Summary
我々は、単一セルの時系列データを抽出するために蛍光成長酵母細胞の顕微鏡ムービー、GUIベースのソフトウェアパッケージを取得する単純なプロトコルを提示する。分析では、目視検査と追跡対象データの手動キュレーションと統合され自動化された系統と分裂時間の割り当てが含まれています。
Abstract
蛍光タイムラプス顕微鏡は、単一細胞レベルでの多くの生物学的過程の研究の強力なツールとなっています。具体的には、遺伝子発現の時間依存性を示すムービーは、その規制のダイナミクスへの洞察を提供するが、単一細胞の蛍光ムービーを取得し、分析する多くの技術的課題がある。ここでは、そのようなデータを生成するために市販のマイクロ流体培養装置を用いた単純なプロトコル、およびMATLABベースのグラフィカル·ユーザー·インターフェース（GUI）系蛍光画像を定量化するためのソフトウェアパッケージを説明する。ソフトウェアセグメントとトラックセル、ユーザが視覚的にデータのエラーをキュレーションすることができますし、自動的に系統と分裂時間を割り当てます。 GUIはさらに、全細胞トレースならびにそれら第一及び第二の時間導関数を生成するために時系列を解析する。ソフトウェアはS.のために設計されましたが出芽酵母は、そのモジュール性と多様性は、それトン許可する必要がありますいくつかの変更を他の細胞型を研究するためのプラットフォームとしての役割を果たす、Ø。
Introduction
遺伝子発現の単一細胞解析は遺伝子調節の多くの側面の我々の理解を進めたた。フローサイトメトリーまたは顕微鏡を用いて蛍光レポーター発現の静的なスナップショットは、単一セルの発現の分布に有用な情報を提供するが、直接遺伝子発現動態を通知するために必要な時系列データの履歴と進化を欠いている。蛍光タイムラプス顕微鏡は、単一セルの測定とその歴史の両方を取得する手段を提供します。種々の実験および解析技術は、このような遺伝子調節機能洞察を付与する、蛍光レポーター発現の映画を取得し、定量化するために開発されている（概説1を参照）は、セル間のばらつき2,3、細菌persister形成4、転写として開始と伸長5、6,7を破裂転写、細胞周期依存性8,9、および遺伝10。しかし、OBTaining品質単一細胞蛍光時系列は、培養の重要な技術的課題に制御環境で、取得した蛍光映画のハイスループット定量化における細胞の単層を伴う。ここでは、Sの蛍光ムービーを取得し、分析するための手順を説明細胞培養装置の製造における、またはソフトウェア開発の経験のない必須（ 図1） セレビシエ 。
まず、我々は詳細例プロトコルを一つ以上の蛍光レポーターを表現する出芽酵母用蛍光時系列ムービーを生成する。カスタマイズされたマイクロ流体文化室が建設され、成功した以前に11-13採用されてきたけれども、我々はCellAsic（ヘイワード、カリフォルニア州）から市販のマイクロ流体デバイスを使用しています。システム閉じ込める単分子層の成長への細胞とは、灌流環境の継続的な制御が可能になります。我々は提示顕微鏡プロトコルはfluorescを取得するための簡単な手段です。単一の酵母細胞の蛍光類似動画データを得レンス出芽酵母の映画が、任意の修飾実験プロトコルは、（カスタマイズ培養装置、代替メディア条件等 ）置換されていてもよい。
次に、時系列データを抽出するためにグラフィカルユーザーインターフェース（GUI）系蛍光時系列の迅速分析（移植片）のためのGUIと呼ばれるMATLABのソフトウェアパッケージ（Mathworks社、ナティック、MA）を使用して、映画の分析を概説単一細胞のために。移植片は、細胞をセグメント化し、追跡すると蛍光強度と幾何学的な情報を抽出することで汎用性の高い、オープンソースのソフトウェアパッケージセルID 14と同様の機能を備えています。しかし、移植片は重要な追加機能を提供します。まず、セグメンテーションとデータの正確性ではなく、分析後の外れ値の領域のトレースだけ統計ゲーを確認するために追跡の結果を簡単にインタラクティブな編集を提供しています。また、分析にautomaticallに延びyは出芽酵母の関心系統および細胞周期の点を指定する。母と娘は、2つの独立したセル領域を形成するために分割したときに決定することは、セル全体（任意の接続つぼみ含む母）細胞周期8全体の測定値を決定する非常に重要です。スイートは、これらのタスクを達成するために3つのモジュールから構成されています。最初のセグメントはセル領域に焦点を当てたとやり場の明視野像との対比に基づいており、ユーザが定義し、視覚的にセグメントパラメータをテストすることができます。第二トラック（クロッカーら IDLルーチンのブレアとデュフレーヌのMATLAB実装を使用して、で入手可能：。 http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ）および時間を介して細胞領域を測定し、自動的に系統を割り当て、および目視検査を可能にする誤り訂正。シンプルなプロットのGUIは、クエリの単一セルのプロパティに含まれています。第三のモジュールは、つぼみ出現と分裂TIを帰しMES、および全細胞時系列データならびにそれら第一及び第二の時間導関数を（9などを参照）を出力する。解析モジュールは、選択した統計ソフトウェアでその後の研究のためのスペース区切りのテキストファイルとしてデータを出力します。したがって、パッケージは、ユーザがグラフィカル·インターフェースを介して高品質の時系列データを抽出することができます。我々は、細胞周期9の関数として単一出芽酵母細胞内でリアルタイムの転写率を推定するためにこの方法を使用している。モジュールは出芽酵母のために最適化されているが、パラメータや、必要に応じて、自由に利用可能なコードは、他の生物やイメージタイプに適合させることができる。セグメンテーション、トラッキング、系統割り当てアルゴリズムは、割り当てられたイメージングおよび問題の生物の種類に特異的であり得る。既存のアルゴリズムが置き換えられますが、それでもユーザーフレンドリーな目視検査とセグメンテーションの補正と常にoccuトラッキングエラーを可能にするGUIインタフェースを保持することができます任意のアルゴリズムでR。
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Protocol
1。マイクロ流体商工会議所で成長シングル酵母細胞の蛍光顕微鏡のビデオを入手
- 新たに成長しているプレートから細胞を1ミリリットルSC培地（2％グルコースとアミノ酸の完全な補完と合成定義されたメディア）を接種し、一晩培養をインキュベート〜30時ころドラム上16時間℃の最後のOD 600nmの初期の対数増殖期のために〜0.1であるような文化を準備します。
- OD 600nmの = 0.1にスターター、必要に応じて文化や新鮮な試験管で再生する1ミリリットル追加の6-8時間を希釈。これは、マイクロ流体デバイスへのロードに適し密度で栄養豊富な定常状態で成長して細胞を提供する。 （代わりに、実験に必要な細胞を調製するために必要な手続きと手順1.1から1.2を交換してください。）
- CellAsicからY04Cマイクロ流体培養プレートを準備します。出荷ソリューションを削除;滅菌水で井戸をすすぎ、そしてONIX灌流システムフローを使用チャネルをフラッシュする5分間6 psiで井戸1-6を通る水。その後、10秒（ローディングチャンネルがはるかに高い流量を持っており、別々にフラッシュする必要があります）のために6 psiでうまくロード8からの流れ。
- すべての井戸から水を取り出して、よく8ロードセル内の入口で250μlのSC井戸1-6とステップ1.2からの培養液50μlと交換してください。 （代わりに、異なる条件の切り替えを必要とする実験のための入口の井戸1-6に目的のメディアを配置します。）
- プレートにONIXマニホールドをシールし、よくするための出発メディアを保持する唯一の入口から6 psiで少なくとも5分間、続いて2分間6 psiで入口井戸1-6から流してプライミングチャネルと文化室を開始実験。ステップ1.7になるまで継続的にこれを流す。
- 実験のために顕微鏡を準備します。私たちは、カスケードII裏面照射型EMCCDカメラ（Photometrics、ツーソン、アリゾナ州）とツァイスアクシオObserver.Z1広視野顕微鏡を使用し、200ルーメンメタルハライドアーク退色を防ぐために10％に減衰蛍光励起用ランプ（PRIOR科学、ロックランド、マサチューセッツ州）。複数の蛍光チャネルで取得するために必要な切り替え時間を最小限に抑えるために、我々夫婦CFP、YFP、およびRFPのための適切な励起/発光フィルタにシングル、トリプルバンドパスダイクロイックフィルタキューブ（;セット89006クロマルネサステクノロジ、滝、VTベローズ）外部、高速スイッチングフィルターホイール（Ludl電子製品、ノヴァ、CA）に設定された。
- 客観的な（必要に応じて、我々はツァイスプラン - アポクロマート63X/1.40オイルDICを使用）に浸漬液の数滴を置き、倒立顕微鏡のステージに確実にマイクロ流体デバイスをマウント。プレートを確保することが実験を通して段階で全くずれないデータ分析時にセルトラッキングを向上させます。我々は、単にそのシフトを防ぐために、ステージにマウントプレートをテープ。
- 埋め込み位置のいずれかを使用して最初の培養室の左端の3分の1（室の高さは最も小さいです）に焦点を当てるるマーカー。よくメディア入口から流れを切り、5秒バーストで6 psiでセルの負荷だけでなく8からの流れ。細胞の培養室を見て回るためにステージを移動します。所望の細胞密度が達成されるまでロードフロー時間と圧力を増加しますが、新鮮な培地がチャンバに入る左端の障壁をオーバーロードし、目詰まりしないようにしてください。
- よく6 psiで始まるメディアを含むメディアの入口から流れる始める。
- 変形者（Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーベール）または他の顕微鏡検査の自動化と制御ソフトウェアでは、時間をかけて複数のステージ位置で複数の画像を取るために多次元買収をセットアップ。数および時間点の間隔を設定する。 〜10個の細胞それぞれにいくつかの段階のポジションを選択してください（より迅速に混雑されます）。我々は通常、それぞれが各時点で取得のため〜11秒を必要とする、最大16の位置に5分間隔と画像を使用しています。
- そのため、各ステージ位置における各時点番目に取得を設定する電子プログラムがされます：;獲得BF透過光明視野（BF）変形者の内蔵オートフォーカス方式（フォーカス精度をより細かく制御を提供し、それぞれのステージ位置の開始時にカスタム記述ジャーナルとしてオートフォーカスを実装）を使用して、画像に焦点を当て焦点面（FP）〜+1程度の画像; FP（画像間で必要に応じてフォーカスを変更するためのカスタム書かれたジャーナルを使用）-4〜程度でフォーカスのBF（BFOOF）画像を取得し、1つはグレースケール獲得最小限の退色との迅速な取得のために最適化された設定を使用してFPに各蛍光レポーターのための画像。
- 必要な場合は、無細胞と培養チャンバーの分野で各蛍光レポーターの背景とシェーディング補正画像を得る。
- ONIX制御ソフトウェアでの実験のために流れのプログラムを準備します。同時に変形者で取得プログラムとONIX制御ソフトウェアのフロープログラムを開始します。
- 実験の最後に、国連修正蛍光像（必要な場合）、および必要に応じて。STKムービーファイル（位置1用など作成BF、BFOOF、CFP、YFP及びRFP映画に各段階の位置で各画像チャネルについて。TIFファイルを結合であっても、背景とシェーディング）。
2。 MATLABでFormatData GUIを使用してトラッキングするための形式とセグメントデータ（図2）
- データ入力GUIを開くには、MATLABでFormatData.mファイルを実行します。上部には、指定するか、データディレクトリを設定するには、画像ファイルを含むフォルダを参照し、その後の実験で記録されたデータ型とイメージファイルを指定するためにGUIを使用します。
- 右側には、実行するためにどの解析タイプを示すために、 "タイムラプス"の隣にあるラジオボタンを選択します。 "タイムラプス"時系列（ 例えばマイクロ流体チャンバー内で増殖する細胞の動画）などの画像のシリーズを扱います。 "静的"母集団から取られたスナップショットのセット（DIFで撮影例えば複数の画像のように、それぞれの画像シリーズを扱いますシングルスライド標本上ferentポジション）。この移植片バージョンでは、複数の位置のための時間経過のデータを処理することができますが、それぞれの位置に別々のファイルとして（ステップ2.14を参照）。
- フレーム内で見かけ細胞運動を最小限に抑えるために映画の中で、それぞれの画像をシフトすることによって不正確な段階の動きを補正するために画像レジストレーションのためのチェックボックスをオンにします。我々は強く、それが大幅に（後で手動トラックキュレーションを減らすこと）追跡向上としてこれをお勧めしますが、画像は国境でシフトされている場所を埋めるためにランダム、 "ホワイトノイズ"ピクセル値を追加します。また、ステップ2.7にセグメント化されたBFの画像を表示した後、またはステップ2.13まで、任意の時点で選択することができる。
- "データチャンネル"パネルで "明るいフィールド"チェックボックスをオンにします。 BF·イメージをロードするため右に "選択"をクリックします。 * TIFファイルの場合、選択しながらShiftキーを押したままつのムービーに対応するすべてのBFのイメージを選択し、 "開く"をクリックしてください。 * STKファイルの場合は、単に関心のBFスタックを選択します。画像は、成功している場合完全に認識される、ファイル名は "データの認識"パネルの右側にあるポップアップメニューに表示されます。 * TIFファイルの場合、ファイル名が（ - BF_t001など取得時のシーケンシャル名前でファイルを保存する）が正しい順序で表示されることを確認してください。
- "ブライトフィールド（焦点）"チェックボックスをオンにし、右側にポップアップで表示されますBFOOFファイルをロードするステップ2.4のように、 "選択"ボタンを使用します。 （BFOOFよく63XセグメントでFPに相対BF -4程度として得られる。）
- "セルマスク"チェックボックスをオンにします。 "マスクソース"パネルで、 "セグメントBF"の横にあるラジオボタンを選択します。セグメンテーションGUIを開くには、 "パラメータ"ボタンを押してください。 （代わりに、後者を押すと、ステップ2.4のように映画を選択し、 "マスクファイルを選択"ボタンの横にあるラジオボタンを選択することにより、あらかじめセグメント化されたマスクのムービーを選択し、この場合は、BFOOFムービーが必要とされない、と2.8ステップにスキップすることができます。）
- 異なるセグメントパラメータを設定します（それぞれの説明が表示することができます"パラメーターの説明"）を押すと"テスト"（ 図3）をクリックすることで、セグメンテーションの品質をテストすることによってED。成功裏に分割された領域は、マゼンタの境界線と緑になります。映画の中の複数の時点を確認するには、スライダを使用してください。セグメンテーションが良好である場合に、FormatData GUIにセグメントパラメータを返すように "完了"を選択します。
- "カラー画像"ボックスをチェックします。テキストエディットボックスの最初の蛍光画像チャネルの色の名前を入力し、 "追加して選択し、"ステップ2.4のように、色のファイルをロードするために押します。色名は、左側のリストボックスに追加され、ファイル名が右側のテーブルに追加される。間違いがカラーファイルを読み込むで作られている場合は、左側のリストボックスで色の名前を選択し、ファイルを削除する "カラーを削除"をクリックしてください。各カラーチャンネルごとに繰り返します。
- 蛍光色（ 例えば蛍光標識核→ヌクレイックアシッズリサーチのいずれかに基づいて、追加のサブ領域をマスクした場合耳領域マスク）が望まれている、 "カラーマスク"チェックボックスをオンにします。そうでない場合は、2.12に進みます。 "カラーマスクソース"パネルで、テキスト編集ボックスにサブ領域マスク名を入力します。 "カラーマスクソース"パネル（色は、ステップ6で追加されていることが必要）のポップアップメニューから色を選択し、しきい値のテストGUIを開くには、 "パラメータ"を押してください。
- 自動的に大津の方法15を使用してしきい値を決定するために、画像がしきい値（ 図4）の上に保存領域が強調表示されます"自動しきい値"ボタンを押してください。しきい値を手動で編集ボックスを使用して調整することができる。しきい値はすべての時点に適切であることを確認するには、スクロールバーを使用します。満足したら、FormatData GUIへのしきい値を返すように "Done"を押してください。
- 選択されたカラー画像に適用し、しきい値モジュールを使用してサブ領域マスクを生成するために "追加およびセグメント"を押してください。カラーマスク名と関連するソースはrで、左側の表に表示され右表に現れるecognizedファイル名。 （代わりに、押し "を追加し、[選択]、"既製のサブ領域マスクファイルをロードします。）
- 下部には、指定するか、保存ディレクトリとして使用する目的のフォルダを参照します。
- ：画像（で入手フランソワNedelecによって開発tiffread2.mコードを使用して、ファイルを読み込むには、 "データの書式設定"を押しhttp://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 、プロセスデータ、および*を作成します）指定したフォルダにあります。マットはファイル。このファイルには、ProcessTimeSeries GUIへの入力として機能します。
- 各ステージ位置のために映画のセットのためのステップ2.4から2.13までを繰り返します。
3。 ProcessTimeSeries GUI、およびバーテンIDとリネージュの割り当て（図5）との時間を通して、トラックセルと系統
- 追跡GUIを開くには、MATLABでProcessTimeSeries.mファイルを実行します。開封後は、次のパラメータを設定するGUI：
- "商工会議所の高さ"（パネル、左上の "ファイルI / O"） - これは、細胞が捕捉されている室の高さを示している。それは、8とセル領域のメジャーとマイナーの軸に基づいて3次元楕円体として細胞容積を近似における制約として使用されています。
- "ミクロン/ピクセル"（パネル"ファイルI / O"） -断面積および体積がそれぞれ、2ミクロンと3ミクロンで算出することができるので、画像内程度の距離に画素を較正するための変換係数。
- "フィルタパネル"（以下 "ファイルI / O"パネル） - セットの最小値とマスクのジャンク領域を除外するための最大のパラメータ： "エリア" - ピクセル領域面積、 "シズオカ" - 偏心率、→0として、より円形; "SF" - →1のようなより円形の形状係数、。
- "ファイルI / O"のパネルで "ロード画像"をクリックして、FormatData GUIによって関心の出力*マットのデータファイルを選択します。領域マスク（および任意のサブ領域マスク）各カラーチャンネルに適用される、異なった測定値の数（ 表1）作られている。データファイルが保存されている。分析は最初から再開する必要がある場合（以前のセッションからProcessTimeSeriesにファイルをロードする場合、それは要求されます注意：それはFormatData GUIから新鮮あたかもこれは、既に完了した任意のトラックのキュレーションを消去し、データを扱います場合。誤ってすぐに上書きされる前にキュレーション*。マットファイルを防ぐために、MATLABコマンドウィンドウでCtrl + Cを押して、再起動した。）
- 次に、細胞を追跡します。 "トラックセル"パネル（ "フィルタ"パネルの隣）で、次のパラメータを設定します。
- "最大変位" - セルが別のセルとしてラベルされる前に、隣接する画像間を移動することができますピクセル単位で最大距離。より高い変位アルゴリズムが多くのセルを移動さを占めることを意味し、それはまた、群集のセル領域をマッチングの複雑さを増大させる。私たちは、（ステップ3を参照してください12で開始し、エラーがトラッキングで発生した場合減少.4）。
- "最小長" - 有効なデータ系列考慮すべき細胞トレースのオカレンスの最小数。我々は、任意の本当の痕跡の除去を防ぐために1を使用しますが、これは短命、スプリアス領域のトレースに分割結果場合に増加させることができる。
- "フレームメモリ" - 連続したフレームの最大数のセル領域が消えることができ、それが戻ったときに同じIDが与えられる。それは "フレームメモリ"よりも長い間消えている場合は、戻ったときに、新しいIDが与えられます。私たちは、領域が戻る前に2フレームのセグメンテーションでは見逃されることができるように2を使用します。
- 地域の重心を（：ブレアとクロッカーのデュフレーヌMATLABの実装、グリア、および週IDLルーチンで利用可能な使用して、次への1フレームから領域を追跡する"トラック·セル"をクリックhttp://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ） 、新たに出現する芽のための系統の割り当て、およびデータを保存する。系統は自動的分によって割り当てられ推定芽、各フレーム内の潜在的な母親の間の距離をimizing。あなたのデータのための必要に応じてポップアップウィンドウに（エラーは "難しい組み合わせ論"によるMATLABコマンドウィンドウに表示された場合は、 "最大変位"を減少させると追跡を繰り返してください。）パラメータを変更。
- さまざまなGUIツールまたはショートカットキー（ "選択されたセル情報"パネルの上にあるボタンを押すことによって、ポップアップウィンドウに表示されている）を使用して、不完全に分割された領域とIDまたは系統の割り当てで間違いをキュレーション。
- スライダー、 "前の画像"、 "次の画像"（Ctrlキー+左/右） - 表示し、画像シリーズのフレーム間を移動するために使用する。
- "画像＃は" - 左と右の軸の現在の画像のフレーム数が表示されます。 "＃画像"編集ボックス右側でその番号を入力して、指定されたフレームに移動します。
- "デルタフレームは、" - （ - 左Δ=右）左右の軸間のフレーム数の差を示しています。
- （Ctrlキー+ T） "テキストを隠す" - でセルIDを表示を交互右軸はどうか。
- "非表示のラベル"の（Ctrl + L） - 左軸かどうかでセルIDを表示を切り替えます。
- "マスク"ポップアップメニュー - 、マスク、携帯マスク、または左側のパネルに表示するための任意のユーザー定義のサブマスクを表示していないのどちらかを選択。
- "オーバーレイ"ポップアップメニュー（Ctrlキー1から9）が - 左フレームのBFと色層を表示するように選択。ショーBFは、両方の軸にオンまたはオフBF層を切り替えるだけです。 （ "*"オーバーレイが表示されている意味）再びメニューのオーバレイ名を選択して表示かどうかを切り替えます。 2-9の順序でカラーオーバーレイをトグルするとCtrlキー+1トグルBFオーバーレイ、。
- "設定した色は、" - オーバーレイ表示の色を決定するために使用します。ポップアップウィンドウを設定するためにどの蛍光チャネル照会した後、カラーパレットは、ユーザー定義のために表示されます。
- パネル "地域とトラックを変更する" - これらは、セル領域マスクとトレース情報に与える影響の変化を制御します。
- "更新トラック"（Ctrlキー+ U）は - 再使用セルIDを割り当てる。ない細胞は、右の軸で選択されていない場合は、セルIDを変更するために、GUIは、プロンプトが表示されます。 ID XはXの将来のすべてのインスタンスがYに変更し、現在のYの任意の将来のインスタンスは、時折一つのセルを繰り返し2 IDは、間を前後に切り替えますX.（に切り替えられますされ、Yに変更された場合、これはoversegmented地域ではなく、更新ID機能にエラーで複数のIDを収容しようとしてトラッキングに起因している。）複数のセルが選択され、それらのIDが同時に変更しましたが、 それぞれに一意のIDを与えることを確認することができます。現在のファイルに存在しないIDにリージョンを割り当てるには、 "0"を入力し、1が生成されます。 2ハイライトセルのIDを交換するには、Ctrl + Wを使用してください。
- "選択したトラックを削除します"の（Ctrl + D） - 現在の右の軸枠で選択したセルまたは複数のセル領域を削除するために使用します。ない（セルが選択されていない場合、IDを求めるプロンプトが表示されます。）永久IDトレースのすべてのインスタンスを削除するには、デの横にあるチェックボックスをオン選択したトラックのボタンをクリックします（テキストは "すべて削除"に変更されます）LETE。これは永続的なジャンク領域を取り除くのに便利ですが、最初のIDが有効セルまたは芽領域に切り替えていないことを確認するために将来のフレームを確認してください。
- （Ctrlキー+ AまたはM） "地域のマージ" - セル領域を滑らかにして組み合わせたものです。選択して、右の軸のセルまたはセル（選択した場合の領域が赤に変わります）をクリックします。つの領域にマージする形態学的に円盤状の要素を使用して亀裂や小さな欠けているチャンクを埋めるために閉じます。二つ以上の近くの領域をマージするつの領域にそれらを組み合わせて、新たな領域に最も低いIDを与える。これはオーバーセグメント化された領域（多くの場合、細胞が大きな液胞を持っているとき）に便利です。
- "地域を描く" - 目的の右軸領域を描画し、ダブルフィニッシュにクリックしてマウスを使用しています。データセット（1〜65535）には存在しない固有のIDを提供します。キーボードのDeleteを押してキャンセルします。
- "リネージュトラッキング"パネル - 追跡後、系統の割り当てが自動的に生成されます。新規IDの領域が表示されたら、新しいセルIDがピンク色で表示され、赤のラインはマザー領域に描画されます。芽であることが大きすぎるか遠すぎる可能性の母親からの新しい領域が緑色で表示され、 "NaNは"（ "しない番号"、 表2を参照）の母のIDが割り当てられます。第1の時点に存在する領域が "0"の母IDを持っている。個々の割り当てを修正するには、テキスト編集の分野で母親と芽のIDを入力し、 "修正"をクリックしてください。セルの母親を消去するには、その母親として "0"を入力してください。高速な方法は、右の画像の2つの領域を選択し、Ctrlキー+ Fで押すことです娘細胞のための任意の既存の母の割り当てを消去しながら、これは自動的に、娘として母と新しい領域として古い地域を割り当てます。注意：いつでも "計算系統は"再計算ユーザーが以前にキュレーションしているものも含め、すべての系統の割り当てを、意志クリック。
- "選択されたセル情報"パネル - "私を取得NFO "は右の軸で選択した領域の一部の測定値が表示されます。"測定は... "（"データのエクスポート、ユーザーだけでなく、のような他の操作のためのデフォルトのリストを定義します）が表示されている測定値を決定することができます "。使用することができます正しいIDと系統（ 例えば、セルXは、時刻tにおける芽を有する場合、それはおそらく時刻tにおける別の芽を持っていない+ 5分）を決定する。
- アップデート*マットファイルのユーザの変更を反映するために - 。（Ctrl + S）を "変更を保存"。頻繁に使用する（元に戻す機能があるなし）！
- "プロットの生成" - GeneratePlots GUIを開きます。迅速ProcessTimeSeries GUI、それらの平均、または各フレームのすべての地域の平均値の右側の軸で強調単一セル領域に対して選択した変数の情報や簡単な計算をプロットするために使用します。このGUIは、荒い最初の導関数を計算しますが、左上に正しい時間間隔を指定して確認することができます。プロットは "図を生成する"を押して保存するための図に出力することができる。
- データを適切にキュレートするには、次のいずれかのoversegmented領域をマージ、セル全体をキャプチャしない任意の領域を削除し、母芽の関係が適切に割り当てられている（赤線は芽の出現時にはそれらの間に表示され、芽のIDがピンクであるとき、以下を参照してください確認してください表2）、および（ "0"）は母親を割り当てていない、または地域の削除、地域の母親を割り当て、IDを固定することにより、任意の緑色のIDを排除。その母親に芽領域（それが不正確なボリューム推定につながる）マージしないようにつぼみのデータが最終的な分析の間に母のそれに追加されます。
- 視覚的に最大近隣の最後の時間に各フレームのデータを検査し、それ以降のフレームを使用しない場合には、全体の時系列が要求されない。
- 変更内容を保存してください。
- 繰り返して、各ステージ位置のために*。マットファイルの3.1から3.7を繰り返します。
4。分析のためのデータのエクスポート
- 単にティムを通じて各セルの生の地域の測定をエクスポートするにはeは、 "データのエクスポート"を押してください。興味のある測定が開きGUIで選択することができ、それらはカラムヘッダーと変数名とスペースで区切られた*。txtのファイルに出力されます。
- 時間の経過と共に全体の細胞のための時系列を分析し、細胞周期の情報を算出、およびその誘導体を取り、 "時系列解析"を押してください。ウィンドウは、関心および分析パラメータの入力（ 図6）の測定値の選択を可能にするオープンする。
- GUI（以降のすべてのフレームが無視されます）にキュレート前回のポイントを入力します。デフォルトのスムージングと細胞周期割り当てパラメータは5分間隔で撮像当社の半数体と二倍体株のためにうまく動作しますが、これらは、最良の結果を得るために変化させる必要があるかもしれません。 （パラメータの値は手動でテストデータセットのために出芽と分裂時間を決定し、自動化されたアルゴリズムの性能を比較することにより、適切であることを確認してください。）
- すべてのパラメータが設定されると、プッシュする "分析"
- コンズそれぞれの生の測定のための配列をtructと（各蛍光のムービーの最初のフレームの非セル面積の平均強度として測定、またはセルのピクセルあたりの平均自己蛍光を考慮して指定することができます）バックグラウンドを差し引く。
- 高周波測定ノイズます（9章 ）を除去するために選択された測定値に平滑化スプラインをフィット。
- 自動的に9で説明したように音量時系列の傾きの変化に基づいて、各セルの芽の出現と細胞分裂の回数を決定します。つぼみの測定は、次に連続する全細胞の時系列のための出現と分裂、各サイクルの間に母親の測定値に追加されます。正規化された細胞周期の進行にも分割の分割は0〜2の範囲で計算される。
- 安定した1回目と選択測定の第2 回微分を取るために平滑化スプラインをフィット。 （明確に定義された誘導体の目的のために、時系列前のサイクルのエンドポイントを満たすために、次の細胞周期のデータをシフトすることによって分裂にわたる連続的な作られています。）
- すべての地域の出力生と平滑化時系列、および全細胞平滑化、連続しており、各測定のための配列として差別化された時系列。最初の要素は、背景減算用のカラーインデックスであり、最初の行の残りの部分は、セルIDを保持する第1列の残りの部分は、フレーム番号であり、残りの要素は、各行と列に各単セル用の時系列を保持する最初の列のフレームに対応する。細胞周期の進行時系列及び系統情報の類似の配列はまた、出力される。配列 "LineageArrayは"第五列を通じて母芽関係と最初を表す各行を持つテーブルを含む母ID、つぼみID、最初のつぼみ領域推定出芽フレーム、推定分割フレームのフレームです。データは、*。マットファイル（MATLABデータファイル）にエクスポートされます。
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Representative Results
正常に実行され、分析実験は、現実的に割り当てられた芽の出現と分割時間を持つ単一の細胞全体のために主に連続的な時系列が得られます。例として、我々は表4、Y47の成長とグローバルな表現は、単一の細胞で、経時的に変化するかを観察するために構成的ADH1プロモーターによって駆動セルリアン蛍光タンパク質（CFP）（の統合されたコピーを表現ハプロイド酵母株と上記のプロトコルを実行）。我々は、時間をかけて全細胞（ 図7A）測定値を得るために時系列解析を実行し、および9に見られるように、細胞周期に依存して、ボリュームおよび発現の両方に現れる。芽の形成後、総合計体積（母+芽）タンパク質濃度、または平均強度ながら、（8,16と整合）芽の出現以前よりもより迅速に増加し、（ 図7Bおよび7C）わずかに減少。組み合わせた統合の上昇テッドタンパク質（この場合はボリュームをx濃度）また、出芽（ 図7D）の後に加速します。単独母領域（ 図7B＆D）と比較して、これらの結果は、適切にセル全体測定を芽寄与を組み込み、適切な芽形成と分割時間の割り当ての必要性を強調することの重要性を実証する。我々は9を報告してきたように、私たちは瞬時相対するmRNAレベルM（t）と転写率（t）は 、両方ともも（ 図7Eと7F）出芽後に増加を計算するために差別化された時系列を使用することができます：
計測時系列の安定時間導関数を生成する能力にも速度論的研究に利益をもたらす。私たちは、切り替え可能な転写活性を有する観察、キメラ転写因子（ 表4、Y962）を発現する酵母株を使用しています。リン酸飢餓経路、Pho4p、のマスター転写因子は、細胞外リンconcentratio nは18に対応してnucleo -細胞質局在化を介して制御されます。私たちは、TETオペロン（テト）に結合tetRに、とPho4pのDNA結合ドメインに置き換え、およびC末端Pho4-tetRにYFP-9を作成するには、黄色蛍光タンパク質に新たな転写因子を融合。灌流媒体中のリン酸塩レベルを切り替えることにより、我々は、7重音の結合部位からなる合成プロモーターによって駆動される統合されたCFPの発現を切り替えることができND CYC1最小プロモーター（7xtetOpr-CFP）。時系列解析は、転写因子は核（ステップ2.9から10と同様にRFPベースの核サブマスクを作成するRFPおよび核タンパク質Nhp2pの融合を使用して）にローカライズされたときに表示され、時標的遺伝子が起動し、転写を停止させる（ 図8）。経時的誘導体系列を解析することにより、各単セル内の標的プロモーターの活性化および非活性化時間が安定した蛍光レポーターの濃度が高い場合であっても推測することができる。 表1。 ProcessTimeSeries GUIの測定変数命名。 表2。系統の割り当てステータスのセルIDカラーコード。 表3。移植片は説明書を提出。 表4。本研究で用いた酵母株。 
P（t）は時に総タンパク質であるここで、t、γMは、mRNAの分解速度0.04分-1で
図1。プロトコルの概略。プロトコルは1のための手順を説明します）マイクロ流体文化、2）蛍光タイムラプス顕微鏡、3）データ解析、 
図2。 FormatData GUI。インタフェースは、形式、およびそれ以降の計算と目視検査のセグメント画像データをインポートするために使用されます。数字は、各コンポーネントに対応するプロトコルの手順を示しています。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。 
図3。 GUI SegTest。インターフェースは、細胞セグメントをテストするために使用され ATIONパラメータと視覚的にステップ2.7のようにセグメンテーション精度を確認します。 
図4。 ColorThreshTest GUI。インターフェイスは、ステップ2.10のように選ばれた蛍光チャネルから細胞内のマスクを作成するために必要な強度閾値をテストするために使用されます。 
図5。 ProcessTimeSeries GUI。インタフェースは、測定、追跡、視覚的に点検し、セル領域と系統の割り当てを編集するために使用されます。数字は、各コンポーネントに対応するプロトコル工程を示している。ターゲット= "_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。 
図6。 GUI AnalysisParams。インタフェースはステップ4.3および4.4のように時系列解析に必要なパラメータを入力するために使用される。 
図7。数世代にわたってマイクロ流体文化にADH1 PR-CFPを発現している半数体酵母の単細胞時系列。（）ブライトフィールド（一番上の行）とCFP（下段）顕微鏡写真を、実験を通して、細胞のために指示された時点で表示されます。セグメント化された母細胞（青outli用NE）とその芽（緑の輪郭）、連続したセル全体が赤い枠で囲まれている。生の母親と芽（B）体積及び（C）タンパク質濃度の時系列は、測定ノイズを除去するために平滑化され、（D）集積CFP蛍光は体積および濃度の積として計算した。全細胞（赤）トレースが部門間微分平滑スプライン（BとD）にフィットしやすい累計を維持するために過去の部門を拡張されています。 （E）の相対的なmRNAレベル及び（F）瞬時転写速度は、式（1-2）及び（D）はスプラインフィットを用いて計算される。 
図8。 nucleo -細胞質へのプロモーターの転写レート応答単一の酵母細胞内Pho4-YFP融合の往復。（A）は 、4つの指定された収集チャネルからの顕微鏡写真（B）が反応してRFP-著しい核に局在すること切り替え可能YFP融合Pho4-tetRにベーターとセルのために示されている低リン酸塩と7xtetOpr-CFPレポーターの（C）ドライブ式。平均（黒線）上に局在して（D）推測転写レートの変動および単一細胞レベルでの（赤が連続を表し、赤とマゼンタのライン、セル領域）が赤で概説した。いくつかのタンパク質が娘細胞に失われたとき、BにおけるCFP式のシャープドロップは細胞分裂と一致。 計測名 説明 時間 画像のフレーム番号 エリア 総数O領域を含むFピクセル ボリューム （4/3）πabc、どこ=地域の½長径、B =½短軸長および c = Bまたは½ "商工会議所の高さ"（いずれか小さい方） （X）_（Y）が意味する カラーチャネル（X）における領域マスクのピクセル強度（Y）を意味 （X）_（Y）メジアン カラーチャネルにおける領域マスクの平均ピクセル強度（Y）（X） （X）_（Y）スタンダード カラーチャネルにおける領域マスクのピクセル強度の標準偏差（Y）（X） （X）_（Y）IQR 25 パーセンタイル値は- 75 パーセンタイルカラーチャネル（X）における領域マスク（Y）のピクセル強度の四分位範囲 （X）_（Y）T20pct カラーチャネル（X）における領域マスクのピクセル強度の上部20％（Y）のための強さを意味します。使用サブマスクずに細胞内局在を決定するために、次の測定に比べてFUL。 （X）_（Y）B80pct カラーチャネル（X）における領域マスクのピクセル強度のボトム80％（Y）のための強さを意味します。サブマスクずに細胞内局在を決定するために、前回の測定と比較して有用である。 （X）_（Y）M50pct カラーチャネルにおける領域マスクのピクセル強度の真ん中50％（Y）（X）のため強度を意味する （X）_cellint セル全体の色チャンネル（X）（Xボリュームピクセル強度を意味する）の統合された蛍光（母と接続された任意の芽） （Z）生 変数のための "時系列解析"によって生の時系列データ出力（Z） （Z）スムース 変数のための "時系列解析"によってスプライン平滑化生の時系列データ出力（Z） （Z）全体 全細胞（M変数のための "時系列解析"によって他+付属の芽（Z）Rawsmooth）時系列データ出力（Z） （Z）写 全細胞の時系列データは、変数のための "時系列解析"（Z）で（ "累計"）部門での連続出力を作った （Z）WhSmooth 変数の "時系列解析"によるスプライン平滑化（Z）全細胞時系列データ出力（Z） （Z）DDT 変数の "時系列解析"によるスプライン平滑化の最初の時間微分（Z）全細胞時系列データ出力（Z） （Z）d2dt2 変数の "時系列解析"によるスプライン平滑化の第2のタイム·誘導体（Z）全細胞時系列データ出力（Z） セルID色 リネージュステータス 黄色 割り当てられた母 ピンク 新しい芽（割り当てられた母親に描か赤線） 緑 全く母親が割り当てられていません ファイル名 説明 FormatData.m データ入力GUIそのProcessTimeSeries.mによる処理のための形式の映画やセグメントBF画像 FormatData.fig FormatData GUIウィンドウのレイアウト BFsegment.m extractregions2.mとsegmentregions.mとBFセグメンテーションモジュール、 SegTest.m セグメンテーション品質テストGUI SegTest.fig SegTest GUIウィンドウのレイアウト extractregions2.m 領域を識別するためのBFセグメンテーションモジュールの第1成分 segmentregions.m BF分離する分割モジュールとクリーンセル領域の第2の成分 color2submask.m 蛍光ベースのサブマスクセグメンテーションモジュール ColorThreshTest.m 蛍光ベースのしきい値マスクテストGUI ColorThreshTest.fig ColorThreshTest GUIウィンドウのレイアウト tiffread2.m MATLABで使用するためのデータを抽出*。TIFまたは*。STKファイル imalign.m 2次元相互相関を使用して、画像レジストレーション ProcessTimeSeries.m 領域を追跡するデータ処理GUIは、系統を割り当て、およびエラーの視覚的な補正を可能にします。また、GUIベースのプロッティング機能を提供し、全細胞の時系列データを出力 ProcessTimeSeries.fig ProcessTimeSeries GUIウィンドウのレイアウト cleanMask.m ProcessTimeSeries GUIのパラメータに基づいてマスク領域を排除 track.m 地域の重心に基づいてセル領域を追跡 OptimizeLineages.m リネージュ割り当てモジュールは、物理的な距離と過去と未来新進イベントに基づいて最適な母芽との関係を決定 getClosestObjects.m それぞれの新しいセルID（つぼみ）が隣接セルを検索します SelectVariables.m 興味のある変数を選択するための測定選択GUI SelectVariables.fig SelectVariables GUIウィンドウのレイアウト GeneratePlots.m ProcessTimeSeriesウィンドウのデータをプロットするためのGUI GeneratePlots.fig GeneratePlots GUIウィンドウのレイアウト AnalyzeCellSeries.m 時系列解析モジュールは、細胞分裂時間を決定し、本文に記載されているように全体のセル測定を出力する assignDivisionsInf2.m 芽もやしと細胞分裂の回数割り当て AnalysisParams.m 細胞時系列解析パラメータ入力 AnalysisParams.fig AnalysisParams GUIウィンドウのレイアウト ひずみID 遺伝子型（W303ベース） リファレンス Y47 MAT LEU2 :: ADH1pr-CFP-フォリボシルトランスフェラーゼ:: URA3 :: kanR ::フォリボシルトランスフェラーゼ 19 Y962 MAT ADE + NHP2 :: RFP-NATspl2Δ:: LEU2 pho4 :: TRP1pho84Δ：：klura3 phm4 :: HIS3MX6leu2Δ:: TEF1m7pr-PHO4ΔP2-tetRに-cYFP URA3 :: 7xtetOpr-CFP 9
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Discussion
上記のプロトコルでは、マイクロ流体、またはソフトウェア開発の限られた経験を有する蛍光時系列データを取得して分析するための簡単な方法が記載されている。バーテン追跡および系統の割り当て;、関連するセルサイズおよび発現測定値を抽出し、それは1つは、単一の酵母細胞の経時蛍光ムービーを取得することができ、市販のマイクロ流体培養装置を用いて、時間と汎用性の高いグラフィカルユーザ上で細胞全体の挙動を解析するインタフェース（GUI）。実験、セグメンテーション、およびトラッキングのステップは様々な方法以前に11,13,14でアプローチしてきたが、上記の手順は、生物学コミュニティの広いサブセットにこれらの技術をよりアクセシブルにするために設計されています。上記の手順は、特定のマイクロ流体培養装置用に最適化されている間、全体的な分析がより安価でカスタマイズ可能になる既製のマイクロ流体培養技術など同様のデバイスに適合させることができる。 Fundamentally、我々は採用セグメンテーションと地域の測定アルゴリズムは、既存の方法13,14に似ていますが、移植片ソフトウェアは視覚的に地域の追跡および系統の割り当てをキュレートし、正確に細胞周期のフェーズを割り当てる機能を追加します。これらの機能の両方を正確にデータ系列の時間導関数を計算するために不可欠である。
大幅に得られた時系列データの品質に影響を与えるプロトコルにおけるいくつかのステップがある。最初に細胞を培養チャンバーをオーバーロードすることは（室リフレッシュ時間が重要な運動の実験では特に顕著）チャンバー内に灌流が減少し、かつ異常増殖は、以前の実験の時間経過で発生します。これは、最良短い時間のためのより低いセルの負荷圧力で開始し、適切な細胞密度が達成されるまで徐々に一方または両方を増加させることによって回避することができる。イメージングのためのステージ位置の選択は、関連すると同様に重要であるconsideration。どのように多くの細胞が時間をかけて画像フレーム内にあり、混雑がメディア拡散にどのように影響するかを予測します歪み、計画の倍加時間を知る。十分散細胞が10微小コロニーに成長しますが、最初は一緒にグループ10細胞は単一の大きなコロニー（それは直径〜14細胞よりも大きい場合、我々は植民地の中央に6 psiで栄養素の拡散限界に気づいた）に成長する。上流のプロトコルステップで余分な労力は、後で手動でのデータキュレーションを促進し、出力時系列を向上させます。プレートがしっかりとステージに搭載されていることを確認し、非常に自動的に時間を通じて単一細胞の追跡の精度を向上させるためにFormatData GUIで画像レジストレーションオプションを使用します。注意が必要なエラーの数を低減することも可能な限り最高のセグメントパラメータの選択に時間を費やす。 remergingのでトラッキングソフトウェアは、セル領域よりもむしろundersegmentationのわずかoversegmentationで最適に動作し分割セルは領域を分割する線を描画するよりも簡単な作業であるが、増加したoversegmentationは偽、新たな地域の存在に起因する系統の割り当てでエラーが増加します。さらに、全体のセルの測定値が正確になりますように、すべての母親の芽との関係が適切に割り当てられていることを確認してください。芽がセグメンテーションでは見逃さまたは画像境界の外側に成長されている場合は、スプリアスの結果を防ぐために、母親のデータ系列を終了することを検討してください。これは簡単に間違ったフレームに固有のID（ "0"のIDを入力します）への母地域の変更、新規IDの将来のすべてのインスタンスを削除する機能 "すべて削除"を使用して行われます。これらの手順には細心の注意を大幅に生の時系列データの精度が向上します。
"時系列解析"を押すことにより、出力されるデータの有効な解釈を確立するために、我々はいくつかの追加のお問い合わせをお勧めします。芽の出現と分割時間を確認し、正確にユーザーが入力オフセット電に基づいて決定されるTパラメータ。手動テストの映画のセットのために出芽と分裂時間を記録し、アルゴリズムの結果と比較します。視覚的に時間の細胞質分裂が母と娘の間に完了推定するために、狭く、暗くする、その境界線を探してください。 （NB：分割時間の手動観察蛍光著しい核エイズと試験菌株別の方法は、原形質膜を蛍光マークし、閉じるために母と娘細胞の間のギャップを探すことでしょう。）また、キャプチャされた光が由来するとき、セルの合計蛍光が良い（体積を乗じた平均地域強度（キャプチャ光がセルの薄い断面に由来する場合）として、あるいは領域にわたって統合された蛍光のように計算されているかどうかをチェックセル全体）。セルの両端蛍光更新領域7の長軸と短軸で記述半楕円のカーブと一致した場合、キャプチャされた光がセル全体に由来する、総蛍光笙（面積）×（平均強度）として計算することがULD。セルの高さよりもはるかに少ない被写界深度と63Xで我々のケースでは、蛍光プロフィールは、比較的平坦であり、合計蛍光を×（体積）（平均強度）として計算される。別の考慮事項は、蛍光体の退色です。ソフトウェアは、分析に退色考慮していないので、蛍光時系列出力のみ観察レポーターを表しています。退色プロセスが取得設定と蛍光画像、蛍光体の性質、およびその他のさまざまな実験固有のパラメータを取得するために使用される時間間隔に大きく依存。また、退色がその治療のための一般的なアルゴリズムを防ぐシンプルな、一次速度式によってよく説明されないことがあります。そこで、時系列の出力に光退色を考慮しないが、分析方法は、ユーザの解釈を助けるためにこのプロセスの速度を測定するために使用することができる。最後に、smoothiを選択観測された時系列に適しngのパラメータ。データの真の特徴を維持しながら、理想的には、平滑化スプラインは、高周波測定ノイズを除去することができます。これを達成するために必要なパラメータは、特定の時系列の特性に依存し、実験の間で変わるかもしれない。
ソフトウェアは、様々なタイムラプス蛍光顕微鏡データの分析のために柔軟であることが意図されていた。カラーチャンネル任意の数を含むことができ、任意のサブ領域マスクを作成するために使用することができる。アルゴリズムは出芽酵母細胞の映画のためによく働くが、機能の多くは、他の生物の映画に拡張する必要があります。地域測定（ボリュームを除く）、トラッキング、キュレーションは、セルマスクにのみ依存するため、適応可能である。セグメンテーション、系列割り当て、細胞分裂判定し、時系列解析モジュールは、独立して、特定のニーズに合わせて変更することができる。加えて、むしろそれ自体含まを使用するよりもgmentationモジュールは、事前にセグメント化されたマスクムービーが入力することができ、かつ位相差または差分干渉コントラスト画像は、明視野置換することができる。 GUIがその後IDと系統の割り当てを追跡し、キュレーションするために主に使用することができます。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
我々は、ソフトウェア上のコメントにエミリージャクソン、ジョシュアZeidman、そしてニコラスレンに感謝します。この作品はGM95733（NM）に、BBBE 103316とMITスタートアップ資金（NMへ）によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Y04C Yeast Perfusion Plate | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Microfluidic Perfusion Platform | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Cascade II EMCCD camera | Photometrics | ||
| Lumen 200 metal-halide arc lamp | PRIOR Scientific | ||
| Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set | Chroma Technology Corp | set #89006 | Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato) |
| MAC 5000 controller and filter wheels | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | 64-bit version handles large data files better than 32-bit |
References
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