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Biology

नवोदित खमीर की प्रतिदीप्ति समय चूक सिनेमा हासिल करना और grafts का उपयोग कर एकल सेल गतिशीलता का विश्लेषण

Published: July 18, 2013 doi: 10.3791/50456
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology

Summary

हम प्रतिदीप्ति बढ़ रही खमीर कोशिकाओं के माइक्रोस्कोपी फिल्मों, और एकल कोशिका समय श्रृंखला डेटा निकालने के लिए एक जीयूआई आधारित सॉफ्टवेयर पैकेज प्राप्त करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल उपस्थित थे. विश्लेषण स्वचालित वंश और दृश्य निरीक्षण और ट्रैक किए गए डेटा का मार्गदर्शन curation के साथ एकीकृत विभाजन के समय असाइनमेंट शामिल है.

Abstract

प्रतिदीप्ति समय चूक माइक्रोस्कोपी एकल कोशिका स्तर पर कई जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन में एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है. विशेष रूप से, जीन अभिव्यक्ति की अस्थायी निर्भरता चित्रण फिल्मों इसके विनियमन की गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, लेकिन, एकल कक्षों के प्रतिदीप्ति फिल्में प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए कई तकनीकी चुनौतियों का सामना कर रहे हैं. हम यहां इस तरह के डेटा उत्पन्न करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microfluidic संस्कृति उपकरण का उपयोग कर एक सरल प्रोटोकॉल, और एक MATLAB आधारित, ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) आधारित सॉफ्टवेयर पैकेज प्रतिदीप्ति छवियों यों को वर्णन. सॉफ्टवेयर क्षेत्रों और पटरियों कोशिकाओं, उपयोगकर्ता नेत्रहीन डेटा में त्रुटियों उपपादरी करने के लिए सक्षम बनाता है, और स्वचालित रूप से वंश और विभाजन के समय प्रदान करती है. जीयूआई आगे पूरे सेल निशान के रूप में भी उनकी पहली और दूसरी बार के डेरिवेटिव के उत्पादन के लिए समय श्रृंखला विश्लेषण करती है. सॉफ्टवेयर एस के लिए डिजाइन किया गया था cerevisiae, इसके प्रतिरूपकता और चंचलता यह टी की अनुमति चाहिएकुछ संशोधनों के साथ अन्य प्रकार की कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक मंच के रूप में सेवा ओ.

Introduction

जीन अभिव्यक्ति की एकल कोशिका विश्लेषण जीन विनियमन के कई पहलुओं के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाया गया है. प्रवाह cytometry या माइक्रोस्कोपी का उपयोग फ्लोरोसेंट संवाददाता अभिव्यक्ति की स्टेटिक स्नैपशॉट एकल कक्ष अभिव्यक्ति के वितरण पर उपयोगी जानकारी प्रदान करते हैं, लेकिन इतिहास और सीधे जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता को सूचित करने के लिए आवश्यक समय श्रृंखला डेटा के विकास की कमी है. प्रतिदीप्ति समय चूक माइक्रोस्कोपी एकल कक्ष माप और उनके इतिहास दोनों को प्राप्त करने के लिए एक साधन प्रस्तुत करता है. विभिन्न प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक तकनीकों इस प्रकार इस तरह के सेल करने वाली सेल भिन्नता 2,3, बैक्टीरियल persister गठन 4, प्रतिलेखन के रूप में जीन विनियमन सुविधाओं में अंतर्दृष्टि (एक समीक्षा के लिए 1 देखें) प्रदान करने, फ्लोरोसेंट संवाददाता अभिव्यक्ति की फिल्मों प्राप्त और यों के लिए विकसित किया गया है दीक्षा और बढ़ाव 5, 6,7 फोड़ ट्रांसक्रिप्शनल, सेल चक्र निर्भरता 8,9, और आनुवांशिकता 10. हालांकि, OBTaining गुणवत्ता एकल कक्ष प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला संवर्धन में महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौतियों का एक चलाया हुआ वातावरण में और अधिग्रहण प्रतिदीप्ति फिल्मों के उच्च throughput मात्रा का ठहराव में कोशिकाओं की एक monolayer शामिल है. यहाँ, हम एस के प्रतिदीप्ति फिल्में प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन सेल संस्कृति डिवाइस के निर्माण में या सॉफ्टवेयर के विकास में कोई आवश्यक अनुभव (चित्रा 1) के साथ cerevisiae.

सबसे पहले, हम विस्तार से एक उदाहरण प्रोटोकॉल एक या एक से अधिक फ्लोरोसेंट संवाददाताओं व्यक्त नवोदित खमीर के लिए प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला फिल्मों उत्पन्न करने के लिए. अनुकूलित microfluidic संस्कृति कक्षों का निर्माण किया है और सफलतापूर्वक पहले 11-13 नियोजित किया गया है, हालांकि हम CellAsic (हेवर्ड, सीए) से एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microfluidic डिवाइस का उपयोग करें. प्रणाली के दायरे monolayer के विकास के लिए कोशिकाओं और छिड़काव पर्यावरण के लगातार नियंत्रण की अनुमति देता है. हम वर्तमान माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल fluoresc प्राप्त करने के लिए एक सरल साधन हैखिलाडि़यों नवोदित खमीर की फिल्मों, लेकिन किसी भी संशोधित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल (एक स्वनिर्धारित संस्कृति डिवाइस, वैकल्पिक मीडिया की स्थिति, आदि.) एक खमीर कोशिकाओं के समान प्रतिदीप्ति फिल्म डेटा उपज प्रतिस्थापित किया जा सकता है.

अगला, हम समय श्रृंखला डेटा निकालने के लिए एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) आधारित MATLAB में सॉफ्टवेयर पैकेज (Mathworks, Natick, एमए), प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला का त्वरित विश्लेषण (grafts) के लिए जीयूआई करार दिया है, का उपयोग फिल्मों का विश्लेषण रूपरेखा एकल कक्षों के लिए. Grafts कोशिकाओं segmenting और ट्रैकिंग में और प्रतिदीप्ति तीव्रता और ज्यामितीय जानकारी निकालने में बहुमुखी, खुले स्रोत सॉफ्टवेयर पैकेज सेल आईडी 14 के समान सुविधाएँ है. हालांकि, grafts महत्वपूर्ण अतिरिक्त फीचर्स प्रदान करता है. सबसे पहले, यह विभाजन और डेटा सटीकता, बजाय विश्लेषण के बाद ग़ैर क्षेत्र निशान से सिर्फ सांख्यिकीय gating को सत्यापित करने के लिए ट्रैकिंग के परिणाम की आसान इंटरैक्टिव संपादन प्रदान करता है. इसके अलावा, यह automaticall को विश्लेषण फैलीवाई नामित वंश और नवोदित खमीर की ब्याज की सेल चक्र अंक. माँ और बेटी दो स्वतंत्र सेल क्षेत्रों के लिए फार्म विभाजित जब निर्धारण पूरे सेल (किसी भी जुड़े कली सहित मां) सेल चक्र 8 के दौरान माप का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है. सुइट इन कार्यों को पूरा करने के लिए तीन मॉड्यूल शामिल हैं. केंद्रित और अनफोकस्ड उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के बीच इसके विपरीत पर आधारित है, और पहली क्षेत्रों सेल क्षेत्रों उपयोगकर्ता विभाजन मानकों को परिभाषित और नेत्रहीन का परीक्षण करने की अनुमति देता है. दूसरा (. पर उपलब्ध ब्लेयर और क्रोकर एट अल आईडीएल दिनचर्या का Dufresne के MATLAB के कार्यान्वयन का उपयोग,: पटरियों http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) और समय के माध्यम से सेल क्षेत्रों के उपाय, स्वतः प्रजातियों प्रदान करती है, और दृश्य निरीक्षण के लिए सक्षम बनाता है और त्रुटि सुधार. एक साधारण साजिश रचने जीयूआई क्वेरी एकल कोशिका के गुण को शामिल किया जाता है. तीसरा मॉड्यूल कली उद्भव और विभाजन ती श्रेयएमईएस, और पूरे सेल समय श्रृंखला डेटा के रूप में भी उनकी पहली और दूसरी बार के डेरिवेटिव (के रूप में 9 में चर्चा) outputs. विश्लेषण मॉड्यूल चुनाव के सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में बाद के अध्ययन के लिए एक अंतरिक्ष सीमांकित पाठ फ़ाइल के रूप में डेटा outputs. इस प्रकार, पैकेज उपयोगकर्ता एक ग्राफिकल इंटरफ़ेस के माध्यम से उच्च गुणवत्ता के साथ समय श्रृंखला डेटा निकालने के लिए सक्षम बनाता है. हम सेल चक्र 9 के एक समारोह के रूप में एक नवोदित खमीर कोशिकाओं में वास्तविक समय प्रतिलेखन दरों में अनुमान लगाने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है. मॉड्यूल नवोदित खमीर, पैरामीटर या के लिए अनुकूलित किया गया है, यदि आवश्यक हो, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कोड अन्य जीवों और छवि प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. विभाजन, ट्रैकिंग, और वंश असाइनमेंट एल्गोरिदम सौंपा इमेजिंग और प्रश्न में जीव के प्रकार के लिए विशिष्ट हो सकता है. मौजूदा एल्गोरिदम बदल दिया है, लेकिन अभी भी उपयोगकर्ता के अनुकूल दृश्य निरीक्षण और विभाजन के सुधार और कहा कि सदा ही occu ट्रैकिंग त्रुटियों की अनुमति देता है कि जीयूआई इंटरफेस बनाए रखने के लिए किया जा सकता हैकिसी भी एल्गोरिथ्म के साथ आर.

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Protocol

1. एक microfluidic चैंबर में बढ़ते एकल खमीर कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी सिनेमा प्राप्त करें

  1. एक हौसले बढ़ रही थाली से कोशिकाओं के साथ 1 मिलीलीटर अनुसूचित जाति मीडिया (2% ग्लूकोज और एमिनो एसिड की पूरी पूरक के साथ सिंथेटिक परिभाषित मीडिया) टीका लगाना, और 30 डिग्री सेल्सियस पर एक रोलर ड्रम पर ~ 16 घंटे संस्कृति रातोंरात सेते अंतिम ओवर ड्राफ्ट 600nm जल्दी लॉग चरण के विकास के लिए ~ 0.1 है कि संस्कृति इस तरह तैयार करें.
  2. आयुध डिपो 600nm = 0.1 स्टार्टर जरूरत के रूप में संस्कृति और एक ताजा टेस्ट ट्यूब में regrow 1 मिलीलीटर एक अतिरिक्त 6-8 घंटे पतला. इस microfluidic डिवाइस में लोड करने के लिए उपयुक्त एक घनत्व में एक पोषक तत्व युक्त स्थिर अवस्था में बढ़ कोशिकाओं प्रदान करता है. (वैकल्पिक रूप से, प्रयोग के लिए आवश्यक के रूप में कोशिकाओं को तैयार करने के लिए आवश्यक प्रक्रिया के साथ कदम 1.1-1.2 की जगह.)
  3. CellAsic से एक Y04C microfluidic संस्कृति की थाली तैयार: शिपिंग समाधान निकालने, बाँझ पानी के साथ कुओं कुल्ला, और ONIX छिड़काव प्रणाली प्रवाह का उपयोगचैनलों को फ्लश करने के लिए 5 मिनट के लिए 6 साई में कुओं 1-6 के माध्यम से पानी. फिर, 10 सेकंड (लोडिंग चैनल बहुत उच्च प्रवाह दर है और अलग से प्लावित किया जाना चाहिए) के लिए 6 साई में अच्छी तरह से लोड 8 से प्रवाह.
  4. सभी कुओं से पानी निकाल दें और अच्छी तरह से 8 लदान कोशिका में प्रवेश में 250 μl अनुसूचित जाति कुओं 1-6 और कदम 1.2 से संस्कृति की 50 μl के साथ बदलें. (वैकल्पिक रूप से, अलग अलग परिस्थितियों के बीच स्विचिंग की आवश्यकता के प्रयोगों के लिए इनलेट कुओं 1-6 में वांछित मीडिया जगह है.)
  5. थाली को ONIX कई गुना सील, और अच्छी तरह से करने के लिए शुरू मीडिया पकड़े ही इनलेट से 6 साई में कम से कम 5 मिनट के द्वारा पीछा 2 मिनट के लिए 6 साई में प्रवेश कुओं 1-6 से बह द्वारा भड़काना चैनलों और संस्कृति कक्ष शुरू प्रयोग. 1.7 कदम जब तक लगातार इस प्रवाह.
  6. प्रयोग के लिए माइक्रोस्कोप की तैयारी. हम एक झरना द्वितीय पीछे से प्रबुद्ध EMCCD कैमरे (Photometrics, Tuscon, AZ) के साथ एक Zeiss axio के Observer.Z1 widefield माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और एक लुमेन 200 धातु halide चापphotobleaching को रोकने के लिए 10% करने के लिए तनु प्रतिदीप्ति उत्तेजना के लिए दीपक (पूर्व वैज्ञानिक, रॉकलैंड, एमए). कई फ्लोरोसेंट चैनलों में प्राप्त करने के लिए आवश्यक स्विचिंग समय को कम करने के लिए, हम कुछ पाकिस्तानी, YFP, और आरएफपी के लिए उपयुक्त / उत्तेजना उत्सर्जन फिल्टर करने के लिए एक एकल, ट्रिपल bandpass dichroic फिल्टर क्यूब (; सेट 89,006 Chroma प्रौद्योगिकी कॉर्प, फॉल्स, वीटी धौंकनी) बाहरी, तेजी से स्विचन फिल्टर पहियों (Ludl इलेक्ट्रॉनिक उत्पाद, Novato, सीए) में निर्धारित किया है.
  7. उद्देश्य (यदि आवश्यक हो तो, हम एक Zeiss योजना Apochromat 63X/1.40 तेल डीआईसी का उपयोग) पर विसर्जन द्रव की कुछ बूँदें प्लेस, और उलटा माइक्रोस्कोप की अवस्था में सुरक्षित रूप से microfluidic डिवाइस माउंट. थाली प्रयोग भर चरण में बिल्कुल भी बदलाव नहीं करता है यह सुनिश्चित करना डेटा विश्लेषण के दौरान सेल ट्रैकिंग में सुधार. हम बस अपने स्थानांतरण को रोकने के लिए मंच माउंट प्लेट टेप.
  8. एम्बेडेड स्थिति में से एक का उपयोग कर पहली संस्कृति कक्ष के बाएँ तरफ के तीसरे (चैम्बर ऊंचाई छोटी है) पर ध्यान देंमोर्चे मार्करों. अच्छी तरह से मीडिया के प्रवेश से प्रवाह बंद करें, और सेल से प्रवाह 5 सेकंड धारा में 6 साई में अच्छी तरह से 8 लोड हो रहा है. कोशिकाओं के लिए संस्कृति कक्ष के आसपास देखने के लिए मंच ले जाएँ. वांछित सेल घनत्व हासिल की है जब तक प्रवाह समय और दबाव लोड हो रहा है बढ़ाएँ, लेकिन ओवरलोडिंग और ताजा मीडिया कक्ष में प्रवेश करती है जहां सबसे बाएँ बाधा clogging से बचने.
  9. अच्छी तरह से 6 साई पर शुरू मीडिया वाले मीडिया के प्रवेश से बह शुरू करो.
  10. MetaMorph (आण्विक उपकरण, सनीवेल, सीए) या अन्य माइक्रोस्कोपी स्वचालन और नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, समय के साथ कई चरण पदों पर कई चित्र लेने के लिए एक बहु - आयामी अधिग्रहण सेटअप. की संख्या और समय अंक के बीच अंतराल निर्धारित करें. ~ 10 कोशिकाओं को एक साथ कई मंच पदों का चयन करें (अधिक तेजी से पल्ला झुकना होगा). हम आम तौर पर हर हर समय बिंदु पर अधिग्रहण के लिए ~ 11 सेकंड की आवश्यकता होती है, जो करने के लिए 16 पदों के लिए 5 मिनट के अंतराल और छवि का उपयोग करें.
  11. इतना है कि प्रत्येक चरण के स्थान पर हर समय बिंदु वें पर अधिग्रहण सेटअपई कार्यक्रम होगा:; अधिग्रहण बीएफ प्रेषित प्रकाश उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) MetaMorph में निर्मित autofocus के विधि (ध्यान सटीकता पर अधिक नियंत्रण प्रदान करता है प्रत्येक चरण के स्थिति के शुरू में एक रिवाज से लिखा पत्रिका के रूप में ऑटोफोकस को लागू करने) का उपयोग कर छवि पर ध्यान केंद्रित फोकल विमान (एफ पी) के लिए 1 माइक्रोन से कम छवि, एफ पी (छवियों के बीच के रूप में आवश्यक ध्यान बदलने के लिए कस्टम लिखित पत्रिकाओं का उपयोग करें) -4 माइक्रोन से कम ध्यान से बाहर एक बीएफ (BFOOF) छवि के अधिग्रहण, और एक स्केल अधिग्रहण न्यूनतम photobleaching के साथ तेजी से अधिग्रहण के लिए अनुकूलित सेटिंग्स का उपयोग एफ पी पर प्रत्येक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के लिए छवि.
  12. यदि आवश्यक हो, कोई कोशिकाओं के साथ संस्कृति कक्ष के एक क्षेत्र में एक फ्लोरोसेंट संवाददाता के लिए पृष्ठभूमि और छायांकन सुधार छवियों को प्राप्त करते हैं.
  13. ONIX नियंत्रण सॉफ्टवेयर में प्रयोग के लिए प्रवाह कार्यक्रम तैयार करें. इसके साथ ही MetaMorph में अधिग्रहण कार्यक्रम और ONIX नियंत्रण सॉफ्टवेयर में प्रवाह कार्यक्रम शुरू करते हैं.
  14. प्रयोग के अंत में, संयुक्त राष्ट्र को सहीफ्लोरोसेंट छवियों (यदि आवश्यक), और वैकल्पिक रूप से एक. stk फिल्म फ़ाइल (स्थिति 1 के लिए उदाहरण बना बीएफ, BFOOF, रवांडा, YFP और आरएफपी फिल्मों में प्रत्येक चरण की स्थिति में प्रत्येक छवि चैनल के लिए. tif फ़ाइलें गठबंधन में भी पृष्ठभूमि और छायांकन ).

2. MATLAB में FormatData जीयूआई का उपयोग ट्रैकिंग के लिए प्रारूप और खण्ड डेटा (चित्रा 2)

  1. डेटा इनपुट जीयूआई खोलने के लिए MATLAB में FormatData.m फ़ाइल चलाएँ. शीर्ष पर, निर्दिष्ट या डेटा निर्देशिका सेट करने के लिए छवि फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर के लिए ब्राउज़ करें, और उसके प्रयोग में दर्ज आंकड़ों के प्रकार और छवि फ़ाइलों को निर्दिष्ट करने के लिए जीयूआई का उपयोग करें.
  2. सही करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए जो विश्लेषण प्रकार का संकेत "समय चूक" के बगल में रेडियो बटन का चयन करें. "समय चूक" एक समय श्रृंखला (जैसे एक microfluidic कक्ष में बढ़ कोशिकाओं की एक फिल्म) के रूप में छवि श्रृंखला का इलाज करेंगे. "स्थैतिक" एक जनसंख्या (जैसे कई चित्र अलग से लिया से ली गई फोटो का एक सेट के रूप में प्रत्येक छवि श्रृंखला का इलाज करेंगेएक एकल स्लाइड नमूने पर अलग पदों). इस grafts संस्करण में कई पदों के लिए समय चूक डेटा लेकिन हर स्थिति के लिए एक अलग फ़ाइल (कदम 2.14 देखें) के रूप में संसाधित किया जा सकता है.
  3. सीमा के भीतर स्पष्ट सेल आंदोलन को कम करने के लिए फिल्मों में प्रत्येक छवि स्थानांतरण द्वारा imprecise चरण आंदोलनों के लिए सही करने के लिए छवि पंजीकरण के लिए बॉक्स को चेक करें. हम दृढ़ता से यह बहुत (बाद में मार्गदर्शन ट्रैक curation को कम करने) ट्रैकिंग सुधार के रूप में यह सलाह देते हैं, लेकिन छवियों सीमा पर स्थानांतरित कर दिया गया है जहां में भरने के लिए यादृच्छिक, "सफेद शोर 'पिक्सेल मूल्यों बढ़ जाएगा. यह भी कदम 2.7 में खंडित बीएफ छवियों को देखने के बाद या कदम 2.13 तक किसी भी बिंदु पर चुना जा सकता है.
  4. "डेटा चैनल" पैनल में "तेज फील्ड" बॉक्स की जाँच करें. बीएफ छवियों को लोड करने के लिए सही करने के लिए "का चयन करें" पर क्लिक करें. *. TIF फ़ाइलों के लिए, का चयन करते समय शिफ्ट कुंजी धारण करके एक ही फिल्म के लिए इसी सब बीएफ छवियों का चयन करें, फिर "खोलें" क्लिक करें. *. STK फ़ाइलों के लिए, सिर्फ ब्याज का बीएफ ढेर का चयन करें. छवियों सफलता कर रहे हैंपूरी तरह से मान्यता प्राप्त, फ़ाइल नाम "मान्यता प्राप्त डाटा" पैनल में सही करने के लिए पॉपअप मेनू में सूचीबद्ध किया जाएगा. . * TIF फ़ाइलों के लिए, फ़ाइल नाम (- BF_t001, आदि अधिग्रहण के दौरान अनुक्रमिक नाम के साथ फ़ाइलों को बचाने के लिए) सही क्रम में दिखाई देते हैं सुनिश्चित करें.
  5. "तेज फील्ड (ध्यान से बाहर)" बॉक्स की जाँच करें और सही करने के लिए पॉपअप में सूचीबद्ध किया जाएगा जो BFOOF फाइलें लोड करने के लिए 2.4 चरण में के रूप में "चुनें" बटन का उपयोग करें. (BFOOF अच्छी तरह 63X क्षेत्रों में एफ पी के सापेक्ष बीएफ -4 माइक्रोन के रूप में प्राप्त किया.)
  6. "सेल मास्क" बॉक्स की जाँच करें. "मास्क स्रोत" पैनल में, "सेगमेंट बीएफ" के बगल में रेडियो बटन का चयन करें. विभाजन जीयूआई खोलने के लिए "पैरामीटर" बटन पुश. (वैकल्पिक रूप से, इस मामले में, एक BFOOF फिल्म की जरूरत नहीं है. उत्तरार्द्ध दबाने, और 2.4 चरण में के रूप में फिल्म का चयन, "चुनें मास्क फाइल" बटन के बगल में रेडियो बटन का चयन करके एक पूर्व खंडों मुखौटा फिल्म का चयन करें, और 2.8 कदम को छोड़ सकते हैं.)
  7. विभिन्न विभाजन मानकों (प्रत्येक का वर्णन देखने जा सकते हैं सेट"पैरामीटर वर्णन") दबाकर, और "टेस्ट" (चित्रा 3) पर क्लिक करके विभाजन की गुणवत्ता का परीक्षण द्वारा एड. सफलतापूर्वक खंडों क्षेत्रों मैजेंटा सीमाओं के साथ हरी हो जाएगा. फिल्म में कई बार बिंदुओं की जांच करने के लिए स्लाइडर का उपयोग सुनिश्चित करें. विभाजन संतोषजनक है, जब FormatData जीयूआई को विभाजन मापदंडों लौटने के लिए "पूर्ण" का चयन करें.
  8. "रंग छवियाँ" बॉक्स की जाँच करें. पाठ संपादन बॉक्स में पहली फ्लोरोसेंट छवि चैनल के लिए रंग का नाम दर्ज करें, और फिर प्रेस "जोड़ें और चुनें" 2.4 चरण में रूप रंग फ़ाइलों को लोड करने के लिए. रंग नाम बाईं तरफ सूची बॉक्स में जोड़ दिया जाएगा, और फ़ाइल नाम सही पर तालिका में जोड़ा जाएगा. एक गलती रंग फाइल लोड करने में किया जाता है, बाईं तरफ सूची बॉक्स में रंग नाम का चयन करें और फ़ाइलों को दूर करने के लिए "निकालें रंग" क्लिक करें. प्रत्येक रंग चैनल के लिए दोहराएँ.
  9. अतिरिक्त उप क्षेत्र मास्क फ्लोरोसेंट रंगों में से एक (जैसे fluorescently लेबल नाभिक → Nucl पर आधारित हैंकान क्षेत्र मुखौटा) वांछित हैं, "रंग मास्क" बॉक्स की जाँच करें. यदि नहीं, 2.12 कदम को छोड़. "रंग मास्क स्रोत" पैनल में, पाठ संपादन बॉक्स में उप क्षेत्र मुखौटा नाम दर्ज करें. "रंग मास्क स्रोत" पैनल (रंग चरण 6 में जोड़ दिया गया है करने के लिए आवश्यकता होती है) में पॉपअप मेनू से एक रंग चुनें और जीयूआई परीक्षण एक सीमा खोलने के लिए "पैरामीटर" धक्का.
  10. स्वत: Otsu की विधि 15 का उपयोग कर सीमा निर्धारित करने के लिए, और छवि सीमा (चित्रा 4) के ऊपर संरक्षित क्षेत्रों पर प्रकाश डाला जाएगा "ऑटो दहलीज" बटन पुश. सीमा मैन्युअल संपादन बॉक्स का उपयोग कर समायोजित किया जा सकता है. सीमा सब समय अंक के लिए उपयुक्त है, पुष्टि करने के लिए स्क्रॉल पट्टी का उपयोग करें. संतुष्ट होने पर, FormatData जीयूआई को सीमा से वापस जाने के लिए "ठीक है" धक्का.
  11. पुश चयनित रंग छवियों के लिए लागू दहलीज मॉड्यूल का उपयोग कर उप क्षेत्र मुखौटा उत्पन्न करने के लिए "जोड़ें और सेगमेंट". रंग मुखौटा नाम और स्रोत प्रासंगिक आर के साथ छोड़ दिया करने के लिए तालिका में प्रदर्शित किया जाएगासही पर तालिका में प्रदर्शित होने ecognized फ़ाइल नाम. (वैकल्पिक रूप से, धक्का "जोड़ें और चुनें" पूर्व उप क्षेत्र मुखौटा फ़ाइलों को लोड करने के लिए.)
  12. तल में, निर्दिष्ट या बचाने निर्देशिका के रूप में प्रयोग की जाने वाली इच्छित फ़ोल्डर को ब्राउज़ करें.
  13. : छवि (पर उपलब्ध फ्रेंकोइस Nedelec द्वारा विकसित tiffread2.m कोड का उपयोग कर, फाइलों को पढ़ने के लिए "स्वरूप डाटा" प्रेस http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 , प्रक्रिया डेटा, और एक * बनाएँ) निर्दिष्ट फ़ोल्डर में. चटाई फ़ाइल. यह फाइल ProcessTimeSeries जीयूआई को इनपुट के रूप में काम करेगा.
  14. प्रत्येक चरण के पद के लिए फिल्मों के सेट के लिए कदम 2.4-2.13 दोहराएँ.

3. ProcessTimeSeries जीयूआई, और उपपादरी आईडी और वंश कार्य (चित्रा 5) के साथ समय के माध्यम से ट्रैक कोशिकाओं और प्रजातियों

  1. ट्रैकिंग जीयूआई खोलने के लिए MATLAB में ProcessTimeSeries.m फ़ाइल चलाएँ. उद्घाटन के बाद निम्नलिखित मानकों सेटजीयूआई:
    • "चैंबर ऊंचाई" ("फाइल मैं / हे" पैनल, ऊपरी बाएं) - यह कोशिकाओं फंस रहे हैं जिसमें कक्ष की ऊंचाई को इंगित करता है. यह 8 के रूप में सेल क्षेत्र की बड़ी और छोटी अक्ष पर आधारित एक 3 डी दीर्घवृत्ताभ के रूप में सेल की मात्रा का अनुमान करने में एक बाधा के रूप में प्रयोग किया जाता है.
    • "माइक्रोन / पिक्सेल" (पैनल "मैं / हे फाइल") - पार के अनुभागीय क्षेत्र और मात्रा क्रमश: 2 सुक्ष्ममापी और माइक्रोन 3 में गणना की जा सकती तो छवियों में माइक्रोन दूरी तक पिक्सेल जांच करने के लिए रूपांतरण कारक.
    • "फिल्टर पैनल" (नीचे "फाइल मैं / हे" पैनल) - सेट न्यूनतम और नकाब में कबाड़ क्षेत्रों बाहर फिल्टर करने के लिए अधिकतम पैरामीटर: "एरिया" - पिक्सल में क्षेत्र क्षेत्र, "ECC" - सनक कारक, → 0 के रूप में अधिक परिपत्र , "एफ" - आकार कारक, → 1 के रूप में अधिक परिपत्र.
  2. "फाइल मैं / हे" पैनल में "लोड छवियाँ" क्लिक करें, और FormatData जीयूआई द्वारा ब्याज उत्पादन के *. चटाई डेटा फ़ाइल का चयन करें. क्षेत्र मुखौटा (और किसी भी उप क्षेत्र मास्क) प्रत्येक रंग चैनल के लिए लागू किया जाता है, और अलग माप की एक संख्या (1 टेबल) बना रहे हैं. डेटा फ़ाइल तो बचा लिया गया है. पिछले सत्र से ProcessTimeSeries में एक फाइल लोड हो रहा है तो विश्लेषण शुरू से ही आरंभ किया जाना चाहिए (यदि, यह पूछेंगे चेतावनी:.. यह पहले ही पूरा कर किसी भी ट्रैक curation मिटा और यह FormatData जीयूआई से ताजा मानो डेटा का इलाज होगा गलती से जल्दी ओवरराइट किया जा रहा से पहले क्यूरेट *. चटाई फ़ाइल को रोकने के लिए MATLAB कमांड विंडो में Ctrl + सी मारा, फिर आरंभ.)
  3. इसके बाद, कोशिकाओं को ट्रैक. "ट्रैक प्रकोष्ठों" पैनल ("फिल्टर" पैनल के बगल में) में, निम्नलिखित मानकों सेट:
    • "अधिकतम विस्थापन" - एक सेल एक अलग सेल के रूप में चिह्नित किया जा रहा से पहले आसन्न छवियों के बीच यात्रा कर सकते पिक्सल में अधिकतम दूरी. हायर विस्थापन एल्गोरिथ्म अधिक बढ़ कोशिकाओं के लिए खाते में कर सकते हैं इसका मतलब है, लेकिन यह भी भीड़ में सेल क्षेत्रों मिलान की जटिलता बढ़ जाती है. हम (3 कदम देखना 12 से शुरू और एक त्रुटि ट्रैकिंग में होता है अगर कमी.4).
    • "न्यूनतम लंबाई" - एक मान्य डेटा श्रृंखला पर विचार किया जा करने के लिए एक सेल का पता लगाने के लिए घटनाओं की न्यूनतम संख्या. हम किसी भी असली निशान को हटाने को रोकने के लिए 1 का उपयोग करें, लेकिन यह अल्पकालिक, नकली क्षेत्र निशान में विभाजन परिणाम अगर बढ़ाया जा सकता है.
    • "फ्रेम स्मृति" - लगातार फ्रेम की अधिकतम संख्या एक सेल क्षेत्र गायब हो सकते हैं और इसे वापस जब एक ही आईडी दिया जाएगा. यह "फ्रेम स्मृति" से अधिक समय के लिए गायब हो जाता है, तो यह लौटने पर एक नई पहचान दी जाएगी. हम क्षेत्रों लौटने से पहले 2 तख्ते के लिए विभाजन से चूक होने की अनुमति देने के लिए 2 का उपयोग करें.
  4. क्षेत्र centroids (: ब्लेयर और क्रोकर की Dufresne MATLAB के कार्यान्वयन, Grier, और सप्ताह आईडीएल दिनचर्या, पर उपलब्ध का उपयोग कर अगले करने के लिए एक सीमा से क्षेत्रों को ट्रैक करने के लिए "ट्रैक कोशिकाओं" पर क्लिक http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) , नव दिखने कलियों के लिए प्रजातियों आवंटित करने के लिए, और डेटा को बचाने के लिए. प्रजातियों स्वतः मिनट द्वारा आवंटित कर रहे हैंप्रत्येक फ्रेम में ख्यात कलियों और संभावित माताओं के बीच दूरी imizing. (एक त्रुटि "मुश्किल साहचर्य" के कारण MATLAB कमांड विंडो में दिखाई देता है, "अधिकतम विस्थापन" कम होती है और ट्रैकिंग दोहराएँ.) बदलें मापदंडों अपने डेटा के लिए आवश्यक के रूप में पॉपअप विंडोज़ में.
  5. विभिन्न जीयूआई उपकरण या शॉर्टकट कुंजियों ("चुना सेल सूचना" पैनल ऊपर बटन दबाने से एक पॉप अप विंडो में दिखाया गया है) का उपयोग करते हुए खराब खंडों क्षेत्रों और आईडी या वंश कार्य में गलतियों उपपादरी.
    • स्लाइडर, "पिछला छवि", "अगली छवि" (Ctrl + छोड़ा / सही) - प्रदर्शन और छवि श्रृंखला में फ्रेम के बीच ले जाने के लिए उपयोग करते हैं.
    • "छवि" # - बाएँ और दाएँ कुल्हाड़ियों में मौजूदा छवि के फ्रेम संख्या प्रदर्शित करता है. "छवि" बॉक्स को संपादित सही में अपने नंबर टाइप करके एक निर्दिष्ट फ्रेम में ले जाएँ.
    • "डेल्टा फ्रेम" - (- बाएं Δ = सही) सही है और छोड़ दिया कुल्हाड़ियों के बीच फ्रेम संख्या में अंतर को दर्शाता है.
    • (Ctrl + टी) "छिपाएँ" - में सेल आईडी प्रदर्शित करने के बीच टॉगलसही कुल्हाड़ियों या नहीं.
    • "छिपाएँ लेबल" (Ctrl + एल) - बाएं कुल्हाड़ियों या नहीं में सेल आईडी प्रदर्शित करने के बीच टॉगल.
    • "मास्क" पॉपअप मेनू - कोई मुखौटा, सेलुलर मुखौटा, या बाएं पैनल में प्रदर्शन के लिए किसी भी उपयोगकर्ता परिभाषित उप मास्क प्रदर्शित करने के बीच का चयन करें.
    • "ओवरले" पॉपअप मेनू (कंट्रोल 1-9) - बाएँ फ्रेम में बीएफ और रंग की परतों को प्रदर्शित करने के लिए चुनते हैं. दिखाएँ बीएफ दोनों कुल्हाड़ियों में बीएफ परत पर या बंद टॉगल करता है कि केवल एक ही है. फिर मेनू में ओवरले नाम ("*" ओवरले प्रदर्शित होता है अर्थ) का चयन करके प्रदर्शन के बीच या नहीं टॉगल. 2-9 क्रम में रंग ओवरले toggling के साथ Ctrl +1 टॉगल बीएफ ओवरले,.
    • "सेट रंग" - ओवरले प्रदर्शन के लिए रंग निर्धारित करने के लिए उपयोग करें. एक पॉपअप विंडो स्थापित करने के लिए जो प्रतिदीप्ति चैनल क्वेरी करेगा, और तब रंग पैलेट उपयोगकर्ता परिभाषा के लिए दिखाई देगा.
    • पैनल "क्षेत्र और पटरियों को संशोधित" - इन सेल क्षेत्र मुखौटा और जानकारी का पता लगाने पर प्रभाव परिवर्तन को नियंत्रित करता है:
      • "अपडेट पटरियों" (Ctrl + यू) - फिर से करने के लिए उपयोगसेल आईडी आवंटित. कोई कोशिकाओं सही कुल्हाड़ियों में चयनित हैं, तो एक सेल ID परिवर्तित करने के लिए, जीयूआई संकेत देगा. आईडी एक्स वाई के लिए बदल जाता है, एक्स के भविष्य की सभी उदाहरणों वाई के लिए बदल जाएगा, और वर्तमान वाई के भविष्य के किसी भी उदाहरण हैं, (एक्स के लिए बंद हो जाएगा कभी कभी एक सेल बार बार, 2 आईडी के बीच आगे और पीछे स्विच जाएगा. यह बल्कि अद्यतन आईडी समारोह में एक त्रुटि से एक oversegmented क्षेत्र में एक से अधिक आईडी को समायोजित करने की कोशिश कर रहा है पर नज़र रखने की वजह से है.) एकाधिक कक्षों का चयन किया और उनके आईडी एक साथ बदल गया है, लेकिन प्रत्येक एक अद्वितीय पहचान पत्र देने के लिए सुनिश्चित किया जा सकता है. वर्तमान फ़ाइल में मौजूद नहीं है कि एक आईडी के लिए एक क्षेत्र आवंटित करने के लिए, "0" दर्ज करें और एक उत्पन्न हो जाएगा. दो पर प्रकाश डाला कोशिकाओं की आईडी स्वैप करने के लिए कंट्रोल + डब्ल्यू का प्रयोग करें.
      • "चुना पटरियों को हटाएँ" (Ctrl + डी) - वर्तमान सही कुल्हाड़ियों फ्रेम में चयनित कक्ष या एकाधिक सेल क्षेत्रों को नष्ट करने के लिए इस्तेमाल करते हैं. (कोई कक्षों का चयन कर रहे हैं, आईडी के लिए संकेत देगा.) स्थायी रूप से एक आईडी का पता लगाने के सभी उदाहरणों को हटाने के लिए डी करने के लिए अगले चेक बॉक्सlete चयनित पटरियों बटन (पाठ "सभी हटाएँ" में बदल जाएगा). यह लगातार जंक क्षेत्रों से छुटकारा प्राप्त करने के लिए उपयोगी है, लेकिन पहली आईडी एक वैध सेल या कली क्षेत्र में परिवर्तन नहीं करता है सुनिश्चित करने के लिए भविष्य के तख्ते की जाँच करें.
      • "मर्ज क्षेत्र" (Ctrl + एक या एम) - सेल क्षेत्रों smooths और जोड़ती है. चयन को सही कुल्हाड़ियों में एक सेल या कोशिकाओं (चयनित अगर क्षेत्र लाल हो जाएगा) पर क्लिक करें. एक क्षेत्र पर विलय आकृति विज्ञान एक डिस्क के आकार का तत्व का उपयोग दरारें या छोटे लापता मात्रा में भरने के लिए बंद हो जाएगा. दो या दो से अधिक आसपास के क्षेत्रों विलय एक क्षेत्र में उनके गठबंधन और नए क्षेत्र के लिए सबसे कम आईडी दे देंगे. इस पर-खंडों क्षेत्रों (कोशिकाओं बड़े रिक्तिकाएं है अक्सर जब) के लिए उपयोगी है.
      • "क्षेत्र ड्रा" - वांछित जहां सही कुल्हाड़ियों में एक क्षेत्र को आकर्षित और डबल समाप्त करने के लिए क्लिक करने के लिए माउस का उपयोग करें. डेटा सेट (1 और 65535 के बीच) में उपस्थित नहीं एक अद्वितीय पहचान प्रदान करें. कुंजीपटल पर हटाएँ दबाकर रद्द.
    • "वंश ट्रैकिंग" पैनल - ट्रैकिंग के बाद,वंश कार्य स्वचालित रूप से उत्पन्न कर रहे हैं. नई आईडी क्षेत्रों दिखाई देते हैं, नए सेल आईडी गुलाबी में प्रकट होता है और एक लाल रेखा माता क्षेत्र के लिए तैयार है. बहुत बड़ा नए क्षेत्रों कलियों हो या बहुत दूर संभावित माताओं से हरे रंग में दिखाई देते हैं और "नेन" ("एक नंबर", 2 टेबल देखें) की मां आईडी आवंटित कर रहे हैं करने के लिए. पहली बार बिंदु पर मौजूदा क्षेत्र "0" बच्चों की मां आईडी. व्यक्तिगत कार्य को ठीक करने के लिए, पाठ संपादित क्षेत्रों में मां और कली आईडी दर्ज करें और "ठीक" पर क्लिक करें. एक सेल की मां को मिटा करने के लिए, अपनी माँ के रूप में "0" दर्ज करें. एक तेजी से विधि सही छवि में दो क्षेत्रों का चयन करें और Ctrl + F प्रेस करने के लिए है बेटी सेल के लिए किसी भी पहले से मौजूदा मां कार्य मिटा जबकि यह स्वतः ही, बेटी के रूप में मां और नए क्षेत्र के रूप में पुराने क्षेत्र आवंटित करेगा. चेतावनी: किसी भी समय "प्रजातियों की गणना करें" पर क्लिक उन सहित पुनर्गणना सभी वंश कार्य, उपयोगकर्ता पहले से क्यूरेट किया है जाएगा.
    • "चुना सेल सूचना" पैनल - "मैं जाओएनएफओ "सही कुल्हाड़ियों में चयनित क्षेत्रों में से कुछ माप प्रदर्शित करेगा." माप ... "(निर्यात डेटा" उपयोगकर्ता जो माप के साथ ही इस तरह के रूप में अन्य कार्यों के लिए तयशुदा सूची परिभाषित) प्रदर्शित कर रहे हैं निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है ". इस्तेमाल किया जा सकता है सही आईडी और प्रजातियों (जैसे सेल एक्स समय टी में एक कली है, यह सबसे अधिक संभावना समय टी में एक और कली नहीं है + 5 मिनट) निर्धारित करने के लिए.
    • अद्यतन * चटाई फ़ाइल उपयोगकर्ता परिवर्तनों को प्रतिबिंबित करने के लिए -. (Ctrl + एस) "परिवर्तन सहेजें". अक्सर उपयोग (कोई समारोह पूर्ववत है)!
    • "भूखंड उत्पन्न" - GeneratePlots जीयूआई खोलता है. जल्दी ProcessTimeSeries जीयूआई, उनके मतलब, या प्रत्येक फ्रेम में सभी क्षेत्रों का मतलब सही कुल्हाड़ियों में प्रकाश डाला एकल कक्ष क्षेत्रों के लिए चयनित चर जानकारी और सरल गणना साजिश करने के लिए इस्तेमाल किया. यह जीयूआई किसी न किसी पहले डेरिवेटिव की गणना, लेकिन ऊपर छोड़ दिया पर सही समय अंतराल को निर्दिष्ट करने के लिए सुनिश्चित किया जा सकता. भूखंड "चित्रा उत्पन्न" दबाने से बचाने के लिए एक आंकड़ा करने के लिए उत्पादन किया जा सकता है.
    • ठीक डेटा उपपादरी के लिए: किसी भी oversegmented क्षेत्रों विलय, पूरे सेल पर कब्जा नहीं किसी भी क्षेत्रों को नष्ट, माँ कली रिश्तों को ठीक से (एक लाल रेखा कली उद्भव के समय में उन दोनों के बीच प्रकट होता आवंटित कर रहे हैं सुनिश्चित हो, कली आईडी गुलाबी है जब देखते हैं, तालिका 2), और, इस क्षेत्र में एक मां बताए, आईडी फिक्सिंग कोई माँ ("0"), बताए या क्षेत्र को हटा कर किसी भी हरी आईडी खत्म. अपनी माँ के लिए एक कली क्षेत्र (यह गलत मात्रा आकलन करने के लिए नेतृत्व करेंगे) मर्ज नहीं तो बड डेटा अंतिम विश्लेषण के दौरान मां की उस में जोड़ दिया जाएगा.
    • दिखने में ऊपर ब्याज के अंतिम समय के लिए प्रत्येक फ्रेम के लिए डेटा का निरीक्षण किया, लेकिन बाद में फ्रेम का उपयोग नहीं अगर यह पूरे समय श्रृंखला की आवश्यकता नहीं है.
    • परिवर्तनों को बचाने के लिए सुनिश्चित करें.
    • दोहराएँ प्रत्येक चरण के पद के लिए *. चटाई फ़ाइल के लिए 3.1-3.7 कदम.

4. विश्लेषण के लिए निर्यात डेटा

  1. बस टिम के माध्यम से प्रत्येक कक्ष के लिए कच्चे क्षेत्र मापन के निर्यात करने के लिएई, "निर्यात डेटा" धक्का. ब्याज की माप खुलती है जीयूआई में चुना जा सकता है, और वे एक अंतरिक्ष सीमांकित में उत्पादन किया जाएगा *. Txt कॉलम हेडर के रूप में चर नाम के साथ फाइल.
  2. समय के साथ पूरे कोशिकाओं के लिए समय श्रृंखला का विश्लेषण करने के लिए, सेल चक्र जानकारी गणना, और डेरिवेटिव ले, "समय श्रृंखला विश्लेषण" धक्का. एक विंडो ब्याज और विश्लेषण मापदंडों के इनपुट (चित्रा 6) की माप के चयन की अनुमति खुल जाएगा.
  3. जीयूआई (बाद के सभी तख्ते पर ध्यान नहीं दिया जाएगा) में क्यूरेट पिछली बार बिंदु दर्ज करें. डिफ़ॉल्ट चौरसाई और सेल चक्र असाइनमेंट मापदंडों हमारे अगुणित और 5 मिनट के अंतराल में imaged द्विगुणित उपभेदों के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, लेकिन इन सबसे अच्छा परिणाम के लिए अलग किया जा करना पड़ सकता है. (पैरामीटर मान स्वयं एक परीक्षण डेटा सेट के लिए नवोदित और विभाजन के समय को निर्धारित करने और स्वचालित एल्गोरिथ्म के प्रदर्शन से तुलना करके उपयुक्त हैं की जाँच करें.)
  4. सभी मापदंडों सेट कर रहे हैं, के लिए "विश्लेषण" धक्का:
    1. विपक्षप्रत्येक कच्चे माप के लिए सरणियों truct और पृष्ठभूमि (प्रत्येक फ्लोरोसेंट फिल्म में पहली फ्रेम से गैर सेल क्षेत्र की औसत तीव्रता के रूप में मापा जाता है, या सेल पिक्सेल प्रति औसत autofluorescence के लिए खाते में निर्दिष्ट किया जा सकता है) घटाना.
    2. उच्च आवृत्ति माप के शोर के रूप में (9) पर चर्चा समाप्त करने के लिए चयनित मापन के लिए एक चौरसाई पट्टी फिट.
    3. स्वचालित रूप से 9 में चर्चा की मात्रा समय श्रृंखला की ढाल में परिवर्तन के आधार पर प्रत्येक कक्ष के लिए कली उद्भव और कोशिका विभाजन के समय निर्धारित करते हैं. कली माप तो एक सन्निहित पूरे सेल समय श्रृंखला के लिए उद्भव और विभाजन प्रत्येक चक्र के बीच मां के मापन के लिए जोड़ दिया जाएगा. एक सामान्यीकृत सेल चक्र प्रगति भी विभाजन से विभाजन करने के लिए 0 से 2 को लेकर की गणना की जाएगी.
    4. स्थिर 1 सेंट और चयनित माप के 2 डेरिवेटिव लेने के लिए एक चौरसाई पट्टी फिट. (अच्छी तरह से परिभाषित डेरिवेटिव, समय श्रृंखला के प्रयोजन के लिएपिछले चक्र के लिए समापन बिंदु को पूरा करने के लिए निम्नलिखित सेल चक्र के लिए डेटा स्थानांतरण द्वारा संभाग भर में निरंतर बना रहे हैं.)
    5. आउटपुट प्रत्येक माप के लिए एक सरणी के रूप में कच्चे और सरलीकृत समय श्रृंखला के सभी क्षेत्रों के लिए, और पूरे सेल सरलीकृत, निरंतर, और विभेदित समय श्रृंखला. पहला तत्व पृष्ठभूमि घटाव के लिए एक रंग सूचकांक है, पहली पंक्ति के बाकी, सेल आईडी रखती प्रथम स्तंभ के बाकी फ्रेम संख्या है, और शेष तत्वों प्रत्येक पंक्ति के साथ एक स्तंभ में प्रत्येक एकल कक्ष के लिए समय श्रृंखला पकड़ पहले कॉलम में फ्रेम करने के लिए इसी. सेल चक्र प्रगति समय श्रृंखला और वंश जानकारी का एक समान सरणी भी उत्पादन किया जाएगा. सरणी "LineageArray" माँ आईडी, कली आईडी, पहली कली क्षेत्र के फ्रेम, अनुमान नवोदित फ्रेम, और अनुमानित विभाजन फ्रेम रहे पांचवें स्तंभ के माध्यम से एक मां कली रिश्ते और प्रथम प्रतिनिधित्व प्रत्येक पंक्ति के साथ एक मेज होता है. डेटा एक *. चटाई फ़ाइल (MATLAB डेटा फ़ाइल) को निर्यात किया जाता है.

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Representative Results

एक सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया और विश्लेषण प्रयोग वास्तविक सौंपा कली उद्भव और विभाजन के समय के साथ ही पूरे कोशिकाओं के लिए ज्यादातर निरंतर समय श्रृंखला निकलेगा. एक उदाहरण के रूप में, हम विकास और वैश्विक अभिव्यक्ति एकल कक्षों में समय (तालिका 4, Y47 पर भिन्न हो सकते हैं पालन कैसे विधान ADH1 प्रमोटर द्वारा संचालित आसमानी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक एकीकृत प्रतिलिपि (पाकिस्तानी) व्यक्त एक अगुणित खमीर तनाव के साथ ऊपर प्रोटोकॉल का प्रदर्शन ). हम समय के साथ (चित्रा 7A) माप पूरे सेल प्राप्त करने के लिए समय श्रृंखला विश्लेषण भागा, और 9 के रूप में पाया सेल चक्र पर निर्भरता मात्रा और अभिव्यक्ति दोनों के लिए उभर रहे हैं. प्रोटीन एकाग्रता, या औसत तीव्रता, थोड़ा (आंकड़े 7B और 7C) कम हो जाती है, जबकि कली गठन के बाद कुल संयुक्त मात्रा (मां + कली) (8,16 के साथ संगत) और अधिक तेजी से कली उद्भव से पहले की तुलना में बढ़ जाती है. संयुक्त एकीकरण में वृद्धिटेड प्रोटीन (इस मामले में मात्रा एक्स एकाग्रता) भी नवोदित (चित्रा 7 दिन) के बाद accelerates. अकेले माता क्षेत्र (चित्रा 7B एंड डी) के मुकाबले इन परिणामों को ठीक से पूरे सेल माप को कली योगदान को शामिल करने और उचित कली गठन और विभाजन के समय कार्य के लिए आवश्यकता पर प्रकाश डाला के महत्व को प्रदर्शित करता है. हम 9 की सूचना दी है के रूप में, हम एक तात्कालिक सापेक्ष mRNA के स्तर एम (टी) और प्रतिलेखन दर एक (टी), जो दोनों भी (चित्रा 7E और 7F) नवोदित बाद वृद्धि की गणना करने के लिए विभेदित समय श्रृंखला का उपयोग कर सकते हैं:

1 समीकरण
पी (टी) समय पर कुल प्रोटीन है जहां टी और γ एम 0.04 मिनट -1 mRNA गिरावट दर है

माप समय श्रृंखला के स्थिर समय डेरिवेटिव उत्पन्न करने की क्षमता भी गतिज पढ़ाई लाभ. हम स्विच प्रतिलेखन गतिविधि के साथ एक नमूदार, असाध्य प्रतिलेखन कारक (तालिका 4, Y962) व्यक्त एक खमीर तनाव का उपयोग करें. फॉस्फेट भुखमरी मार्ग, Pho4p के मास्टर प्रतिलेखन कारक बाह्य फॉस्फेट concentratio एन 18 के जवाब में nucleo-साइटोप्लाज्मिक स्थानीयकरण के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है. हम tet ओपेरोन (Teto) जो बांध tetr, साथ Pho4p का डीएनए बाध्यकारी डोमेन की जगह है, और सी टर्मिनली Pho4-tetr-YFP 9 बनाने के लिए एक पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए नए प्रतिलेखन कारक जुड़े हुए. छिड़काव मीडिया में फॉस्फेट स्तर बंद करके, हम तो 7 Teto बाध्यकारी साइटों एक से बना सिंथेटिक प्रमोटर द्वारा संचालित एक एकीकृत रवांडा की अभिव्यक्ति को चालू कर सकता हैएन डी CYC1 न्यूनतम प्रमोटर (7xtetOpr-पाकिस्तानी). एक समय श्रृंखला विश्लेषण प्रतिलेखन कारक नाभिक (कदम 2.9-10 में के रूप में एक आरएफपी आधारित परमाणु submask बनाने के लिए आरएफपी के एक संलयन और परमाणु प्रोटीन Nhp2p का उपयोग करके), और जब लक्ष्य जीन शुरू होता है और प्रतिलेखन बंद हो जाता है के लिए स्थानीय है जब पता चलता है (चित्र 8). समय के साथ व्युत्पन्न श्रृंखला का विश्लेषण करके, प्रत्येक एकल कक्ष में लक्ष्य प्रमोटर के सक्रियण और क्रियाशीलता छोड़ना बार स्थिर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की एकाग्रता उच्च है, जब भी अनुमान लगाया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध. प्रोटोकॉल) 1 के लिए microfluidic संस्कृति, 2) प्रतिदीप्ति, समय चूक माइक्रोस्कोपी, 3) डेटा विश्लेषण, और चरणों का वर्णन

चित्रा 2
चित्रा 2. FormatData जीयूआई. इंटरफेस, स्वरूप, और बाद में गणना और दृश्य निरीक्षण के लिए खंड छवि डेटा आयात करने के लिए प्रयोग किया जाता है. नंबर प्रत्येक घटक के लिए इसी प्रोटोकॉल कदम से संकेत मिलता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. SegTest जीयूआई. इंटरफेस सेल खंड परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है व्यावहारिक मानकों और नेत्रहीन कदम 2.7 में के रूप में विभाजन सटीकता की पुष्टि.

चित्रा 4
4 चित्रा. ColorThreshTest जीयूआई. इंटरफ़ेस 2.10 कदम के रूप में चुना प्रतिदीप्ति चैनल से एक subcellular मुखौटा बनाने के लिए आवश्यक तीव्रता सीमा का परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. ProcessTimeSeries जीयूआई. इंटरफेस, उपाय ट्रैक, नेत्रहीन का निरीक्षण, और सेल क्षेत्रों और वंश कार्य संपादित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. नंबर प्रत्येक घटक के लिए इसी प्रोटोकॉल कदम से संकेत मिलता है.लक्ष्य = "_blank"> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
6 चित्रा. AnalysisParams जीयूआई. इंटरफेस कदम 4.3 और 4.4 में के रूप में समय श्रृंखला विश्लेषण के लिए आवश्यक मापदंडों दर्ज करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

7 चित्रा
चित्रा 7. कई पीढ़ियों से अधिक microfluidic संस्कृति में ADH1 जनसंपर्क पाकिस्तानी व्यक्त एक अगुणित खमीर की एकल कोशिका समय श्रृंखला. (ए) उज्ज्वल क्षेत्र (शीर्ष पंक्ति) और साउदी (नीचे पंक्ति) micrographs प्रयोग भर में एक सेल के लिए संकेत समय बिंदुओं पर दिखाए जाते हैं . खंडों माँ सेल (नीला outli लिएपूर्वोत्तर) और उसके कलियों (हरे रंग की रूपरेखा), सन्निहित पूरे सेल लाल रंग में उल्लिखित है. कच्चे माँ और कली (बी) की मात्रा और (सी) प्रोटीन एकाग्रता समय श्रृंखला माप शोर को दूर करने के लिए smoothed रहे थे, और (डी) एकीकृत पाकिस्तानी प्रतिदीप्ति मात्रा और एकाग्रता के उत्पाद के रूप में गणना की गई. पूरे सेल (लाल) का पता लगाने डिवीजनों में एक डिफ़्रेंशिएबल समरेखण पट्टी (बी और डी) के लिए फिट करने के लिए आसान है कि एक चल कुल रखने के लिए अतीत विभाजन बढ़ा दिया है. (ई) के सापेक्ष mRNA के स्तर और (एफ) तात्कालिक प्रतिलेखन दर समीकरण (1-2) और (डी) में तख़्ता फिट उपयोग कर की गणना कर रहे हैं.

8 चित्रा
चित्रा 8. Nucleo-साइटोप्लाज्मिक करने प्रवर्तक प्रतिलेखन दर प्रतिक्रियाएक खमीर कोशिकाओं में एक Pho4-YFP संलयन के चक्कर. (ए) के चार संकेत अधिग्रहण चैनलों से micrographs (बी) के जवाब में आरएफपी के रूप में चिह्नित नाभिक के लिए localizes कि एक switchable YFP-इनकार Pho4-tetr transactivator साथ एक सेल के लिए दिखाए जाते हैं कम फॉस्फेट और एक 7xtetOpr-पाकिस्तानी पत्रकार की (सी) ड्राइव अभिव्यक्ति. करने के लिए (डी) औसतन स्थानीयकरण (काला लाइन) के साथ और एकल कोशिका स्तर पर inferred प्रतिलेखन दर में परिवर्तन (लाल और मैजंटा लाइनों, लाल सन्निहित का प्रतिनिधित्व करता है सेल क्षेत्र ए) में लाल रंग में उल्लिखित. कुछ प्रोटीन बेटी सेल के लिए खो दिया है जब बी में पाकिस्तानी अभिव्यक्ति में तेज बूंदों कोशिका विभाजन के साथ मेल खाना.

मापन नाम विवरण
समय छवि फ्रेम संख्या
क्षेत्र कुल संख्या ओक्षेत्र शामिल च पिक्सल
खंड (4/3) πabc, जहां एक = क्षेत्र के साढ़े प्रमुख धुरी लंबाई, ख = साढ़े नाबालिग अक्ष लंबाई, और ग = ख या साढ़े "चैंबर ऊंचाई" (जो भी छोटा होता है)
(एक्स) _ (वाई) मतलब रंग चैनल में क्षेत्र मुखौटा (वाई) (एक्स) के लिए पिक्सेल तीव्रता मीन
(एक्स) _ (वाई) मंझला रंग चैनल में क्षेत्र मुखौटा के लिए औसत पिक्सेल तीव्रता (वाई) (एक्स)
(एक्स) _ (वाई) एसटीडी रंग चैनल में क्षेत्र मुखौटा (वाई) (एक्स) के लिए पिक्सेल तीव्रता का मानक विचलन
(एक्स) _ (वाई) IQR 25 वीं प्रतिशतक मूल्य - 75 वीं प्रतिशतक रंग चैनल (एक्स), में क्षेत्र मुखौटा (वाई) के लिए पिक्सेल तीव्रता का अन्तःचतुर्थक श्रेणी
(एक्स) _ (वाई) T20pct रंग चैनल (एक्स) में क्षेत्र मुखौटा (वाई) के लिए पिक्सेल तीव्रता के शीर्ष 20% के लिए तीव्रता मतलब. उपयोगएक submask बिना subcellular स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए अगले माप के साथ तुलना में ful है.
(एक्स) _ (वाई) B80pct रंग चैनल (एक्स) में क्षेत्र मुखौटा (वाई) के लिए पिक्सेल तीव्रता के नीचे 80% के लिए तीव्रता मतलब. एक submask बिना subcellular स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए पिछले माप के साथ तुलना में उपयोगी.
(एक्स) _ (वाई) M50pct रंग चैनल में क्षेत्र मुखौटा के लिए पिक्सेल तीव्रता के बीच 50% (वाई) (एक्स) के लिए तीव्रता मीन
(एक्स) _cellint पूरे सेल (मां और किसी भी जुड़े कली) के लिए रंग चैनल (एक्स) (पिक्सेल तीव्रता मतलब एक्स मात्रा) का एकीकृत प्रतिदीप्ति
(जेड) कच्चे चर के लिए "समय श्रृंखला विश्लेषण" से कच्चे समय श्रृंखला डेटा निर्गम (जेड)
(जेड) गोदा चर के लिए "समय श्रृंखला विश्लेषण" द्वारा तख़्ता smoothed कच्चे समय श्रृंखला डेटा निर्गम (जेड)
(जेड) पूरे पूरे सेल (एमचर के लिए "समय श्रृंखला विश्लेषण" द्वारा अन्य + संलग्न कली (जेड) Rawsmooth) समय श्रृंखला डेटा निर्गम (जेड)
(जेड) Cont पूरे सेल समय श्रृंखला डेटा चर के लिए "समय श्रृंखला विश्लेषण" (जेड) द्वारा ("चल कुल") डिवीजनों में निरंतर उत्पादन बनाया
(जेड) WhSmooth चर के लिए "समय श्रृंखला विश्लेषण" द्वारा तख़्ता सरलीकृत (जेड) पूरे सेल समय श्रृंखला डेटा निर्गम (जेड)
(जेड) डीडीटी चर के लिए "समय श्रृंखला विश्लेषण" द्वारा तख़्ता सरलीकृत सबसे पहले समय व्युत्पन्न (जेड) पूरे सेल समय श्रृंखला डेटा निर्गम (जेड)
(जेड) d2dt2 चर के लिए "समय श्रृंखला विश्लेषण" द्वारा तख़्ता सरलीकृत का दूसरा समय व्युत्पन्न (जेड) पूरे सेल समय श्रृंखला डेटा निर्गम (जेड)

तालिका 1. ProcessTimeSeries जीयूआई में मापन चर नामकरण.

सेल आईडी रंग वंश का दर्जा
पीला सौंपा मां
गुलाबी नई कली (सौंपा मां के लिए तैयार की लाल रेखा)
ग्रीन सौंपे मां

तालिका 2. वंश असाइनमेंट की स्थिति के लिए सेल आईडी रंग कोड.

फ़ाइल नाम विवरण
FormatData.m डाटा इनपुट जीयूआई कि ProcessTimeSeries.m से प्रसंस्करण के लिए प्रारूपों फिल्मों और क्षेत्रों बीएफ छवियों
FormatData.fig FormatData जीयूआई खिड़की लेआउट
BFsegment.m Extractregions2.m और segmentregions.m साथ बीएफ विभाजन मॉड्यूल,
SegTest.m विभाजन गुणवत्ता परीक्षण जीयूआई
SegTest.fig SegTest जीयूआई खिड़की लेआउट
extractregions2.m क्षेत्रों की पहचान के लिए बीएफ विभाजन मॉड्यूल के पहले घटक
segmentregions.m अलग और साफ सेल क्षेत्रों के लिए बीएफ विभाजन मॉड्यूल के दूसरे घटक
color2submask.m प्रतिदीप्ति आधारित submask विभाजन मॉड्यूल
ColorThreshTest.m प्रतिदीप्ति आधारित सीमा मुखौटा परीक्षण जीयूआई
ColorThreshTest.fig ColorThreshTest जीयूआई खिड़की लेआउट
tiffread2.m MATLAB में इस्तेमाल के लिए अर्क डेटा *. TIF या *. STK फाइलें
imalign.m 2 डी पार सहसंबंध का उपयोग कर छवि पंजीकरण
ProcessTimeSeries.m क्षेत्रों है कि पटरियों डाटा प्रोसेसिंग जीयूआई, प्रजातियों प्रदान करती है, और त्रुटियों के दृश्य सुधार सक्षम बनाता है. इसके अलावा जीयूआई आधारित साजिश रचने की क्षमता प्रदान करता है और पूरे सेल समय श्रृंखला डेटा outputs
ProcessTimeSeries.fig ProcessTimeSeries जीयूआई खिड़की लेआउट
cleanMask.m ProcessTimeSeries जीयूआई में मापदंडों के आधार पर मुखौटा क्षेत्रों को समाप्त करता है
track.m क्षेत्र centroids के आधार पर सेल क्षेत्रों ट्रैक्स
OptimizeLineages.m वंश असाइनमेंट मॉड्यूल भौतिक दूरी और अतीत और भविष्य नवोदित घटनाओं के आधार पर इष्टतम माँ कली संबंधों को निर्धारित करता है
getClosestObjects.m प्रत्येक नया सेल आईडी (कली) के लिए पड़ोसी कोशिकाओं ढूँढता
SelectVariables.m ब्याज की चर को चुनने के लिए माप चयन जीयूआई
SelectVariables.fig SelectVariables जीयूआई खिड़की लेआउट
GeneratePlots.m ProcessTimeSeries खिड़की में डेटा के लिए जीयूआई की साजिश रचने
GeneratePlots.fig GeneratePlots जीयूआई खिड़की लेआउट
AnalyzeCellSeries.m समय श्रृंखला विश्लेषण मॉड्यूल कोशिका विभाजन के समय निर्धारित करता है और पाठ में वर्णित के रूप में पूरे सेल माप outputs
assignDivisionsInf2.m कली कोशिका विभाजन के समय अंकुर और असाइन
AnalysisParams.m सेल समय श्रृंखला विश्लेषण पैरामीटर इनपुट
AnalysisParams.fig AnalysisParams जीयूआई खिड़की लेआउट

तालिका 3. Grafts विवरण दर्ज करें.

तनाव आईडी जीनोटाइप (W303 आधारित) संदर्भ
Y47 मेट एक leu2 :: ADH1pr-पाकिस्तानी-hisG :: URA3 :: kanR :: hisG 19
Y962 मेट एक एडीई + NHP2 :: आरएफपी-नेट spl2Δ :: leu2 pho4 :: TRP1 pho84Δ:: Klura3 phm4 :: HIS3MX6 leu2Δ :: TEF1m7pr-PHO4ΔP2-tetr-cYFP URA3 :: 7xtetOpr-पाकिस्तानी 9

तालिका 4. इस अध्ययन में इस्तेमाल खमीर उपभेदों.

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Discussion

ऊपर प्रोटोकॉल microfluidics में या सॉफ्टवेयर के विकास में सीमित अनुभव के साथ प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला डेटा प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है. यह एक एकल खमीर कोशिकाओं के समय चूक प्रतिदीप्ति फिल्में प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है, उपपादरी ट्रैकिंग और वंश कार्य, प्रासंगिक सेल आकार और अभिव्यक्ति माप निकालने के लिए और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microfluidic संस्कृति डिवाइस का उपयोग कर समय और एक बहुमुखी ग्राफिकल यूजर पूरे कोशिकाओं के व्यवहार का विश्लेषण इंटरफेस (जीयूआई). प्रयोगात्मक, विभाजन, और ट्रैकिंग कदम विभिन्न तरीकों से पहले 11,13,14 में संपर्क किया गया है, वहीं उपरोक्त प्रक्रिया जीव विज्ञान समुदाय के एक व्यापक सबसेट के लिए इन तकनीकों को और अधिक सुलभ बनाने के लिए बनाया गया है. उपरोक्त प्रक्रिया एक विशेष microfluidic संस्कृति डिवाइस के लिए अनुकूलित है जबकि, समग्र विश्लेषण सस्ता और अधिक अनुकूलन बन मुस्तैद microfluidic संस्कृति प्रौद्योगिकियों के रूप में इसी तरह के उपकरणों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. Fundamएन्टैल्ली, हम रोजगार के विभाजन और क्षेत्र माप एल्गोरिदम मौजूदा तरीकों 13,14 के समान हैं, लेकिन grafts सॉफ्टवेयर नेत्रहीन क्षेत्र ट्रैकिंग और वंश कार्य उपपादरी के लिए है और इसे सही सेल चक्र चरणों आवंटित करने की क्षमता जोड़ता है. इन सुविधाओं के दोनों सही डेटा श्रृंखला का समय डेरिवेटिव की गणना करने के लिए महत्वपूर्ण हैं.

काफी परिणामस्वरूप समय श्रृंखला डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित जो प्रोटोकॉल में कई कदम उठाए हैं. प्रारंभ में कोशिकाओं के साथ संस्कृति कक्ष ओवरलोडिंग (चैम्बर ताज़ा समय महत्वपूर्ण है जहां गतिज प्रयोगों में विशेष रूप से ध्यान देने योग्य) कक्ष में छिड़काव कम हो जाएगा, और अधिक बढ़ना पहले प्रयोग के समय के पाठ्यक्रम में घटित होगा. यह सबसे अच्छा कम समय के लिए कम सेल लोड हो रहा दबाव के साथ शुरू और एक उचित सेल घनत्व हासिल की है जब तक धीरे - धीरे एक या दोनों में वृद्धि से बचा जा सकता है. इमेजिंग के लिए स्टेज स्थिति चयन से संबंधित एक और भी उतना ही महत्वपूर्ण माना जाता हैeration. कितने कोशिकाओं समय के साथ छवि फ्रेम में हो और भीड़ मीडिया प्रसार को कैसे प्रभावित करेगा आशा होगी तनाव, योजना के दोहरीकरण के समय को जानने का. दस छितरी कोशिकाओं दस microcolonies में विकसित होगा, लेकिन शुरू में एक साथ समूहीकृत दस कोशिकाओं को एक एकल, बड़े कॉलोनी (यह व्यास में ~ 14 कोशिकाओं की तुलना में अधिक होता है जब हम एक कॉलोनी के केंद्र से 6 साई में पोषक प्रसार सीमाओं देखा है) में विकसित होगा . नदी के ऊपर प्रोटोकॉल चरणों में अतिरिक्त प्रयास भी बाद में मैन्युअल डेटा curation की सुविधा है, और उत्पादन समय श्रृंखला को बेहतर बनाता है. थाली मजबूती चरण में मुहिम शुरू की है सुनिश्चित करें और बेहद स्वचालित रूप से समय के माध्यम से एकल कक्षों ट्रैकिंग में सटीकता में सुधार FormatData जीयूआई में छवि पंजीकरण विकल्प का उपयोग करें. ध्यान देने की जरूरत है, जो त्रुटियों की संख्या कम करने के लिए भी सर्वोत्तम संभव विभाजन मापदंडों के चयन में समय बिताएं. एक remerging क्योंकि ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर मामूली सेल क्षेत्रों के oversegmentation बजाय undersegmentation साथ सबसे अच्छा काम करता हैविभाजन सेल क्षेत्रों को विभाजित करने के लिए लाइनों ड्राइंग से एक आसान काम नहीं है, लेकिन, वृद्धि हुई oversegmentation झूठी, नए क्षेत्रों की उपस्थिति के कारण वंश कार्य में त्रुटियों बढ़ जाती है. इसके अलावा, पूरे सेल के लिए माप सही होगा कि इतना सब माँ कली संबंधों को ठीक से आवंटित कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें. एक कली विभाजन से चूक या छवि सीमा के बाहर बढ़ता जाता है, तो नकली परिणामों को रोकने के लिए मां के डेटा श्रृंखला समाप्त होने पर विचार करें. यह आसानी से गलत फ्रेम में एक अद्वितीय पहचान पत्र ("0" की आईडी लिखें) को माँ क्षेत्र बदल रहा है, और नई पहचान के भविष्य की सभी उदाहरणों को दूर करने के लिए "हटाएँ सभी" सुविधा का उपयोग करके किया जाता है. इन कदमों के करीब ध्यान बहुत कच्चे समय श्रृंखला डेटा की सटीकता में वृद्धि होगी.

"समय श्रृंखला विश्लेषण" दबाकर डेटा उत्पादन के वैध व्याख्या की स्थापना करने के लिए, हम कुछ अतिरिक्त पूछताछ की सलाह देते हैं. कली उद्भव और विभाजन बार सत्यापित सही उपयोगकर्ता के inpu के आधार पर निर्धारित किया जाता हैटी मापदंडों. मैन्युअल रूप से एक परीक्षण फिल्म के सेट के लिए नवोदित और विभाजन बार रिकॉर्ड और एल्गोरिथ्म परिणाम की तुलना करें. नेत्रहीन समय cytokinesis एक मां और बेटी के बीच पूरे किये का अनुमान है, संकीर्ण और अंधा करने के लिए अपनी सीमा के लिए लग रही है. (नायब:. विभाजन के समय की पुस्तिका अवलोकन में एक fluorescently चिह्नित नाभिक एड्स के साथ एक परीक्षण तनाव एक अन्य विधि प्लाज्मा झिल्ली fluorescently-चिह्न और बंद करने के लिए मां और बेटी की कोशिकाओं के बीच के अंतर के लिए देखने के लिए किया जाएगा.). इसके अलावा, कब्जा कर लिया प्रकाश के स्रोत से जब एक सेल के लिए कुल प्रतिदीप्ति बेहतर (मात्रा से गुणा औसत क्षेत्र तीव्रता (कब्जा कर लिया प्रकाश सेल की एक पतली पार अनुभाग से निकलती हैं) के रूप में या क्षेत्र में एकीकृत प्रतिदीप्ति के रूप में गणना की है कि जांच पूरे सेल). एक सेल भर प्रतिदीप्ति प्रोफाइल क्षेत्र 7 की बड़ी और छोटी कुल्हाड़ियों द्वारा वर्णित एक अर्द्ध दीर्घवृत्त की वक्र मेल खाता है, पर कब्जा कर लिया प्रकाश पूरे सेल से निकलती है, और कुल प्रतिदीप्ति थानेदारएक्स (क्षेत्र) (तीव्रता मतलब है) के रूप में गणना की जा uld. सेल ऊंचाई की तुलना में बहुत कम क्षेत्र की गहराई के साथ 63X में हमारे मामले में, प्रतिदीप्ति प्रोफाइल अपेक्षाकृत सपाट है और कुल प्रतिदीप्ति एक्स (मात्रा) (मतलब तीव्रता) के रूप में गणना की है. एक और विचार की fluorophore photobleaching है. सॉफ्टवेयर विश्लेषण में photobleaching विचार नहीं करता है, और इस प्रकार प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला उत्पादन केवल नमूदार संवाददाता का प्रतिनिधित्व करता है. Photobleaching प्रक्रियाओं अधिग्रहण सेटिंग्स और प्रतिदीप्ति छवियों, फ्लोरोफोरे की प्रकृति, और विभिन्न अन्य प्रयोग विशेष पैरामीटर प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता समय अंतराल पर काफी निर्भर करते हैं. Photobleaching भी अपने इलाज के लिए एक सामान्य एल्गोरिथ्म रोकता है जो एक साधारण, पहली आदेश दर अभिव्यक्ति, द्वारा अच्छी तरह से वर्णित नहीं किया जा सकता. इसलिए हम समय श्रृंखला उत्पादन में photobleaching के लिए खाता नहीं है, लेकिन विश्लेषणात्मक विधि उपयोगकर्ता की व्याख्या सहायता करने के लिए इस प्रक्रिया के कैनेटीक्स को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्त में, smoothi ​​का चयनमनाया समय श्रृंखला के लिए उपयुक्त एनजी मापदंडों. डेटा में असली सुविधाओं के संरक्षण, जबकि आदर्श रूप में, चौरसाई splines के उच्च आवृत्ति माप शोर को समाप्त होगा. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए आवश्यक मापदंडों विशेष समय श्रृंखला की विशेषताओं पर निर्भर करती है और प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकते हैं.

सॉफ्टवेयर विभिन्न समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी डेटा के विश्लेषण के लिए लचीला होना करने का इरादा था. रंग चैनलों की कोई भी संख्या शामिल किया जा सकता है और किसी भी एक उप क्षेत्र मुखौटा बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एल्गोरिदम नवोदित खमीर कोशिकाओं की फिल्मों के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, functionalities के कई के रूप में अच्छी तरह से अन्य जीवों की फिल्मों के लिए विस्तार करना चाहिए. क्षेत्र माप (मात्रा को छोड़कर), ट्रैकिंग, और curation सेल मुखौटा पर ही निर्भर करते हैं और इस तरह निभा रहे हैं. विभाजन, वंश असाइनमेंट, कोशिका विभाजन के दृढ़ संकल्प, और समय श्रृंखला विश्लेषण मॉड्यूल स्वतंत्र रूप से विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है. इसके अलावा, बल्कि शामिल से उपयोग करने की तुलनाgmentation मॉड्यूल, एक पूर्व खंडों मुखौटा फिल्म निवेश किया जा सकता है, और चरण विपरीत या अंतर हस्तक्षेप विपरीत छवियों उज्ज्वल क्षेत्र के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है. जीयूआई तो आईडी और वंश कार्य ट्रैक और उपपादरी के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

हम सॉफ्टवेयर पर टिप्पणी के लिए एमिली जैक्सन, यहोशू Zeidman, और निकोलस रेन धन्यवाद. इस काम GM95733 (समुद्री मील दूर करने के लिए), BBBE 103,316 और एमआईटी स्टार्टअप धन (समुद्री मील दूर करने के लिए) द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate CellAsic Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform CellAsic EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective Zeiss 440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set Chroma Technology Corp set #89006 Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a Mathworks 64-bit version handles large data files better than 32-bit

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References

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सूक्ष्म जीव विज्ञान अंक 77 सेलुलर जीवविज्ञान आण्विक जीव विज्ञान जेनेटिक्स बायोफिज़िक्स, माइक्रोस्कोपी प्रतिदीप्ति सेल बायोलॉजी माइक्रोस्कोपी / प्रतिदीप्ति और समय चूक नवोदित खमीर जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता विभाजन वंश ट्रैकिंग छवि ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर खमीर कोशिकाओं इमेजिंग
नवोदित खमीर की प्रतिदीप्ति समय चूक सिनेमा हासिल करना और grafts का उपयोग कर एकल सेल गतिशीलता का विश्लेषण
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Zopf, C. J., Maheshri, N. Acquiring… More

Zopf, C. J., Maheshri, N. Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS. J. Vis. Exp. (77), e50456, doi:10.3791/50456 (2013).

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