Adenoviral Transduksjon av Naive CD4 T-celler for å studere Treg Differensiering

Summary

Adenoviral genoverføring inn naive CD4 T-celler med transgene uttrykk for Coxsackie adenovirus reseptoren gjør den molekylære analyser av regulatoriske T-celle differensiering

Abstract

Regulatoriske T-celler (Tregs) er viktige for å gi immuntoleranse til selv så vel som til visse fremmede antigener. Tregs kan genereres fra naive CD4 T-celler in vitro med TCR-og ko-stimulering i nærvær av TGFβ og IL-2. Dette bærer et enormt potensial for fremtidige terapier, men molekylene og signalveier som styrer differensiering er i stor grad ukjent.

Primær T-celler kan manipuleres gjennom svangerskap utenfor genekspresjon, men vanlige metoder ikke klarer å målrette den viktigste naiv tilstand av T-celle før primære antigen anerkjennelse. Her gir vi en protokoll for å uttrykke ektopisk gener for naive CD4 T-celler in vitro før indusere Treg differensiering. Det gjelder transduksjon med replikering-mangelfull adenovirus og forklarer sin generasjon og produksjon. Den adenovirus kan ta opp store innsatser (opptil 7 kb), og kan utstyres med arrangører for å oppnå høy og forbigående overexpression i T-celler. Det transduces effektivt naive mus T-celler hvis de uttrykker en transgen Coxsackie adenovirus reseptor (CAR). Viktigere, etter smitte T-cellene er fortsatt naiv (CD44 ^lav, CD62L ^høy) og hvile (CD25 ^-, CD69 ^-) og kan aktiveres og differensiert i Tregs lik ikke-infiserte celler. Dermed kan denne metoden manipulering av CD4 T-celle differensiering fra begynnelsen. Det sikrer at ektopisk genuttrykk er allerede på plass når tidlige signalering hendelsene i den første TCR stimulering induserer celleforandringer som til slutt fører til Treg differensiering.

Introduction

Tregs er avgjørende for å opprettholde immunforsvaret toleranse og til å dempe skyter immunreaksjoner. Tregs undertrykke tilskuer T celle aktivering. Følgelig fører ablasjon av Tregs til dødelig autoimmunitet og selvødeleggelse drevet av aktiverte T-celler ^en. Tregs utvikles i thymus ved negativ seleksjon av CD4 positive enkelt-forløpere, men de kan også skille i periferien fra naive CD4 T-celler ved lav-dose antigen stimulering med suboptimal ko-stimulering ^1,2. Thymisk Tregs synes å undertrykke vev autoimmunitet mot selv-antigener, mens perifer Tregs har vært innblandet i å gi toleranse i tarmen eller lunge. Disse induserte Tregs potente hindre T celle aktivering etter anerkjennelse av utenlandske antigener i slimhinnene, herunder miljømessige antigener fra mat og luft, commensal bakterier og allergener ^3,4. I tillegg Tregs er avgjørende for å etablere mors toleranse for fosterets peptider ⁵ og å prelufthull graft-versus-host sykdom ^6.. På samme tid, Tregs også mediere uønskede effekter ved å dempe immun overvåking av tumorceller ^7,8. Kjennetegnet av Tregs er uttrykk for den delen-angivelse transkripsjonsfaktor foxp3, en gaffel-head domenenavn som inneholder transkripsjonsfaktor som er nødvendig og tilstrekkelig for å konferere Treg funksjon ^9,10. Noen signalveier som kan indusere foxp3 uttrykk er kjent. Imidlertid er de molekylære prosesser som kontroll, regulere eller modulere Treg differensiering i respons til T-celle-reseptor utløsende mindre godt forstått.

Tregs kan meget effektivt kan bli indusert in vitro gjennom stimulering av naive CD4 T-celler med anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer i nærvær av TGFβ og IL-2 ^11. Som den nye Tregs er funksjonelle in vivo, manipulering av molekyler som fremmer Treg differensiering bærer et enormt potensial for fremtidig therapies, for eksempel, ved behandling av astma, Crohns sykdom, og transplantasjon ^11,12. Motsatt kan terapeutisk modulering av molekyler til å blokkere Treg differensiering gi nytte i fremtidige tilnærminger av kombinert behandling av slike pasienter.

In vitro differensiering assay har vært medvirkende til beskrivelsen av molekylære endringer som er forbundet med T-celle undersett differensiering. I øyeblikket, eksperimentelle forsøk på å søke eller skjerm for genprodukter som styrer T-celle differensiering er hemmet av det faktum at de vanligste metodene for ektopisk genuttrykk mislykkes i naive T-celler. For eksempel elektroporering og retroviral transduksjon er bare effektive i aktiverte T-celler. I motsetning til opprinnelige forventninger, lentiviral transduksjon, som vanligvis effektiv i hvilende celler, krever pre-aktivering av naive T-celler av cytokiner ^13. Videre overføring av cDNA eller mRNA under elektroporeringinnebærer depolarisering av cellemembranen, som selv confers trekk ved T-celleaktivering, og kan til og med mobilisere Ca ^{2 +} signalering og aktivere NFAT proteiner (upublisert observasjon og ref.. ^14). Tilsvarende for retroviral transduksjon, naive T-celler har til å bli aktivert for 18 - 40 timer. I løpet av denne tid, forekommer nedbrytning av den nukleære membranen i løpet av celledeling og gjør det mulig for den etterfølgende genomisk integrering av den retrovirale vektoren ^15.. Disse metoder er derfor ikke i stand til å ta opp den molekylære tidlig innledende regulering av T-celle møte med antigen, som er den avgjørende fase av hjelper T celle-differensiering.

Adenoviral transduksjon er kjent for å gi forbigående ektopisk genekspresjon i en rekke humane celletyper som uttrykker human adenovirus Coxsackie-reseptor (CAR). Den fortsetter uten krav til celle aktivering eller celle-syklus progresjon. Overflaten uttrykk for CAR er en forutsetning for effektiv virus tilknytning og internalisering, og transgene ekspresjon av den avkortede versjon CARΔ1 under en T-celle-spesifikk promotor ble funnet å gjengi mus thymocytter og T-celler som er mottakelige for infeksjon adenoviral ^16.. Viktigere, ikke transgene ikke endre thymocyte utvikling eller in vitro differensiering av naive CD4 T-celler i ulike undergrupper (data ikke vist, ref. ^17.). Adenovirus-mediert transduksjon av T-celler ble tidligere brukt for overexpression ^17,18 og knock-down tilnærming ^19,20. De transgene T-celler kan bli renset fra kommersielt tilgjengelig DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. og ref. ^17..). Viktigste er at adenoviral transduction høyt uttrykk av et gen av interesse for naive T-celler uten å indusere tydelige tegn på aktivering. T-cellene er fortsatt naiv (CD44 ^lav, CD62L ^høy) og hvile (CD25 ^-, CD69 ^-) etter infectipå og kan aktiveres og differensiert i Treg lik ikke-infiserte celler.

Produksjon av rekombinante adenovirus kan oppnås etter transfeksjon av celler med HEK293A adenovirale plasmider (Figur 1). Disse plasmider inneholder vanligvis den menneskelige type 5 adenovirus genom med E1 og E3 gener slettede å gjengi rekombinant adenovirus replikering-inkompetente ^21. HEK293A celler utfylle replikering mangel som de har blitt udødeliggjort gjennom stabil integrering av skåret adenovirus ^22. Siden adenovirus vektorer er store (~ 40 kb), og dermed ikke godt egnet for tradisjonell begrensning enzym-mediert kloning, brukte vi den Gateway-systemet. Genet av interesse blir først klonet inn i en mindre adgang vektor, hvorfra det lett kan overføres til det adenovirale vektor destinasjon via lambda rekombinasjon reaksjon (LR) ^23. Vi konstruerte pCAGAdDu vektorved å kombinere CAG promoter (kylling aktin promoter og CMV forsterker) med et uttrykk kassett som inneholder LR nettsider flankerer prokaryote ccdB seleksjonsmarkør ^24. Denne ekspresjonskassett er sammensmeltet til en intern ribosom inngang stedet (IRES) element som tillater coexpression av den eukaryote infeksjon markør forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP), som er kondensert til en sekvens inneholdende det bovine veksthormon poly (A)-signal. Vi valgte CAG cis-regulatoriske sekvenser, ettersom prototypic CMV-promotor ble funnet å være svært aktiveringen-avhengige og derfor ugunstig for genekspresjon i naive T-celler.

Her gir vi en protokoll for effektiv in vitro differensiering Treg og en fremgangsmåte for å transduce naive CD4 T-celler uten aktivering (figur 2). Metoden gjør det mulig ektopisk genekspresjon eller slå ned foregående CD4 T-celle differensiering på naive tilstand. Den lar teste effekten av en overexpressed gen av interesse i løpet av tidlig signalering hendelser ved første TCR stimulering til T-celle undergruppe engasjement. Våre validering eksperimenter også gi grunnlag for å etablere lignende adenovirus programmet i differensiering av andre T celle undergrupper som Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, eller TFH celler.

Protocol

En. Kloning av et gen av interesse inn i en post Vector

1. Klon genet av interesse inn i en post vektor. PCR amplifikasjon av genet fulgt av butt-ende ligering inn i en topoisomerase-coupled vektor (f.eks pENTR / D-TOPO) eller restriksjonsenzym-mediert kloning kan anvendes for denne fremgangsmåte.

2. Overføre genet av interesse i pCAGAdDu Destinasjon Vector

1. Overføre genet av interesse fra oppføringen vektor inn destinasjonen vektor av LR rekombinasjon (f.eks Gateway LR Clonase II Enzyme Mix). Dette vil skape adenoviral ekspresjonsvektoren (figur 1).
2. Linearisere 10 ug av det adenovirale ekspresjonsvektor i en paci begrensning Digest, felle ut DNA og resuspender den i vann ved en konsentrasjon på 3 ug pr 100 ul. Linearisering frigjør de virale inverterte repetisjoner (ITR), som er nødvendig for replikering og encapsidation av viral DNA inn viruspartikler.

3. Generasjon av Primary Virus Lysate

1. Seed 1 x 10 ⁵ HEK293A celler i 2 ml cellekultur-medium (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) i en brønn i en 6-brønns plate og inkuberes cellene i 6 - 14 timer ved 37 ° C i en 10% CO ₂ inkubator å tillate dem å følge. Celler bør da være på ca 50% confluency.
2. Lipofection: Transfer 6 ul av jetPEI reagens til 94 pl av 50 mM NaCl, vortex kort stund. Legg den blandede oppløsningen til 100 ul adenovirus lineariserte vektor mens virvling og inkuber denne transfeksjon blandingen i 15 - 30 minutter ved romtemperatur.

Utføre alle disse trinnene under de aktuelle biosikkerhet betingelser for adenovirus infeksjon!

3. Tilsett dråpevis måte på HEK293A celle-inneholdende brønn og inkuberes cellene ved 37 ° C og 10% _CO2. Når du bruker en fluorescens markør, evaluere overfÃDette skjer effektivitet visuelt etter 12-36 timers bruk en omvendt fluorescens mikroskop. Tilsett 0,5 ml friskt medium hver 3. dag.
4. Sjekk hver 2-3 dager med en lys eller fluorescens mikroskop for cytopatiske effekter (CPE), som er områder med forstørrede og avrundede celler som begynner å løsne. Dette er et tegn på effektiv virus generasjon. Ved forekomst av bredere soner av CPE (figur 3), vil det ta 24 - 72 timer før alle celler er infisert.
5. Når alle celler som viser tegn til CPE, men før en samlet løsgjøring av celler skjer, løsne cellene ved forsiktig pipettering og overføre cellene med supernatanten (SN, 3 - 5 ml) til et 15 ml rør polystyren.
6. Fryse cellene i SN på tørris i 15 - 20 min og tine dem raskt ved 37 ° C i etterkant for å sprekke cellene. Gjenta denne fryse-og tine-syklus (F / TC) to ganger til. Hold den primære virus lysatet på is for bruk innen en dag eller fryse den ved -80 ° C for langtidslagring. Eventuelle ekstra F/ TC vil redusere virustiter ved 30 - 50%.

4. Virus Amplification

1. Seed og vokse HEK293A celler til 90% samløpet på en 14 cm vev kultur parabolen.
2. Infisere cellene med halvparten av primær virus-lysat (1.5 - 2,5 ml) og inkuberes cellene i minst 36 timer. Nesten alle cellene skal bli smittet da, noe som kan fastslås ved fluorescens mikroskopi. For re-forsterkning av en allerede forsterket (dvs. mer konsentrert) virus lager, infisere HEK293A på et mangfold av infeksjon (MOI) på 50 (se 6.3).
3. Celler som skal avvirkes når alle av dem viser CPE men før løsgjøring. Med effektiv virus produksjon denne tilstanden er nådd innen 48 timer etter smitte. (Hvis det tar opp til en uke, bør du vurdere en ny runde med forsterkning ved å øke mengden av adenovirus lager brukes til infeksjonen er beskrevet i 4.2.)
4. Løsne cellene ved forsiktig pipettering og overføre celler og SN til en 50 ml polystyren rør. Spinn celler ned ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C.
5. Fjern SN og resuspender pelleten i et egnet volum av medium eller SN (ca. 1 ml).
6. Utfør 3 F / TC for å oppbryte cellene og sentrifuger ved 800 xg i 15 min ved 4 ° C. Ta av SN som inneholder virus partikler (dvs. konsentrert virus lysatet), og delmengde viruset lysatet å lagre den ved -80 ° C.

5. Virus Titer Fastsettelse

1. Seed 10 ⁵ A549 celler per brønn inn i fem brønner på en 12-brønners plate i 1 ml medium og la cellene holder seg for seks hr.
2. Bruk en ul konsentrert adenovirus (tint på is) til å utføre en seriell fortynning i medium (1:5,000, 1:10.000, 1:50,000, 1:100.000) og tilsett 10 mL per brønn. La en vel uinfisert å justere gating i strømningscytometri.
3. Etter 36 timer, ta av SN, vask med PBS og løsne celler (f.eks ved trypsinering). For biohazard forholdsregler, anbefales det å fikse calen i 100 pl 4% paraformaldehyd i PBS i 10 min ved romtemperatur og vaskes med PBS en gang.
4. Utfør en FACS analyse av infeksjon markør uttrykk. Plot 'ul viral lysate brukt "mot det absolutte antallet infiserte celler (figur 4). Bestem den lineære området av infeksjon og beregne titer pr ml ufortynnet virus fra standardkurven over lineære område ved hjelp av x = 1,000 mL.

6. T Cell Infeksjon

1. Isolere naive / hvilende CD4 T-celler fra DO11.10 tg; CARΔ1 tg mus ved MACS (Naive CD4 + T Cell Isolation Kit II) eller FACS sortering (CD4 + CD25-CD62L + CD44-).
2. For småskalaforsøk, pipetteres et passende volum av viralt lysat for å oppnå en MOI på 50 inn i en brønn av en 96-brønns rundbunnet plate.
3. Legg til opptil 4 x 10 ⁵ T-celler i en endelig infeksjon volum på 50 mL i T-celle medium (RPMI1640, 10% FBS, 5% PenStrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM Essentialvitamin, 1x L-Glutamin, 1:250,000 Mercaptoethanol, 10 mMHEPES).
   Eksempel:
   En MOI på 50 skal benyttes for å infisere 3 x 10 ⁵ T-celler; den virale titer er 3 x 10 ml ^{9 -1}
   Virus volum = MOI x T celle nummer / viral titer = 50 x (3 x 10 ⁵⁾ / (3 x 10 ⁹ ml ^-1) = 0.005 ml

Merk: for smitte av større celle tall, skalere opp ved hjelp av en MOI av 50 i en infeksjon volum på 165 mL per 10 ⁶ naive T-celler i et polystyren rør med løs kopp (opp tp 3 ml per rør).

4. Inkuber cellene i 90 min ved 37 ° C i en 5% _CO2 inkubator.
5. Spinn ned cellene ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur, ta av SN, resuspender i 200 ul PBS. Sentrifuger på nytt og ta av SN.

(Valgfritt: cellene kan vaskes på nytt for å fjerne viruset mer effektivt)

6. Resuspender celleri 200 mL T-celle medium uten å stimulere antistoffer og uten IL-2 og andre cytokiner og hvile dem i 40 timer ved 37 ° C i en 5% CO ₂ inkubator for å tillate ekspresjon av genet av interesse før aktivering.

7. T celle aktivering og Polarisering

1. Pipetter et volum på anti-CD3-og anti-CD28-koblede perler som tilsvarer celle nummer (for eksempel 4 x 10 ⁵⁾ inn i en liten reagens cup, legger 10-fold volum av PBS og sette dem på en magnet for 2 min . Ta av supernatanten og resuspender perler i 200 mL polariserende medium (for Tregs: T-celle-medium + 1 ng / ml TGFβ, 100 U / ml IL-2).

Merk: Celler kan også aktiveres ved hjelp av vevskultur-retter belagt med anti-CD28 og anti-CD3-antistoffer, eller i en DO11.10 T celle reseptor-spesifikk måte ved hjelp av bestrålte BALB / c-splenocytter pulserende med ovalbumin 323-339 peptid antigen.

2. Centrifuge den hvilte celler som før, ta av SN og Resuspender celler i 200 mL polariserende medium som inneholder anti-CD3-og anti-CD28-antistoff-koblede perler. Inkuber i 72 timer ved 37 ° C i en 5% _CO2 inkubator uten å endre medium.

8. T Cell fiksering og farging for flowcytometrisystemer

1. Vask cellene: Spinn ned cellene ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur, ta av SN, resuspender i 200 ul PBS. Sentrifuger på nytt og ta av SN. Utføre alle følgende vask steg tilsvarende.
2. Resuspender cellene i 100 pl festbar døde cellefarging løsning og inkuberes i 30 min ved 4 ° C.
3. Vask cellene, resuspender i 100 pl PBS, tilsettes 100 pl 4% paraformaldehyd i PBS, 15 inkuber min ved RT.
4. Vask cellene, resuspender dem i 200 ul iskald 70% metanol i PBS og inkuberes i 30 min på is.

Merk: Celler kan behandles fra nå av uten biohazard forholdsregel!

5. Forbered 60 mL herre-blanding av 60 mL PBS + 10 mikrogram / ml Fc-blokken (anti-FCR3 å blokkere uspesifikk binding). Vask cellene, resuspender dem i 40 pl av PBS + anti-FCR3 og inkuberes 15 minutter ved RT.
6. Tilsett 20 mL PBS + anti-FCR3 inneholdende 1 mikrogram PE-koblet anti-foxp3 antistoff, bland godt og inkuber ved 4 ° C over natten.
7. Vask cellene to ganger i PBS og analysere celler i et strømningscytometer.

Representative Results

Virus Produksjon

For generering av høye virus titer, er tidspunktet for HEK293A celleinnhøstningsutstyr i primær virus produksjon eller virus forsterkning avgjørende. Representative fluorescerende og fase kontrast med visuelle tegn på virus produksjon er vist i figur 3.. Den CPE ble observert 10 dager etter transfeksjon av HEK293A celler med en kontroll pCAGAdDu vektor uten innsatsen. CPE er preget av utseendet på områder med forstørret og round-up celler som begynner å løsne og viser høy uttrykk for infeksjon markør GFP. Omfanget av CPE er indikativ for effektiv virus generasjon. Cellekultur platene viser lignende CPE kan høstes innen 24 - 72 timer, og en rå virus lysate kan genereres av fryse-og-tine sykluser. Virustiter kan deretter bestemmes ved seriell fortynning av virus-lysat for å tillate sammenligning av infeksjoner med en lik MOI (figur 4). Innenfor lineære området, than regresjonsanalyse ligning kan brukes til å beregne antallet infeksiøse partikler per ml ufortynnet virus-lysat. I eksemplet er titeren for x = 1 ul er 30016535 mL ^-1 ≈ 3 x 10 ¹⁰ ml ^-1.

Evaluere virkningen av Adenovirus Infeksjon på T celle aktivering og Differensiering

Effektene av adenovirus transduction på målcellene har blitt evaluert ved å infisere naive CD4 T-celler med økende Mois bruker en adenoviral kontroll vektor som bare uttrykker IRES-GFP (figur 5a). Infeksjonen effektivitet ble målt ved FACS-analyse bestemme GFP positive celler i faste T-celle-prøver 72 timer etter induksjon av Treg differensiering. Frekvensen av GFP positive celler økte med MOI brukes for infeksjon og nådde 84% infeksjon på en MOI av 50. Vi vil ikke få mye høyere prosentandeler av infiserte T-celler ved bruk av MOI større enn 50 (data ikke vist). Selv om infeDette skjer effektivitet kan variere avhengig av genet av interesse, kan man vanligvis infisere mer enn 50% av cellene ved en MOI på 50. Ved MOIS mellom 1 og 50 cellens levedyktighet ikke ble påvirket (figur 5b). Viktigere var det stimulering og differensiering av naive T-celler til Tregs lignende i den infiserte forhold til de ikke-infiserte celler (figur 5c). En viktig egenskap ved adenovirus transduksjon er dens evne til å infisere hvilende og naive T-celler uten overdragelse eller som krever T-celle aktivering. Dette er åpenbart fra analysen av markører for T-celleaktivering (CD25, CD69, CD44), og markøren av naive (CD62L) T-celler i prøver med eller uten adenovirus-infeksjon og hvile i 40 timer ved 37 ° C i en 5% CO ₂ inkubator (figur 6). Før in vitro T-celleaktivering med anti-CD3-og anti-CD28-koblede perler, ble de infiserte og ikke-infiserte T-celler på samme måte CD25 ^{lav, lav} CD69 og CD44 ^low men CD62L ^høy, viser deres naive og hviletilstand (figur 6, øvre paneler). Ved T-celle aktivering, viste de infiserte cellene oppregulering av aktivering markører CD25, CD69 og downregulation av CD62L nesten umulig å skille fra infiserte celler (figur 6, lavere paneler). Således er aktiveringsstatusen av T-celler ikke endret av adenovirus-infeksjon. I hvilefasen er forbundet med tapet av 60 til 70% av cellene på grunn av fravær av vekstfaktorer eller cytokiner, sammenlignet med 10 - 20% døde celler 40 timer etter aktivering uten å hvile. Dette ble tatt hensyn til ved valg av det initiale celletall på 3 x 10 ⁵ celler.

Evaluere Overuttrykte nivå av en Gene of Interest

For å evaluere mengden av overekspresjon oppnås ved adenoviral genoverføring, søkte vi å bestemme microRNA-155 (Mir-155) ekspresjonsnivåer i naive T-celler som vire infisert med Mir-155-uttrykke eller kontroll adenovirus eller ble forlatt infisert. Vi valgte Mir-155 siden denne modne miRNA er uttrykt på et moderat nivå i naive T-celler og blir sterkt indusert på T-celle aktivering. Videre har den en avgjørende rolle i T celle-avhengige humorale responser ^25,26.

Nivået på microRNA overexpression ble evaluert av qPCR. Etter infeksjon, ble cellene uthvilt for 40 timer, aktiveres for 40 timer, eller hvilt 40 timer etterfulgt av 40 hr av aktivering. Etter 40 timers hvile, de naive T-celler infisert med Mir-155 koder for virus viste en omtrent 17-ganger overuttrykte mir-155 sammenlignet med celler infisert med kontroll-viruset eller ikke-infiserte celler (figur 7). Dette nesten matchet i hvilken grad den endogene Mir-155 er indusert etter T-celle aktivering (Figur 7 og ref.. ^25,27). Uavhengig av denne sterke induksjon av den endogene Mir-155 nivåer, celler infisert med miR-155 adenovirus fortsatt viste om fire-fold økning i uttrykk av Mir-155 ved aktivering i forhold til å kontrollere virus-infiserte eller ikke-infiserte celler. Observert nivå for ektopisk overexpression var sammenlignbare for andre microRNAs (data ikke vist). Vær oppmerksom på at for store innsatser, kan overexpression være mindre effektive.

Analyse av T celledifferensiering

Dataene analyse kan utføres på flere måter. Analyse av differensiering i GFP ^positiv port av et gen av interesse (dvs. i de infiserte celler) sammenlignet med differensiering i de samme GFP ^positiv port av kontroll-infiserte celler (celler ved hjelp av en vektor uten gen av interesse) er tilstrekkelig til å oppdage betydelige forskjeller. For å studere mer subtil virkning av et gen av interesse, har vi sammenlignet differensiering i infiserte celler med den av ikke-infiserte celler fra den samme brønnen (figur 8). Disse fungerer som en intern control, og kan benyttes til å beregne den "relative differensiering" inne i en brønn. Hvis et virus har ingen effekt på differensiering, vil den "relative differensiering" ideelt sett være en. Den relative differensiering for kontroll viruset i våre hender har en rekkevidde på 0,9 til 1,1. Relativ differensiering bør bare brukes til å sammenligne gen-interesse-infiserte prøver å kontrollere virus-infiserte prøvene.

Figur 1. Skjematisk fremstilling av adenovirus generasjon. Entry vektorer (pENTR) inneholder rekombinasjon donorflater (AttL1, AttL2), som flankerer en genet av interesse. Destinasjonen vektor pCAGAdDu inneholder rekombinasjon målwebområder (AttR1, AttR2) flankerer toksinet CcdB genet for negativ seleksjon i E. coli, som blir erstattet med genet av interessegjennom LR rekombinasjon. Destinasjonen vektor inneholder også en menneskelig type 5 adenovirus genom uten E1/E3 gener, som har blitt slettet for å generere replikering-mangelfull rekombinant adenovirus. Paci linearisering frigjør invertert repetisjoner (ITR) før transfeksjon inn HEK293A celler som bærer adenovirus gener å generere smittsomme adenovirus partikler som resulterer i cytopathic effekter. Adenovirus er høstet fra produserende celler ved fryse-og-tine sykluser. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Skjematisk fremstilling av T-celle-infeksjon og differensiering. Naive T-celler ble infisert med en adenovirus-lysat i 1,5 timer, vasket med PB S og hvilte i T-celle medium for 40 timer ved 37 ° C i en 5% CO ₂ inkubator. Cellene ble deretter aktivert i 72 timer ved hjelp av anti-CD28 og anti-CD3-antistoff-koblede perler i nærvær av TGFβ og IL-2. Faste og fargede celler ble analysert ved FACS, og ekspresjon av foxp3 i infiserte versus ikke-infiserte celler ble bestemt.

Figur 3. Cytopatisk effekten av adenovirus-produserende HEK293A celler. Forekomst av CPE i dag ti etter transfeksjon av 10 ⁵ HEK293A celler med 3 ng av lineær pCAGAdDu vektor. Det venstre panelet viser fase kontrast bildet, viser det høyre panelet den grønne fluorescens.

55/50455fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50455/50455fig4.jpg "/>
Figur 4. Bestemmelse av titer av adenovirus-lysater ved infeksjon av A549-celler. 10. ⁵ A549-celler ble infisert med det indikerte virus fortynning, inkubert i 48 timer og analysert for ekspresjon av infeksjonen markør GFP ved strømningscytometri. Antallet GFP ^positive celler er plottet mot mengden virus som brukes. Den titer av ufortynnet virus blir beregnet fra standardkurven over lineære område ved hjelp av x = 1,000 mL.

Figur 5. Adenovirus infeksjon på en MOI av 1 - 50 har ingen effekt på T-celle levedyktighet eller Treg differensiering Naive T-celler renset fra DO11.10 tg; CARΔ1 tg mus ble infisert med adenovirus på ulike Mois.i 90 min, vasket med PBS og hvilte i 40 timer i ikke T-celle medium. Celler ble aktivert i Treg polariserende forholdene for 72 timer. Faste og fargede celler ble analysert for inkorporering av død celle fargestoff (b) ekspresjon av infeksjonen markør GFP (a) og av den differensiering markør foxp3 (c). klikk her for å vise større figur .

Figur 6. Adenovirus infeksjon endrer ikke aktiveringsstatusen av T-celler naive T-celler fra DO11.10 tg;. CARΔ1 tg mus ble infisert med adenovirus ved en MOI på 50 til 90 min (linjer) eller forble uinfisert (områder), vasket med PBS og uthvilt for 40 hr. Celler ble analysert for expression av aktivering markører før (øvre paneler) og etter (nedre paneler) 40 hr av aktivering i Treg polariserende forhold.

Figur 7. . Relative Mir-155 overexpression før og etter T-celle aktivering Naive T-celler fra DO11.10 tg; CARΔ1 tg mus ble smittet på en MOI av 50 med microRNA-155 (Mir-155)-uttrykke eller kontroll adenovirus, eller venstre infisert. Cellene ble deretter hvilt i 40 hr, aktivert i 40 timer, eller hvilte 40 hr etterfulgt av 40 timers aktivering. Uttrykk for microRNA-155 ble bestemt i forhold til SnoRNA202 av qPCR.

positive (dvs. infiserte celler) uttrykkes i forhold til prosentandelen av foxp3 + celler i GFP ^negative (ikke-infiserte celler). Relativ differensiering er lik 1, hvis overexpressed genet av interesse hadde ingen effekt på Treg differensiering. Verdier over 1 indikerer en fremmende effekt på differensiering, mens verdier under ett viser en hemmende effekt.

Discussion

Virus Generation og Titrering

For optimal transfeksjon resultater, kvaliteten og mengden av lineær vektor vises viktigst. Vi observerte ikke negative effekter på primære lysate produksjon fra en innledende overvekst av kulturen siden infeksjonen vil raskt gå en gang effektiv virus produksjon skjer. Imidlertid kan virusproduksjon ved HEK293A celler bli påvirket av lange innstikk som reduserer effektiviteten. Noen åpne leserammene ble faktisk funnet å forstyrre virus produksjon. Disse viral aksjer kan vanligvis bli reddet gjennom flere runder med forsterkning, og bare få åpne leserammene ble funnet å være uforenlig med virus produksjon. Fra vår erfaring, vil utseendet av CPE innen 48 timer etter infeksjon for virus amplifikasjon gir vanligvis et viralt lysat av omtrent 1 x oktober ^{9 til} 5 x 10 ¹⁰ infeksiøse partikler / ml.

Adenoviral Infeksjon av Naive T-celler

Adenoviral infeksjon av naive T-celler endres ikke aktiveringsstatusen av T-celler før og etter stimulering. Dette gjør transduksjon systemet en kraftig eksperimentelt verktøy for å studere T-celle differensiering fra første TCR-stimulering på. Man har bestemt effektiv ektopisk ekspresjon av gener av interesse etter infeksjon og "hvile" av T-celler for 40 timer, i en tid når cellen er fremdeles naiv og viser ikke tegn til aktivering. Dette betyr at under den etterfølgende T-celleaktivering, blir genet av interesse som allerede er overuttrykt og kan utøve sin innflytelse på T-celle differensiering fra begynnelsen. Dermed har adenoviral transduction en klar fordel over elektroporering eller retrovirale transduksjon som krever aktivering og uttrykke et gen av interesse bare etter første TCR signalering ^15,28. Imidlertid, hvis sen aspekter ved differensiering skal bli analysert, og ekspresjon av genet av interesse ikke er nødvendig før første T-celle Activasjon, kan naive T-celler i tillegg bli stimulert direkte etter adenoviral transduksjon. Siden adenoviral infeksjon er meget effektiv, kan den utvides til å studere samarbeidsaktivitetar av to gener av interesse ved å utføre dobbel infeksjon med adenovirus som uttrykker andre infeksjoner markører som Thy1.1 eller hCD2. Sistnevnte er også tilgjengelige for antistoff overflate farging og kan omgå problemer med markør konservering ved fiksering. I aktiverte T-celler, har imidlertid adenoviral infeksjon en mye lavere effektivitet, og elektroporering eller retrovirale transduksjon metoder kan være fordelaktige. En annen påminnelse for adenovirus søknaden er forbigående karakter uttrykk. Adenovirus er beholdt som episome festet til den kjernefysiske matrise av cellen og vil bli utvannet som T-celler som sprer, som fører til tap av markørgenet ekspresjon i løpet av fem til syv dager etter T-celleaktivering (data ikke vist,. Ref. ^17). I tillegg, adenovirus-transduserte celler er readily gjenkjennes og fjernes ved et intakt immun-system, som begrenser dets bruk in vivo, for eksempel i adoptiv overføring eksperimenter av T-celler i mus. En annen potensiell anvendelse av adenoviral system kan være infeksjon i Treg celler isolert fra DO11.10 tg; CARΔ1 tg mus for å studere Treg funksjon eller avstamning stabilitet aspekter.

Validering av Adenovirus Effekter på infiserte celler

Adenovirus infeksjon var effektiv og hadde nesten ingen innflytelse på T-celle levedyktighet og treg differensiering. Ved en MOI på 50, erholdt vi den beste infeksjon effektivitet uten å følge de uheldige effekter av adenovirus-infeksjon på T-celler. Dette må likeledes etablert når systemet anvendes for andre cellekultur eller differensiering tilstand, vanligvis ved titrering eksperimenter ved hjelp av tom adenovirus uten ekspresjon av genet av interesse. Hvis det adenovirale infeksjon som sådan ikke påvirker resultatet av forsøket,sammenligningen av genet av interesse-bærende adenovirus med tom adenovirus er likevel hensiktsmessig å avdekke virkninger av den overførte genet av interesse. Hvis det ikke er noen effekt av adenoviral infeksjon, kan den målte parameteren også sammenlignes mellom ikke-infiserte og infiserte celler av samme prøve.

Data Analysis

Den fiksering metoden beskrevet her tillater en simultan analyse av differensiering markør foxp3 sammen med infeksjonen markør GFP, slik at en 'relativ differensiering "kan bestemmes. Denne analysen av to populasjoner innen en prøve har høyere følsomhet for subtile effekter enn bulk befolkningen sammenligninger mellom to prøver, siden det tar godt-til-vel variasjoner i betraktning. Imidlertid vil kun effekt iboende i infiserte celler bli gjenkjent av denne metoden, mens vel-brede effekten, f.eks påvirkninger som utøves av et utskilt faktor, ville bli neglisjert. Relativ differensiering skal styres i hverteksperiment ved å ta med kontroll-infiserte celler for å utelukke effektene av infeksjonen på differensiering. For optimale resultater, bør en nesten lik frekvensen av infiserte til friske celler i løpet av én prøve være rettet for, mens høyere infeksjon priser er gunstige i bulk sammenligninger mellom flere prøver.

I konklusjonen, genoverføring inn naive T-celler ved hjelp av adenovirus kombinert med in vitro differensiering protokoller er et kraftig system for å undersøke det molekylære grunnlaget for Treg differensiering. Dette kan medføre at generasjonen av kunnskap for å utnytte den dominerende toleranse gitt av Tregs i terapeutiske tilnærminger mot allergiske og autoimmune sykdommer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A Cell Line	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
6-well plates	BD Falcon	353046
14 cm tissue culture dish	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr	Taconic Farms	Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamine	Invitrogen	25030
HEPES Buffer Solution (1 M)	Invitrogen	15630-056
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation	Invitrogen	114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1	R&D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L-23105
Mouse BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay	Roche Applied Biosystems	4427975
LightCycler 480 Probes Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Roche Applied Biosystems	4366596