferenciação relativa" no interior de um poço. Se um vírus não tem nenhum efeito sobre a diferenciação, a "diferenciação relativa" irá ser idealmente uma. A diferenciação relativa para o vírus de controlo nas nossas mãos tem uma gama de 0,9 a 1,1. Diferenciação relativa deve ser aplicado apenas para comparação gene de interesse amostras infectadas para controlar amostras infectadas pelo vírus.
Figura 1. Representação esquemática da geração de adenovírus. Vetores de entrada (pENTR) contêm áreas doadoras de recombinação (AttL1, AttL2), que ladeiam um gene de interesse. O destino vetor pCAGAdDu contém os sítios-alvo de recombinação (attr1, attr2) flanqueando o gene CCDB toxina para a seleção negativa em E. coli, que é substituído pelo gene de interesseatravés de recombinação LR. O vector de destino também contém um genoma de adenovírus tipo 5 humano, sem genes E1/E3, que foram suprimidos para gerar adenovírus recombinantes deficientes na replicação. PacI liberta linearização repetições invertidas (ITR), antes da transfecção para células HEK293A que carregam os genes de adenovirus para gerar infecciosa partículas de adenovirus que resultam em efeitos citopáticos. Adenovírus é colhida a partir de células produtoras de ciclos de gelo-e-descongelamento. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 2. Representação esquemática da infecção de células T e de diferenciação. Células T naive foram infectadas com adenovírus ligado durante 1,5 h, lavou-se com PB S e descansou em meio de células T durante 40 horas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora. As células foram então activadas durante 72 horas utilizando os anticorpos anti-CD28 e anti-CD3 grânulos anticorpo acoplado na presença de TGF-p e IL-2. As células fixadas e coradas foram analisadas por FACS, e a expressão de Foxp3 nas células infectadas e não-infectadas foi determinada.
Figura 3. Efeito citopático de adenovírus células produtoras HEK293A. Ocorrência de CPE em dez dias após a transfecção de 10 5 células HEK293A com 3 ng de linearizada pCAGAdDu vetor. O painel da esquerda mostra a imagem de contraste de fase, o painel da direita mostra a fluorescência verde.
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Figura 4. Determinação do título de lisados de adenovírus por infecção de células A549. 10 5 células A549 foram infectadas com o vírus da diluição indicada, incubadas durante 48 horas e analisadas para a expressão do marcador de infecção de GFP por citometria de fluxo. O número de células GFP positivas é representada graficamente contra a quantidade de vírus utilizado. O título de vírus não diluído é calculada a partir da curva padrão no intervalo linear utilizando x = 1.000 ul.
Figura 5. Infecção por adenovírus a uma MOI de 1-50 não tem nenhum efeito sobre a viabilidade das células T ou a diferenciação de células T naive Treg purificada a partir DO11.10 tg; ratinhos tg CARΔ1 foram infectadas com adenovírus em diferentes MOI.durante 90 min, lavadas com PBS e repousou durante 40 horas em meio de células T. As células foram ativadas em Treg condições de polarização durante 72 horas. As células fixadas e coradas foram analisadas quanto à incorporação de corante de células mortas (b), a expressão do marcador de infecção GFP (a) e do marcador de diferenciação Foxp3 (c). clique aqui para ver figura maior .
Figura 6. Infecção com adenovírus não altera o estado de activação das células T a partir de células T Naive DO11.10 tg,. CARΔ1 ratinhos tg foram infectadas com adenovírus a uma MOI de 50 durante 90 min (linhas) ou para a esquerda não infectado (zonas), lavadas com PBS e descansou por 40 horas. As células foram analisadas para expression de marcadores de ativação antes (painéis superiores) e depois (painéis inferiores) 40 h de ativação em Treg condições de polarização.
Figura 7. . Relativos superexpressão de miR-155 antes e após a ativação da célula T células T ingênuo DO11.10 tg, tg CARΔ1 camundongos foram infectados em um MOI de 50 com microRNA-155 (miR-155) expressando ou adenovírus controle, ou para a esquerda não infectado. As células foram então descansou por 40 horas, ativado por 40 horas, ou descansado 40 horas seguidas por 40 horas de ativação. Expressão de microRNA-155 foi determinada em relação ao SnoRNA202 por qPCR.
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Discussion
Geração de vírus e Titulação
Para obter resultados de transfecção ideais, a qualidade ea quantidade de linear vetor aparecem mais importante. Não foram observados efeitos negativos sobre a produção primária a partir de um lisado supercrescimento inicial da cultura, desde a infecção prosseguir rapidamente uma vez que a produção de vírus eficiente ocorre. No entanto, a produção de vírus por células HEK293A pode ser afectada por inserções longas que reduzem a eficiência. Algumas estruturas de leitura abertas foram, na verdade, verificou-se interferir com a produção de vírus. Essas ações virais geralmente pode ser resgatado por meio de vários ciclos de amplificação, e apenas alguns quadros de leitura abertos foram considerados incompatíveis com a produção de vírus. A partir da nossa experiência, o aparecimento do CPE dentro de 48 horas após a infecção para a amplificação de vírus irá tipicamente produzir um lisado virai de cerca de 1 x 09-5 outubro 10 x 10 partículas infecciosas / ml.
Infecção adenovírus de células T Naive
Infecção adenoviral de células T naive não muda o estado de activação das células T, antes e após a estimulação. Isso faz com que o sistema de transdução de uma ferramenta poderosa para o estudo experimental a diferenciação de células T a partir de TCR-estimulação inicial em. Nós determinamos expressão ectópica eficiente de genes de interesse após a infecção e 'descanso' de células T por 40 horas, em um momento em que o celular ainda é ingênuo e não mostra sinais de ativação. Isto significa que, durante a subsequente activação das células T, o gene de interesse já é abundante e pode exercer a sua influência sobre a diferenciação de células T a partir do início. Assim, a transdução de adenovírus tem uma clara vantagem sobre eletroporação ou transdução retroviral, que requer ativação e expressar um gene de interesse somente após inicial TCR sinalização 15,28. No entanto, se os aspectos finais da diferenciação deve ser analisada e a expressão do gene de interesse não é necessária antes da primeira célula T activção, as células T virgens assim como pode ser estimulada imediatamente após a transdução de adenovírus. Uma vez que a infecção de adenovírus é muito eficiente, que pode ser estendido para estudar as actividades de cooperação de dois genes de interesse, através da realização de infecções duplas com adenovírus que expressam outros marcadores de infecção, tais como Thy1.1 ou hCD2. O último também é acessível para a coloração de superfície do anticorpo e podem contornar as dificuldades na preservação marcador durante a fixação. Em células T activadas, no entanto, a infecção adenoviral tem uma eficiência muito menor, e electroporação ou métodos de transdução retroviral pode ser favorável. Outra ressalva para aplicação adenovírus é o caráter transitório de expressão. O adenovírus é mantida como um epissoma ligado à matriz nuclear da célula e serão diluídas como as células T proliferam, conduzindo a perda de expressão do gene marcador dentro de cinco a sete dias após a activação das células T (dados não apresentados;. Ref. 17). Além disso, as células transduzidas com adenovírus são readily reconhecidas e eliminadas por um sistema imunitário intacto, o que limita o seu uso in vivo, por exemplo, em experiências de transferência adoptiva de células T no rato. Outra aplicação potencial do sistema adenovírus poderia ser a infecção de células Treg isoladas de DO11.10 tg; CARΔ1 camundongos tg para estudar a função Treg ou aspectos de estabilidade linhagem.
Validação dos Efeitos sobre as células infectadas por adenovírus
Infecção por adenovírus foi eficiente e quase nenhuma influência sobre a viabilidade das células T e diferenciação Treg. A uma moi de 50, obteve-se a melhor eficiência de infecção, sem observar os efeitos adversos da infecção com adenovírus nas células T. Isto tem de ser estabelecida de forma semelhante, sempre que o sistema é aplicado à outra cultura celular ou condição diferenciação, tipicamente por experiências de titulação utilizando adenovírus vazio sem expressão do gene de interesse. Se a infecção de adenovírus, como tal, não afecta o resultado da experiência,a comparação do gene de adenovírus juros com adenovírus vazio ainda é apropriado para descobrir os efeitos do gene transferido de interesse. Se não há qualquer efeito de infecção adenoviral, o parâmetro medido podem também ser comparados entre as células não infectadas e infectadas com a mesma amostra.
Análise de Dados
O método de fixação aqui descrito permite a análise simultânea de diferenciação marcador Foxp3, juntamente com o marcador GFP infecção, portanto, uma «relação de diferenciação" pode ser determinada. Esta análise de duas populações dentro de uma amostra tem maior sensibilidade para efeitos sutis do que as comparações população em massa entre duas amostras, uma vez que leva variações bem-bem em conta. No entanto, apenas os efeitos intrínsecos às células infectadas será reconhecido por este método, enquanto que os efeitos bem largas, por exemplo, as influências exercidas por um factor secretado, iria ser negligenciada. Diferenciação relativa deve ser controlada em cadaexperimento, incluindo as células infectadas pelo controle para excluir efeitos da própria infecção na diferenciação. Para melhores resultados, uma taxa quase igual de infectados com células não infectadas dentro de uma amostra deve ser orientado para, enquanto que as taxas de infecção mais elevadas são favoráveis em comparação a granel, entre várias amostras.
Em conclusão, a transferência de genes em células T ingénuas utilizando adenovírus combinado com os protocolos de diferenciação in vitro é um sistema poderoso para investigar a base molecular da diferenciação Treg. Isso pode permitir que a geração de conhecimento para explorar a tolerância dominante conferida por Tregs nas abordagens terapêuticas contra doenças alérgicas e auto-imunes.
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Disclosures
Os autores declaram que não há conflito de interesse.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Lirui Du para a construção do vetor pCAGAdDU e Oliver Gorka para a prestação do protocolo de fixação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| PacI | New England Biolabs | R057S | |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N | |
| HEK293A Cell Line | Invitrogen | R705-07 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 14 cm tissue culture dish | Nunc | 168381 | |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 | |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E | |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Invitrogen | 15630-056 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | |
| MEM Essential vitamin mixture (100x) | Lonza | 13-607C | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation | Invitrogen | 114-56D | |
| Recombinant Human TGF-beta 1 | R&D Systems | 240B | |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | ||
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 | |
| Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 | |
| Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 | |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
References
- Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
- Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
- Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
- Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
- Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
- Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
- Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
- Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).
- Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
- Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).
- Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).
- Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
- Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
- Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4 (2002).
- Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
- Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
- Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
- Thai, T. -H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
- Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
- Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
- Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).
