Summary
Adenovirale trasferimento genico nelle cellule T CD4 naive con transgenici espressione del recettore adenovirus Coxsackie permette l'analisi molecolare della differenziazione delle cellule T regolatorie
Abstract
Cellule T regolatorie (Treg) sono essenziali per fornire la tolleranza immune da auto così come a certi antigeni estranei. Tregs può essere generato da CD4 naive cellule T in vitro con TCR-e co-stimolazione in presenza di TGFβ e IL-2. Questo porta il potenziale enorme per terapie future, tuttavia, le molecole e vie di segnalazione che la differenziazione di controllo sono in gran parte sconosciuti.
Cellule T primarie possono essere manipolati attraverso l'espressione genica ectopica, ma non riescono metodi comuni di indirizzare il più importante stato naif della cellula T prima del riconoscimento dell'antigene primaria. Qui, forniamo un protocollo di esprimere geni ectopiche nelle cellule T CD4 naive in vitro prima di indurre la differenziazione Treg. Si applica la trasduzione con l'adenovirus replica-carente e spiega la sua generazione e la produzione. L'adenovirus può occupare una grande inserti (fino a 7 kb) e può essere dotato di promotori per realizzare alta e transitori Sovraespression nelle cellule T. E trasduce efficacemente le cellule T naive topo se esprimono un recettore adenovirus Coxsackie transgenico (CAR). Importante, dopo l'infezione le cellule T naive rimangono (CD44 bassa, alta CD62L) e di riposo (CD25 -, CD69 -) e possono essere attivate e differenziate in Tregs simili alle cellule non infette. Così, questo metodo consente la manipolazione di cellule CD4 T differenziamento cellulare dal suo inizio. Essa assicura che l'espressione genica ectopica è già in atto quando i primi eventi di segnalazione della stimolazione iniziale TCR induce cambiamenti cellulari che alla fine portano a Treg differenziazione.
Introduction
Tregs sono cruciali per mantenere la tolleranza immunitaria e per smorzare le risposte immunitarie superamenti. Treg sopprimere l'attivazione delle cellule T astanti. Di conseguenza, l'ablazione del Tregs porta ad autoimmunità fatale e autodistruzione guidato da cellule T attivate 1. Treg sviluppano nel timo durante la selezione negativa dei CD4 precursori single-positive, ma possono anche differenziarsi in periferia da CD4 naive cellule T dopo stimolazione antigene a basso dosaggio con subottimale di co-stimolazione 1,2. Timica Treg sembra sopprimere l'autoimmunità tessuto contro auto-antigeni, mentre periferica Treg sono stati implicati nel fornire tolleranza nell'intestino o polmonari. Questi indotta Treg potentemente prevenire l'attivazione delle cellule T dopo il riconoscimento di antigeni estranei nella mucosa, tra antigeni ambientali da cibo e aria, batteri commensali, e allergeni 3,4. Inoltre, Tregs sono cruciali per stabilire la tolleranza materna al peptidi fetali 5 e quello di prevent malattia del trapianto contro l'ospite 6. Allo stesso tempo, Tregs anche mediare effetti indesiderati attenuando sorveglianza immunitaria delle cellule tumorali 7,8. L'elemento caratterizzante Tregs è l'espressione del sottoinsieme specificando-fattore di trascrizione Foxp3, un fattore di trascrizione dominio contenente forcella-testa che è necessario e sufficiente per conferire funzione 9,10 Treg. Alcune vie di segnalazione che possono indurre l'espressione Foxp3 sono noti. Tuttavia, i processi molecolari che controllano, regolano o modulano Treg differenziazione in risposta al recettore delle cellule T innescando sono meno conosciuti.
Tregs molto efficace può essere indotta in vitro mediante la stimolazione delle cellule T CD4 naive con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 in presenza di TGFβ e IL-2 11. Come l'emergente Treg sono funzionali in vivo, la manipolazione di molecole che promuovono la differenziazione Treg porta un enorme potenziale per il futuro therapies, per esempio, il trattamento di asma, malattia di Crohn, e trapianto 11,12. Viceversa, la modulazione terapeutica di molecole per bloccare differenziazione Treg può fornire beneficio in futuro approcci di trattamento combinato dei pazienti con tumori.
Saggi in vitro hanno differenziazione state fondamentali per la descrizione delle modifiche molecolari che sono associati con T sottoinsieme differenziazione cellulare. Al momento, i tentativi sperimentali per cercare o schermo per prodotti genici che la differenziazione delle cellule T sono controllo ostacolata dal fatto che i metodi più comuni di espressione genica ectopica falliscono nelle cellule T naive. Per esempio, elettroporazione e trasduzione retrovirale sono efficaci solo in cellule T attivate. Contrariamente alle aspettative iniziali, trasduzione lentivirali, che è in genere efficace in cellule quiescenti, necessita di pre-attivazione delle cellule T naive dalle citochine 13. Inoltre, il trasferimento di cDNA o mRNA durante elettroporazionecomporta depolarizzazione della membrana plasmatica, che si conferisce caratteristiche di attivazione delle cellule T e può anche mobilizzare Ca2 + segnalazione e attivare le proteine NFAT (osservazione inedito e rif. 14). Analogamente, per la trasduzione retrovirale, le cellule T naive devono essere attivati per 18 - 40 hr. Durante questo tempo, la rottura della membrana nucleare nel corso della divisione cellulare si verifica e consente la successiva integrazione genomica del vettore retrovirale 15. Questi metodi non sono quindi in grado di affrontare la regolazione molecolare precoce di cellule T incontro iniziale con l'antigene, che è la fase determinante di differenziazione delle cellule T helper.
Trasduzione adenovirale è noto per conferire espressione genica transiente ectopica in un certo numero di tipi di cellule umane che esprimono il recettore umano Coxsackie adenovirus (CAR). Procede senza necessità di attivazione delle cellule o la progressione del ciclo cellulare. L'espressione superficiale di CAR è essenziale per l'attacco del virus efficiente e interiorizzazione, e l'espressione transgenica della versione troncata CARΔ1 sotto una T promotore specifico delle cellule è stato trovato per rendere timociti topo e cellule T suscettibili alle infezioni adenovirale 16. È importante sottolineare che il transgene non altera sviluppo timociti o differenziazione in vitro di cellule CD4 T naive in diversi sottoinsiemi (dati non mostrati; rif 17.). Adenovirus-mediata trasduzione di cellule T è stato precedentemente utilizzato per la sovraespressione 17,18 e knock-down approcci 19,20. Le cellule T transgeniche possono essere purificati da disponibile in commercio DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. e ref 17.). Importante, trasduzione adenovirale permette un'elevata espressione di un gene di interesse in cellule T naive senza indurre segni evidenti di attivazione. Le cellule T rimangono ingenui (basso CD44, CD62L alto) e di riposo (CD25 -, CD69 -) dopo infection e può essere attivato e differenziate in Treg simili alle cellule non infette.
Produzione di adenovirus ricombinanti può essere raggiunto dopo la trasfezione di cellule con plasmidi HEK293A adenovirali (Figura 1). Questi plasmidi contengono in genere il tipo di adenovirus 5 genoma umano con i geni E1 ed E3 eliminati per rendere adenovirus ricombinanti replicazione-incompetenti 21. Cellule HEK293A completano carenza di replica in quanto sono stati immortalati attraverso l'integrazione stabile di adenovirus tosato 22. Dal momento che i vettori adenovirus sono di grandi dimensioni (~ 40 kb) e di conseguenza non è adatto per la tradizionale restrizione enzimatica clonazione, abbiamo impiegato il sistema Gateway. Il gene di interesse viene inizialmente clonato in un vettore voce più piccola, dal quale può essere facilmente trasferito nel vettore adenovirale destinazione tramite reazione di ricombinazione lambda (LR) 23. Abbiamo costruito la pCAGAdDu vettorecombinando il promotore CAG (pollo promotore actina e CMV enhancer), con una cassetta di espressione contenente siti di LR che fiancheggiano il procariotica CCDB selezione marcatore 24. Questa cassetta di espressione è fuso ad un sito interno ingresso ribosoma (IRES) elemento che permette coexpression dell'infezione marcatore proteina fluorescente verde rafforzata eucariotica (eGFP), che è fuso ad una sequenza contenente l'ormone della crescita bovina poly (A)-segnale. Abbiamo scelto le sequenze cis-regolatori CAG, poiché il prototipo promotore CMV è risultato essere altamente attivazione-dipendente e pertanto sfavorevole per l'espressione genica in cellule T naive.
Qui, forniamo un protocollo per efficiente in vitro Treg differenziazione e un metodo per trasdurre CD4 naive cellule T senza attivazione (Figura 2). Il metodo consente di espressione genica ectopica o abbattere CD4 precedenti differenziazione delle cellule T allo stato ingenuo. Esso consente di testare l'effetto di un overexpressed gene di interesse durante le prime manifestazioni di segnalazione alla stimolazione TCR iniziale fino T impegno sottoinsieme delle cellule. Nostri esperimenti di validazione forniscono anche la base per stabilire simile all'applicazione adenovirus nella differenziazione di altri sottoinsiemi T cellule quali Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, o cellule tfh.
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Protocol
1. La clonazione di un gene di interesse in un vettore di ingresso
- Clonare il gene di interesse in un vettore di ingresso. Amplificazione PCR del gene seguita da ligazione smussato-end in un vettore topoisomerasi-coupled (es pENTR / D-TOPO) o di restrizione enzimatica clonazione può essere utilizzato per questa procedura.
2. Trasferimento del gene di interesse nel pCAGAdDu destinazione Vector
- Trasferire il gene di interesse da parte del vettore di ingresso nel vettore di destinazione dalla LR ricombinazione (es. Gateway LR Clonase II Enzyme Mix). Questo creerà il vettore di espressione adenovirale (Figura 1).
- Linearizzare 10 pg del vettore di espressione adenovirale in una raccolta di limitazione PacI, precipitare il DNA e risospendere in acqua ad una concentrazione di 3 mg per 100 microlitri. Linearizzazione libera le ripetizioni invertite virali (ITR), che sono necessari per la replicazione e incapsidazione del vDNA Iral in particelle virali.
3. Generazione del Virus lisato Primaria
- Seme 1 x 10 5 cellule HEK293A in 2 ml RPMI (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti e incubare le cellule per 6-14 ore a 37 ° C in un 10% CO 2 incubatore per consentire loro di aderire. Le cellule devono quindi essere di circa il 50% di confluenza.
- Lipofezione: Trasferimento 6 ml di reagente jetPEI in 94 ml di 50 mM NaCl, brevemente vortice. Aggiungere la soluzione mista di 100 pl linearizzato vettore adenovirus mentre vortex e incubare questa miscela di trasfezione per 15 - 30 min a temperatura ambiente.
Eseguire tutti i passaggi seguenti, alle opportune condizioni di biosicurezza per l'infezione da adenovirus!
- Erogare la soluzione a gocce sulla cella contenente ben HEK293A e incubare le cellule a 37 ° C e 10% di CO 2. Quando si utilizza un indicatore di fluorescenza, valutare il transfeefficienza ction visivamente dopo 12-36 ore utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito. Aggiungere 0,5 ml di mezzo fresco ogni 3 giorni.
- Controllare ogni 2 - 3 giorni con un microscopio ottico a fluorescenza o per effetto citopatico (CPE), che sono le zone con le cellule allargata e arrotondata che iniziano a staccarsi. Ciò è indicativo di generazione virus efficiente. Al verificarsi di zone più ampie di CPE (Figura 3), ci vorranno 24-72 ore prima di tutte le cellule sono infettate.
- Quando tutte le cellule mostrano segni di CPE, ma prima di un distacco totale di cellule avviene, staccano le cellule pipettando delicatamente e trasferire le cellule con supernatante (SN, 3-5 ml) in una provetta di polistirene da 15 ml.
- Congelare le cellule nella SN in ghiaccio secco per 15 - 20 min e scongelare rapidamente a 37 ° C dopo la rottura delle cellule. Ripetere questo gelo-disgelo e-ciclo (F / TC) altre due volte. Tenere il lisato virus primario sul ghiaccio per l'uso all'interno di un giorno o congelarlo a -80 ° C per la conservazione a lungo termine. Qualsiasi ulteriore F/ TC ridurrà il titolo del virus del 30 - 50%.
4. Virus Amplificazione
- Seed e far crescere le cellule HEK293A al 90% di confluenza in un piatto di coltura 14 cm tessuto.
- Infettare le cellule con la metà del lisato virus primario (1,5 - 2,5 ml) e incubare le cellule per almeno 36 ore. Quasi tutte le celle devono essere infettate poi, che può essere determinata mediante microscopia a fluorescenza. Per la ri-amplificazione di un già amplificato (cioè più concentrata) stock virus, infettare HEK293A ad una molteplicità di infezione (MOI) di 50 (vedere 6.3).
- Le cellule devono essere raccolte quando tutti loro mostrano CPE, ma prima di distacco. Con la produzione di virus efficiente questo stato viene raggiunto entro 48 ore dopo l'infezione. (Se ci vogliono fino a una settimana, prendere in considerazione un altro giro di amplificazione, aumentando la quantità di magazzino adenovirus usati per l'infezione descritto al punto 4.2.)
- Staccare le cellule pipettando dolce e cellule di trasferimento e SN in una provetta di polistirene da 50 ml. Spin celle in basso a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
- Rimuovere il SN e risospendere il pellet in un opportuno volume di media o SN (ca. 1 ml).
- Eseguire 3 F / TC per disturbare le cellule e centrifugare a 800 xg per 15 min a 4 ° C. Togliere il SN che contiene le particelle del virus (cioè il lisato virus concentrato), e un'aliquota del lisato virus per conservarlo a -80 ° C.
5. Virus Titer Determinazione
- Seed 10 A549 5 cellule per pozzetto in 5 pozzetti di una 12-pozzetti in 1 ml di mezzo e lasciare che le cellule aderiscono per 6 ore.
- Usare 1 ml di adenovirus concentrato (scongelati in ghiaccio) per eseguire una diluizione del siero in media (1:5.000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) e aggiungere 10 microlitri per pozzetto. Lascia un bene non infetto per regolare il gating in citometria a flusso.
- Dopo 36 ore, togliere il SN, lavare con PBS e staccare le cellule (per esempio mediante tripsinizzazione). Per le precauzioni di sicurezza, si consiglia di fissare cells in 100 microlitri 4% paraformaldeide in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente e lavata con PBS contemporaneamente.
- Effettuare una analisi FACS di espressione marcatore dell'infezione. Plot 'lisato virale microlitri applicato' contro il numero assoluto di cellule infette (Figura 4). Determinare il campo lineare di infezione e calcolare il titolo per ml di virus diluito dalla curva standard sopra la gamma lineare con x = 1,000 microlitri.
6. L'infezione delle cellule T
- Isolate le cellule T CD4 naive / riposo da DO11.10 tg; topi Tg CARΔ1 utilizzando MACS (CD4 + T Naive cellulare Isolamento Kit II) o FACS ordinamento (CD4 + CD25-CD62L + CD44-).
- Per gli esperimenti su piccola scala, pipettare un volume appropriato di lisato virale per ottenere una MOI di 50 in un pozzetto di una piastra 96 pozzetti a fondo tondo.
- Aggiungere fino a 4 x 10 5 cellule T in un volume finale di infezione di 50 microlitri in terreno cellule T (RPMI1640, 10% FBS, 5% PenStrep, 5% NaPyruvate, NEAA 1x, 1x MEM Essentialvitamina, 1x L-glutammina, 1:250.000 Mercaptoetanolo, 10 HEPES mm).
Esempio:
Un MOI di 50 deve essere utilizzato per infettare 3 x 10 5 cellule T; il titolo virale è 3 x 10 9 ml -1
Volume di Virus = MOI x T numero di cellule / titolo virale = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 9 ml -1) = 0.005 ml
Nota: per l'infezione del numero di cellule più grandi, Scale Up utilizzando un MOI di 50 in un volume infezione di 165 microlitri per 10 6 cellule T naive in una provetta di polistirene con tazza sciolto (fino tp 3 ml per provetta).
- Incubare le cellule per 90 min a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore.
- Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente, togliere SN, risospendere in 200 l di PBS. Centrifugare nuovamente e togliere SN.
(Opzionale: le cellule possono essere nuovamente lavati per rimuovere il virus in modo più efficiente)
- Risospendere le cellulein 200 microlitri di medie cellule T senza anticorpi stimolanti e senza IL-2 o di altre citochine e riposarsi per 40 ore a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore per consentire l'espressione del gene di interesse prima dell'attivazione.
7. T cellule attivazione e polarizzazione
- Pipetta un volume di anti-CD3 e anti-CD28 perline accoppiati che è uguale al numero delle cellule (ad esempio 4 x 10 5) in una piccola tazza reagente, aggiungere il volume di 10 volte di PBS e metterle su una calamita per 2 min . Rimuovere il surnatante e risospendere le sfere in 200 microlitri di polarizzazione media (per Treg: T medie delle cellule + 1 ng / ml TGFβ, 100 U / ml di IL-2).
Nota: Le cellule possono anche essere attivati utilizzando piatti di coltura tissutale sensibilizzate con anticorpi anti-CD28 e anti-CD3, o in una forma specifica del recettore DO11.10 cellule T usando irradiati BALB / c splenociti pulsate con ovalbumina 323-339 antigene peptidico.
- Centrifuge il riposato celle di prima, togliere il SN e risospendere le cellule in 200 microlitri polarizzante terreno contenente anti-CD3 e anti-CD28-anticorpi accoppiati perline. Incubare per 72 ore a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore senza cambiare mezzo.
8. T cellulare fissazione e la colorazione per Citometria a Flusso
- Lavare le cellule: Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente, togliere SN, risospendere in 200 l di PBS. Centrifugare nuovamente e togliere SN. Eseguire tutte le seguenti fasi di lavaggio di conseguenza.
- Risospendere le cellule in 100 microlitri soluzione colorante cellulare morto risolvibile e incubare per 30 minuti a 4 ° C.
- Lavare le cellule, risospendere in 100 l di PBS, aggiungere 100 microlitri paraformaldeide al 4% in PBS, incubare 15 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule, li risospendere in 200 ml ghiacciata 70% di metanolo in PBS e incubare per 30 minuti in ghiaccio.
Nota: Le celle possono essere trattati da ora in poi, senza precauzione rischio biologico!
- Preparare 60 ml master-mix di 60 microlitri di PBS + 10 mcg / ml Fc-block (anti-FCR3 per bloccare legame non specifico). Lavare le cellule, li risospendere in 40 ml di PBS + anti-FCR3 e incubare 15 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 20 ml di PBS + anti-FCR3 contenente 1 mg PE-accoppiato anticorpo anti-Foxp3, mescolare bene e incubare a 4 ° C durante la notte.
- Lavare le cellule due volte in PBS e analizzare le cellule su un citofluorimetro.
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Representative Results
Virus Produzione
Per la generazione di viremia elevata, i tempi di raccolta delle cellule HEK293A nella produzione di virus primaria o amplificazione del virus è di fondamentale importanza. Rappresentativi immagini a contrasto di fase e fluorescenza con segni visivi di produzione di virus sono mostrati in Figura 3. Il CPE è stata osservata 10 giorni dopo la transfezione di cellule HEK293A con pCAGAdDu controllo vettoriale senza inserto. CPE sono caratterizzate dalla comparsa di aree con celle ingrandite e round-up che iniziano a staccare e manifestare un'elevata espressione del marcatore GFP infezione. L'entità del CPE è indicativo di generazione virus efficiente. Piastre di colture cellulari mostrano simile CPE può essere raccolto entro 24-72 ore, e un lisato virus grezzo possono essere generati da cicli di gelo-disgelo e. Il titolo virale può essere determinata mediante diluizione seriale del lisato virus per permettere il confronto delle infezioni con pari MOI (Figura 4). All'interno del range lineare, tegli analisi di regressione equazione può essere utilizzato per calcolare il numero di particelle infettive per ml diluito lisato virus. Nell'esempio, il titolo per x = 1 microlitri è 30.016.535 microlitri -1 ≈ 3 x 10 10 ml -1.
Valutare l'impatto di Adenovirus infezione delle cellule T di attivazione e differenziazione
Gli effetti della trasduzione adenovirus sulle cellule bersaglio sono state valutate da infettare le cellule T CD4 naive con crescenti MOI utilizzando un vettore di controllo adenovirale che esprime solo IRES-GFP (figura 5a). L'efficienza di infezione è stata misurata mediante analisi FACS determinando cellule GFP positive in campioni di cellule T fissi 72 ore dopo l'induzione del differenziamento Treg. La percentuale di cellule GFP positive aumentata con il MOI utilizzato per l'infezione e l'infezione ha raggiunto 84% ad una MOI di 50. Non otteniamo percentuali molto più elevate di cellule T infettate utilizzando MOI maggiore di 50 (dati non mostrati). Anche se infeefficienza ction può variare a seconda del gene di interesse, si può infettare tipicamente più del 50% delle cellule ad una MOI di 50. A MOI tra 1 e 50 la vitalità cellulare non è stata influenzata (Figura 5b). Importante, la stimolazione e la differenziazione delle cellule T naive in Tregs era simile nel infetto rispetto alle cellule non infettate (Figura 5c). Una proprietà chiave della trasduzione adenovirus è la sua capacità di infettare le cellule T naive e di riposo senza conferire o richiedere l'attivazione delle cellule T. Questo è evidente dall'analisi dei marcatori di attivazione delle cellule T (CD25, CD69, CD44) e il marcatore di (CD62L) cellule T naive in campioni con o senza infezione adenovirus e riposare per 40 ore a 37 ° C in 5% di CO 2 incubatore (Figura 6). Prima di attivazione in vitro di cellule T con anti-CD3 e anti-CD28 perline accoppiati, le cellule T infette, erano similmente bassi CD25, CD69 e CD44 basso low ma alto CD62L, dimostrando il loro stato ingenuo e di riposo (figura 6, pannelli superiori). Su di attivazione delle cellule T, le cellule infette mostravano upregulation dell'attivazione marker CD25, CD69 e CD62L sottoregolazione di quasi indistinguibile da cellule non infettate (Figura 6, i pannelli inferiori). Così, lo stato di attivazione delle cellule T non è alterato da adenovirus. La fase di riposo è associato con la perdita di 60 e il 70% delle cellule per l'assenza di fattori di crescita o citochine, rispetto al 10-20% di cellule morte 40 ore dopo l'attivazione senza riposo. Questa è stata presa in considerazione al momento di scegliere il numero di cellule iniziale di 3 x 10 5 cellule.
Valutare il livello di sovraespressione di un gene di interesse
Per valutare la quantità di sovraespressione conseguito mediante trasferimento genico adenovirale, abbiamo cercato di determinare il microRNA-155 (miR-155) livelli di espressione in cellule T naive che noinuovamente infettati con miR-155 che esprimono o adenovirus di controllo o sono stati lasciati non infetto. Abbiamo scelto miR-155 in quanto questo miRNA maturo si esprime a livelli moderati nelle cellule T naive e diventa fortemente indotta su di attivazione delle cellule T. Inoltre, ha un ruolo cruciale in T cell-dipendenti risposte umorali 25,26.
Il livello di microRNA sovraespressione è stata valutata mediante qPCR. Dopo l'infezione, le cellule sono state riposato per 40 ore, attivati per 40 ore, o riposato 40 ore seguito da 40 ore di attivazione. Dopo 40 hr riposo, le cellule T naive infettate con virus codifica miR-155 visualizzata una sovraespressione di circa 17 volte di miR-155 rispetto alle cellule infettate con virus di controllo o cellule non infettate (Figura 7). Questo quasi abbinato la misura in cui il endogena miR-155 è indotta dopo l'attivazione delle cellule T (Figura 7 e rif. 25,27). Indipendentemente da questa forte induzione del miR-155 endogeno livelli, le cellule infettate con miR-155 adenovirus mostrava ancora circa quattro volte maggiore espressione del miR-155 su attivazione rispetto alle cellule di controllo infettate da virus o non infetti. Il livello osservato di sovraespressione ectopica era paragonabile ad altri microRNA (dati non riportati). Si prega di notare che per i grandi inserti, sovraespressione può essere meno efficace.
Analisi delle T Differenziamento Cellulare
L'analisi dei dati può essere eseguita in diversi modi. Analisi di differenziazione nel cancello positivo GFP di un gene di interesse (cioè nelle cellule infette) rispetto alla differenziazione nella stessa GFP cancello positivo di cellule di controllo (cellule infettate con un vettore senza gene di interesse) è sufficiente per rilevare differenze sostanziali. Per studiare effetti più sottili di un gene di interesse, abbiamo confrontato la differenziazione in cellule infettate con quella di cellule non infette dallo stesso pozzo (Figura 8). Questi servono come Contro internol, e può essere utilizzata per calcolare la "differenziazione relativa" dentro un pozzo. Se un virus non ha alcun effetto sulla differenziazione, la "differenziazione relativa" sarà idealmente 1. La differenziazione relativa per il virus di controllo nelle nostre mani ha una gamma di 0,9-1,1. Differenziazione relativa dovrebbe essere applicato solo a confronto gene-di campioni di interesse infetti per controllare i campioni infetti da virus.
Figura 1. Rappresentazione schematica di generazione di adenovirus. Vettori di ingresso (pENTR) contengono siti donatori di ricombinazione (AttL1, AttL2), che fiancheggiano un gene di interesse. La destinazione vettore pCAGAdDu contiene i siti bersaglio di ricombinazione (attr1, attr2) che fiancheggiano il gene CCDB tossina per selezione negativa in E. coli, che è sostituito dal gene di interessemediante ricombinazione LR. Il vettore di destinazione contiene anche un tipo di adenovirus 5 genoma umano senza E1/E3 geni, che sono stati cancellati per generare adenovirus replica con deficit di ricombinanti. PacI linearizzazione libera ripetizioni invertite (ITR) prima di trasfezione in cellule HEK293A che portano i geni per generare adenovirus infettivi particelle di adenovirus che provocano effetto citopatico. Adenovirus è raccolto da cellule produttrici di cicli di gelo-e-disgelo. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Rappresentazione schematica di infezione delle cellule T e la differenziazione. Cellule T naive sono stati infettati con un lisato adenovirus per 1,5 ore, lavato con PB S e riposto in terreno cellule T per 40 ore a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. Le cellule sono state poi attivate per 72 ore con anticorpi anti-CD28 e anti-CD3 perline anticorpi accoppiati in presenza di TGFβ e IL-2. Cellule fissate e colorate sono state analizzate mediante FACS, e l'espressione di Foxp3 nelle cellule infette rispetto a non-infetta è stata determinata.
Figura 3. Effetto citopatico di adenovirus cellule produttrici HEK293A. Comparsa di CPE dieci giorni dopo la trasfezione di 10 5 cellule HEK293A con 3 ng di linearizzata pCAGAdDu vettore. Il pannello di sinistra mostra l'immagine di contrasto di fase, il pannello di destra mostra la fluorescenza verde.
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Figura 4. Determinazione del titolo di lisati adenovirus da infezione di cellule A549. 10 5 cellule A549 sono state infettate con il virus diluizione indicata, incubate per 48 ore e analizzati per l'espressione del marcatore di infezione GFP mediante citometria a flusso. Il numero di cellule GFP positive è tracciata contro la quantità di virus utilizzato. Il titolo di virus diluito viene calcolata dalla curva standard sopra la gamma lineare con x = 1,000 microlitri.
Figura 5. Adenovirus ad una MOI di 1 - 50 non ha alcun effetto sulla vitalità delle cellule T o differenziazione Treg cellule T naive purificato da DO11.10 tg; CARΔ1 topi Tg sono stati infettati con adenovirus a differenti MOI.per 90 minuti, lavate con PBS e fatti riposare per 40 ore in media delle cellule T. Le cellule sono state attivate in condizioni Treg polarizzanti per 72 ore. Cellule fissate e colorate sono stati analizzati per incorporazione di colorante cellule morte (b), espressione dell'infezione marcatore GFP (a), e del marcatore Foxp3 differenziazione (c). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 6. Adenovirus non modifica lo stato di attivazione delle cellule T da cellule T naive DO11.10 tg;. CARΔ1 topi Tg sono stati infettati con adenovirus ad una MOI di 50 per 90 min (righe) o sinistro non infetto (zone), lavate con PBS e riposato per 40 ore. Le cellule sono state analizzate per expression di marcatori di attivazione prima (pannelli superiori) e dopo (pannelli inferiori) 40 ore di attivazione in Treg condizioni polarizzanti.
Figura 7. Le cellule T naive relativi miR-155 sovraespressione prima e dopo l'attivazione delle cellule T da DO11.10 tg;. CARΔ1 topi Tg sono stati infettati con un MOI di 50 con microRNA-155 (miR-155) che esprimono o adenovirus di controllo, o di sinistra non infetto. Le cellule sono state poi riposato per 40 ore, attivati per 40 ore, o riposato 40 ore seguito da 40 ore di attivazione. Espressione di microRNA-155 è stato determinato rispetto al SnoRNA202 da qPCR.
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Discussion
Generazione Virus e titolazione
Per risultati ottimali trasfezione, la qualità e la quantità di vettore linearizzato appaiono più importante. Non abbiamo osservato effetti negativi sulla produzione di lisato primaria da una crescita eccessiva iniziale della cultura in quanto l'infezione procede rapidamente una volta che la produzione di virus efficiente verifica. Tuttavia, la produzione di virus dalle cellule HEK293A può essere influenzata da lunghi inserti che diminuiscono l'efficienza. Alcune fasi di lettura aperta stati effettivamente trovato per interferire con la produzione di virus. Questi stock virali in genere può essere salvati attraverso vari cicli di amplificazione, e solo poche fasi di lettura aperta sono risultati incompatibili con la produzione di virus. Dalla nostra esperienza, la comparsa di CPE entro 48 ore dopo l'infezione per amplificazione virale in genere produrrà un lisato virale di circa 1 x 10 9 - 5 x 10 10 particelle infettive / ml.
Infezione Adenoviral di cellule T naive
Infezione adenovirale di cellule T naive non modifica lo stato di attivazione delle cellule T, prima e dopo la stimolazione. Questo rende il sistema di trasduzione un potente strumento sperimentale per studiare la differenziazione delle cellule T da TCR-stimolazione iniziale. Abbiamo determinato efficace espressione ectopica di geni di interesse dopo l'infezione e 'riposo' di cellule T per 40 ore, in un momento in cui la cellula è ancora ingenuo e non mostra segni di attivazione. Ciò significa che durante l'attivazione delle cellule T successivo, il gene di interesse viene già sovraespresso e può esercitare la sua influenza sulla differenziazione delle cellule T dall'inizio. Così, trasduzione adenovirus ha un chiaro vantaggio rispetto elettroporazione o trasduzione retrovirale che richiede l'attivazione ed esprimere un gene di interesse solo dopo la segnalazione del TCR iniziale 15,28. Tuttavia, se aspetti tardivi del differenziamento sono analizzati e l'espressione del gene di interesse non è richiesto prima iniziale T cell activzione, le cellule T naive può anche essere stimolata direttamente dopo la trasduzione adenovirale. Poiché l'infezione adenovirale è molto efficiente, essa può essere estesa a studiare attività di cooperazione dei due geni di interesse eseguendo infezioni doppie con adenovirus che esprimono altri marcatori di infezione come Thy1.1 o hCD2. Quest'ultimo è accessibile anche per anticorpi colorazione della superficie e può aggirare le difficoltà di conservazione marcatore durante la fissazione. Nelle cellule T attivate, tuttavia, l'infezione adenovirale ha un rendimento molto più basso, ed elettroporazione o metodi di trasduzione retrovirale può essere favorevole. Un altro avvertimento per l'applicazione adenovirus è il carattere transitorio di espressione. Adenovirus è mantenuto come dell'episoma attaccato alla matrice nucleare della cellula e viene diluito come cellule T proliferano, porta alla perdita di espressione gene marcatore entro cinque-sette giorni dopo l'attivazione delle cellule T (dati non mostrati;. Rif 17). Inoltre, adenovirus-trasdotte cellule sono readily riconosciuti ed eliminati da un sistema immunitario intatto, che ne limita l'utilizzo in vivo, per esempio, in esperimenti di trasferimento adottivo di cellule T nel topo. Un'altra potenziale applicazione del sistema adenoviral potrebbe essere l'infezione di cellule Treg isolate da DO11.10 tg; CARΔ1 topi Tg per studiare la funzione Treg o aspetti di stabilità lignaggio.
Validazione di Effetti Adenovirus su cellule infette
Infezione Adenovirus è stato efficiente e ha avuto quasi nessuna influenza sulla vitalità delle cellule T e la differenziazione Treg. Ad una MOI di 50, abbiamo ottenuto la migliore efficienza dell'infezione senza osservare effetti negativi di adenovirus sulle cellule T. Questo deve essere stabilito in modo simile quando il sistema è applicato altra coltura cellulare o condizione differenziazione, tipicamente mediante esperimenti di titolazione utilizzando adenovirus vuota senza espressione del gene di interesse. Se l'infezione adenovirale come tale non influenza il risultato dell'esperimento,il confronto di gene di adenovirus fruttiferi con adenovirus vuota è ancora il caso di scoprire effetti del gene trasferito di interesse. Se non vi è alcun effetto di infezione adenovirale, il parametro misurato può essere confrontata tra cellule non infette e infette dello stesso campione.
Analisi dei dati
Il metodo di fissazione descritto qui permette l'analisi simultanea del marcatore Foxp3 differenziazione insieme al marcatore GFP infezione, quindi un 'differenziazione parente' può essere determinato. Questa analisi di due popolazioni all'interno di un campione ha una maggiore sensibilità per gli effetti sottili che i confronti di popolazione di massa tra due campioni, visto che richiede variazioni ben di-bene in considerazione. Tuttavia, solo gli effetti propri di cellule infettate saranno riconosciuti da questo metodo, mentre gli effetti ben larghe, ad esempio, le influenze esercitate da un fattore secreto, sarebbero stati trascurati. Differenziazione relativa dovrebbe essere controllata in ciascunaesperimento includendo cellule di controllo da HIV per escludere effetti della stessa infezione sulla differenziazione. Per risultati ottimali, un tasso quasi uguale di infetti alle cellule non infette entro un campione deve essere finalizzato per, mentre i tassi di infezione più elevati sono favorevoli in confronto alla rinfusa tra i diversi campioni.
In conclusione, il trasferimento genico in cellule T naive con adenovirus combinato con protocolli di differenziamento in vitro è un potente sistema per indagare le basi molecolari delle Treg differenziazione. Ciò può consentire la generazione di conoscenze per sfruttare la tolleranza dominante conferito dalla Treg in approcci terapeutici contro le malattie allergiche e autoimmuni.
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Disclosures
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Lirui Du per la costruzione del vettore pCAGAdDU e Oliver Gorka per disposizione del protocollo di fissazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| PacI | New England Biolabs | R057S | |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N | |
| HEK293A Cell Line | Invitrogen | R705-07 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 14 cm tissue culture dish | Nunc | 168381 | |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 | |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E | |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Invitrogen | 15630-056 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | |
| MEM Essential vitamin mixture (100x) | Lonza | 13-607C | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation | Invitrogen | 114-56D | |
| Recombinant Human TGF-beta 1 | R&D Systems | 240B | |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | ||
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 | |
| Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 | |
| Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 | |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
References
- Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
- Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
- Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
- Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
- Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
- Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
- Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
- Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).
- Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
- Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).
- Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).
- Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
- Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
- Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4 (2002).
- Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
- Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
- Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
- Thai, T. -H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
- Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
- Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
- Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).
