Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Аденовирусной трансдукции наивного CD4 Т-клеток по изучению Treg Дифференциация

Published: August 13, 2013 doi: 10.3791/50455
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Molecular Immunology, Helmholtz Zentrum München

Summary

Аденовирусные перенос гена в наивных CD4 Т-клеток с трансгенной экспрессии рецептора аденовируса Коксаки позволяет молекулярного анализа регуляторных Т-клеточной дифференцировки

Abstract

Регуляторные Т-клетки (Treg,) имеют важное значение для обеспечивать иммунную толерантность к себе, а также определенные чужеродные антигены. Tregs могут быть получены от наивных Т клеток CD4 в пробирке с TCR-и совместной стимуляции в присутствии TGF-и ИЛ-2. Это имеет огромный потенциал для будущих терапий, однако, молекулы и сигнальных путей, которые контролируют дифференциации в значительной степени неизвестными.

Первичные Т-клетки можно манипулировать посредством эктопической экспрессии генов, но общие методы не позволяют нацелены на наиболее важных наивных состояние Т-клеток перед первичным распознавание антигена. Здесь мы предоставляем протокол выразить внематочной генов в наивных Т клеток CD4 в пробирке Перед тем как вызвать Treg дифференциации. Это относится трансдукции репликацию аденовируса-дефицитных и объясняет его поколения и производства. Аденовирус может занять до больших вставками (до 7 КБ) и может быть оборудован с промоутерами для достижения высоких и переходные ПЕРЕЭКСПression в Т-клетках. Он эффективно преобразовывает наивные Т-клетки мыши, если они выражают трансгенных аденовирус Коксаки рецепторов (CAR). Важно отметить, что после инфекции Т-клеток остаются наивных (CD44 низкий, CD62L высокий) и отдыха (CD25 -, CD69 -) и может быть активирована и дифференцировались в Tregs похожа на неинфицированных клеток. Таким образом, этот метод позволяет манипуляции дифференциации CD4 Т-клеток с самого начала. Это гарантирует, что эктопическая экспрессия гена уже на месте, когда в начале сигнальных событий начальной стимуляции TCR вызывает клеточный изменения, которые в конечном итоге ведут в Treg дифференциации.

Introduction

Tregs имеют решающее значение для поддержания иммунной толерантности и, чтобы ослабить превышение иммунных реакций. Tregs подавлять наблюдателем активацию Т-клеток. Следовательно, абляция Tregs приводит к фатальным аутоиммунные и самоуничтожение обусловлен активированных Т-клеток 1. Tregs развиваться в тимусе при отрицательной селекции клеток CD4 одним положительным предшественников, но они также могут дифференцироваться в периферии от наивных CD4 Т-клеток при низких дозах антигена стимуляции с субоптимальной костимуляцию 1,2. Тимуса Tregs кажется подавить ткани аутоиммунные против аутоантигенов, в то время как периферийная Tregs были вовлечены в обеспечении толерантности в кишки или легкого. Эти индуцированные Tregs мощно предотвратить активацию Т-клеток после признания чужеродных антигенов в слизистой оболочке, в том числе экологических антигенов из пищи и воздуха, синантропных бактерий и аллергенов 3,4. Кроме того, Tregs имеют решающее значение для создания материнской толерантности к плода пептиды 5 и предварительновентиляционные трансплантат против хозяина 6. В то же время, Tregs также посредником нежелательных эффектов путем ослабления иммунного надзора опухолевых клеток 7,8. Отличительной особенностью Tregs является выражением подмножество указанием Foxp3-фактор транскрипции, вилка-головной домен-содержащий транскрипционный фактор, который является необходимым и достаточным для придания Treg функции 9,10. Некоторые сигнальных путей, которые могут индуцировать Foxp3 экспрессии, хорошо известны. Однако молекулярные процессы, контроля, регулирования, или модулировать Treg дифференцировка на Т-клеточный рецептор запуска менее понятны.

Tregs может быть очень эффективно индуцированных в пробирке посредством стимуляции наивным Т-клеток CD4 анти-CD3 и анти-CD28 антитела в присутствии TGF-и ИЛ-2 11. Поскольку новые Tregs функциональны в естественных условиях, манипулирование молекулами, которые способствуют Treg дифференциации несет огромный потенциал для будущего therapiы, например, при лечении астмы, болезни Крона, и трансплантации 11,12. С другой стороны, терапевтическое модуляции молекул блокировать Treg дифференциации может принести пользу в будущем подходы комбинированного лечения онкологических больных.

В анализах пробирке дифференциации играют важную роль для описания молекулярных изменений, которые связаны с Т дифференциации подмножество клетки. На данный момент экспериментальные попытки поиска или экран для генных продуктов, которые контролируют дифференцировки Т-клеток препятствует тот факт, что наиболее распространенными методами эктопической экспрессии гена неудачу в наивных Т-клеток. Например, электропорации и ретровирусной трансдукции эффективны только в активированных Т-клеток. В отличие от первоначальных ожиданий, лентивирусов трансдукции, которое обычно эффективны в покоящихся клеток, требует предварительной активации наивных Т-клеток цитокинами 13. Кроме того, передача кДНК или мРНК во время электропорациивключает деполяризацию мембраны плазмы, которая сама дает особенности активации Т-клеток и может даже мобилизации Са 2 + сигналов и активировать NFAT белков (неопубликованные наблюдения и реф. 14). Аналогично, для ретровирусов трансдукции, наивные Т-клетки должны быть активированы в течение 18 - 40 часов. В течение этого времени распада ядерной мембраны в процессе клеточного деления происходит и позволяет последующей интеграции геномной ретровирусный вектор 15. Эти методы являются, следовательно, не в состоянии решать начале молекулярный регулирование начальной Т встречи клетки с антигеном, который является решающей фазе помощник дифференцировки Т-клеток.

Аденовирусной трансдукции, как известно, придают переходных эктопической экспрессии гена в ряде типов клеток человека, которые экспрессируют человеческий рецептор аденовируса Коксаки (CAR). Это продолжается без требования для активации клеток или клеточного цикла. Поверхностную экспрессию CAR необходимо эффективное присоединение вируса и интернализации и трансгенной экспрессии усеченной версии CARΔ1 под Т-клеток промотора было установлено, оказывают мышь тимоцитов и Т-клетки, восприимчивыми к аденовирусной инфекции 16. Важно отметить, что трансгенов не изменяет тимоцитов развития или в пробирке дифференцировки наивных CD4 Т-клеток в различные подмножества (данные не приводятся; ссылка 17.). Аденовирус трансдукции Т-клеток был ранее использован для сверхэкспрессию 17,18 и нокдауна подходы 19,20. Трансгенных клеток T может быть очищен из коммерчески доступных DO11.10 ТГ; CARΔ1 ТГ (Taconic, Inc и ссылка 17.). Важно отметить, что аденовирусной трансдукции позволяет с высокой экспрессией гена интереса к наивным Т-клеткам, не вызывая очевидных признаков активации. Т-клетки остаются наивными (CD44 низкий, CD62L высокий) и отдыха (CD25 -, CD69 -) после Infectiна и может быть активирована и дифференцировались в Treg похожа на неинфицированных клеток.

Получение рекомбинантных аденовирусов может быть достигнута после трансфекции клетки HEK293A с аденовирусной плазмиды (фиг. 1). Эти плазмиды обычно содержат человеческий тип 5 геном аденовируса с E1 и E3 генов удален оказывать рекомбинантных аденовирусов репликации некомпетентные 21. HEK293A клетки дополняют репликации дефицита, как они были увековечены через стабильной интеграции стриженого аденовирус 22. С аденовирусных векторов большие (~ 40 Kb) и, следовательно, не очень хорошо подходит для традиционных ферментов рестрикции-опосредованной клонирование, мы использовали шлюза системы. Интерес ген первоначально клонировали в меньший входной вектор, из которого можно легко переносить в аденовирусный вектор назначения через лямбда реакции рекомбинации (LR) 23. Мы построили pCAGAdDu векторпутем объединения CAG промотор (курица промотор актина и энхансер CMV) счет экспрессирующей кассеты, содержащей LR сайтов, фланкирующих прокариотических выбор CCDB маркер 24. Эта кассета экспрессии слитого с внутреннего входа рибосом (IRES) элемент, который позволяет совместной экспрессии эукариотических инфекции маркер усиленный зеленый флуоресцентный белок (УЗФБ), которые слиты с последовательностью, содержащей бычьего гормона роста поли (А)-сигнала. Мы выбрали CAG цис-регуляторных последовательностей, так как прототип промотор CMV было обнаружено, что чрезвычайно-зависимой активации и, следовательно, неблагоприятных для экспрессии генов в наивным Т-клеток.

Здесь мы приводим протокол для эффективной дифференциации в пробирке Treg и способу для трансдукции наивных CD4 Т-клеток без активации (фиг. 2). Метод позволяет эктопическая экспрессия гена или сбить предыдущего CD4 Т-клеток в наивной государства. Это позволяет тестирования эффекта overexpresseD интересующего гена в раннем сигнальных событий при первоначальной стимуляции TCR до T приверженность подмножество клетки. Наши эксперименты проверки также обеспечивают основу для создания аналогичных приложений аденовирус в дифференцировке клетки других подмножеств T, таких как Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, или TFH клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Клонирование гена в векторной записи

  1. Клонирование гена в векторной записи. ПЦР-амплификации гена, за которым лигирование тупых концов в топоизомеразы связью вектор (например pENTR / D-TOPO) или рестриктазы-опосредованного клонирование может быть использован для этой процедуры.

2. Перенос гена в вектор назначения pCAGAdDu

  1. Передача интересующего гена от векторной записи в целевой вектор на LR рекомбинации (например, шлюз LR Clonase II смеси ферментов). Это создаст аденовирусной вектора экспрессии (рис. 1).
  2. Линеаризовать 10 мкг аденовирусного вектора экспрессии в ограничение PacI дайджест, осадить ДНК и ресуспендируют в воде при концентрации 3 мкг на 100 мкл. Линеаризация высвобождает вирусные инвертированные повторы (ITR), которые необходимы для репликации и капсидировани объемИРАЛ ДНК в вирусных частицах.

3. Генерация первичного лизат Вирус

  1. Семенной 1 × 10 5 HEK293A клеток в 2 мл клеточной культуральной среде Игла (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) в одну лунку 6-луночного планшета и инкубировали клетки в течение 6 - 14 ч при 37 ° С в 10% CO 2 инкубатор, чтобы их придерживаться. Клетки должны быть по крайней примерно 50% слияния.
  2. Липофекция: Трансфер 6 мкл реагента jetPEI в 94 мкл 50 мкМ NaCl, вихревые кратко. Добавление смешанного раствора до 100 мкл линеаризованного вектора аденовируса в то время как вортексе и инкубируют эту смесь для трансфекции в течение 15 - 30 мин при комнатной температуре.

Выполните все следующие шаги при соответствующих условиях биобезопасности для аденовирусной инфекции!

  1. Разливают каплям раствор на клеточной содержащих HEK293A и инкубировать клетки при 37 ° С и 10% CO 2. При использовании флуоресцентного маркера, оценить Transfeие эффективности визуально после 12 - 36 часов с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа. Добавить 0,5 мл свежей среды каждые 3 дня.
  2. Проверка каждые 2 - 3 дней с легкой или флуоресцентный микроскоп для цитопатического эффекта (CPE), которые являются зонах с увеличенным и округлые клетки, которые начинают отделяться. Это свидетельствует об эффективной генерации вируса. При наступлении более широкие зоны CPE (рис. 3), это займет 24 - 72 часов, после чего все клетки инфицированы.
  3. Когда все клетки проявляют признаки CPE, но до общего отделение клеток происходит, открепления клеток, осторожно пипеткой и переноса клеток супернатант (SN, 3 - 5 мл) в 15 мл полистирольные трубки.
  4. Замораживание клеток в SN на сухом льду в течение 15 - 20 мин и оттаивать их быстро при 37 ° С после этого к разрыву клеток. Повторите этот замораживания-оттаивания и цикла (F / TC) еще два раза. Хранить первичные лизата вируса на льду для использования в течение дня или заморозить при температуре -80 ° С в течение длительного хранения. Любые дополнительные F/ TC приведет к снижению титра вируса на 30 - 50%.

4. Вирус Усиление

  1. Семенной и расти HEK293A клетках до 90% слияния на 14 см блюдо культуры ткани.
  2. Infect клеток с половиной первичного лизата вируса (1,5 - 2,5 мл) и инкубировали клетки в течение по крайней мере 36 часов. Почти все клетки должны быть заражен, то, что может быть определено с помощью флуоресцентной микроскопии. Для повторного усиления уже усиливается (т.е. более концентрированный) штамма вируса, заражать HEK293A при множественности заражения (МВД) 50 (см. 6.3).
  3. Клетки должны быть собраны, когда все из них показывают CPE, но до отряда. С эффективное производство этого вируса состояние достигается в течение 48 часов после заражения. (Если это занимает до одной недели, рассмотрим еще один раунд усиления за счет увеличения количества аденовируса акции использовали для заражения описано в 4.2.)
  4. Отделить клетки, осторожно пипеткой и переноса клеток и SN в 50 мл полистирольные трубки. Спин клетки вниз при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° C.
  5. Удалить SN и ресуспендируют осадок в подходящем объеме среды или СН (приблизительно 1 мл).
  6. Выполнить 3 F / TC для разрушения клеток и центрифугируют при 800 х г в течение 15 мин при 4 ° С. Снимают SN, который содержит вирусные частицы (т.е. концентрированной лизата вируса), и аликвоты вируса лизата хранить его при температуре -80 ° C.

5. Вирус определения титра

  1. Семенной 10 5 549 клеток на лунку в 5 лунки 12-луночного планшета в 1 мл среды и пусть клетки придерживаться течение 6 часов.
  2. Используйте 1 мкл концентрированной аденовирус (оттаивали на льду) для выполнения серийных разведений в среде (1:5000, 1:10000, 1:50000, 1:100000) и добавить 10 мкл на лунку. Оставьте одну и неинфицированных регулировать стробирования в проточной цитометрии.
  3. После 36 часов, снять С.Н., промыть PBS и отделить клетки (например трипсинизацией). Для биологической меры предосторожности, рекомендуется исправить Cлоктей в 100 мкл 4% параформальдегид в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре и промывают один раз PBS.
  4. Выполните FACS анализ экспрессии маркеров инфекции. Земля 'мкл вирусный лизат применяться против абсолютного числа инфицированных клеток (рис. 4). Определение линейного диапазона инфекции и расчета титра на мл неразбавленного вирус из стандартной кривой на линейном диапазоне использованием х = 1000 мкл.

6. Инфекция T сотовых

  1. Изолировать наивные / отдыха CD4 Т-клеток от DO11.10 TG; CARΔ1 TG мышей с использованием MACS (Наивные CD4 + Т-клеток Изоляция Kit II) или FACS сортировки (CD4 + CD25-CD44 + CD62L-).
  2. Для небольших экспериментов, пипетки соответствующий объем вирусный лизат для достижения МВД 50 в одну лунку 96-луночного круглым дном тарелки.
  3. Добавьте до 4 × 10 5 Т-клеток в конечном объеме заражение 50 мкл в средней Т-клеток (RPMI 1640, 10% FBS, 5% PenStrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM Эфирныевитамин, 1x L-глутамина, 1:250000 меркаптоэтанола, 10 мМ HEPES).
    Пример:
    МВД 50 должно использоваться для заражения 3 х 10 5 Т-клеток; Титр вируса составляет 3 × 10 9 мл -1
    Вирус объем = х Т МВД номер мобильного / титр вирусов = 50 х (3 х 10 5) / (3 × 10 9 мл -1) = 0,005 мл

Примечание: для заражения большего числа клеток, по расширению использования МВД в 50 инфекции объем 165 мкл на 10 6 наивных Т-клеток в полистирола трубка с подвижным чашки (до TP 3 мл на пробирку).

  1. Клетки инкубируют в течение 90 мин при 37 ° С в 5% CO 2-инкубаторе.
  2. Спином вниз клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, снять С.Н., ресуспендируйте в 200 мкл PBS. Центрифуга снова и снять SN.

(Дополнительно: клетки могут быть снова промывают, чтобы удалить вирус более эффективно)

  1. Ресуспендируют клетокв 200 мкл среды Т-клеток без стимулирующих антител и без IL-2 или других цитокинов и остальные их в течение 40 ч при 37 ° С в 5% СО 2 инкубаторе в возможной экспрессию интересующего гена перед активацией.

7. Активацию Т-клеток и поляризация

  1. Внесите объем анти-CD3 и анти-CD28-связанной бисера, равная числу клеток (например, 4 х 10 5) в маленькую чашку реагента, добавьте 10-кратный объем PBS и положил их на магнит в течение 2 мин . Взлет супернатант и ресуспендируют бисером в 200 мкл поляризационной среды (Tregs: Т-клеток среда + 1 нг / мл TGF, 100 U / мл IL-2).

Примечание: Клетки могут быть также активированы с использованием тканевых культуральных чашках, покрытых анти-CD28 и анти-CD3 антитела или в DO11.10 Т-клеточного рецептора конкретным способом с использованием облученных мышей BALB / с спленоцитов импульсного овальбумином 323-339 пептидного антигена.

  1. Centrifugе отдыхали клетки как и раньше, снять SN и ресуспендирования клеток в 200 мкл среды, содержащей поляризационными анти-CD3 и анти-CD28-антитело связью бисером. Инкубируют в течение 72 ч при 37 ° С в 5% СО 2 инкубаторе без смены среды.

8. T Фиксация клеток и окрашивание на проточной цитометрии

  1. Вымойте клетки: SPIN вниз клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, снять С.Н., ресуспендируйте в 200 мкл PBS. Центрифуга снова и снять SN. Выполнение всех следующих стадий промывки соответственно.
  2. Ресуспендируют клеток в 100 мкл фиксации мертвой решение окрашивания клеток и инкубировали в течение 30 мин при 4 ° С.
  3. Вымойте клетки, ресуспендируют в 100 мкл PBS, добавьте 100 мкл 4% параформальдегида в PBS, инкубировать 15 минут при комнатной температуре.
  4. Вымойте клетки, ресуспендируют их в 200 мкл ледяной 70% метанола в PBS и инкубировать в течение 30 минут на льду.

Примечание: Клетки можно рассматривать отныне без биологической меры предосторожности!

  1. Подготовка 60 мкл мастер-смеси 60 мкл PBS + 10 мкг / мл Fc-блок (анти-FCR3 блокировать неспецифического связывания). Мытье клетки, ресуспендируют их в 40 мкл PBS + анти-FCR3 и инкубируют 15 мин при комнатной температуре.
  2. Добавить 20 мкл PBS + анти-FCR3, содержащей 1 мкг PE-сочетании анти-антитело Foxp3, хорошо перемешивают и инкубируют при 4 ° С в течение ночи.
  3. Мытье клетки дважды в PBS и клетки анализируют на проточном цитометре.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Вирус Продакшн

Для генерации высоких титров вируса, сроки HEK293A сбора клеток в первичном производстве вируса или усиления имеет решающее значение. Представитель флуоресцентные и фазового контраста изображения с визуальные признаки продукции вируса показаны на рисунке 3. CPE наблюдались через 10 дней после трансфекции клетки HEK293A с векторным управлением pCAGAdDu без вставки. CPE характеризуются появлением областей с увеличенной и облавы клетки, которые начинают отделяться и обладают высокой экспрессией GFP маркером инфекции. Степень CPE является показателем эффективности производства вируса. Клеточные культуры пластины схожих CPE могут быть собраны в течение 24 - 72 ч, а сырой лизата вируса могут быть получены путем замораживания и-оттаивания. Титр вируса может быть определена путем серийного разведения вируса лизата, чтобы позволить сравнение инфекций с равным MOI (рис. 4). В линейном диапазоне, тон регрессионного анализа уравнение может быть использовано для вычисления числа инфекционных частиц на мл неразбавленного лизата вируса. В примере, титр при х = 1 мкл является 30016535 мкл -1 ≈ 3 х 10 мл 10 -1.

Оценка воздействия аденовирусной инфекции на активацию Т-клеток и дифференцировки

Эффекты аденовирус трансдукции на клетки-мишени были оценены путем заражения наивных Т клеток CD4 с увеличением MÕIS использованием аденовирусных векторного управления, что только выражает IRES-GFP (рис. 5а). Эффективность инфицирования измерялась FACS анализ определения GFP-положительных клеток в основной ячейке T образцы 72 часа после индукции Treg дифференциации. Скорость GFP-положительных клеток увеличилось с МВД используется для инфекции и достиг 84% инфекции в МВД 50. Мы не получить значительно более высокий процент инфицированных Т-клеток при использовании MOI больше 50 (данные не показаны). Хотя инфеие эффективности может изменяться в зависимости от интересующего гена, можно обычно заражают более 50% клеток в МВД 50. На влаги от 1 до 50 жизнеспособность клеток не влияет (рис. 5б). Важно отметить, что стимулирование и дифференцировки наивных Т-клеток в Tregs была одинаковой в инфицированных по сравнению с не-инфицированные клетки (рис. 5в). Ключевым свойством аденовирус трансдукции является его способность инфицировать наивным и покоящиеся Т-клетки без присвоения или требующих активацию Т-клеток. Это очевидно из анализа маркеров активации Т-клеток (CD25, CD69, CD44) и маркер наивных (CD62L) Т-клеток в образцах с или без аденовирусной инфекции и отдыха в течение 40 ч при 37 ° С в 5% СО 2-инкубаторе (рис. 6). Перед в пробирке активации Т-клеток с антителами против CD3 и анти-CD28-связанной шарики, инфицированных и неинфицированных Т-клетки были одинаково CD25 низкий, CD69 и CD44 низкий лвл но CD62L высоко, демонстрируя свои наивные и состояние покоя (рис. 6, верхней панели). После активации Т-клеток, инфицированных клеток показал регуляция маркеров активации CD25, CD69 и CD62L подавление почти неотличимы от неинфицированных клеток (рис. 6, нижние панели). Таким образом, статус активации Т-клеток не изменяется при аденовирусной инфекции. Фазе покоя связан с потерей от 60 до 70% клеток в связи с отсутствием факторов роста или цитокины, по сравнению с 10 - 20% мертвых клеток 40 часов после активации без отдыха. Это было принято во внимание при выборе исходного числа ячейки 3 х 10 5 клеток.

Оценивая Сверхэкспрессия Уровень интерес ген

Для того чтобы оценить количество избыточной экспрессии достигается аденовирусный перенос генов, мы попытались определить микроРНК-155 (микроРНК-155) уровни экспрессии в наивным Т-клеткам, которые мыповторно инфицированы микроРНК-155-выражения или контроля аденовирус или остались неинфицированных. Мы выбрали микроРНК-155, так как это зрелая микроРНК выражается при умеренных уровнях в наивных Т-клеток и становится сильно индуцируется при активации Т-клеток. Кроме того, он играет решающую роль в Т-клетками гуморального ответа 25,26.

Уровень избыточной экспрессии микроРНК оценивали по количественной ПЦР. После инфицирования клетки отдыхал 40 часов, активированный в течение 40 часов или 40 часа отдыхали затем 40 ч активации. Через 40 часа отдыха, наивным Т-клеток, инфицированных микроРНК-155 кодирования вирус отображается примерно в 17 раз сверхэкспрессией микроРНК-155 по сравнению с клетками, инфицированными контрольным вирусом или неинфицированных клеток (рис. 7). Это почти соответствует степени, в которой эндогенный микроРНК-155 индуцируется после активации Т-клеток (фиг. 7 и ссылка 25,27). Независимо от этого сильного индукции эндогенного микроРНК-155 уровнях, клетки, инфицированные миR-155 аденовирус еще показал примерно четырехкратное увеличение в экспрессии микроРНК-155 при активации по сравнению с контрольными вирус-инфицированных или неинфицированных клеток. Наблюдаемый уровень эктопического гиперэкспрессия была сопоставимой для других микроРНК (данные не показаны). Пожалуйста, обратите внимание, что при большом вставками, избыточная экспрессия может быть менее эффективной.

Анализ Т-клеток

Анализ данных может быть выполнена несколькими способами. Анализ дифференциации в GFP положительные ворота интерес ген (т. е. в инфицированные клетки) по сравнению с дифференциацией в том же GFP-положительных ворота контрольных клеток (инфицированные клетки с использованием вектора без интересующего гена) достаточно, чтобы обнаружить существенных различий. Для изучения более тонкие эффекты интерес гена, мы сравнивали дифференциации в инфицированных клетках с тем из неинфицированных клеток из той же скважины (фиг. 8). Они служат в качестве внутреннего противоречивыел и может быть использовано для вычисления «относительной дифференциации" внутри скважины. Если вирус не имеет никакого влияния на дифференциацию, "относительная дифференциация" в идеале быть 1. Относительная дифференциация для контроля вируса в наших руках имеет диапазон от 0,9 до 1,1. Относительная дифференциация должна быть применена только к сравнению ген-интерес-инфицированных образцов для контроля инфицированных вирусом образцов.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схематическое представление аденовирус поколения. Запись векторов (pENTR) содержат рекомбинации донорских участков (AttL1, AttL2), который фланг гена. Назначения вектор pCAGAdDu содержит целевые сайты рекомбинации (attr1, attr2) фланговые гена токсина БДКК для отрицательного отбора в E. палочка, который заменен интерес геназа счет рекомбинации LR. Назначения вектор также содержит человеческий тип 5 геном аденовируса без E1/E3 генов, которые были удалены для создания репликации с дефицитом рекомбинантных аденовирусов. PacI линеаризации освобождает инвертированные повторы (ITR) до трансфекции в клетки, которые несут HEK293A аденовирусная генов для создания инфекционного аденовирусных частиц, в результате цитопатического эффекта. Аденовирус собирают из клеток, продуцирующих сублимационной и-оттаивания. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2
Рисунок 2. Схематическое представление Т инфекции и дифференцировку клеток. Наивные Т-клетки инфицировали аденовирусом лизат в течение 1,5 часа, промывают PB S и T отдыхали в клеточной среде в течение 40 ч при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора. Затем клетки активированы в течение 72 ч с использованием анти-CD28 и анти-CD3 антитела связью шариков в присутствии TGF-и ИЛ-2. Фиксированные и окрашенные клетки анализировали с помощью FACS, и экспрессии Foxp3 в инфицированных против неинфицированных клеток определяли.

Рисунок 3
Рисунок 3. Цитопатическое действие аденовируса-производителей HEK293A клеток. Появление CPE на десятый день после трансфекции 10 5 клеток HEK293A с 3 нг вектора линеаризованной pCAGAdDu. Левая панель показывает изображение фазового контраста, правая панель показывает зеленую флуоресценцию.

55/50455fig4highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50455/50455fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Определение титра аденовирус лизатов инфицированием клеток А549. 10 5 A549 клетки были инфицированы указанных разведений вируса, инкубировали в течение 48 ч и анализировали на экспрессию GFP инфекции маркера с помощью проточной цитометрии. Количество GFP-положительных клеток представлено в зависимости от количества вируса использовали. Титр вируса неразбавленный рассчитывается по калибровочной кривой на линейном диапазоне использованием х = 1000 мкл.

Рисунок 5
Рисунок 5. Аденовирусной инфекции в МВД 1 - 50 не имеет никакого влияния на жизнеспособность клеток T или Treg дифференциации наивные Т-клетки очищают от DO11.10 TG; CARΔ1 TG мышей инфицировали аденовирус в разное Mois.в течение 90 мин, промывали PBS и отдыхали в течение 40 ч в среде Т-клеток. Клетки были активированы в Treg поляризационный условиях в течение 72 часов. Фиксировали и окрашивали клетки анализировали на включение мертвых красителем клетки (B), экспрессия маркеров инфекции (GFP) и Foxp3 маркера дифференцировки (с). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 6
Рисунок 6. Аденовирусной инфекции не изменяет состояния активации наивных Т-клеток Т-клеток от DO11.10 TG;. CARΔ1 TG мышей инфицировали аденовирус в МВД 50 в течение 90 мин (линии) или влево неинфицированных (области), промывали PBS и отдыхали в течение 40 часов. Клетки анализировали на Expression маркеров активации до (верхние панели) и после (нижние панели) 40 час активации в Treg поляризационный условиях.

Рисунок 7
Рисунок 7. . Относительная микроРНК-155 сверхэкспрессию до и после активации Т-клеток Наивные Т-клеток от DO11.10 TG; CARΔ1 TG мышей инфицировали в МВД 50 с микроРНК-155 (MIR-155), экспрессирующих или контроля аденовирус, или влево неинфицированных. Затем клетки отдыхали в течение 40 ч, активированных в течение 40 часов или 40 часа отдыхали затем 40 часа активации. Выражение микроРНК-155 была определена относительно SnoRNA202 КПЦР.

Рисунок 8
GFP-положительных (т.е. инфицированные клетки) выражается по отношению к процентному содержанию Foxp3 + клеток в GFP отрицательным (неинфицированные клетки). Относительно дифференциации равна 1, если сверхэкспрессированную интерес гена не влияет на Treg дифференциации. Значения выше 1 указывает на стимулирующее действие на дифференцировку, в то время как значения ниже 1 указывает на тормозящее действие.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Поколение Вирус и титрование

Для получения оптимальных результатов трансфекции, качество и количество векторных линеаризованной представляются наиболее важными. Мы не наблюдали негативных последствий от производства сырья лизат из начальных разрастание культуры с инфекцией быстро продолжит выполнение после эффективного производства вируса происходит. Тем не менее, продукцию вируса на клетки HEK293A могут быть затронуты длинные вставками, которые снижают эффективность. Некоторые открытых рамок считывания, на самом деле нашли мешать производству вирусов. Эти вирусные акции как правило, может быть спасен через несколько раундов усиления, и только несколько открытых рамок считывания, оказались несовместимыми с вирусом производства. Исходя из нашего опыта, появление CPE в течение 48 часа после заражения для амплификации вируса, как правило, получить вирусный лизат около 1 х 10 9 - 5 х 10 10 инфекционных частиц / мл.

Аденовирусная инфекция наивного Т-клеток

Аденовирусная инфекция наивных Т-клеток не изменяет состояния активации Т-клеток до и после стимуляции. Это делает системы трансдукции мощным экспериментальным инструментом для изучения Т-клеток от начального TCR-стимуляции. Мы определили эффективный эктопической экспрессии интересующих генов после заражения и "покоя" Т-клеток в течение 40 ч, в то время, когда клетка еще наивные и не показывает признаков активации. Это означает, что при последующей активации Т-клеток, представляющего интерес гена уже избыточно экспрессируется и может оказывать влияние на Т-клеток с самого начала. Таким образом, аденовирусной трансдукции имеет явное преимущество перед электропорации или ретровирусную трансдукции, которые требуют активации и экспрессии гена интерес только после первоначального TCR сигнализации 15,28. Однако, если поздно аспекты дифференциации должны быть проанализированы и экспрессию интересующего гена не требуется до начальной Т-клеточной активностиAtion, наивные Т-клеток может также быть стимулировано непосредственно после аденовирусной трансдукции. Поскольку аденовирусная инфекция является очень эффективным, он может быть расширен для изучения совместной деятельности двух интересующих генов, выполняя двойной инфекции аденовирусы, которые выражают другие маркеры инфекции, такие как Thy1.1 или hCD2. Последний также доступны для окрашивания антителами поверхности и может обойти трудности в сохранении маркеров при фиксации. В активированных Т-клетках, однако, аденовирусной инфекции имеет значительно более низкую эффективность, и электропорацию или трансдукцию ретровирусных методов может быть благоприятным. Другая оговорка для аденовируса приложение преходящий характер выражения. Аденовирус сохраняется в виде эписомы прикреплен к ядерному матриксу ячейки и будет разбавлен как Т-клетки пролиферируют, что приводит к потере экспрессии маркерного гена в течение пяти-семи дней после активации Т-клеток (данные не показаны;. Ссылка 17). Кроме того, аденовирус-трансдуцированных клеток readilу признаны и устранить интактной иммунной системы, что ограничивает его применение в естественных условиях, например, в приемной экспериментов передачи Т-клеток у мышей. Другим потенциальным применением аденовирусной системы может быть инфекция Treg клетки, выделенные из DO11.10 TG; CARΔ1 TG мышей для изучения Treg функции или аспектов линии стабильности.

Валидация аденовирус Влияние на инфицированных клеток

Аденовирусной инфекции была эффективной и не имел почти никакого влияния на Т жизнеспособности клеток и Treg дифференциации. В МВД 50, мы получили лучший инфекции эффективности без соблюдения неблагоприятных последствий аденовирусной инфекции на Т-клетках. Это должно быть установлено так же, когда система применяется к другой культуре клеток или дифференцировку состояние, обычно путем титрования экспериментов с использованием пустого аденовирус без экспрессии интересующего гена. Если аденовирусная инфекция сама по себе повлиять на результат эксперимента,Сравнение генов процентных аденовирус с пустыми аденовирус еще уместно раскрыть последствия перенесенного гена интереса. Если нет эффекта аденовирусной инфекции, измеренный параметр можно сравнивать между неинфицированных и инфицированных клеток одного и того же образца.

Анализ данных

Фиксация Метод, описанный здесь позволяет одновременный анализ Foxp3 маркер дифференцировки вместе с GFP маркер инфекции, так что относительные дифференциации 'может быть определена. Этот анализ двух популяций в пределах одного образца имеет более высокую чувствительность для тонких эффектов, чем основная масса населения сравнений между двумя образцами, поскольку он занимает также к лунке вариации во внимание. Однако только эффекты, присущие на инфицированные клетки будут распознаны с помощью этого метода, а также в масштабах эффектов, например, давление оказывается на секретируемый фактор, было бы пренебречь. Относительная дифференциация следует контролировать в каждойэксперимента включая контроль-инфицированные клетки, чтобы исключить эффекты инфекции сама по дифференциации. Для получения оптимальных результатов, почти равной скорости инфицированных неинфицированных клеток в течение одного образца должно быть направлено на, в то время как более высокий риск инфицирования благоприятны навалом сравнений между несколькими образцами.

В заключение переноса генов в наивных Т-клеток использованием аденовирус в сочетании с протоколами в пробирке дифференциации является мощной системой для исследования молекулярной основы Treg дифференциации. Это может позволить генерирования знаний, чтобы эксплуатировать доминирующей толерантности предоставляемых Tregs в терапевтических подходов от аллергических и аутоиммунных заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Lirui Du построения pCAGAdDU вектора и Оливер Горка для обеспечения фиксации протокола.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit Invitrogen K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix Invitrogen 11791020
PacI New England Biolabs R057S
jetPEI Polyplus-transfection 101-10N
HEK293A Cell Line Invitrogen R705-07
A549 ATCC CCL-185
6-well plates BD Falcon 353046
14 cm tissue culture dish Nunc 168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr Taconic Farms Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II Miltenyi Biotech 130-094-131
DMEM Invitrogen 41966-052
FBS PAN Biotech 1502-P110704
PenStrep Invitrogen 15140-122
RPMI 1640 Lonza BE12-167F
NaPyruvate Lonza BE13-115E
NEAA 100x Lonza BE13-114E
L-Glutamine Invitrogen 25030
HEPES Buffer Solution (1 M) Invitrogen 15630-056
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x) Lonza 13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation Invitrogen 114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1 R&D Systems 240B
Proleukin S (18 x 106IE) Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Invitrogen L-23105
Mouse BD Fc BlockT BD Pharmingen 553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE eBioscience 12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay Roche Applied Biosystems 4427975
LightCycler 480 Probes Master Roche Applied Biosystems 04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Roche Applied Biosystems 4366596

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
  2. Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
  3. Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
  4. Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
  5. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  6. Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
  7. Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
  8. Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
  9. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  10. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  11. Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
  12. Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).
  13. Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
  14. Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).
  15. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).
  16. Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
  17. Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
  18. Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4 (2002).
  19. Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
  20. Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
  21. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
  22. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
  23. Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
  24. Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
  25. Thai, T. -H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
  26. Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
  27. Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
  28. Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).

Tags

Иммунологии выпуск 78 клеточной биологии молекулярной биологии медицины биомедицинской инженерии биотехнологии инфекция генетика микробиология вирусология Т-лимфоциты нормативные CD4-положительные Т-лимфоциты нормативные аденовирусы человека MicroRNAs антигены дифференциации Т-лимфоцитов методы переноса генов Трансдукцию генетических Трансфекцию аденовирус переноса генов микроРНК избыточная экспрессия сбить клетки CD4 T, нормативные Т-клеток вирусы клетки проточной цитометрии
Аденовирусной трансдукции наивного CD4 Т-клеток по изучению Treg Дифференциация
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warth, S. C., Heissmeyer, V.… More

Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation. J. Vis. Exp. (78), e50455, doi:10.3791/50455 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter