Summary
نقدم بروتوكول بسيط للحصول على الأفلام المجهري مضان من خلايا الخميرة في التزايد، ومجموعة من البرامج المستندة إلى واجهة المستخدم الرسومية لاستخراج البيانات وحيدة الخلية سلسلة زمنية. يتضمن تحليل النسب الآلي وتقسيم الوقت الاحالة متكاملة مع الفحص البصري وكرأيشن اليدوي للبيانات مجنزرة.
Abstract
أصبحت مضان الوقت الفاصل بين المجهري أداة قوية في دراسة العديد من العمليات البيولوجية على مستوى خلية واحدة. على وجه الخصوص، والأفلام التي تصور الاعتماد الزمانية في التعبير الجيني توفير نظرة ثاقبة على ديناميات تنظيمه، ومع ذلك، هناك العديد من التحديات التقنية إلى الحصول على وتحليل الأفلام مضان من الخلايا واحد. نحن هنا وصف بروتوكول بسيطة باستخدام المتاحة تجاريا جهاز الثقافة ميكروفلويديك لتوليد مثل هذه البيانات، و، واجهة المستندة إلى MATLAB المستخدم الرسومية (GUI) المستندة إلى حزمة برامج لقياس الصور مضان. قطاعات البرمجيات وخلايا المسارات، وتمكن المستخدم من الإشراف أخطاء في البيانات بصريا، وتلقائيا بتعيين النسب والأوقات الانقسام. يحلل GUI مزيد من السلسلة الزمنية لإنتاج آثار خلية كاملة وكذلك مشتقاتها المرة الأولى والثانية. في حين تم تصميم البرنامج لS. الخباز، ينبغي نمطية وبراعة تسمح لها رس تكون بمثابة منصة لدراسة أنواع الخلايا الأخرى مع بعض التعديلات.
Introduction
وقد عززت تحليل وحيدة الخلية في التعبير الجيني فهمنا لكثير من جوانب تنظيم الجينات. لقطات ثابتة من الفلورسنت التعبير مراسل باستخدام التدفق الخلوي أو المجهري تقديم معلومات مفيدة عن توزيع للتعبير عن خلية واحدة، ولكنها تفتقر إلى تاريخ وتطور بيانات السلاسل الزمنية اللازمة لإبلاغ مباشرة ديناميات التعبير الجيني. يعرض مضان المجهري الوقت الفاصل بين وسيلة للحصول على كل القياسات وحيدة الخلية وتاريخهم. وقد تم تطوير تقنيات التجريبية والتحليلية المختلفة للحصول على وكميا أفلام من الفلورسنت التعبير الصحفي، وبالتالي إضفاء نظرة ثاقبة ميزات تنظيم الجينات (انظر 1 للمراجعة) مثل الاختلاف الخلية الى خلية 2،3، تشكيل persister البكتيرية 4، النسخ بدء واستطالة 5، النسخي انفجار 6،7، والاعتماد دورة الخلية 8،9، والتوريث 10. ومع ذلك، OBTينطوي aining سلسلة زمنية مضان وحيدة الخلية جودة تحديات تقنية كبيرة في زراعة أحادي الطبقة من الخلايا في بيئة يمكن السيطرة عليها والكمي في الإنتاجية العالية من الأفلام مضان المكتسبة. هنا، نحن تصف الإجراء إلى الحصول على وتحليل الأفلام مضان من S. الخباز مع عدم وجود الخبرة المطلوبة في خلية تصنيع جهاز الثقافة أو في مجال تطوير البرمجيات (الشكل 1).
أولا، نحن بالتفصيل بروتوكول سبيل المثال لتوليد مضان سلسلة أفلام وقت لالخميرة في مهدها التعبير عن واحد أو أكثر للصحفيين الفلورسنت. على الرغم من الغرف ثقافة ميكروفلويديك مخصصة تم بناؤها واستخدامها بنجاح 11-13 سابقا، ونحن نستخدم جهاز ميكروفلويديك المتاحة تجاريا من CellAsic (هايوارد، كاليفورنيا). حدود خلايا الجهاز إلى نمو أحادي الطبقة ويسمح التحكم المستمر للبيئة نضح. بروتوكول المجهري نقدم وسيلة بسيطة للحصول على fluorescقد تكون بديلا الأفلام جزأين من الخميرة في مهدها، ولكن أي تعديل بروتوكول التجريبية (جهاز الثقافة حسب الطلب، وظروف وسائل الإعلام البديلة، الخ.) مما أسفر عن بيانات الفيلم مضان مماثلة لخلايا الخميرة واحد.
المقبل، ونحن الخطوط العريضة لتحليل الأفلام باستخدام واجهة المستخدم الرسومية (GUI) المستندة إلى حزمة البرامج في MATLAB (ماثووركس، ناتيك، MA)، ويطلق عليها اسم واجهة المستخدم الرسومية لتحليل سريع من الإسفار السلاسل الزمنية (قلم الكتاب)، لاستخراج بيانات السلاسل الزمنية للخلايا واحدة. قلم الكتاب له سمات مشابهة لتنوعا، وحزمة برمجيات المصدر المفتوح 14 خلية-ID في بتجزئة وتتبع الخلايا واستخراج في كثافة مضان والمعلومات الهندسية. ومع ذلك، قلم الكتاب يوفر ميزات إضافية هامة. أولا، فإنه يوفر سهولة التحرير التفاعلية من تجزئة والنتائج تتبع للتحقق من دقة البيانات، بدلا من مجرد النابضة الإحصائية من آثار المنطقة ناشز بعد التحليل. وعلاوة على ذلك، فإنه يمتد إلى تحليل تلقائيا.Y المكلف النسب ونقاط دورة الخلية من الفائدة من الخميرة في مهدها. تحديد متى الأم وابنتها تقسيم لتشكيل منطقتين خلية مستقلة أمر حاسم لتحديد الخلية بأكملها (بما في ذلك أي الأم برعم متصل) القياسات طوال دورة الخلية 8. يتكون الجناح من ثلاث وحدات لإنجاز هذه المهام. شرائح أول المناطق الخلايا استنادا إلى التناقض بين الصور مجال مشرق مركزة وغير مركزة، ويسمح للمستخدم لتحديد واختبار بصريا المعلمات تجزئة. المسارين الثاني (. باستخدام بلير وتنفيذ MATLAB Dufresne لمن كروكر وآخرون IDL الروتينية، متاحة في: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) ويقيس مناطق الخلية عبر الزمن؛ تلقائيا بتعيين الأنساب، وتمكن الفحص البصري وتصحيح الخطأ. يتم تضمين واجهة المستخدم الرسومية بسيطة بالتآمر لاستعلام خصائص خلية واحدة. وحدة ثالث ينسب ظهور برعم والانقسام TIMES، وإخراج كاملة بيانات السلاسل الزمنية المحمولة، فضلا عن مشتقاتها المرة الأولى والثانية (كما تمت مناقشته في 9). وحدة تحليل إخراج البيانات كملف نصي الفضاء بفواصل لدراسة لاحقة في البرنامج الإحصائي للاختيار. وهكذا، فإن حزمة تمكن المستخدم لاستخراج بيانات السلاسل الزمنية ذات جودة عالية من خلال واجهة رسومية. وقد استخدمنا هذا الأسلوب لتقدير معدلات النسخ في الوقت الحقيقي في خلايا الخميرة في مهدها واحدة بوصفها وظيفة من دورة الخلية 9. بينما تم تحسين وحدات للخميرة في مهدها، المعلمات أو، إذا لزم الأمر، يمكن تكييفها رمز متاحة بحرية للكائنات الحية الأخرى وأنواع الصور. قد يكون الإنقسام، وتتبع، ونسب خوارزميات مهمة محددة لأنواع التصوير وتعيين الكائن في السؤال. ويمكن الاستعاضة عن خوارزميات القائمة، ولكن ما زالت تحتفظ واجهة المستخدم الرسومية التي تتيح التفتيش سهلة الاستخدام البصرية وتصحيح الأخطاء تجزئة وتتبع دائما أن occuR مع أي خوارزمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الحصول على أفلام المجهر الفلورسنت من خلايا الخميرة واحدة تنمو في غرفة ميكروفلويديك
- تطعيم 1 مل سائل الإعلام SC (وسائل الإعلام الاصطناعية تعريف مع 2٪ الجلوكوز وتكملة كاملة من الأحماض الأمينية) مع خلايا من لوحة المتزايد طازجة، واحتضان الثقافة بين عشية وضحاها ~ 16 ساعة على الأسطوانة عند 30 درجة مئوية. إعداد مثل هذه الثقافة أن المباراة النهائية OD ل 600Nm هو ~ 0.1 للنمو على مرحلة وسجل في وقت مبكر.
- تمييع ثقافة كاتب حسب الحاجة وتنمو 1 مل في أنبوب اختبار جديد ل6-8 ساعات إضافية لOD ل 600Nm = 0.1. وهذا يوفر خلايا تنمو في حالة مستقرة الغنية بالمغذيات في مناطق ذات كثافة مناسبة لتحميل في الجهاز ميكروفلويديك. (بدلا من ذلك، استبدال الخطوات 1،1-1،2 للإجراءات اللازمة لإعداد الخلايا كما هو مطلوب للتجربة.)
- إعداد Y04C لوحة الثقافة ميكروفلويديك من CellAsic: إزالة الحل الشحن؛ شطف الآبار مع الماء المعقم، وباستخدام نظام نضح تدفق ONIXالمياه من خلال الآبار 1-6 في 6 رطل لمدة 5 دقائق لمسح القنوات. ثم، وتدفق من التحميل بشكل جيد 8 في 6 رطل لمدة 10 ثانية (قناة التحميل ديها معدلات تدفق أعلى من ذلك بكثير، وينبغي أن يتم مسح منفصل).
- إزالة المياه من جميع الآبار واستبدالها مع 250 ميكرولتر SC في مدخل الآبار 1-6 و 50 ميكرولتر من ثقافة من الخطوة 1.2 في الخلية التحميل جيدا 8. (بدلا من ذلك، وضع وسائل الاعلام المطلوب في الآبار مدخل 1-6 للتجارب التي تتطلب التبديل بين الأوضاع المختلفة.)
- ختم متعددة ONIX إلى لوحة، وتبدأ فتيلة القنوات وغرفة الثقافة التي تتدفق من مدخل الآبار 1-6 في 6 رطل لمدة 2 دقيقة تليها لا يقل عن 5 دقائق في 6 رطل فقط من مدخل عقد جيدا وسائل الإعلام انطلاق لل التجربة. تتدفق باستمرار حتى هذه الخطوة 1.7.
- إعداد المجهر للتجربة. ونحن نستخدم زايس محوري Observer.Z1 widefield المجهر مع الكاميرا II EMCCD الخلفية مضاءة تتالي (Photometrics، توكسون، من الألف إلى الياء) والتجويف 200 قوس من المعدن هاليدمصباح (قبل العلمية، روكلاند، MA) لإثارة مضان الموهن إلى 10٪ لمنع photobleaching. لتقليل الوقت اللازم لاكتساب التحول في قنوات الفلورسنت متعددة، ونحن زوجين، مكعب مرشح الثلاثي ممر الموجة مزدوج اللون واحد لمرشحات الإثارة / الانبعاثات المناسبة لCFP، YFP، وطلب تقديم العروض (كروما تكنولوجيا كورب، الخوار فولز، VT، مجموعة 89006) تعيين في الخارجية، في التحول بسرعة عجلات تصفية (Ludl المنتجات الالكترونية، نوفاتو، CA).
- ضع بضع قطرات من السائل الغمر على الهدف (إذا لزم الأمر، ونحن نستخدم زايس خطة-امزيغ 63X/1.40 DIC النفط)، وتركيب جهاز ميكروفلويديك بشكل آمن في مرحلة مجهر مقلوب. ضمان لوحة لا تحول على الإطلاق في مرحلة في كافة مراحل التجربة يحسن تتبع الخلية خلال تحليل البيانات. نحن ببساطة بتصوير لوحة إلى جبل مرحلة لمنع تحول لها.
- التركيز على ثالث أقصى اليسار من الغرفة الثقافة الأول (حيث ارتفاع الغرفة هو أصغر) باستخدام واحدة من POSI جزءا لا يتجزأ منعلامات نشوئها. إيقاف تدفق من مدخل وسائل الإعلام بشكل جيد، وتدفق من خلية التحميل جيدا 8 في 6 رطل في 5 ثانية رشقات نارية. نقل المرحلة أن ننظر في جميع أنحاء غرفة الثقافة للخلايا. زيادة التحميل الوقت التدفق والضغط حتى يتم تحقيق كثافة الخلية المطلوبة، ولكن تجنب الحمولة الزائدة وانسداد الحاجز الموجود في أقصى اليسار حيث يدخل وسائل الإعلام الجديدة للغرفة.
- تبدأ تتدفق من مدخل سائل الإعلام التي تحتوي كذلك وسائل الإعلام ابتداء من الساعة 6 رطل.
- في MetaMorph (الأجهزة الجزيئية، سانيفيل كاليفورنيا) أو غيرها من التشغيل الآلي المجهر ومراقبة البرامج، إعداد اكتساب متعددة الأبعاد لالتقاط صور متعددة في مواقع متعددة المراحل مع مرور الوقت. تعيين عدد من والفاصل الزمني بين نقطة زمنية. اختر العديد من المناصب المرحلة مع ~ 10 خلايا لكل منها (أكثر سوف ازدحام بسرعة). نحن عادة استخدام 5 فترات دقيقة وصورة يصل إلى 16 وظيفة، والتي تتطلب كل ~ 11 ثانية لاقتناء في كل نقطة زمنية.
- إعداد اقتناء بحيث في كل مرحلة موقف في كل نقطة مرة البرنامج البريد و: التركيز على مجال مشرق ضوء المنقولة (BF) الصورة باستخدام MetaMorph الذي بني في طريقة ضبط تلقائي للصورة (تنفيذ ضبط تلقائي للصورة بوصفها مجلة مخصصة مكتوب في بداية كل موقف المرحلة توفر قدرا أكبر من السيطرة على دقة التركيز)؛ اكتساب BF صورة في +1 ميكرون إلى المستوى البؤري (FP)؛ الحصول على BF من التركيز (BFOOF) الصورة في ميكرون -4 إلى FP (استخدام المجلات المخصصة مكتوبة لتغيير التركيز على النحو المطلوب بين الصور)، والحصول على واحد الرمادي صورة لكل مراسل فلوري في FP باستخدام إعدادات الأمثل لاقتناء السريع مع الحد الأدنى من photobleaching.
- إذا لزم الأمر، يجب الحصول خلفية وتظليل الصور التصحيح لكل مراسل فلوري في منطقة من الغرفة الثقافة مع عدم وجود الخلايا.
- إعداد برنامج تدفق للتجربة في برنامج حاسوبي لمراقبة ONIX. تبدأ في وقت واحد برنامج الاستحواذ في MetaMorph وبرنامج التدفق في برنامج حاسوبي لمراقبة ONIX.
- في نهاية التجربة، تصحيح للأمم المتحدةحتى الخلفية والتظليل في الصور الفلورسنت (إذا لزم الأمر)، واختياريا الجمع بين. TIF الملفات لكل قناة صورة في كل موقف المرحلة إلى ملف فيلم STK (على سبيل المثال إنشاء BF، BFOOF، CFP، YFP والأفلام RFP للموضع 1 ).
2. وشكل قطعة بيانات لتتبع استخدام واجهة المستخدم الرسومية FormatData في MATLAB (الشكل 2)
- تشغيل ملف FormatData.m في MATLAB لفتح واجهة المستخدم الرسومية إدخال البيانات. في الجزء العلوي، حدد أو استعرض للوصول إلى المجلد الذي يحتوي على ملفات الصور لتعيين دليل البيانات، ومن ثم استخدام واجهة المستخدم الرسومية لتحديد أنواع البيانات وملفات الصور تسجيلها في التجربة.
- إلى اليمين، حدد زر الاختيار بجوار "الوقت الفاصل" للإشارة إلى أي نوع من التحليل لأداء. "الوقت الفاصل" سوف يعامل صورة سلسلة على شكل سلسلة الوقت (على سبيل المثال فيلم من خلايا تنمو في غرفة ميكروفلويديك). "ثابت" سوف يعامل كل سلسلة صورة ومجموعة من لقطات مأخوذة من السكان (مثل صور متعددة المتخذة في DIFمواقف مختلفتين على عينة شريحة واحدة). في هذا الإصدار قلم الكتاب، يمكن معالجة البيانات في الوقت الفاصل بين لشغل وظائف متعددة ولكن كملف منفصل لكل منصب (راجع الخطوة 2.14).
- ضع علامة في المربع للتسجيل الصورة لتصحيح الحركات مرحلة دقيقة عن طريق تحويل كل صورة في الأفلام لتقليل حركة الخلية واضح ضمن الإطار. ونحن نوصي بشدة هذا لأنه يحسن إلى حد كبير تتبع (الحد دليل كرأيشن المسار في وقت لاحق)، لكنه سيضيف عشوائية، "الضوضاء البيضاء" القيم بكسل لملء حيث تم تحويل الصور على الحدود. ويمكن أيضا أن يتم تحديده بعد مشاهدة الصور BF مجزأة في الخطوة 2.7 أو في أي نقطة حتى الخطوة 2.13.
- تحقق من "برايت حقل" مربع في لوحة "بيانات القنوات". انقر فوق "تحديد" إلى اليمين لتحميل الصور BF. ل*. TIF الملفات، حدد كافة الصور BF المقابلة لفيلم واحد عن طريق الضغط على مفتاح Shift أثناء اختيار، ثم انقر فوق "فتح". ل*. الملفات STK، ما عليك سوى اختيار مكدس BF من الفائدة. إذا كانت الصور هي النجاحالاعتراف الكامل، سيتم سرد أسماء الملفات في القائمة المنبثقة إلى اليمين في "بيانات معترف بها" لوحة. . ل* TIF الملفات، تأكد تظهر أسماء الملفات بالترتيب الصحيح (حفظ الملفات مع أسماء متسلسلة خلال الاستحواذ - BF_t001، الخ).
- تحقق من "حقل مشرق (من التركيز)" مربع واستخدم زر "اختيار" كما في الخطوة 2.4 لتحميل الملفات BFOOF، والتي سوف تكون مدرجة في الإطار إلى اليمين. (BFOOF الحصول عليها BF -4 ميكرون نسبة إلى FP في 63X شرائح جيدا.)
- تحقق من "خلية قناع" مربع. في "قناع المصدر" لوحة، حدد زر الاختيار بجوار "الجزء BF". دفع "معلمات" زر لفتح واجهة المستخدم الرسومية تجزئة. (بدلا من ذلك، حدد فيلم قناع قبل مجزأة عن طريق اختيار زر الراديو بجانب "ملف قناع اختر" زر، الضغط على هذا الأخير، واختيار الفيلم كما في الخطوة 2.4. في هذه الحالة، ليست هناك حاجة فيلم BFOOF، و يمكن انتقل إلى الخطوة 2.8.)
- تعيين المعلمات تجزئة مختلفة (أوصاف كل يمكن عرضإد عن طريق الضغط على "أوصاف المعلمة")، واختبار جودة تجزئة بالنقر على "اختبار" (الشكل 3). بنجاح مناطق مجزأة سوف تكون خضراء ذات حدود أرجواني. تأكد من استخدام شريط التمرير للتحقق من نقاط زمنية متعددة في الفيلم. عندما تجزئة غير مرضية، حدد "تم" للعودة المعلمات تجزئة إلى FormatData واجهة المستخدم الرسومية.
- تحقق من "لون الصور" مربع. أدخل اسم اللون لأول قناة صورة الفلورسنت في مربع التحرير النص، ثم اضغط على "إضافة وحدد" لتحميل الملفات اللون كما في الخطوة 2.4. سيتم إضافة اسم اللون إلى مربع القائمة على اليسار، وسيتم إضافة أسماء الملفات إلى الجدول على اليمين. إذا ارتكبت خطأ في تحميل الملفات اللون، حدد اسم اللون في مربع القائمة على اليمين وانقر على "إزالة اللون" لإزالة الملفات. كرر لكل قناة لون.
- إذا أقنعة المنطقة فرعي إضافي على أساس واحد من الألوان فلوري (على سبيل المثال fluorescently المسمى نواة → nuclوالمطلوب الأذن قناع المنطقة)، والتحقق من "اللون قناع" مربع. إذا لم يكن كذلك، انتقل إلى الخطوة 2.12. في "قناع المصدر اللون" لوحة، أدخل اسم قناع الإقليم الفرعي في مربع التحرير النص. اختيار لون من القائمة المنبثقة في "اللون قناع المصدر" لوحة (يتطلب لون قد اضيفت في الخطوة 6) ودفع "معلمات" لفتح عتبة اختبار واجهة المستخدم الرسومية.
- تضغط على الزر "لصناعة السيارات في عتبة" لتحديد تلقائيا عتبة باستخدام طريقة أوتسو في 15، وسوف صورة تسليط الضوء على المحميات فوق عتبة (الشكل 4). عتبة يمكن تعديلها يدويا باستخدام مربع التحرير. استخدام شريط التمرير لتأكيد عتبة هو مناسبة لجميع نقاط الوقت. عندما راض، ودفع "تم" للعودة إلى عتبة FormatData واجهة المستخدم الرسومية.
- دفع "إضافة والقطاع" لتوليد قناع المنطقة الفرعية باستخدام وحدة عتبة تطبيقها على الصور اللون المحدد. سيتم عرض اسم قناع لون ومصدر في الجدول إلى اليسار، مع R ذات الصلةأسماء الملفات ecognized تظهر في الجدول على اليمين. (بدلا من ذلك، دفع "إضافة وحدد" لتحميل الملفات قناع شبه المنطقة مسبقة الصنع.)
- في الجزء السفلي، تحديد أو استعرض للوصول إلى المجلد المطلوب ليتم استخدامها كدليل الحفظ.
- اضغط على "تنسيق البيانات" لقراءة ملفات الصور (باستخدام الرمز tiffread2.m التي وضعتها فرانسوا Nedelec، متاحة في: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 )، معالجة البيانات، وإنشاء * ملف. حصيرة في المجلد المحدد. سيكون هذا الملف بمثابة مدخلات إلى ProcessTimeSeries واجهة المستخدم الرسومية.
- كرر الخطوة 2،4-2،13 لمجموعة من الأفلام لكل منصب المرحلة.
3. خلايا المسار والأنساب عبر الزمن مع واجهة المستخدم الرسومية ProcessTimeSeries، والهوية الخوري وظائف بيتية النسب (الشكل 5)
- تشغيل ملف ProcessTimeSeries.m في MATLAB لفتح تتبع واجهة المستخدم الرسومية. تعيين المعلمات التالية بعد فتحواجهة المستخدم الرسومية:
- "ارتفاع الدائرة" ("ملف I / O" لوحة، اليسرى العليا) - وهذا يدل على ارتفاع للغرفة التي محاصرون الخلايا. يتم استخدامه كعقبة في تقريب حجم الخلية كما الإهليلجي 3D استنادا إلى محور الرئيسية والثانوية في المنطقة كما هو الحال في الخلية 8.
- "ميكرون / بكسل" ("ملف I / O" لوحة) - عامل التحويل لمعايرة بكسل لمسافة ميكرومتر في الصور بحيث يمكن حساب مساحة المقطع العرضي وحجم ميكرون في 2 و 3 ميكرون، على التوالي.
- "لوحة فلاتر" (أدناه "ملف I / O" لوحة) - مجموعة الحد الأدنى والحد الأقصى المعلمات لتصفية المناطق غير المرغوب فيه في القناع: "المنطقة" - منطقة المنطقة بالبكسل؛ "سفر الجامعة" - عامل الانحراف، أكثر دائرية كما → 0 ؛ "SF" - عامل الشكل، وأكثر دائرية كما → 1.
- انقر على زر "تحميل الصور" في "ملف I / O" لوحة، وحدد ملف البيانات *. حصيرة من الناتج الفائدة من قبل FormatData واجهة المستخدم الرسومية. يتم تطبيق القناع المنطقة (أي أقنعة ودون الإقليمية) لكل قناة لون، ويتم إجراء عدد من القياسات المختلفة (الجدول 1). ثم يتم حفظ ملف البيانات. (إذا تحميل ملف إلى ProcessTimeSeries من دورة سابقة، وسوف أسأل ما إذا كان يجب إعادة تشغيل التحليل من البداية تنبيه:. هذا وسوف يمحو أي كرأيشن المسار أنجزت بالفعل وعلاج البيانات كما لو كانت طازجة من FormatData GUI إذا إعادة تشغيل طريق الخطأ، اضغط Ctrl + بسرعة C في إطار الأوامر MATLAB لمنع * من تنسيق ملف سابقا. حصيرة من الكتابة فوق.)
- المقبل، وتتبع الخلايا. في لوحة "تعقب الخلايا" (بجانب لوحة "فلاتر")، تعيين المعلمات التالية:
- "ماكس التشرد" - أقصى مسافة بالبكسل خلية يمكن السفر بين الصور المتجاورة قبل أن توصف بأنها مختلفة من الخلايا. الإزاحة العالي يعني الخوارزمية يمكن حساب لخلايا تتحرك أكثر، لكنه يزيد أيضا من تعقيد مطابقة المناطق خلية في الحشود. نبدأ في 12 و نقصان في حالة حدوث خطأ في تتبع (راجع الخطوة 3.4).
- "طول الحد الأدنى" - الحد الأدنى لعدد الحوادث لخلية تتبع لاعتبار سلسلة بيانات صالحة. نحن نستخدم 1 إلى منع إزالة أي آثار حقيقية، ولكن يمكن زيادة هذا إذا كانت النتائج تجزئة في يدم طويلا، وآثار المنطقة زائفة.
- "ذاكرة الإطار" - الحد الأقصى لعدد إطارات متتالية منطقة الخلية يمكن أن تختفي وأن تعطى نفس ID عندما تعود. إذا كان يختفي لمدة أطول من "ذاكرة الإطار"، سيتم منحها هوية جديدة لدى عودته. نحن نستخدم 2 للسماح المناطق ينبغي تفويتها من قبل تجزئة لل2 إطارات قبل أن يعود.
- انقر فوق "خلايا المسار" لتعقب مناطق من إطار واحد إلى التالي باستخدام النقطة الوسطى المنطقة (بلير وتنفيذ MATLAB Dufresne من كروكر، جرير، والأسابيع IDL الروتينية، متاحة في: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) ، لتعيين الأنساب للبراعم التي تظهر حديثا، وحفظ البيانات. يتم تعيين تلقائيا الأنساب من قبل دقيقةimizing المسافات بين براعم المفترضة والأمهات المحتملين في كل إطار. (إذا ظهر خطأ في إطار الأوامر MATLAB بسبب "التوافقية صعبة"، وانخفاض "ماكس التشرد" وكرر تتبع.) تغيير المعلمات في النوافذ المنبثقة عند الضرورة للبيانات الخاصة بك.
- الإشراف المناطق وأخطاء في رقم أو تعيينات نسب مجزأة على نحو رديء باستخدام مختلف أدوات واجهة المستخدم الرسومية أو مفاتيح الاختصار (كما هو موضح في نافذة منبثقة عن طريق الضغط على زر فوق لوحة "معلومات مختارة الخلية").
- المنزلق، "السابق صورة"، "الصورة التالية" (CTRL + يسار / يمين) - استخدامها لعرض والتنقل بين الإطارات في صورة سلسلة.
- "صورة #" - يعرض عدد من إطار الصورة الحالية في المحاور اليسار واليمين. الانتقال إلى الإطار المحدد عن طريق كتابة رقم في الحق "صورة #" مربع التحرير.
- "دلتا الإطار" - يظهر الفرق في عدد الإطار بين محاور اليمنى واليسرى (Δ = حق - يسار).
- "إخفاء النص" (CTRL + T) - تبديل بين عرض معرفات خلية فيمحاور حق أم لا.
- "إخفاء تسميات" (CTRL + L) - تبديل بين عرض معرفات خلية في محاور اليسار أو لا.
- "قناع" القائمة المنبثقة - الاختيار بين عرض أي قناع، قناع الخلوية، أو أي أقنعة شبه المعرفة من قبل المستخدم للعرض في اللوحة اليسرى.
- "تراكب" القائمة المنبثقة (السيطرة 1-9) - اختيار عرض BF وطبقات اللون في الإطار الأيسر. عرض BF هو الوحيد الذي تبديل طبقة BF أو إيقاف تشغيله في كلا المحورين. تبديل بين عرض أم لا عن طريق اختيار اسم تراكب في القائمة مرة أخرى ("*" ترمز يتم عرض تراكب). CTRL +1 تبديل BF تراكب، مع 2-9 تبديل وتراكب اللون في النظام.
- "مجموعة الألوان" - استخدامها لتحديد لون للعرض تراكب. وهناك نافذة منبثقة الاستعلام التي قناة مضان لتعيين، ومن ثم سوف تظهر لوحة الألوان لتعريف المستخدم.
- "تعديل الأقاليم والمسارات" لوحة - التحكم هذه التغييرات تأثير على قناع المنطقة الخليوي ومعلومات التتبع:
- "مسارات التحديث" (CTRL + U) - استخدامها لإعادةتعيين معرفات الخلية. إذا تم تحديد أي خلايا في محاور الحق، فإن واجهة المستخدم الرسومية المطالبة هوية الخلية للتغيير. عندما يتم تغيير ID X إلى Y، وسيتم تغيير جميع الحالات المستقبلية من X إلى Y، وأية حالات مستقبل Y الحالي، وسيتم تبديل لاكس (أحيانا خلية واحدة ستتحول ذهابا وإيابا بين 2 معرفات، مرارا وتكرارا، وهذا ويرجع ذلك إلى تتبع تحاول استيعاب معرفات متعددة في المنطقة oversegmented بدلا من خطأ في وظيفة معرف التحديث.) خلايا متعددة يمكن اختيار وتغيير هوياتهم في وقت واحد، ولكن تأكد لإعطاء كل هوية فريدة من نوعها. لتعيين المنطقة لمعرف غير موجود في الملف الحالي، أدخل "0" وسيتم إنشاء واحد. استخدم Ctrl + W لمبادلة معرفات اثنين من الخلايا المميزة.
- "حذف المسارات المحددة" (على Ctrl + D) - استخدامها لحذف الخلية المحددة أو المناطق خلية متعددة في محاور حق الحالية الإطار. (إذا لم يتم اختيار الخلايا، سيدفع لID.) لحذف جميع الحالات من أثر معرف بشكل دائم، والتحقق من المربع المجاور للديوليته زر المسارات المحددة (سوف النص تغيير إلى "حذف الكل"). وهذا مفيد للتخلص من المناطق غير المرغوب فيه الثابتة، ولكن الاختيار الأول إطارات المستقبل للتأكد من هوية لا تبديل لخلية صالحة أو المنطقة برعم.
- "المناطق دمج" (CTRL + A أو M) - ينعم ويجمع بين المناطق الخلية. انقر فوق خلية أو خلايا في المحاور الحق في تحديد (المنطقة سوف تتحول حمراء إذا مختارة). ودمج في منطقة واحدة قريبة شكليا لملء الشقوق أو في مجموعات صغيرة في عداد المفقودين باستخدام عنصر على شكل قرص. سوف دمج اثنين أو أكثر من المناطق القريبة الجمع بينهما في منطقة واحدة وإعطاء أدنى ID إلى منطقة جديدة. وهذا مفيد لمناطق الإفراط في مجزأة (غالبا عندما يكون خلايا فجوات كبيرة).
- "ارسم المنطقة" - استخدام الماوس لرسم المنطقة في المحاور الحق حيث المطلوب والنقر المزدوج وحتى النهاية. توفير معرف فريد غير موجود في مجموعة البيانات (بين 1 و 65535). إلغاء حذف عن طريق الضغط على لوحة المفاتيح.
- "النسب تتبع" لوحة - بعد تتبع،يتم إنشاؤها تلقائيا تعيينات النسب. عندما تظهر المناطق الهوية الجديدة، يظهر معرف الخلية الجديدة باللون الوردي ويتم رسم خط أحمر في المنطقة الأم. مناطق جديدة كبيرة جدا ليكون براعم أو بعيدة جدا من الأمهات المحتملين تظهر باللون الأخضر ويتم تعيين هوية أم "نان" ("ليس رقما"، انظر الجدول 2). المناطق الموجودة عند نقطة مرة الأولى يكون لديك معرف أم "0". لإصلاح التعيينات الفردية، أدخل الأم ومعرفات برعم في مجالات تحرير النص وانقر على زر "فيكس". لمحو الأم الخلية، أدخل "0" كما أمه. وهناك طريقة أسرع هو اختيار منطقتين في الصورة الصحيحة واضغط على Ctrl + F. هذا وسوف تلقائيا تعيين المنطقة القديمة والأم والمنطقة أجدد كابنة، في حين محو أي تعيينات الأم الموجودة سابقا للخلية ابنة. تنبيه: بالنقر على "حساب الأنساب" في أي وقت وسوف حساب جميع التخصيصات النسب، بما فيها تلك التي قام المستخدم من تنسيق سابقا.
- "الخلية المحددة المعلومات" لوحة - "الحصول على INFO "سيتم عرض بعض القياسات من مناطق مختارة في محاور الحق." القياسات ... "يسمح للمستخدم لتحديد القياسات التي يتم عرضها (وكذلك تحديد القائمة الافتراضية لعمليات أخرى مثل" تصدير البيانات "). ويمكن استخدام لتحديد هويات والأنساب (على سبيل المثال إذا كانت الخلية X لديه برعم في الزمن t، فإنه على الأرجح لا يملك برعم آخر في الوقت t + 5 دقائق) الصحيح.
- "حفظ التغييرات" (CTRL + S) - تحديث الملف * حصيرة لتعكس التغيرات المستخدم. تستخدمها بشكل متكرر (ليس هناك تراجع وظيفة)!
- "إنشاء مؤامرات" - يفتح GeneratePlots واجهة المستخدم الرسومية. تستخدم لرسم المعلومات بسرعة متغير اختيارها والعمليات الحسابية البسيطة للمناطق وحيدة الخلية أبرزت في المحاور اليمنى من ProcessTimeSeries واجهة المستخدم الرسومية، يعني، أو الوسط من جميع المناطق في كل إطار. وهذا يمكن أن GUI حساب المشتقات الأولى الخام، ولكن تأكد من تحديد الفاصل الزمني الصحيح في أعلى اليسار. قد تكون المؤامرات الإخراج إلى الرقم لإنقاذ عن طريق الضغط على "إنشاء الشكل".
- إلى الإشراف البيانات بشكل صحيح: أي دمج المناطق oversegmented؛ حذف أي المناطق التي لم الاستيلاء على خلية كاملة؛ تأكد يتم تعيين بشكل صحيح العلاقات الأم برعم (يظهر خط أحمر بينهما في وقت ظهور برعم، عندما ID برعم وردي، انظر الجدول 2)، والقضاء على أي معرفات الخضراء عن طريق تحديد الهوية، تعيين المنطقة الأم، وتكليف أي الأم ("0")، أو حذف المنطقة. ستتم إضافة البيانات برعم إلى أن الأم أثناء التحليل النهائي لذلك لا دمج المنطقة برعم إلى أمه (ذلك سيؤدي الى عدم دقة تقدير حجم).
- تفقد البصر البيانات لكل إطار حتى الوقت الأخير من الفائدة، ولكن ليس مطلوبا من السلسلة الزمنية بأكملها إذا لم تكن تستخدم الإطارات في وقت لاحق.
- تأكد من حفظ التغييرات.
- كرر الخطوات من 3،1-3،7 لملف *. حصيرة لكل منصب المرحلة.
4. تصدير البيانات لتحليل
- ببساطة تصدير قياسات المنطقة الخام لكل خلية من خلال تيمه، ودفع "تصدير البيانات". يمكن تحديد القياسات من الاهتمام في واجهة المستخدم الرسومية التي يتم فتحها، وأنها سوف يكون الناتج في بفواصل الفضاء *. TXT ملف مع أسماء المتغيرات ورؤوس الأعمدة.
- لتحليل السلاسل الزمنية للخلايا كلها على مر الزمن، وحساب المعلومات دورة الخلية، واتخاذ المشتقات، ودفع "تحليل السلاسل الزمنية". وهناك نافذة مفتوحة تسمح اختيار قياسات المصالح والمدخلات من المعلمات تحليل (الشكل 6).
- أدخل نقطة للمرة الأخيرة من تنسيق في واجهة المستخدم الرسومية (سيتم تجاهل جميع الأطر اللاحقة). وتجانس ودورة الخلية معلمات التعيين الافتراضي تعمل بشكل جيد لدينا فرداني وسلالات مضاعفا تصويرها في فترات 5 دقائق، ولكن هذه قد تحتاج إلى أن تختلف حصول على أفضل النتائج. (تأكد من أن القيم المعلمة المناسبة من قبل يدويا تحديد الوقت في مهدها، وتقسيم لمجموعة بيانات الاختبار ومقارنة أداء خوارزمية الآلي.)
- عندما يتم تعيين كافة المعلمات، ودفع "تحليل" إلى:
- سلبياتtruct صفائف لكل قياس الخام وطرح الخلفية (التي تقاس على أنها متوسط كثافة المنطقة غير خلية من الإطار الأول في كل فيلم الفلورسنت، أو يمكن أن تكون محددة لحساب متوسط تألق ذاتي لكل بكسل الخلية).
- تناسب شريحة تمهيد للمقاييس المحددة للقضاء على الضوضاء قياس عالية التردد (كما تمت مناقشته في 9).
- تحديد تلقائيا ظهور برعم ومرات انقسام الخلايا لكل خلية على أساس التغيرات في المنحدر من سلسلة زمنية كما نوقش في حجم 9. وبعد ذلك تضاف القياسات برعم لقياسات الأم بين ظهور وتقسيم كل دورة لسلسلة زمنية خلية كاملة متجاورة. كما سيتم احتساب تطبيع تقدم دورة الخلية تتراوح 0-2 من شعبة إلى شعبة.
- تناسب شريحة تجانس لاتخاذ مستقرة شارع 1 و 2 المشتقات الثانية من القياسات المحددة. (لغرض مشتقات محددة جيدا، السلاسل الزمنيةمصنوعة المستمر عبر تقسيم عن طريق تحويل البيانات لدورة الخلية التالية لتلبية نقطة النهاية للدورة السابقة.)
- الناتج الخام والسلاسل الزمنية ممهدة لجميع المناطق، وكلها ممهدة الخلية، مستمرة، وسلسلة زمنية متباينة كصفيف لكل قياس. العنصر الأول هو مؤشر للون خلفية الطرح، والباقي من الصف الأول يحمل معرفات الخلية، والباقي من العمود الأول هو رقم الإطار، والعناصر المتبقية عقد السلسلة الزمنية لكل خلية واحدة في العمود مع كل صف المقابلة لإطار في العمود الأول. وهناك مجموعة مماثلة من دورة الخلية سلسلة زمنية التقدم والمعلومات النسب تكون أيضا الإخراج. مجموعة "LineageArray" يحتوي على جدول مع كل صف يمثل العلاقة بين الأم وبرعم، وأول من خلال أعمدة الخامسة هي هوية الأم، برعم ID، إطار المنطقة برعم الأول، إطار في مهدها يقدر، والإطار تقسيم المقدرة. ويتم تصدير البيانات إلى ملف *. حصيرة (ملف البيانات MATLAB).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وهناك تجربة أجريت بنجاح وتحليل السلاسل الزمنية تسفر في الغالب المستمر للخلايا كل واحد مع تعيين واقعي ظهور برعم والأوقات الانقسام. وكمثال على ذلك، أجرينا البروتوكول أعلاه مع سلالة الخميرة فرداني إبداء نسخة متكاملة من بروتين فلوري أزرق (CFP) مدفوعا التأسيسي ADH1 المروج للاطلاع على كيفية نمو والتعبير العالمية قد تختلف مع مرور الوقت في الخلايا واحد (الجدول 4، Y47 ). ركضنا تحليل السلاسل الزمنية للحصول على خلية كاملة (7A الشكل) القياسات على مر الزمن، والاعتماد على دورة الخلية يظهر لكل من حجم والتعبير كما وجدت في 9. بعد تشكيل برعم، فإن إجمالي حجم المختلطة (الأم + برعم) يزيد بسرعة أكبر من ذي قبل ظهور برعم (بما يتفق مع 8،16)، في حين تركيز البروتين، أو متوسط الشدة، ويقلل قليلا (أرقام 7B و 7C). ارتفاع في التكامل المشتركالبروتين تيد (تركيز X حجم في هذه الحالة) يسرع أيضا بعد في مهدها (الشكل 7D). مقارنة مع المنطقة الأم وحدها (الشكل 7B & D)، وهذه النتائج تدل على أهمية إدماج صحيح المساهمات برعم لقياس خلية كاملة وتسليط الضوء على الحاجة إلى تشكيل برعم السليم ومهام تقسيم الوقت. ونحن وأفادت 9، يمكننا استخدام السلاسل الزمنية المتباينة لحساب حظية مستوى مرنا النسبية M (T) ومعدل النسخ A (ر)، والتي على حد سواء زيادة أيضا بعد في مهدها (7E الشكل و7F):
القدرة على توليد المشتقات مستقرة وقت السلاسل الزمنية قياس يفيد أيضا دراسات الحركية. نحن نستخدم سلالة الخميرة إبداء، عامل النسخ خيالي ملاحظتها مع النشاط النسخ للتحويل (الجدول 4، Y962). يتم التحكم في عامل النسخ ماجستير في مسار المجاعة الفوسفات، Pho4p، من خلال توطين نكليوتيد-حشوية استجابة لخارج الخلية concentratio الفوسفات N 18. استبدلنا المجال الحمض النووي ملزم من Pho4p مع tetR، الذي يربط تيت الاوبرون (تيتو)، وتنصهر C-عضال عامل النسخ الجديدة لبروتين فلوري الصفراء لإنشاء Pho4-tetR-YFP 9. عن طريق التحول على مستوى الفوسفات في وسائل الإعلام نضح، لم نتمكن ثم تبديل تعبير عن CFP متكاملة يقودها المروج الاصطناعية تتألف من 7 مواقع تيتو ملزم علىالثانية في الحد الأدنى من المروج CYC1 (7xtetOpr-CFP). ويبين تحليل السلاسل الزمنية عندما يكون موضعيا عامل النسخ إلى النواة (باستخدام مزيج من كراسة الشروط وNhp2p البروتين النووي لإنشاء submask الذرية ومقرها RFP كما في الخطوة 2،9 حتي 10)، وعندما يبدأ هذا الجين الهدف ويتوقف النسخ (الشكل 8). من خلال تحليل سلسلة مشتقة مع مرور الوقت، وأوقات التفعيل والتعطيل من المروج هدف في كل خلية واحدة يمكن أن يستدل حتى عندما يكون تركيز لمراسل الفلورسنت مستقرة عالية. الجدول 1. قياس تسمية متغير في ProcessTimeSeries واجهة المستخدم الرسومية. الجدول 2. ID الخلية رمز اللون للحصول على مركز الاحالة النسب. الجدول 3. قلم الكتاب ملف الأوصاف. الجدول 4. سلالات الخميرة المستخدمة في هذه الدراسة. 
حيث P (T) هو البروتين الكلي في الوقت t وγ M هو معدل تدهور مرنا 0.04 دقيقة -1 
الشكل 1. التخطيطي من البروتوكول. يصف البروتوكول خطوات ل1) ثقافة ميكروفلويديك، 2) مضان، الوقت الفاصل بين المجهري، 3) تحليل البيانات، و 
الشكل 2. FormatData واجهة المستخدم الرسومية. يستخدم واجهة لاستيراد، والشكل، وبيانات الصورة شريحة لإجراء العمليات الحسابية في وقت لاحق والفحص البصري. أرقام تشير إلى خطوة بروتوكول المقابلة لكل عنصر. انقر هنا لعرض أكبر شخصية . 
الشكل (3). SegTest واجهة المستخدم الرسومية. يستخدم واجهة لاختبار الجزء الخلية المعلمات أوجه وتأكيد بصريا دقة تجزئة كما في الخطوة 2.7. 
الشكل 4. ColorThreshTest واجهة المستخدم الرسومية. يستخدم واجهة لاختبار عتبة كثافة اللازمة لإنشاء قناع التحت خلوية من قناة مضان اختار كما في الخطوة 2.10. 
الشكل 5. ProcessTimeSeries واجهة المستخدم الرسومية. يستخدم واجهة لقياس وتتبع، وفحص البصر، وتحرير المناطق الخليوي وتعيينات النسب. أرقام تشير إلى خطوة بروتوكول المقابلة لكل عنصر.الهدف = "_blank"> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية. 
الشكل (6). AnalysisParams واجهة المستخدم الرسومية. يستخدم واجهة لإدخال المعلمات المطلوبة لتحليل السلاسل الزمنية كما في الخطوات 4.3 و 4.4. 
الرقم 7. السلاسل الزمنية وحيدة الخلية من الخميرة فرداني معربا عن ADH1 PR-CFP في الثقافة ميكروفلويديك على مدى عدة أجيال. (A) يتم عرض حقل مشرق (الصف العلوي) وCFP (الصف السفلي) الميكروسكوب عند نقاط الوقت المشار إليه لخلية في كافة مراحل التجربة . للخلية الأم مجزأة (الازرق outliشمال شرق) والبراعم والخمسين (مخطط الأخضر)، ويرد على خلية كاملة متجاورة في أحمر. تم ممهدة الأم الخام وبرعم (B) حجم و(C) السلاسل الزمنية تركيز البروتين لإزالة الضوضاء القياس، و(D) تم احتساب المتكاملة CFP مضان بوصفها نتاجا لحجم وتركيز. يتم توسيع خلية كاملة (الحمراء) تتبع شعبة الماضية للحفاظ على ما مجموعه تشغيل التي هي سهلة لتناسب إلى المفتاح تجانس اختلاف عبر الانقسامات (B و D). يتم احتساب (E) مستوى مرنا النسبية و(F) معدل النسخ الآنية باستخدام المعادلات (1-2) وتناسب شريحة في (D). 
الرقم 8. المروج النسخ استجابة معدل لنكليوتيد-حشويةمكوكية من انصهار Pho4-YFP في خلايا الخميرة واحد. (A) وترد الميكروسكوب من أربع قنوات الاستحواذ المشار إليه لخلية مع تحويل YFP تنصهر Pho4-tetR transactivator أن (B) يموضع إلى النواة RFP-ملحوظ في استجابة إلى الأقل الفوسفات و (C) محركات الأقراص التعبير عن مراسل 7xtetOpr-CFP. (D) وتغيرات سعر النسخ الاستدلال مع التعريب في المتوسط (الخط الأسود) وعلى مستوى خلية واحدة (أحمر وخطوط قرمزي، حيث يمثل الأحمر متجاورة المنطقة الخلية المبينة باللون الأحمر في A). انخفاض حاد في التعبير CFP في B تتزامن مع انقسام الخلية عندما يتم فقدان بعض البروتين إلى الخلية ابنة. اسم القياس وصف وقت صورة إطار عدد منطقة مجموع عدد سبكسل و تضم المنطقة حجم (4/3) πabc، حيث أ = ½ طول محور رئيسي من المنطقة، ب = ½ طول المحور البسيط، وج = ب أو ½ "ارتفاع الدائرة" (أيهما أصغر) (X) _ (Y) يعني يعني كثافة بكسل لقناع المنطقة (Y) في قناة اللون (X) (X) _ (Y) متوسط كثافة بكسل وسيطة لقناع المنطقة (Y) في قناة اللون (X) (X) _ (Y) STD الانحراف المعياري من شدة بكسل لقناع المنطقة (Y) في قناة اللون (X) (X) _ (Y) الربعية المدى الربيعي من شدة بكسل لقناع المنطقة (Y) في قناة اللون (X)، 75 ال المئين - 25 تشرين قيمة المئين (X) _ (Y) T20pct يعني كثافة لأفضل 20٪ من كثافة بكسل لقناع المنطقة (Y) في قناة اللون (X). استخدمفول بالمقارنة مع قياس المقبلة لتحديد توطين التحت خلوية من دون submask. (X) _ (Y) B80pct يعني كثافة لأسفل 80٪ من كثافة بكسل لقناع المنطقة (Y) في قناة اللون (X). مفيد في المقارنة مع القياس السابقة لتحديد توطين التحت خلوية من دون submask. (X) _ (Y) M50pct يعني كثافة للوسط 50٪ من كثافة بكسل لقناع المنطقة (Y) في قناة اللون (X) (X) _cellint مضان متكاملة من قناة لون (X) (X تعني شدة بكسل حجم) لخلية كاملة (الأم وأي برعم متصل) (Z) الخام سلسلة زمنية الخام إخراج البيانات عن طريق "تحليل السلاسل الزمنية" لمتغير (Z) (Z) السلس خدد ممهدة الوقت الخام سلسلة إخراج البيانات عن طريق "تحليل السلاسل الزمنية" لمتغير (Z) (Z) كامل خلية كاملة (مأخرى + المرفقة برعم (Z) Rawsmooth) الوقت سلسلة إخراج البيانات عن طريق "تحليل السلاسل الزمنية" لمتغير (Z) (Z) للمقاولات قدمت بيانات السلاسل الزمنية خلية كاملة المستمر في الانقسامات ("مجموع تشغيل") خرج عن طريق "تحليل السلاسل الزمنية" لمتغير (Z) (Z) WhSmooth خدد ممهدة (Z) الوقت خلية كاملة سلسلة إخراج البيانات عن طريق "تحليل السلاسل الزمنية" لمتغير (Z) (Z) تي المرة الأولى المشتقة من شريحة ممهدة (Z) الوقت خلية كاملة سلسلة إخراج البيانات عن طريق "تحليل السلاسل الزمنية" لمتغير (Z) (Z) d2dt2 مرة الثانية المشتقة من شريحة ممهدة (Z) الوقت خلية كاملة سلسلة إخراج البيانات عن طريق "تحليل السلاسل الزمنية" لمتغير (Z) لون معرف الخلية وضع النسب أصفر الأم المسندة وردي برعم جديد (خط أحمر الانتباه إلى الأم المخصصة) أخضر لا الأم المسندة اسم الملف وصف FormatData.m إدخال البيانات واجهة المستخدم الرسومية التي صيغ الأفلام وشرائح BF الصور للتجهيز من قبل ProcessTimeSeries.m FormatData.fig FormatData GUI نافذة تخطيط BFsegment.m وحدة تجزئة BF، مع extractregions2.m وsegmentregions.m SegTest.m تجزئة اختبار الجودة واجهة المستخدم الرسومية SegTest.fig SegTest GUI نافذة تخطيط extractregions2.m العنصر الأول من وحدة تجزئة BF لتحديد المناطق segmentregions.m العنصر الثاني من وحدة تجزئة BF إلى مناطق خلية منفصلة ونظيفة color2submask.m مضان القائم على وحدة تجزئة submask ColorThreshTest.m مضان القائم على عتبة قناع اختبار واجهة المستخدم الرسومية ColorThreshTest.fig ColorThreshTest GUI نافذة تخطيط tiffread2.m مقتطفات البيانات *. TIF أو *. الملفات STK لاستخدامها في MATLAB imalign.m تسجيل الصور باستخدام 2D عبر الارتباط ProcessTimeSeries.m معالجة البيانات واجهة المستخدم الرسومية التي تتعقب المناطق، يعين الأنساب، وتمكن تصحيح الأخطاء البصرية. يوفر أيضا القدرة على التخطيط القائم على واجهة المستخدم الرسومية وإخراج البيانات خلية كاملة السلاسل الزمنية ProcessTimeSeries.fig ProcessTimeSeries GUI نافذة تخطيط cleanMask.m يزيل قناع المناطق استنادا إلى معلمات في واجهة المستخدم الرسومية ProcessTimeSeries track.m يتتبع المناطق الخلية يعتمد على النقطة الوسطى المنطقة OptimizeLineages.m وحدة الاحالة النسب يحدد العلاقات الأم برعم الأمثل على أساس المسافة المادية والأحداث في مهدها الماضي والمستقبل getClosestObjects.m يجد خلايا جارة لكل معرف الخلية الجديدة (برعم) SelectVariables.m قياس اختيار واجهة المستخدم الرسومية لاختيار متغيرات الفائدة SelectVariables.fig SelectVariables GUI نافذة تخطيط GeneratePlots.m التآمر واجهة المستخدم الرسومية للبيانات في نافذة ProcessTimeSeries GeneratePlots.fig GeneratePlots GUI نافذة تخطيط AnalyzeCellSeries.m وحدة تحليل السلاسل الزمنية يحدد وقت انقسام الخلايا وإخراج قياسات خلية كاملة كما هو موضح في النص assignDivisionsInf2.m يعين برعم برعم ومرات انقسام الخلايا AnalysisParams.m خلية الوقت سلسلة تحليل المدخلات المعلمة AnalysisParams.fig AnalysisParams GUI نافذة تخطيط ID سلالة النمط الجيني (القائم على W303) مرجع Y47 MAT على leu2 :: ADH1pr-CFP-hisG :: URA3 :: kanR :: hisG 19 Y962 MAT على ADE + NHP2 :: RFP-NAT spl2Δ :: LEU2 pho4 :: TRP1 pho84Δ:: klura3 phm4 :: HIS3MX6 leu2Δ :: TEF1m7pr-PHO4ΔP2-tetR-cYFP URA3 :: 7xtetOpr-CFP 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف البروتوكول أعلاه طريقة بسيطة للحصول على وتحليل مضان بيانات السلاسل الزمنية مع خبرة محدودة في على microfluidics أو في مجال تطوير البرمجيات. فإنه يسمح احد للحصول على الوقت الفاصل بين الأفلام مضان من خلايا الخميرة واحد؛ استخراج حجم الخلية ذات الصلة والقياسات التعبير؛ تتبع الخوري والواجبات النسب، وتحليل سلوك الخلايا الكاملة بمرور الوقت باستخدام جهاز الثقافة ميكروفلويديك المتاحة تجاريا والمستخدم الرسومية تنوعا واجهة (GUI). في حين تم اقترب التجريبية، وتجزئة، وتتبع الخطوات بطرق مختلفة من قبل 11،13،14، تم تصميم الإجراء أعلاه إلى جعل هذه التقنيات للوصول إلى مجموعة فرعية أوسع من المجتمع البيولوجيا. في حين تم تحسين الإجراء أعلاه لجهاز الثقافة ميكروفلويديك وجه الخصوص، يمكن تكييفها التحليل الشامل لأجهزة مماثلة قبالة الجاهزة للاستخدام تكنولوجيات ثقافة ميكروفلويديك تصبح أرخص وأكثر للتخصيص. Fundamentally، وتجزئة والخوارزميات قياس المنطقة التي نتبعها هي مماثلة إلى الأساليب القائمة 13،14، ولكن البرنامج قلم الكتاب يضيف القدرة على الإشراف بصريا تتبع المنطقة والواجبات النسب وتعيين مراحل دورة الخلية بدقة. كل من هذه الميزات تعتبر حاسمة بالنسبة لحساب دقيق لمشتقات الوقت من سلسلة البيانات.
هناك العديد من الخطوات في البروتوكول الذي يؤثر بشكل كبير على جودة بيانات السلاسل الزمنية الناتجة عن ذلك. والحمولة الزائدة في البداية دائرة الثقافة مع الخلايا خفض نضح في غرفة (ملحوظة، ولاسيما في التجارب الحركية حيث غرفة التحديث الوقت مهم)، وسوف يحدث فرط في أثناء وقت التجربة في وقت سابق. يمكن أن يكون أفضل تجنب هذا من خلال البدء مع انخفاض ضغط تحميل خلية لأقصر الأوقات، وزيادة واحدة أو كلا تدريجيا حتى يتم التوصل إلى كثافة الخلية المناسبة. اختيار موقف المرحلة للتصوير هو الإعتبار ذات الصلة، وبنفس القدر من الأهميةeration. معرفة الوقت مضاعفة من سلالة، خطة كيفية العديد من الخلايا ستكون في إطار الصورة مع مرور الوقت وتوقع كيف سيؤثر الازدحام نشر وسائل الاعلام. عشر خلايا فرقت سوف تنمو لتصبح عشرة microcolonies، ولكن سوف عشرة الخلايا مجمعة في البداية معا تنمو لتصبح واحدة، مستعمرة كبيرة (لاحظنا القيود نشر المواد الغذائية في 6 رطل إلى وسط مستعمرة عندما يكون أكبر من ~ 14 خلايا في القطر) . الجهد الإضافي في الخطوات بروتوكول المنبع يسهل أيضا كرأيشن البيانات يدويا في وقت لاحق، ويحسن من سلسلة وقت الإخراج. ضمان تم تركيب لوحة بحزم في مرحلة واستخدام الخيار تسجيل الصورة في FormatData GUI إلى حد كبير في تحسين دقة في تتبع تلقائيا الخلايا واحد عبر الزمن. قضاء بعض الوقت في اختيار المعلمات تجزئة أفضل الممكن أيضا أن تقلل من عدد الأخطاء التي تتطلب الاهتمام. البرنامج يعمل بشكل أفضل مع تتبع oversegmentation طفيف من المناطق الخلية بدلا من undersegmentation لأن remerging علىالخلية الانقسام هو مهمة أسهل من رسم خطوط لتقسيم المناطق، ولكن زيادة oversegmentation يزيد الأخطاء في تعيينات النسب بسبب وجود زائف، مناطق جديدة. وعلاوة على ذلك، تأكد من أن جميع العلاقات الأم برعم يتم تعيين بشكل صحيح بحيث القياسات لخلية كاملة ستكون دقيقة. إذا غاب برعم من قبل تجزئة أو ينمو خارج حدود الصورة، والنظر في إنهاء سلسلة البيانات الأم لمنع نتائج زائفة. ويتم ذلك بسهولة عن طريق تغيير المنطقة الأم إلى معرف فريد (أدخل معرف "0") في إطار الخاطئة، واستخدام "حذف جميع" ميزة لإزالة كافة مثيلات مستقبل الهوية الجديدة. اهتمام وثيق لهذه الخطوات سوف تزيد بشكل كبير من دقة البيانات الخام السلاسل الزمنية.
لتأسيس تفسير صحيح للإخراج البيانات عن طريق الضغط على "تحليل السلاسل الزمنية"، نوصي بضعة استفسارات إضافية. تحقق من ظهور برعم والأوقات شعبة بدقة تحديدها على أساس المستخدم inpuتي المعلمات. تسجيل يدويا مرات في مهدها، وتقسيم لمجموعة فيلم اختبار ومقارنة النتائج الخوارزمية. لتقدير بصريا اكتمال الانقسام السيتوبلازمي الوقت بين الأم وابنتها، والبحث عن حدودهما لضيق وتلقي بظلالها الداكنة. (ملحوظة: سلالة اختبار مع الإيدز النواة fluorescently بعلامات في مراقبة الخط من وقت تقسيم أسلوب آخر سيكون لfluorescently-MARK غشاء البلازما والبحث في الفجوة بين الخلايا الأم وابنتها لإغلاق). أيضا، تحقق ما إذا كان يتم احتساب مجموع مضان لخلية أفضل حيث بلغ متوسط كثافة المنطقة مضروبا في حجم (عندما ينشأ ضوء استولت عليها من شريحة رقيقة من الخلايا) أو كما مضان متكاملة على المنطقة (عندما ينشأ ضوء استولت عليها من الخلية بأكملها). إذا كان الوضع مضان عبر خلية يطابق منحنى شبه القطع الناقص التي وصفها المحاور الرئيسية والثانوية في المنطقة 7، وعلى ضوء القبض تنبع من الخلية بأكملها، ومجموع مضان SHOULD يحتسب كنسبة (يعني كثافة) × (منطقة). في حالتنا في 63X مع عمق المجال أقل بكثير من ارتفاع الخلية، والوضع مضان مسطح نسبيا ويتم احتساب مجموع مضان باسم (متوسط الكثافة) × (حجم). وهناك اعتبار آخر هو photobleaching من fluorophore. البرنامج لا تنظر photobleaching في التحليل، وبالتالي فإن الوقت مضان إخراج سلسلة لا يمثل سوى مراسل ملاحظتها. تعتمد عمليات Photobleaching اعتمادا كبيرا على إعدادات اقتناء والفاصل الزمني تستخدم للحصول على صور مضان، وطبيعة من fluorophore، ومختلف العوامل الأخرى تجربة محددة. Photobleaching أيضا قد لا تكون وصفا جيدا بنسبة بسيطة، من الدرجة الأولى التعبير معدل، والذي يمنع خوارزمية العام لعلاجه. ولذلك، فإننا لا حساب لphotobleaching في إخراج السلسلة الزمنية، ولكن يمكن استخدام الطريقة التحليلية لقياس حركية هذه العملية للمساعدة في تفسير للمستخدم. وأخيرا، اختيار smoothiالمعلمات نانوغرام مناسبة للسلاسل الزمنية المرصودة. من الناحية المثالية، فإن المفاتيح تجانس قضاء على الضوضاء قياس عالية التردد مع الحفاظ على السمات الحقيقية في البيانات. المعلمات المطلوبة لتحقيق هذه تعتمد على خصائص سلسلة زمنية معينة ويمكن أن تختلف بين التجارب.
وكان الهدف من البرنامج أن يكون مرنا لتحليل مختلف البيانات المجهري مضان الوقت الفاصل. يمكن إدراج أي عدد من قنوات اللون وأي يمكن استخدامها لإنشاء قناع المنطقة الفرعية. في حين أن خوارزميات تعمل بشكل جيد لأفلام من خلايا الخميرة في مهدها، وكثير من وظائف ينبغي أن تمتد إلى أفلام من الكائنات الحية الأخرى كذلك. قياس المنطقة (باستثناء وحدة التخزين)، وتتبع، وكرأيشن تعتمد فقط على قناع الخلية، وبالتالي فهي قابلة للتكيف. تجزئة، وتعيين النسب، وتحديد انقسام الخلايا، والوقت وحدات تحليل سلسلة يمكن تعديلها بشكل مستقل لتلائم الاحتياجات المحددة. وبالإضافة إلى ذلك، بدلا من استخدام SE شملتوحدة gmentation، يمكن لفيلم قناع قبل مجزأة تكون المدخلات، ويمكن أن تكون بديلا على النقيض من المرحلة أو التدخل التفاضلية على النقيض من الصور لحقل مشرق. ويمكن بعد ذلك اجهات أن تستخدم في المقام الأول لتتبع والإشراف ID والواجبات النسب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر إميلي جاكسون، جوشوا Zeidman، ونيكولاس رين للتعليقات على البرنامج. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل GM95733 (إلى NM)، ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا BBBE 103316 أموال بدء التشغيل (لNM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Y04C Yeast Perfusion Plate | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Microfluidic Perfusion Platform | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Cascade II EMCCD camera | Photometrics | ||
| Lumen 200 metal-halide arc lamp | PRIOR Scientific | ||
| Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set | Chroma Technology Corp | set #89006 | Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato) |
| MAC 5000 controller and filter wheels | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | 64-bit version handles large data files better than 32-bit |
References
- Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).
- Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332 (6028), 472-474 (2011).
- Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).
- Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. , Submitted (2013).
- Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5 (9), e239 (2007).
- Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024 (2005).
- Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).
- Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3 (1), e1468 (2008).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).
- Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).
- To, T. -L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).
- O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271 (5246), 209-212 (1996).
- Raser, J. M., O'Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).
