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Immunology and Infection

Transduction Adenoviral de CD4 naïfs cellules T pour étudier la différenciation Treg

Published: August 13, 2013 doi: 10.3791/50455
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Molecular Immunology, Helmholtz Zentrum München

Summary

Le transfert de gène adénoviral en CD4 des cellules T naïves avec expression transgénique du récepteur de l'adénovirus Coxsackie permet l'analyse moléculaire de la différenciation des cellules T régulatrices

Abstract

Les cellules T régulatrices (Treg) sont essentielles pour assurer la tolérance immunitaire à l'auto ainsi que pour certains antigènes étrangers. Tregs peut être généré à partir de cellules T CD4 naïves in vitro avec le TCR et co-stimulation en présence de TGF et de l'IL-2. Cela porte un énorme potentiel pour de futurs traitements, cependant, les molécules et les voies de signalisation que la différenciation de contrôle sont largement inconnues.

Les cellules T primaires peuvent être manipulés par l'expression des gènes extra-utérine, mais les méthodes communes parviennent pas à cibler l'état naïf le plus important de la cellule T avant la reconnaissance de l'antigène primaire. Ici, nous fournissons un protocole d'exprimer des gènes extra-utérines en cellules T CD4 naïves in vitro avant d'induire la différenciation Treg. Elle s'applique transduction avec l'adénovirus déficient pour la réplication et explique sa génération et de la production. L'adénovirus peut prendre jusqu'à de grands inserts (jusqu'à 7 ko) et peut être équipé avec les promoteurs pour atteindre la haute et transitoire OVEREXPression dans les cellules T. Il transduit efficacement les lymphocytes T de souris naïves si elles expriment un récepteur de l'adénovirus Coxsackie transgénique (CAR). Surtout, après l'infection, les lymphocytes T restent naïfs (CD44 faible, CD62L élevé) et de repos (CD25 -, CD69 -) et peuvent être activées et différenciées en Tregs similaires aux cellules non-infectées. Ainsi, cette méthode permet la manipulation de cellules CD4 T différenciation cellulaire depuis ses débuts. Il assure que l'expression des gènes extra-utérine est déjà en place lorsque les événements de signalisation précoces de la stimulation initiale TCR induit des changements cellulaires qui aboutissent dans Treg différenciation.

Introduction

Tregs sont cruciales pour maintenir la tolérance immunitaire et à atténuer la réponse immunitaire de surréaction. Tregs supprimer l'activation des cellules T du spectateur. Par conséquent, l'ablation des Tregs conduit à l'auto-immunité fatal et l'auto-destruction entraînée par les cellules T activées 1. Tregs se développent dans le thymus au cours de sélection négative des CD4 précurseurs mono-positifs, mais ils peuvent aussi faire la différence dans la périphérie de CD4 des lymphocytes T naïfs lors de la stimulation antigénique faible dose optimale avec 1,2 co-stimulation. Thymique Tregs semblent supprimer l'auto-immunité tissu contre des auto-antigènes, alors que périphérique Tregs ont été impliqués dans la fourniture de tolérance dans l'intestin ou du poumon. Ceux-ci induit Tregs puissamment prévenir l'activation des lymphocytes T après la reconnaissance d'antigènes étrangers dans la muqueuse, y compris antigènes environnementaux de la nourriture et de l'air, les bactéries commensales, et les allergènes 3,4. En outre, les Tregs sont essentielles pour établir la tolérance maternelle de peptides fœtales 5 et à prévent la maladie du greffon contre l'hôte 6. Dans le même temps, Tregs également médier les effets indésirables en atténuant la surveillance immunitaire des cellules tumorales 7,8. La fonction caractéristique de Tregs est l'expression de la sous-spécification transcription Foxp3 facteur, un facteur de transcription contenant un domaine fourche tête qui est nécessaire et suffisante pour conférer une fonction 9,10 Treg. Certaines voies de signalisation qui peuvent induire l'expression de Foxp3 sont connus. Cependant, les mécanismes moléculaires qui contrôlent, réguler ou moduler Treg différenciation en réponse au récepteur des cellules T déclenchement sont moins bien compris.

Tregs peut être très efficace induite in vitro par la stimulation des cellules T CD4 naïfs avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 en présence de TGF et IL-2 11. Comme les Tregs émergents sont fonctionnelles in vivo, la manipulation de molécules qui favorisent la différenciation Treg porte un énorme potentiel pour l'avenir therapies, par exemple, le traitement de l'asthme, la maladie de Crohn et la transplantation 11,12. Inversement, la modulation thérapeutique de molécules afin de bloquer la différenciation Treg peut offrir des avantages dans les futures approches de traitement combiné des patients atteints de tumeurs.

Dans les essais de différenciation in vitro ont joué un rôle important pour la description des changements moléculaires qui sont associés avec T différenciation de sous-ensemble de cellules. À l'heure actuelle, les tentatives expérimentales à la recherche ou à l'écran pour les produits de gènes qui contrôlent la différenciation des cellules T sont entravés par le fait que les méthodes les plus courantes de l'expression des gènes extra-utérine ne parviennent pas dans les cellules T naïves. Par exemple, l'électroporation et la transduction rétrovirale ne sont efficaces que dans les cellules T activées. Contrairement aux attentes initiales, la transduction lentivirus, qui est généralement efficace dans les cellules au repos, nécessite de pré-activation des cellules T naïves par des cytokines 13. En outre, le transfert de l'ADNc ou de l'ARNm durant l'électroporationimplique une dépolarisation de la membrane plasmique, qui lui-même confère des caractéristiques de l'activation des cellules T et peut même mobiliser Ca 2 + signalisation et activer des protéines NFAT (observation et ref inédit. 14). De même, pour la transduction rétrovirale, les cellules T naïves doivent être activés pour 18 - 40 h. Pendant ce temps, la répartition de la membrane nucléaire au cours de la division cellulaire se produit et permet l'intégration de la génomique ultérieure du vecteur rétroviral 15. Ces méthodes ne sont donc pas en mesure de répondre à la régulation moléculaire début de la rencontre initiale des lymphocytes T avec l'antigène, qui est la phase décisive de la différenciation des cellules T helper.

Transduction adénovirus est connue pour conférer une expression ectopique du gène passagère dans un certain nombre de types de cellules humaines qui expriment le récepteur de l'adénovirus humain Coxsackie (CAR). Il procède sans obligation pour l'activation de la cellule ou de la progression du cycle cellulaire. L'expression de surface de CAR est essentiel pour la fixation du virus efficace et l'intériorisation et l'expression transgénique de la version tronquée CARΔ1 sous un promoteur spécifique des cellules T a été trouvée pour rendre thymocytes de souris et des cellules T sensibles à l'infection par adénovirus 16. Surtout, le transgène ne modifie pas le développement des thymocytes ou la différenciation in vitro des cellules CD4 T naïfs cellules dans différents sous-ensembles (données non présentées; ref 17).. Transduction adénovirus des cellules T a déjà été utilisé pour la surexpression 17,18 et knock-down approches 19,20. Les cellules T transgéniques peuvent être purifiés à partir de commerce DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. et ref 17).. Surtout, transduction adénovirale permet une haute expression d'un gène d'intérêt dans des cellules T naïves sans induire des signes évidents d'activation. Les lymphocytes T restent naïfs (CD44 faible, CD62L élevé) et de repos (CD25 -, CD69 -) après infectisur et peut être activée et différenciée en Treg similaire aux cellules non infectées.

Production d'adénovirus recombinants peut être atteint après transfection de cellules avec des plasmides HEK293A adénoviraux (Figure 1). Ces plasmides contiennent généralement du génome de l'adénovirus humain de type 5 avec les gènes E1 et E3 supprimées pour rendre adénovirus recombinants incompétent pour la réplication 21. Cellules HEK293A complètent carence de réplication tels qu'ils ont été immortalisés par l'intégration stable de l'adénovirus 22 cisaillé. Depuis vecteurs adénoviraux sont grandes (~ 40 kb) et par conséquent pas bien adapté pour l'enzyme de restriction induite par clonage traditionnel, nous avons utilisé le système de passerelle. Le gène d'intérêt est initialement clonée dans un vecteur d'entrée plus petit, à partir de laquelle il peut être facilement transféré dans le vecteur adénoviral de destination par l'intermédiaire de la réaction de recombinaison lambda (LR) 23. Nous avons construit le vecteur pCAGAdDuen associant le promoteur CAG (promoteur de l'actine de poulet et CMV) avec une cassette d'expression contenant des sites LR flanquant le marqueur de sélection ccdB procaryote 24. Cette cassette d'expression est fusionnée à un site d'entrée interne du ribosome (IRES) de l'élément qui permet de co-expression du marqueur renforcée protéine eucaryote de l'infection fluorescente verte (EGFP), qui est fusionné à une séquence contenant l'hormone de croissance bovine poly (A) de signal. Nous avons choisi des séquences cis-régulatrices CAG, puisque le promoteur CMV prototype a été jugée hautement dépendant de l'activation et donc défavorable pour l'expression des gènes dans les cellules T naïves.

Ici, nous fournissons un protocole pour l'efficacité dans Treg différenciation in vitro et une méthode pour la transduction de CD4 des lymphocytes T naïfs sans activation (figure 2). La méthode permet l'expression des gènes extra-utérine ou abattre CD4 précédents différenciation des cellules T à l'état naïf. Il permet de tester l'effet d'une overexpressegène d 'intérêt au cours des événements de signalisation précoces lors de la stimulation initiale TCR jusqu'à engagement de sous-ensemble de cellules T. Nos expériences de validation fournissent également la base pour établir l'application de l'adénovirus similaire dans la différenciation des autres sous-ensembles de cellules T comme Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, ou des cellules TFH.

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Protocol

1. Clonage d'un gène d'intérêt dans un vecteur d'entrée

  1. Cloner le gène d'intérêt dans un vecteur d'entrée. Amplification par PCR du gène suivie d'une ligature d'extrémités franches dans un vecteur topoisomérase couplé (par exemple pENTR / D-TOPO) ou l'enzyme de restriction à médiation par clonage peut être utilisé pour cette procédure.

2. Transfert du gène d'intérêt dans le pCAGAdDu Vecteur de Destination

  1. Transférer le gène d'intérêt à partir du vecteur d'entrée dans le vecteur de destination par recombinaison LR (par exemple la passerelle LR Clonase II Enzyme Mix). Cela va créer le vecteur d'expression adénoviraux (Figure 1).
  2. Linéariser 10 ug du vecteur d'expression adénoviral dans une digestion de restriction PacI, précipiter l'ADN et remettre en suspension dans l'eau à une concentration de 3 pg par 100 pi. Linéarisation libère les répétitions inversées virales (ITR), qui sont nécessaires pour la réplication et l'encapsidation du vADN IRAL dans des particules virales.

3. Génération du lysat Virus primaire

  1. Graine de 1 x 10 5 cellules HEK293A dans deux milieux de culture de cellules ml (DMEM, 10% FBS, 5% Penstrep) dans un puits d'une plaque de 6 puits et incuber les cellules pendant 6 à 14 heures à 37 ° C en 10% Incubateur à CO 2 pour leur permettre d'adhérer. Les cellules doivent alors être à la confluence d'environ 50%.
  2. Lipofection: Transfert 6 pi de réactif jetPEI dans 94 ul de 50 uM NaCl, brièvement vortex. Ajouter la solution mélangée à 100 pi vecteur adénovirus linéarisé en vortex et incuber ce mélange de transfection pendant 15 - 30 min à température ambiante.

Effectuez toutes les étapes suivantes dans les conditions appropriées de biosécurité pour l'infection à adénovirus!

  1. Verser goutte à goutte la solution dans la cellule contenant HEK293A bien et incuber les cellules à 37 ° C et 10% de CO 2. Lorsque vous utilisez un marqueur de fluorescence, d'évaluer le transfeefficacité ction visuellement après 12 à 36 h à l'aide d'un microscope inversé à fluorescence. Ajouter 0,5 ml de milieu frais tous les 3 jours.
  2. Consultez toutes les 2 - 3 jours avec un microscope optique ou de fluorescence pour effet cytopathogène (CPE), qui sont des zones avec des cellules élargies et arrondies qui commencent à se détacher. Ceci est révélateur de la génération de virus efficace. Lors de l'apparition de zones plus larges du CPE (figure 3), il faudra 24 à 72 h avant de toutes les cellules sont infectées.
  3. Lorsque toutes les cellules présentent des signes de CPE, mais avant un décollement de l'ensemble des cellules se produit, détacher les cellules par pipetage doux et les cellules de transfert de surnageant (SN, 3-5 ml) dans un tube en polystyrène de 15 ml.
  4. Geler les cellules de la SN sur glace sèche pendant 15 - 20 min et décongeler rapidement à 37 ° C après la rupture des cellules. Répétez ce gel-dégel et-cycle (F / TC) deux fois plus. Gardez le lysat primaire du virus sur la glace pour une utilisation dans un jour ou le congeler à -80 ° C pour le stockage à long terme. Toute F supplémentaire/ TC permettra de réduire le titre viral de 30 - 50%.

4. amplification du virus

  1. Semences et cultiver des cellules HEK293A à 90% de confluence sur un cm boîte de culture 14 tissulaire.
  2. Infecter les cellules avec la moitié du lysat de virus primaire (1,5 - 2,5 ml) et incuber les cellules pendant au moins 36 h. Presque toutes les cellules devraient être infectés puis, qui peut être déterminé par microscopie à fluorescence. Pour la ré-amplification d'un stock de virus déjà amplifié (soit plus concentré), infecter HEK293A à une multiplicité d'infection (MOI) de 50 (voir 6.3).
  3. Les cellules doivent être récoltées lorsque tous d'entre eux montrent CPE mais avant détachement. Avec une production efficace du virus cet état est atteint dans les 48 heures après l'infection. (Si cela prend jusqu'à une semaine, envisager un autre cycle d'amplification en augmentant la quantité de stock de l'adénovirus utilisé pour l'infection décrite au point 4.2.)
  4. Détacher les cellules par pipetage doux et des cellules de transfert et SN pour un tube en polystyrène de 50 ml. Spin cellules vers le bas à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
  5. Retirez le SN et remettre le culot dans un volume approprié de milieu ou SN (environ 1 ml).
  6. Effectuez 3 F / TC de perturber les cellules et centrifuger à 800 xg pendant 15 min à 4 ° C. Enlevez le SN qui contient les particules de virus (c'est à dire le lysat de virus concentré), et aliquote du lysat de virus de la stocker à -80 ° C.

5. Virus Détermination du titre

  1. Seed 10 5 cellules A549 par puits en 5 puits d'une plaque de 12 puits dans 1 ml de milieu et de laisser cellules adhèrent pendant 6 heures.
  2. Utilisez 1 pl de l'adénovirus concentré (décongelé sur glace) pour effectuer une dilution en série dans le milieu (1:5000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) et ajouter 10 ul par puits. Laissez un bien non infecté pour régler le déclenchement en cytométrie en flux.
  3. Après 36 heures, enlever le SN, lavez avec PBS, les cellules et détachement (par exemple par traitement à la trypsine). Pour les précautions risques biologiques, il est recommandé de fixer caunes de 100 pi paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 10 min à température ambiante et lavage avec du PBS seule fois.
  4. Effectuer une analyse FACS de l'expression du marqueur d'infection. Plot 'ul lysat viral appliquée »contre le nombre absolu de cellules infectées (figure 4). Déterminer la plage linéaire de l'infection et de calculer le titre par ml de virus non dilué à partir de la courbe d'étalonnage sur la plage linéaire avec x = 1000 pl.

6. L'infection des cellules T

  1. Isoler les cellules T CD4 naïfs / repos de DO11.10 tg; souris Tg CARΔ1 utilisant MACS (T CD4 + naïves cellulaire Isolation Kit II) ou FACS (CD4 + CD25 + CD44-CD62L-).
  2. Pour les expériences à petite échelle, une pipette un volume approprié de lysat viral pour atteindre une MOI de 50 dans un puits d'une plaque de 96 puits à fond rond.
  3. Ajoutez jusqu'à 4 x 10 5 cellules T dans un volume d'infection final de 50 ul dans un milieu de cellules T (RPMI1640, 10% de FBS, 5% Penstrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM Essentialvitamine, 1x L-glutamine, 1:250.000 Mercaptoéthanol, HEPES 10 mM).
    Exemple:
    Une MOI de 50 doivent être utilisés pour infecter 3 x 10 5 cellules T; le titre viral est de 3 x 10 9 ml -1
    volume de virus = MOI x T numéro de cellulaire / titre viral = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 9 ml -1) = 0,005 ml

Note: pour une infection du nombre de cellules plus grandes, l'échelle en utilisant une MOI de 50 dans un volume d'infection de 165 pi par 10 6 cellules T naïves dans un tube de polystyrène avec la tasse lâche (jusqu'à tp 3 ml par tube).

  1. Incuber les cellules pendant 90 min à 37 ° C dans 5% d'un incubateur à CO 2.
  2. Isoler les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante, enlever SN, remettre en suspension dans 200 pi de PBS. Centrifuger de nouveau et décoller SN.

(Facultatif: les cellules peuvent être lavées à nouveau pour supprimer le virus plus efficacement)

  1. Remettre les cellulesdans 200 pi de milieu de cellules T sans anticorps stimulant et sans IL-2 ou d'autres cytokines et les reposer pendant 40 heures à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur pour permettre l'expression du gène d'intérêt avant l'activation.

7. Activation des cellules T et de la polarisation

  1. Pipette un volume d'anti-CD3 et perles anti-CD28 couplés qui est égal au nombre de cellules (par exemple 4 x 10 5) dans une petite tasse de réactif, ajouter le volume 10 fois de PBS et mettez-les sur un aimant pour 2 min . Enlever le surnageant et remettre en suspension les perles dans 200 pi de milieu polarisant (pour les Tregs: milieu de cellules T + 1 ng / ml TGFß, 100 U / ml d'IL-2).

Note: Les cellules peuvent également être activés à l'aide des boîtes de culture de tissu recouvertes d'anticorps anti-CD28 et anti-CD3, ou d'une manière spécifique du récepteur DO11.10 cellules T en utilisant irradiés splénocytes BALB / c pulsées avec de l'ovalbumine 323-339 antigène peptidique.

  1. Centrifuge le reposa cellules comme avant, enlever le SN et remettre les cellules dans 200 ul milieu polarisant contenant des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 anticorps couplés à des perles. Incuber pendant 72 heures à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur sans changer de support.

8. T Fixation cellulaire et coloration pour cytométrie en flux

  1. Laver les cellules: Isoler les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante, enlever SN, remettre en suspension dans 200 pi de PBS. Centrifuger de nouveau et décoller SN. Effectuez toutes les étapes de lavage suivantes en conséquence.
  2. Reprendre les cellules dans 100 ul solution fixable de coloration de cellules mortes et incuber pendant 30 min à 4 ° C.
  3. Laver les cellules, remettre en suspension dans 100 pi de PBS, ajouter 100 ul paraformaldéhyde 4% dans du PBS, incuber 15 min à température ambiante.
  4. Laver les cellules, les remettre en suspension dans 200 pi glacée 70% de méthanol dans du PBS et incuber pendant 30 min sur la glace.

Note: Les cellules peuvent être traités à partir de maintenant sans précaution Biohazard!

  1. Préparer 60 pl mélange-maître de 60 pi de PBS + 10 pg / ml Fc-bloc (anti-FCR3 pour bloquer la liaison non spécifique). Laver les cellules, les remettre en suspension dans 40 pl de PBS + anti-FCR3 et incuber 15 min à température ambiante.
  2. Ajouter 20 ul de PBS + anti-FCR3 contenant 1 pg d'anticorps anti-Foxp3 PE-couplé, bien mélanger et laisser incuber à 4 ° C pendant la nuit.
  3. Laver les cellules deux fois dans du PBS et analyser les cellules sur un cytomètre de flux.

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Representative Results

La production de virus

Pour la production de titres élevés de virus, le moment de la récolte des cellules HEK293A dans la production primaire du virus ou d'amplification du virus est cruciale. Représentant images de contraste fluorescents et en phase avec les signes visuels de la production de virus sont présentés dans la figure 3. Le CPE a été observée 10 jours après transfection de cellules HEK293A avec un pCAGAdDu contrôle vectoriel sans insert. CPE sont caractérisés par l'apparition de zones agrandies avec des cellules et rafle qui commencent à se détacher et de présenter une forte expression de la GFP de marqueur de l'infection. L'étendue de la CPE est révélateur de la génération de virus efficace. plaques de culture cellulaire montrant similaire CPE peut être récolté dans les 24 à 72 h, et un lysat de virus premières peuvent être générées par les cycles de gel-dégel et-. Le titre du virus peut alors être déterminé par dilution en série du lysat de virus afin de permettre la comparaison des infections avec une égale MOI (Figure 4). Dans le domaine linéaire, til équation de régression peut être utilisée pour calculer le nombre de particules infectieuses par ml de lysat de virus non dilué. Dans l'exemple, le titre pour x = 1 pi est 30016535 ul -1 ≈ 3 x 10 10 ml -1.

Évaluation de l'incidence de l'infection à adénovirus sur T activation et différenciation cellulaire

Les effets de la transduction des adénovirus sur les cellules cibles ont été évalués en infectant des cellules T CD4 naïfs avec l'augmentation des IAM en utilisant un vecteur adénovirus de contrôle qui n'exprime IRES-GFP (figure 5a). L'efficacité de l'infection a été mesurée par analyse FACS déterminer cellules GFP-positives dans des échantillons de cellules T fixes 72 heures après l'induction de la différenciation Treg. Le taux de cellules GFP-positives a augmenté avec la MOI utilisé pour l'infection et atteint 84% d'infection à une MOI de 50. Nous n'obtenons pas des pourcentages beaucoup plus élevés de lymphocytes T infectés lors de l'utilisation MOI supérieur à 50 (données non présentées). Bien infeefficacité ction peut varier en fonction du gène d'intérêt, on peut généralement infecter plus de 50% des cellules à une MOI de 50. A MOI entre 1 et 50 de la viabilité cellulaire n'a pas été affectée (figure 5b). Surtout, la stimulation et la différenciation des lymphocytes T naïfs en lymphocytes T régulateurs étaient similaires chez les personnes infectées par rapport aux cellules non-infectées (figure 5c). Une propriété clé de la transduction de l'adénovirus est sa capacité à infecter les cellules T naïves et reposant sans conférer ou nécessitant l'activation des lymphocytes T. Cela est évident à partir de l'analyse des marqueurs de l'activation des cellules T (CD25, CD69, CD44) et le marqueur de (CD62L) des cellules T naïves dans des échantillons avec ou sans infection par un adénovirus et se reposer pendant 40 heures à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur (Figure 6). Avant d'activation in vitro des cellules T avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 billes couplées, les cellules T infectées et non infectées étaient tout aussi faible CD25, CD69 et CD44 bas low mais élevé CD62L, démontrant ainsi leur état ​​naïf et de repos (figure 6, panneaux supérieurs). Lors de l'activation des lymphocytes T, les cellules infectées montrent une expression de l'activation des marqueurs CD25, CD69 et la régulation négative de CD62L presque impossible de distinguer les cellules non infectées (figure 6, les panneaux inférieurs). Ainsi, l'état d'activation des cellules T n'est pas modifiée par l'infection à adénovirus. La phase de repos est associé à la perte de 60 à 70% des cellules en raison de l'absence de facteurs de croissance ou des cytokines, contre 10 - 20% de cellules mortes 40 h après l'activation sans repos. Ceci a été pris en compte au moment de choisir le nombre initial de cellules de 3 x 10 5 cellules.

Évaluation de la surexpression niveau d'un gène d'intérêt

Afin d'évaluer le montant de la surexpression obtenu par transfert de gène adénoviral, nous avons cherché à déterminer le microARN-155 (miR-155) les niveaux d'expression dans les cellules T naïves que nousre infectés par le miR-155-exprimer ou adénovirus contrôle ou ont été laissés non infecté. Nous avons choisi de miR-155 depuis cette miRNA mature est exprimée à des niveaux modérés de cellules T naïves et devient fortement induite lors de l'activation des lymphocytes T. En outre, il a un rôle crucial dans la réponse humorale T dépendantes des cellules 25,26.

Le niveau de la surexpression de microARN a été évaluée par qPCR. Après l'infection, les cellules ont été laissées au repos pendant 40 heures, activées pendant 40 heures, ou laissé au repos 40 heures puis de 40 heures d'activation. Après 40 heures de repos, les cellules T naïves infectées par miR-155 du virus de codage affiché une surexpression d'environ 17 fois de miR-155 par rapport à des cellules infectées par le virus de la commande ou de cellules non infectées (figure 7). Cette quasi correspondance de la mesure dans laquelle le endogène miR-155 est induite après activation des cellules T (figure 7 et ref. 25,27). Indépendamment de cette forte induction de l'endogène miR-155 niveaux, les cellules infectées par le miR-155 adénovirus encore montré sur quadruplé augmentation de l'expression de miR-155 lors de l'activation par rapport à contrôler les cellules infectées ou non infectées. Le niveau observé de surexpression ectopique était comparable à d'autres micro-ARN (données non présentées). Veuillez noter que pour les grands inserts, la surexpression peut être moins efficace.

L'analyse de la différenciation des cellules T

L'analyse des données peut être effectuée de plusieurs façons. L'analyse de la différenciation dans la grille positif GFP d'un gène d'intérêt (c'est à dire dans les cellules infectées) par rapport à la différenciation de la même porte positif de la GFP de cellules témoins (cellules infectées en utilisant un vecteur sans gène d'intérêt) est suffisante pour détecter des différences substantielles. Pour étudier les effets plus subtils d'un gène d'intérêt, nous avons comparé la différenciation dans les cellules infectées avec celle des cellules non infectées du même puits (figure 8). Ceux-ci servent comme un contro internel et peut être utilisée pour calculer la "différence par rapport" à l'intérieur d'un puits. Si un virus est sans effet sur la différenciation, la «différenciation relative" sera idéalement être de 1. La différentiation par rapport au virus de commande à la main a une gamme de 0,9 à 1,1. Différenciation relative ne doit être appliqué à la comparaison de gènes d'intérêt échantillons infectés à des échantillons témoins infectées par le virus.

Figure 1
Figure 1. Représentation schématique de la production d'adénovirus. vecteurs d'entrée (pENTR) contiennent des sites donneurs de recombinaison (AttL1, attL2), qui encadrent un gène d'intérêt. La destination pCAGAdDu vecteur contient les sites cibles de recombinaison (attr1, attr2) flanquant le gène de la toxine CcdB pour sélection négative dans E. coli, qui est remplacé par le gène d'intérêtpar recombinaison LR. Le vecteur de destination contient également un génome humain de type 5 d'adénovirus sans E1/E3 gènes, qui ont été supprimés pour générer des adénovirus recombinants déficients en replication. PacI linéarisation libère répétitions inversées (ITR) avant transfection dans des cellules HEK293A qui portent les gènes adénoviraux pour générer infectieuses particules d'adénovirus qui se traduisent par des effets cytopathiques. Adénovirus est récolté à partir des cellules productrices par les cycles de gel-dégel et-. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2. Représentation schématique de l'infection des lymphocytes T et la différenciation. Cellules T naïves ont été infectés par un adénovirus lysat pendant 1,5 heure, on le lave avec PB S et reposé dans un milieu de cellules T pendant 40 heures à 37 ° C dans 5% d'un incubateur à CO 2. Les cellules ont ensuite été activés pendant 72 heures en utilisant anti-CD28 et anti-CD3 billes couplées à des anticorps en présence de TGF et de l'IL-2. Les cellules fixées et colorées ont été analysées par FACS, et l'expression de Foxp3 dans les cellules infectées par rapport aux non-infecté a été déterminée.

Figure 3
Figure 3. Effet cytopathique de l'adénovirus cellules productrices HEK293A. Occurrence de CPE à dix jours après transfection de 10 5 cellules HEK293A avec 3 ng de vecteur linéarisé pCAGAdDu. Le panneau de gauche montre l'image en contraste de phase, le panneau de droite montre la fluorescence verte.

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Figure 4. Détermination du titre des lysats d'adénovirus par l'infection des cellules A549. 10 5 cellules A549 ont été infectées avec le virus de dilution indiqué, incubées pendant 48 heures et analysés pour l'expression du marqueur GFP de l'infection par cytométrie de flux. Le nombre de cellules GFP-positives est représentée en fonction de la quantité de virus utilisée. Le titre des virus non dilué est calculé à partir de la courbe d'étalonnage sur la plage linéaire avec x = 1000 pl.

Figure 5
Figure 5. infection à adénovirus à une MOI de 1 - 50 n'a aucun effet sur ​​la viabilité des cellules T ou la différenciation des Treg cellules T naïves purifiées à partir DO11.10 tg; souris Tg CARΔ1 ont été infectées par l'adénovirus à différentes MOI.pendant 90 min, lavées avec du PBS et il s'est reposé pendant 40 heures dans un milieu de cellules T. Les cellules ont été activées dans Treg conditions de polarisation pendant 72 heures. Les cellules fixées et colorées ont été analysés pour l'incorporation de colorant de cellules mortes (b), l'expression du marqueur GFP d'infection (a) et de la Foxp3 marqueur de différenciation (c). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 6
Figure 6. infection à adénovirus ne modifie pas l'état d'activation des cellules T lymphocytes T naïfs de DO11.10 tg;. CARΔ1 souris Tg ont été infectées par l'adénovirus à une MOI de 50 à 90 min (lignes) ou à gauche non infecté (régions), lavées avec du PBS et reposé pendant 40 heures. Les cellules ont été analysés pour EXPREssion des marqueurs d'activation avant (panneaux supérieurs) et après (panneaux inférieurs) 40 h d'activation dans Treg conditions de polarisation.

Figure 7
Figure 7. Lymphocytes T naïfs par rapport miR-155 surexpression avant et après l'activation des lymphocytes T de DO11.10 tg;. Souris Tg CARΔ1 ont été infectées à une MOI de 50 avec microARN-155 (miR-155) exprimant ou adénovirus contrôle, ou vers la gauche non infecté. Les cellules ont ensuite été mis au repos pendant 40 heures, activées pendant 40 heures, ou laissé au repos 40 heures suivie par 40 activation des RH. L'expression de microARN-155 a été déterminée par rapport à SnoRNA202 par qPCR.

Figure 8
ndlr) GFP-positives est exprimée par rapport au pourcentage de Foxp3 + cellules en cellules négatives (non infectés) GFP. Différenciation relative égale à 1, si le gène surexprimé d'intérêt n'a eu aucun effet sur les Treg différenciation. Les valeurs supérieures à 1 indiquent un effet promoteur sur la différenciation, tandis que les valeurs inférieures à 1 indiquent un effet inhibiteur.

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Discussion

Génération Virus et titrage

Pour obtenir des résultats de transfection optimales, la qualité et la quantité de vecteur linéarisé semblent les plus importants. Nous n'avons pas observé d'effets négatifs sur la production de lysat primaire d'une prolifération initiale de la culture depuis l'infection va procéder rapidement une fois que la production de virus efficace se produit. Cependant, la production de virus par les cellules HEK293A peut être affectée par de longs inserts qui diminuent l'efficacité. Certains cadres de lecture ouverts ont été effectivement trouvés à interférer avec la production de virus. Ces stocks viraux peuvent généralement être secourus par plusieurs cycles d'amplification, et seulement quelques cadres de lecture ouverts ont été jugées incompatibles avec la production de virus. D'après notre expérience, l'apparition de CPE dans les 48 heures après l'infection pour l'amplification du virus va typiquement donner un lysat viral d'environ 1 x 9-5 octobre x 10 10 particules infectieuses / ml.

L'infection à adénovirus de lymphocytes T naïfs

Infection adénovirale de cellules T naïves ne modifie pas l'état d'activation de cellules T, avant et après la stimulation. Cela rend le système de transduction un outil expérimental puissant pour étudier la différenciation des cellules T à partir initial TCR-stimulation sur. Nous avons déterminé l'expression ectopique efficace de gènes d'intérêt après l'infection et «repos» des lymphocytes T pour 40 heures, à un moment où la cellule est encore naïf et ne montre pas de signes d'activation. Cela signifie que lors de l'activation de cellules T subséquente, le gène d'intérêt est déjà surexprimée et peut exercer son influence sur la différenciation des cellules T à partir du début. Ainsi, la transduction adénoviral a un net avantage sur l'électroporation ou la transduction rétrovirale qui nécessitent l'activation et exprimer un gène d'intérêt qu'après signalisation du TCR initial 15,28. Toutefois, si les aspects fin de différenciation doivent être analysés et l'expression du gène d'intérêt n'est pas nécessaire avant la première cellule activité Tation, les cellules T naïves peut ainsi être stimulé directement après transduction adénoviral. Comme l'infection à adénovirus est très efficace, il peut être étendu pour étudier les activités de coopération de deux gènes d'intérêt en effectuant des doubles infections avec les adénovirus qui expriment d'autres marqueurs d'infection tels que Thy1.1 ou hCD2. Ce dernier est également accessible à la coloration de surface des anticorps et peut contourner les difficultés en matière de préservation de marqueur lors de la fixation. Dans les cellules T activées, cependant, l'infection adénovirus a un rendement beaucoup plus faible, et l'électroporation ou des méthodes de transduction rétrovirale peut être favorable. Une autre mise en garde pour l'application de l'adénovirus est le caractère transitoire de l'expression. Adénovirus est maintenu comme un épisome attaché à la matrice nucléaire de la cellule et sera dilué que les cellules T prolifèrent, entraînant la perte de l'expression du gène marqueur dans les cinq à sept jours après l'activation des cellules T (données non présentées;. Ref 17). En outre, les adénovirus cellules transduites sont readilY reconnu et éliminé par un système immunitaire intact, ce qui limite son utilisation in vivo, par exemple, dans les expériences de transfert adoptif de lymphocytes T chez la souris. Une autre application potentielle du système adénovirus pourrait être l'infection des cellules Treg isolés de DO11.10 tg; CARΔ1 souris Tg pour étudier la fonction Treg ou des aspects de stabilité de la lignée.

Validation des effets d'adénovirus sur des cellules infectées

infection à adénovirus a été efficace et a eu presque aucune influence sur la viabilité des cellules T et la différenciation des Treg. À une MOI de 50, nous avons obtenu le meilleur rendement de l'infection sans observer les effets néfastes de l'infection à adénovirus sur les cellules T. Ceci doit être mis en place même lorsque le système est appliqué à d'autres cultures de cellules ou de l'état de différenciation, généralement par des expériences de titration à l'aide adénovirus vide sans expression du gène d'intérêt. Si l'infection adénovirus en tant que telle n'a incidence sur le résultat de l'expérience,la comparaison des gènes d'adénovirus portant intérêt à adénovirus vide est toujours appropriée pour découvrir les effets du gène transféré d'intérêt. S'il n'y a pas d'effet de l'infection à adénovirus, le paramètre mesuré peut également être comparée entre les cellules non infectées et infectées du même échantillon.

Analyse des données

La méthode de fixation décrite ici permet une analyse simultanée de la Foxp3 marqueur de différenciation avec la GFP de marqueur de l'infection, de sorte qu'une «différenciation relative» peut être déterminée. Cette analyse de deux populations au sein d'un échantillon a une plus grande sensibilité pour des effets subtils que les comparaisons de la population en vrac entre les deux échantillons, car il faut bien les variations de puits en compte. Toutefois, seuls les effets intrinsèques aux cellules infectées seront reconnus par cette méthode, tandis que les effets bien larges, par exemple les influences exercées par un facteur sécrété, seraient négligées. Différenciation relative doit être contrôlée dans chaqueexpérience en incluant les cellules infectées par le contrôle d'exclure les effets de l'infection elle-même sur la différenciation. Pour des résultats optimaux, un taux presque égal d'infection pour les cellules non infectées dans l'échantillon doit être recherché, tandis que les taux d'infection plus élevés sont favorables à des comparaisons entre plusieurs échantillons en vrac.

En conclusion, le transfert de gènes dans des cellules T naïves en utilisant un adénovirus associé à des protocoles de différenciation in vitro est un système puissant pour étudier les bases moléculaires de la différenciation Treg. Cela peut permettre la production de connaissances pour exploiter la tolérance dominante conférée par Tregs dans des approches thérapeutiques contre les maladies allergiques et auto-immunes.

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Disclosures

Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêt.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Lirui Du pour la construction du vecteur pCAGAdDU et Oliver Gorka pour la fourniture du protocole de fixation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix Invitrogen 11791020
PacI New England Biolabs R057S
jetPEI Polyplus-transfection 101-10N
HEK293A Cell Line Invitrogen R705-07
A549 ATCC CCL-185
6-well plates BD Falcon 353046
14 cm tissue culture dish Nunc 168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr Taconic Farms Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II Miltenyi Biotech 130-094-131
DMEM Invitrogen 41966-052
FBS PAN Biotech 1502-P110704
PenStrep Invitrogen 15140-122
RPMI 1640 Lonza BE12-167F
NaPyruvate Lonza BE13-115E
NEAA 100x Lonza BE13-114E
L-Glutamine Invitrogen 25030
HEPES Buffer Solution (1 M) Invitrogen 15630-056
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x) Lonza 13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation Invitrogen 114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1 R&D Systems 240B
Proleukin S (18 x 106IE) Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Invitrogen L-23105
Mouse BD Fc BlockT BD Pharmingen 553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE eBioscience 12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay Roche Applied Biosystems 4427975
LightCycler 480 Probes Master Roche Applied Biosystems 04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Roche Applied Biosystems 4366596

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Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation. J. Vis. Exp. (78), e50455, doi:10.3791/50455 (2013).

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