Summary
우리는 형광 성장 효모 세포의 현미경 영화, 단일 셀 시계열 데이터를 추출하는 GUI 기반의 소프트웨어 패키지를 얻을 수있는 간단한 프로토콜을 제시한다. 분석은 자동화 혈통과 육안 검사 및 추적 데이터를 수동으로 큐 레이션과 통합 부문 시간 할당을 포함합니다.
Abstract
형광 시간 경과 현미경은 단일 세포 수준에서 많은 생물학적 과정의 연구에 강력한 도구가되고있다. 특히, 유전자 발현의 시간적 의존성을 묘사하는 영화는 규제의 역학에 대한 통찰력을 제공하지만, 단일 세포의 형광 영화를 획득하고 분석하는 많은 기술적 과제가있다. 우리는 여기에서 이러한 데이터를 생성하는 상업적으로 이용 가능한 미세 배양 장치를 사용하여 간단한 프로토콜 및 MATLAB 기반의 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 기반의 소프트웨어 패키지 형광 이미지를 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 소프트웨어 세그먼트와 트랙 세포는, 사용자가 시각적으로 데이터의 오류를 부젓가락 할 수 있도록, 자동으로 혈통과 분열 시간을 지정합니다. GUI는 또한 전체 셀 추적뿐만 아니라 첫 번째와 두 번째 유도체를 생산하는 시계열을 분석합니다. 소프트웨어는 S.를 위해 설계되었습니다 동안 cerevisiae의 그 모듈과 다양성은 그것에게 t을 허용해야몇 가지 수정을 다른 세포 유형을 공부하는 플랫폼 역할을 O를.
Introduction
유전자 발현의 단일 세포 분석은 유전자 조절의 여러 측면에 대한 우리의 이해를 발전한있다. 유동 세포 계측법 또는 현미경을 사용하여 형광 기자 표현식의 정적 스냅 샷은 단일 셀 표현의 분포에 대한 유용한 정보를 제공하지만, 역사와 직접적으로 유전자 발현 역학을 통보하는 데 필요한 시간 시리즈 데이터의 진화를 부족합니다. 형광 시간 경과 현미경 단일 세포 측정 및 그들의 역사를 모두 얻을 수있는 수단을 제공합니다. 다양한 실험 및 분석 기술은 따라서 이러한 휴대 전화의 변화 2,3, 세균 persister 형성 4, 전사 등의 유전자 조절 기능에 대한 통찰력을 (검토를 위해 1 참조) 부여, 형광 기자 식의 영화를 획득하고 정량화하기 위해 개발되었습니다 시작과 신장 5, 6,7 파열 전사, 세포주기 의존 8,9, 및 유전 10. 그러나 OBTaining 품질의 단일 세포 형광 시계열 배양에서 상당한 기술적 도전 제어 환경에서 획득 한 형광 영화의 높은 처리량 정량에있는 세포의 단일 층을 포함한다. 여기에, 우리는 S의 형광 영화를 획득하고 분석하는 절차를 설명 세포 배양 장치 제조 또는 소프트웨어 개발없이 필요한 경험 (그림 1) cerevisiae의.
첫째, 우리는 당신에게 세부 사항을 예를 들어 프로토콜을 하나 이상 형광 기자를 표현 신진 효모에 대한 형광 시계열 영화를 생성합니다. 사용자 정의 미세 배양 챔버를 구축하고 성공적으로 이전 11-13 사용되어 왔지만, 우리는 CellAsic (헤이워드, CA)에서 상업적으로 이용 가능한 미세 유체 장치를 사용하십시오. 시스템 경계 단층 성장 세포의 관류 환경을 지속적으로 제어 할 수 있습니다. 우리가 제시 현미경 프로토콜은 fluoresc를 얻을 수있는 간단한 방법입니다레퍼런스 신진 효모의 영화,하지만 수정 된 실험 프로토콜 (사용자 정의 문화 장치, 대안 미디어의 조건 등.) 단일 효모 세포의 유사 형광 동영상 데이터를 산출로 대체 할 수 있습니다.
다음으로, 우리는 시계열 데이터를 추출하는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 기반 MATLAB에서 소프트웨어 패키지 (매스 웍스, 틱, MA), 형광 시계열의 신속한 분석 (이식)에 대한 GUI 별명을 사용하여 영화의 분석을 설명 단일 세포. 이식 세포를 분할 및 추적과 형광 강도 및 형상 정보를 추출에서 다양한 오픈 소스 소프트웨어 패키지 셀 ID (14)와 유사한 기능을 가지고 있습니다. 그러나 이식은 중요한 추가 기능을 제공합니다. 첫째, 세분화 및 데이터의 정확성보다는 분석 후 국외자 지역 트레이스 단지 통계 게이트를 확인하기 위해 추적 결과를 쉽게 대화 형 편집을 제공합니다. 또한, 그것은 automaticall에 분석을 확장Y 지명 한 계보와 신진 효모의 관심의 세포주기를 가리 킵니다. 어머니와 딸은 두 개의 독립적 인 셀 영역을 형성하기 위하여 분할하는 경우 결정하는 전체 세포 (연결된 새싹을 포함한 어머니) 세포주기 8에 걸쳐 측정을 결정하는 매우 중요합니다. 제품군은 이러한 작업을 수행하기 위해 3 개의 모듈로 구성되어 있습니다. 집중과 산만 시야 이미지 사이의 대비를 기반으로하며 첫 번째 세그먼트 셀 영역은 사용자가 분할 매개 변수를 정의하고 시각적으로 테스트 할 수 있습니다. 초 (.에서 제공 블레어 크로커 등 IDL 루틴 듀프 레인의 MATLAB 구현을 사용하여 : 트랙 http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ )과 시간을 통해 셀 영역을 측정, 자동 계보를 할당하고, 육안 검사를 수 및 오류 수정. 간단한 플로팅 GUI는 쿼리를 단일 셀 속성에 포함되어 있습니다. 세 번째 모듈은 꽃 봉오리 출현과 분열 티타늄을 돌린다MES, 및 전체 세포의 시계열 데이터뿐만 아니라 그들의 첫 번째와 두 번째 시간 미분을 (같이 9에서 설명)를 출력합니다. 분석 모듈은 선택의 통계 소프트웨어의 후속 연구를위한 공백으로 구분 된 텍스트 파일로 데이터를 출력합니다. 따라서, 패키지는 사용자가 그래픽 인터페이스를 통해 높은 품질의 시계열 데이터를 추출 할 수 있습니다. 우리는 세포주기 9의 함수로 하나의 신진 효모 세포에서 실시간 녹음 속도를 추정하기 위해이 방법을 사용했습니다. 모듈이 싹 트는 효모, 매개 변수 또는 최적화되어 있지만, 필요한 경우, 자유롭게 사용할 코드는 다른 생물 및 이미지 유형에 적용 할 수 있습니다. 분할, 추적, 혈통 할당 알고리즘은 할당 된 이미징 및 문제 유기체의 유형에 해당 할 수 있습니다. 기존의 알고리즘은 대체하지만 여전히 사용자 친화적 인 육안 검사와 분할의 보정 변함 occu 추적 오류를 허용하는 GUI 인터페이스를 유지 할 수어떤 알고리즘 연구.
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Protocol
1. 미세 유체 챔버에서 성장하는 단일 효모 세포의 형광 현미경 동영상을 얻을
- 갓 성장 플레이트의 세포와 1 ML SC 미디어 (2 % 포도당과 아미노산의 완전한 보완이 합성 정의 미디어) 접종하고, 30 ℃에서 롤러 드럼 ~ 16 시간 배양 밤새 배양 최종 OD 600nm의 조기 로그 단계 성장 ~ 0.1이다 문화 등 준비합니다.
- OD 600nm의 = 0.1 스타터 필요에 따라 문화와 신선한 테스트 튜브에서 자라지 1 ML을 추가 6-8시간을 희석. 이 microfluidic 장치에로드하는데 적절한 농도로 영양이 풍부한 정상 상태로 성장 세포를 제공합니다. (또는, 실험에 필요한 세포를 준비하는 데 필요한 절차 단계 1.1-1.2를 대체합니다.)
- CellAsic에서 Y04C 미세 배양 플레이트를 준비 배송 용액을 제거, 멸균 물 우물을 씻어하고, ONIX 관류 시스템 흐름을 사용하여채널을 플러시 5 분 10 PSI에서 우물 1-6를 통해 물. 그런 다음 10 초 (로드 채널이 훨씬 더 높은 유속이 별도로 플러시해야한다) 6 PSI에 잘로드 8의 흐름.
- 모든 우물에서 물을 제거하고 잘 8로드 셀의 입구에 250 μL SC 우물 1-6 단계와 1.2 문화의 50 μL로 교체합니다. (또는 다른 조건 사이의 전환을 요구하는 실험 입구 우물 1-6에서 원하는 미디어를 넣습니다.)
- 플레이트에 ONIX 매니 폴드를 밀봉하고, 잘의 시작 미디어를 들고 단지 입구에서 6 PSI 적어도 5 분 뒤에 2 분 동안 6 PSI에 입구 우물 1-6에서 흐르는하여 프라이밍 채널과 문화 챔버 시작 실험. 단계 1.7까지 지속적으로이 흐름.
- 실험 현미경을 준비합니다. 우리는 캐스케이드 II 백 조명 EMCCD 카메라 (배광, 투싼, AZ)과 혈구 AXIO Observer.Z1 위드 현미경을 사용 루멘 200 메탈 할라이드 아크photobleaching에 방지하기 위해 10 % 감쇠 형광 여기에 대한 램프 (PRIOR 과학, 록클 랜드, MA). 여러 개의 형광 채널에 취득하는 데 필요한 스위칭 시간을 최소화하기 위해, 우리 부부 CFP, YFP 및 RFP에 적합한 여기 / 방출 필터 단일 트리플 대역 통과 이색 필터 큐브 (; 세트 89006 채도 기술 공사, 폭포, 버몬트 벨로 우스) 외부, 고속 스위칭 필터 휠 (Ludl 전자 제품, 노바 토, CA)에서 설정합니다.
- 목표 (필요한 경우, 우리는 혈구 계획 - 고차 색지움 63X/1.40 오일 DIC를 사용)에 침지 액 몇 방울을 배치하고 거꾸로 현미경의 무대에 안전하게 microfluidic 장치를 마운트합니다. 플레이트 실험을하는 단계에서 전혀 이동하지 않습니다 보장하는 것은 데이터 분석시 세포 추적을 향상시킵니다. 우리는 단순히 이동을 방지하기 위해 무대 산에 판을 테이프입니다.
- 임베디드 포지 중 하나를 사용하여 첫 번째 문화 챔버의 왼쪽 세 번째 (챔버의 높이가 최소입니다)에 초점TION 마커. 물론 미디어 입구에서 흐름을 끄고 셀 흐름은 5 초 파열 6 PSI에 잘 8로드. 세포 배양 챔버 주위를 보는 단계로 이동합니다. 원하는 세포 밀도가 달성 될 때까지 시간의 흐름과 압력을로드 증가하지만, 오버로드와 신선한 미디어 챔버를 들어 왼쪽 장벽을 막힘 방지.
- 또한 6 PSI에서 시작 미디어를 포함하는 미디어 입구에서 흐르는 시작합니다.
- MetaMorph (분자 장치, 서니 베일, 캘리포니아) 또는 기타 현미경 자동화 및 제어 소프트웨어, 시간이 지남에 따라 여러 단계의 위치에서 여러 이미지를 가지고하는 다차원 인수를 설정. 의 수와 시간 점 사이의 간격을 설정합니다. ~ 10 셀마다 여러 단계의 위치를 선택합니다 (빨리 혼잡하게됩니다.) 우리는 일반적으로 각 각 시점에서 취득시 ~ 11 초 요구하는 최대 16 자리까지 5 분 간격 및 이미지를 사용합니다.
- 있도록 각 단계의 위치에서 각 시점의 일에 인수를 설정전자 프로그램 것이다; 취득 BF 투과광 시야 (BF) MetaMorph에 내장 된 자동 초점 방식 (초점 정확도를보다 제어를 제공 각 단계의 위치의 시작 부분에 사용자가 작성한 전표로 자동 초점을 구현)를 사용하여 이미지에 초점을 초점면 (FP)에 +1 μm의에서 이미지, FP (이미지 사이에 필요로 포커스를 변경하는 사용자가 작성한 저널을 사용) -4 μm의에 초점 BF (BFOOF) 이미지를 획득하고 하나를 그레이 스케일 인수 최소한의 photobleaching에 신속한 수집을 위해 최적화 된 설정을 사용하여 FP 각 형광 기자에 대한 이미지.
- 필요한 경우, 세포 배양 챔버의 공간에서 형광 리포터 배경 및 음영 보정 이미지를 얻을 수 있습니다.
- ONIX 제어 소프트웨어의 실험 흐름 프로그램을 준비합니다. 동시에 MetaMorph에서 수집 프로그램 ONIX 제어 소프트웨어 흐름 프로그램을 시작합니다.
- 실험의 끝에서, 유엔 수정형광 이미지 (필요한 경우), 선택적. STK 동영상 파일 (위치 1 등 만들기 BF, BFOOF, CFP, YFP 및 RFP 영화에 각 단계의 위치에서 각 이미지 채널에 대해. TIF 파일을 결합에도 배경 및 음영 ).
2. MATLAB에서 FormatData GUI를 사용하여 추적을위한 포맷 및 세그먼트 데이터 (그림 2)
- 데이터 입력 GUI를 열려면 MATLAB에서 FormatData.m 파일을 실행합니다. 상단에 지정하거나 데이터 디렉토리를 설정하는 이미지 파일이 들어있는 폴더로 이동 한 후 실험에 기록 된 데이터 유형과 이미지 파일을 지정하는 GUI를 사용합니다.
- 오른쪽으로 수행 할 분석 유형을 나타내는 "시간 경과"옆에있는 라디오 버튼을 선택합니다. "시간 경과"시간 시리즈 (예를 들어, 마이크로 유체 챔버에서 성장 세포의 동영상)로 이미지 시리즈를 처리합니다. "정적"인구 (예 : 여러 개의 이미지가 DIF에서 찍은에서 가져온 스냅 샷 집합으로 각 이미지 시리즈를 취급합니다단일 슬라이드 샘플에 ferent 위치). 이 이식 버전에서는 여러 위치에 대한 시간 경과 데이터가 있지만 각 위치에 대해 별도의 파일 (단계 2.14)로 처리 할 수 있습니다.
- 프레임 내에서 명백한 세포의 움직임을 최소화하기 위해 영화에서 각 이미지를 이동하여 부정확 한 무대의 움직임을 보정 할 이미지를 등록 확인란을 선택합니다. 우리는 강력하게 크게 (나중에 수동 트랙 큐 레이션을 감소) 추적 개선 등이 권장하지만 이미지가 국경에서 이동 된 위치를 채우기 위해 임의의 "백색 잡음"픽셀 값을 추가합니다. 또한 단계 2.7에서 세그먼트 BF 이미지를 볼 후 또는 단계 2.13까지 어느 시점에서 선택 될 수있다.
- "데이터 채널"패널에서 "시야"확인란을 선택합니다. BF 이미지를로드 할 수있는 권리를 "선택"을 클릭합니다. *. TIF 파일을 선택, Shift 키를 누른 상태에서 하나의 동영상에 해당하는 모든 BF 이미지를 선택한 다음 "열기"를 클릭합니다. *. STK 파일의 경우, 단지 관심 BF 스택을 선택합니다. 이미지가 성공하는 경우완전히 인식, 파일 이름은 "인식 데이터"는 패널의 오른쪽에있는 팝업 메뉴에 나열됩니다. . * TIF 파일의 파일 이름 (- BF_t001 등을 수집하는 동안 순차적 이름으로 파일을 저장) 올바른 순서로 표시해야합니다.
- "시야 (초점)"확인란을 선택하고 오른쪽에있는 팝업 창에 표시됩니다 BFOOF 파일을로드하는 단계 2.4에서와 같이 "Select"(선택) 버튼을 사용합니다. (BFOOF 잘 63X 세그먼트에서 FP에 비해 BF -4 μM로 얻었다.)
- "셀 마스크"확인란을 선택합니다. "마스크 소스"패널에서 "세그먼트 BF"옆의 라디오 버튼을 선택합니다. 분할 GUI를 열려면 "매개 변수"버튼을 누르십시오. (또는,이 경우, BFOOF 영화가 필요하지 않습니다. 후자를 누르면 단계와 2.4에서와 같이 영화를 선택하여 "선택 마스크 파일"버튼 옆에있는 라디오 버튼을 선택하여 사전 분할 마스크 동영상을 선택하고, 2.8 단계를 건너 뛸 수 있습니다.)
- 다른 분할 매개 변수 (각각의 설명을 볼 수 있습니다 설정"매개 변수 설명")을 눌러 및 "테스트"(그림 3)를 클릭하여 분할 품질을 테스트하여 에드. 성공적으로 분할 영역은 마젠타 테두리가 녹색이어야합니다. 영화에서 여러 시간 지점을 확인하는 슬라이더를 사용하십시오. 분할이 만족되면 FormatData GUI로 분할 매개 변수를 반환하는 "완료"를 선택합니다.
- "색상 이미지"확인란을 선택합니다. 텍스트 편집 상자에서 첫 번째 형광 이미지 채널의 색 이름을 입력 한 다음 Enter 키를 눌러 "추가하고 선택"단계 2.4에서와 같이 컬러 파일을로드 할 수 있습니다. 색상 이름은 왼쪽에있는 목록 상자에 추가되고 파일 이름은 오른쪽에있는 테이블에 추가됩니다. 실수가 컬러 파일을로드 제 경우 왼쪽에있는 목록 상자에서 색 이름을 선택하고 파일을 제거하려면 "제거 색"을 클릭합니다. 각 색상 채널에 대해이 단계를 반복합니다.
- 추가 하위 영역 마스크 형광 색상 중 하나 (예 : 찬란 핵 → nucl에 따라 경우귀 지역의 마스크가) 필요한있다 "컬러 마스크"확인란을 선택합니다. 그렇지 않은 경우, 2.12 단계로 건너 뜁니다. "컬러 마스크 소스"패널에서 텍스트 편집 상자에 하위 영역 마스크 이름을 입력합니다. "컬러 마스크 소스"패널 (색은 6 단계에서 추가 된 필요)에서 팝업 메뉴에서 색상을 선택하고 GUI를 테스트 임계 값을 열고 "매개 변수"를 누릅니다.
- 자동 오츠의 방법 15을 사용하여 임계 값을 결정하고, 이미지가 임계 값 (그림 4) 이상 보존 영역을 강조 할 것 "자동 임계 값"버튼을 누르십시오. 임계 값을 수동으로 편집 상자를 사용하여 조정할 수 있습니다. 임계 값이 모든 시간 지점에 대한 적절한 확인하려면 스크롤 막대를 사용하십시오. 만족하면 FormatData GUI에 임계 값으로 돌아가려면 "완료"를 누르십시오.
- 밀어 선택한 컬러 이미지에 적용되는 임계 값 모듈을 사용하여 하위 영역 마스크를 생성하기 위해 "추가하기 그리고 세그먼트". 컬러 마스크 이름과 소스 관련 연구로, 왼쪽 표에 표시됩니다오른쪽 표에 나타나는 ecognized 파일 이름. (또는 눌러 "추가하고"미리 만든 하위 영역 마스크 파일을로드 할 수 있습니다.)
- 아래에서 지정하거나 저장 디렉토리로 사용하기 원하는 폴더로 이동합니다.
- : 이미지 (에서 사용할 수 프랑소와 Nedelec에 의해 개발 된 tiffread2.m 코드를 사용하여 파일을 읽고 "포맷 데이터"를 눌러 http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 , 프로세스 데이터 및 *를 생성) 지정된 폴더에있다. 매트 파일입니다. 이 파일은 ProcessTimeSeries GUI에 입력 될 것입니다.
- 각 단계의 위치에 대한 영화 세트에 대한 단계 2.4-2.13를 반복합니다.
3. ProcessTimeSeries GUI 및 큐 레이트 ID와 리니지 할당 (그림 5)와 함께 시간을 통해 트랙 세포 및 계보
- 추적 GUI를 열려면 MATLAB에서 ProcessTimeSeries.m 파일을 실행합니다. 개봉 후 다음 매개 변수를 설정합니다GUI :
- "상공 회의소 높이"( "파일 I / O"패널 왼쪽 위) - 이것은 세포가 갇혀있는 챔버의 높이를 나타냅니다. 그것은 8에서와 같이 셀 지역의 주요 및 보조 축을 기준으로 3D 타원체로 세포 부피에 가깝게있는 제약 조건으로 사용됩니다.
- "μm의 / 픽셀"(패널 "I / O를 파일") - 단면적과 부피는 각각 μm의 2 μm의 3에서 계산 될 수 있도록 이미지를 μm의 거리를 픽셀을 보정하는 변환 계수.
- "필터 패널"(아래의 "파일 I / O"패널) - 설정 최소 마스크 정크 영역을 필터링 할 최대 변수 "영역"- 픽셀 영역 영역; "ECC"- 편심 계수 → 0으로 더 많은 원형 , "SF"- 형상 계수, → 1 등보다 원형.
- "파일 I / O"패널에서 "이미지로드"를 클릭하고 FormatData GUI하여 관심 출력 *. 매트 데이터 파일을 선택합니다. 지역 마스크 (및 하위 영역 마스크) 각 색상 채널에 적용됩니다, 다른 측정의 수는 (표 1) 만들어집니다. 데이터 파일은 저장됩니다. 이전 세션에서 ProcessTimeSeries에 파일을로드하는 경우 분석은 처음부터 다시 시작해야하는 경우 (, 그것을 요구합니다주의 :..이 이미 완료 모든 트랙의 큐 레이션을 삭제하고 FormatData GUI에서 신선한 것처럼 데이터를 처리 할 경우, 실수로 신속하게 덮어 쓰지 않도록 이전에 기획 *. 매트 파일을 방지하기 위해 MATLAB 명령 창에서 Ctrl + C를 누르십시오, 다시 시작됩니다.)
- 다음으로, 세포를 추적 할 수 있습니다. "트랙 셀"패널 ( "필터"패널 옆)에서 다음 매개 변수를 설정합니다 :
- "최대 변위"- 세포가 다른 세포로 표시되기 전에 인접한 이미지 사이를 이동할 수있는 픽셀의 최대 거리. 높은 변위 알고리즘을 더 이동하는 세포를 차지할 수 있다는 것을 의미하지만, 그것은 또한 군중의 셀 영역을 일치의 복잡성을 증가시킨다. 우리는 (3 단계 참조 12에서 시작하여 오류 추적에 발생하면 감소.4).
- "최소 길이"- 유효한 데이터 시리즈 고려해야 할 셀 추적에 대한 발생의 최소 개수. 우리는 실제 트레이스의 제거를 방지하기 위해 1을 사용하지만이 짧은, 스퓨리어스 영역 흔적 분할 결과 경우 증가 할 수 있습니다.
- "프레임 메모리"- 연속 프레임의 최대 수를 셀 영역이 사라질 수하고 반환 할 때 동일한 ID를 부여. 그것은 "프레임 메모리"이상 사라지면, 그것은 반환에 새 ID를 받게 될 것입니다. 우리는 영역을 반환하기 전에 2 프레임의 분할에 의해 놓친 수 있도록 2를 사용하십시오.
- 지역 중심들을을 (: 블레어와 크로커의 듀프 레인 MATLAB 구현 그리어, 그리고 주 IDL 루틴에서 사용할 수를 사용하여 다음 단계로 하나의 프레임에서 영역을 추적 할 수있는 "트랙 셀"을 클릭 http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) 새로 나오는 새싹에 대한 계보를 할당하고, 데이터를 저장 할 수 있습니다. 계보가 자동으로 분에 의해 할당 할 수 있습니다각 프레임에서 추정 새싹과 잠재적 인 어머니 사이의 거리를 imizing. (오류가 "어려운 조합론"에 의한 MATLAB 명령 창에 나타나면, "최대 배기량을"감소 및 추적을 반복한다.) 매개 변수를 변경하여 데이터의 필요에 따라 팝업 창합니다.
- 다양한 GUI 도구 또는 바로 가기 키 ( "선택된 셀 정보"패널 위의 버튼을 눌러 팝업 창에 표시)를 사용하여 제대로 분할 영역 및 ID 또는 계보 과제에서 실수를 큐 레이트.
- 슬라이더, "이전 이미지", "다음 이미지"(Ctrl 키 + 왼쪽 / 오른쪽) - 표시 이미지 시리즈의 프레임 사이를 이동하는 데 사용합니다.
- "이미지 #"는 - 왼쪽과 오른쪽 축에서 현재 이미지의 프레임 번호를 표시합니다. "# 이미지"편집 상자의 오른쪽에있는 해당 번호를 입력하여 특정 프레임으로 이동합니다.
- "델타 프레임"- (- 왼쪽 Δ = 오른쪽) 오른쪽과 왼쪽 축 사이의 프레임 수의 차이를 보여줍니다.
- (Ctrl 키 + T) "텍스트 숨기기"-의 셀 ID를 표시간에 전환오른쪽 축이나하지.
- "숨기기 레이블"(Ctrl 키 + L) - 왼쪽 축 또는하지의 셀 ID를 표시 사이를 전환합니다.
- "마스크"팝업 메뉴 - 더 마스크, 셀 마스크 또는 왼쪽 패널에 표시 할 사용자 정의 된 서브 마스크를 표시하지 사이에서 선택합니다.
- "오버레이"팝업 메뉴 (Ctrl 키 1-9)는 - 왼쪽 프레임에있는 BF 및 색상 레이어를 표시하려면 선택합니다. 표시 BF는 두 축에서 BF 레이어를 켜거나 끄기 설정을 전환 한 것입니다. 다시 메뉴에서 오버레이 이름 ( "*"오버레이가 표시됩니다 의미)를 선택하여 표시 사이의 여부를 전환합니다. 2-9 순서로 색상 오버레이 전환에 CTRL +1 전환 BF 오버레이.
- "설정 색상"- 오버레이 디스플레이 색상을 결정하는 데 사용합니다. 팝업 창 설정하는 형광 채널을 쿼리하고, 다음 색상 팔레트는 사용자 정의에 나타납니다.
- 패널 "지역 및 트랙을 수정"- 이것들은 세포 영역 마스크 및 추적 정보에 대한 효과 변경 제어 :
- "업데이트 트랙"(Ctrl 키 + U)는 - 다시 사용셀 ID를 지정합니다. 어떤 세포는 오른쪽 축에서 선택하지 않으면 셀 ID를 변경하려면, GUI는 메시지가 표시됩니다. ID X가 Y로 변경 될 때, X 이후의 모든 인스턴스는 Y로 변경되며, 현재 Y의 미래 인스턴스 (X.으로 전환됩니다 때때로 하나의 셀 반복, 2 ID 사이를 앞뒤로 전환합니다.이 오히려 업데이트 ID 함수에서 오류보다 oversegmented 지역에서 여러 ID를 수용하기 위해 노력하고 추적하기 때문입니다.) 여러 셀을 선택하고 해당 ID는 동시에 변경, 각에게 고유 한 ID를 제공해야 할 수 있습니다. 현재 파일에 존재하지 않는 ID에 영역을 할당하려면 "0"을 입력하고 하나가 생성됩니다. 두 강조 셀의 ID를 교환하기 위해 Ctrl 키 + W를 사용합니다.
- "선택한 트랙 삭제"합니다 (Ctrl + D) - 현재 오른쪽 축 프레임에서 선택한 셀 또는 여러 셀 영역을 삭제하십시오. (어떤 셀이 선택되지 않은 경우, ID를 입력하라는 메시지를 표시합니다.) 영구적 ID 추적의 모든 인스턴스를 삭제하려면, 드 옆의 확인란을 선택LETE 선택된 트랙 버튼 (텍스트 "모두 삭제"로 변경됩니다.) 이 영구 정크 지역에 시달리지 유용하지만, 첫 번째 ID가 유효한 셀 또는 꽃 봉오리 영역에 전환되지 않도록하기 위해 미래의 프레임을 확인합니다.
- "병합 영역"(Ctrl 키 + A 또는 M)는 - 셀 영역을 부드럽게하고 결합합니다. 선택 오른쪽 축 셀 (선택한 경우 영역이 빨간색으로 변합니다)를 클릭합니다. 한 지역에 병합 형태 학적으로 디스크 모양의 요소를 사용하여 균열 또는 작은 손실 덩어리를 기입 부근에 있습니다. 두 개 이상의 인근 지역을 병합 한 지역으로 그들을 결합하고 새로운 영역으로 낮은 ID를 제공합니다. 이 오버 분할 영역 (세포가 큰 액포가 종종 경우)에 유용합니다.
- "지역 그리기"- 원하는 오른쪽 축에서 영역을 그리는 두 번 완료를 클릭하여 마우스를 사용합니다. 데이터 세트 (1 ~ 65535 사이)에 존재하지 않는 고유 한 ID를 제공합니다. 키보드의 삭제 키를 눌러 취소합니다.
- "리니지 추적"패널 - 추적 한 후,계보 할당이 자동으로 생성됩니다. 새로운 ID 영역이 표시되면, 새로운 셀 ID가 분홍색으로 표시되고 빨간색 선은 어머니 영역에 그려집니다. 너무 큰 새로운 지역 봉오리거나 너무 멀리 잠재적 인 어머니에서 녹색으로 표시하고 "NaN이"( "숫자가 아님", 표 2 참조)의 어머니 ID를 할당합니다. 처음 점에서 기존의 지역 "0"어머니의 ID를 가지고 있습니다. 개별 과제를 해결하려면 텍스트 편집 필드에서 어머니와 새싹 ID를 입력하고 "수정"을 클릭합니다. 셀의 어머니를 지우려면, 그 어머니로 "0"을 입력합니다. 빠른 방법은 오른쪽 이미지의 두 영역을 선택하고 Ctrl 키 + F를 누르입니다 딸 셀에 대한 기존의 모든 어머니 할당을 삭제하는 동안이 자동으로, 딸과 어머니와 새로운 지역으로 이전 영역을 할당합니다. 주의 : 언제든지 "계보를 계산"클릭을 포함하여 계산 모든 계보 할당, 사용자가 이전에 기획했다합니다.
- "선택한 셀 정보"패널 - "I에게 받기NFO "는 오른쪽 축에서 선택된 영역의 몇 가지 측정을 표시합니다."측정 "(데이터 내보내기"사용자가 어느 측정뿐만 아니라 다른 작업에 대한 기본 목록을 정의)이 표시됩니다 결정할 수 있습니다. "사용할 수 있습니다 올바른 ID와 계보 (예를 들어, 셀 X는 시간 t에서 새싹이있는 경우, 그것은 가능성이 가장 높은 시간 t에 다른 싹이 없습니다 + 5 분)을 결정합니다.
- 업데이트 * 매트 파일을 사용자가 변경 사항을 반영하기 위해 -.합니다 (Ctrl + S) "변경 사항 저장"을 선택합니다. 자주 사용하는 (아무 기능을 취소 없음)!
- "플롯 생성"- GeneratePlots GUI를 엽니 다. 빨리 ProcessTimeSeries GUI, 그들의 평균, 또는 각 프레임에있는 모든 지역의 평균의 오른쪽 축에서 강조 단일 셀 영역에 대한 선택 변수 정보와 간단한 계산을 그릴 때 사용합니다. 이 GUI는 거친 최초의 파생 상품을 계산하지만 왼쪽에 정확한 시간 간격을 지정해야 할 수 있습니다. 플롯은 "그림을 생성"버튼을 누르면 저장을위한 그림으로 출력 할 수 있습니다.
- 데이터를 제대로 보좌 신부하려면 : 모든 oversegmented 지역을 병합, 전체 셀을 캡처되지 않은 영역을 삭제할 어머니 봉오리 관계가 제대로 (빨간색 선이 꽃 봉오리 출현시 그 사이에 나타납니다 할당해야합니다, 새싹 ID가 분홍색 인 경우, 참조 표 2) 및, 지역에게 어머니를 할당 ID를 고정 어머니가를 ( "0"), 할당하거나 영역을 삭제하는 녹색 ID를 제거합니다. 그 어머니에게 꽃 봉오리 영역 (가 부정확 볼륨 추정으로 이어질 것) 병합하지 않도록 봉오리 데이터는 최종 분석하는 동안 어머니의에 추가됩니다.
- 시각적으로까지 관심의 마지막 시간을 각 프레임에 대한 데이터를 검사하지만, 나중에 프레임을 사용하지 않는 경우는 전체 시계열 필요하지 않습니다.
- 변경 사항을 저장해야합니다.
- 를 반복하여 각 단계의 위치를 *. 매트 파일에 대한 3.1-3.7 단계를 반복합니다.
4. 분석을위한 데이터 내보내기
- 단순히 팀을 통해 각 셀에 대해 원시 영역 측정을 내보내려면E, "데이터 내보내기"를 누릅니다. 그 측정이 열립니다 GUI에서 선택할 수 있습니다, 그들은 공백으로 구분으로 출력됩니다 *. TXT 열 헤더와 같은 변수 이름을 가진 파일입니다.
- 시간이 지남에 따라 전체 세포에 대한 시계열을 분석, 세포주기 정보를 계산하고 파생 상품을, "시계열 분석"을 누릅니다. 창은 관심과 분석 매개 변수를 입력 (그림 6)의 측정을 선택할 수 있도록 열립니다.
- GUI (이후의 모든 프레임은 무시됩니다)에서 큐레이터 마지막 점을 입력합니다. 기본 부드럽게하고 세포주기 할당 매개 변수는 우리의 반수체 5 분 간격으로 몇 군데 배체 계통 위해 잘 작동하지만, 이러한 최상의 결과를 위해 변화해야 할 수 있습니다. (매개 변수 값을 수동으로 테스트 데이터 집합 신진과 분열 시간을 결정하고 자동화 된 알고리즘의 성능을 비교하여 적절한 지 확인하십시오.)
- 모든 매개 변수가 설정된 경우에 "분석"푸시 :
- 단점각 원시 측정을위한 배열을 truct와 배경 (각 형광 동영상의 첫 번째 프레임의 비 세포 영역의 평균 강도로 측정하거나, 세포 픽셀 당 평균자가 형광을 고려하여 지정 될 수 있습니다) 뺍니다.
- 고주파 측정 잡음 (로 9에서 설명) 제거하기 위해 선택한 측정에 부드럽게 스플라인을 맞 춥니 다.
- 자동 9에서 논의 볼륨 시계열의 기울기의 변화에 따라 각 셀에 대한 봉오리 출현 및 세포 분열 시간을 결정합니다. 새싹 측정 후 연속 전체 세포 시계열 출현과 나눗셈 각주기 사이에 어머니의 측정에 추가됩니다. 정규화 된 세포주기의 진행은 부문 부문에 0에서 2까지 계산됩니다.
- 안정적인 1 차 및 선택된 측정의 2 차 파생를 취할 스무딩 스플라인을 맞 춥니 다. (잘 정의 된 파생 상품, 시계열의 목적이전주기의 끝점을 충족하기 위해 다음과 같은 세포주기에 대한 데이터를 이동하여 부문에 걸쳐 지속됩니다.)
- 출력 각 측정 배열로 원시와 부드럽게 시계열 모든 지역에 대한, 그리고 전체 세포 부드럽게, 연속, 차별화 된 시계열. 첫 번째 요소는 배경 공제 컬러 인덱스, 첫 번째 행의 나머지는 셀 ID를 보유하고있는 첫 번째 열의 나머지 부분은 프레임 번호이고, 나머지 요소는 각 행과 열에있는 각 단일 셀에 대한 시계열 개최 첫 번째 열에는 프레임에 대응. 세포주기의 진행 시간 시리즈와 혈통 정보와 비슷한 배열도 출력됩니다. 배열은 "LineageArray은"어머니 ID, 새싹 ID, 첫 번째 꽃 봉오리 영역의 구조, 추정 신진 프레임 및 예상 분할 프레임입니다 다섯 번째 열을 통해 어머니 봉오리 관계의 첫 번째를 나타내는 각 행이있는 테이블이 포함되어 있습니다. 데이터는 *. 매트 파일 (MATLAB 데이터 파일)로 내보내집니다.
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Representative Results
성공적으로 수행하고 분석 실험은 현실적으로 할당 봉오리 출현과 분열 시간을 갖는 단일 전체 셀에 대한 대부분의 연속적인 시계열을 얻을 것입니다. 예를 들어, 우리는 성장과 글로벌 식 단세포 시간 (표 4, Y47에 다를 수 있습니다 방법을 관찰하기 위해 제정 ADH1 프로모터에 의해 구동 리안 형광 단백질의 통합 사본 (CFP)를 표현하는 반수체 효모 균주 위의 프로토콜을 수행 ). 우리는 시간이 지남에 따라 (그림 7A) 측정 전체 셀을 얻기 위해 시계열 분석을 실행하고, 9 발견 세포주기에 의존 볼륨과 표현 모두 나온다. 단백질 농도, 또는 평균 강도가 약간 (그림의 7B 및 7C) 감소하면서 봉오리 형성 한 후, 총 결합 된 볼륨 (어머니 + 새싹) (8,16와 일치) 더 빨리 봉오리 출현 이전보다 증가합니다. 결합 INTEGRA 상승테드 단백질 (이 경우 볼륨 NOx 농도)는 신진 (그림 7D) 후 가속합니다. 혼자 어머니 영역 (그림 7B & D)에 비해, 이러한 결과가 제대로 전체 세포의 측정에 새싹 기여를 통합하고 적절한 봉오리 형성과 분열 시간 할당에 대한 필요성을 강조의 중요성을 보여줍니다. 우리는 9보고있다, 우리는 순간 상대의 mRNA 수준 M (t) 및 전사 율 (T), 두도 (그림 7E 및 7F) 신진 후 증가를 계산하는 차별화 된 시계열을 사용할 수 있습니다 :
측정 시간 시리즈의 안정 시간 미분을 생성하는 기능도 운동 연구를 혜택을 제공합니다. 우리는 전환의 전사 활동 관찰, 비현실적 전사 인자 (표 4, Y962)를 표현하는 효모 균주를 사용합니다. 인산 기아 경로, Pho4p의 마스터 전사 인자는 세포 인산 concentratio N 18에 대한 응답으로 nucleo - 세포질 현지화를 통해 제어됩니다. 우리는 TET 오페론 (Teto의)를 결합 tetR로 Pho4p의 DNA 결합 도메인을 대체하고 C-말단에 Pho4-tetR-YFP 9를 만들 수있는 노란색 형광 단백질에 새로운 전사 인자를 융합. 관류 미디어 인산염 수준을 전환하여, 우리는 7 Teto의 결합 부위로 구성된 합성 프로모터에 의해 구동 통합 CFP의 표현을 전환 할 수차 CYC1 최소 프로모터 (7xtetOpr-CFP). 시계열 분석은 전사 인자가 핵 단계 (2.9-10에서와 같이 RFP 기반의 핵 서브 마스크를 만들 수 RFP의 융합 및 핵 단백질 Nhp2p을 사용하여), 그리고 때 대상 유전자 시작하고 녹음을 중지로 지역화 할 때 표시 (그림 8). 시간이 지남에 따라 파생 시리즈를 분석하여, 각각의 단일 세포에서 대상 발기인의 활성화 및 비활성화 시간은 안정 형광 기자의 농도가 높은 경우에도 유추 할 수 있습니다. 표 1. ProcessTimeSeries GUI의 측정 변수 명명법. 표 2. 계보 할당 상태 셀 ID 색상 코드. 표 3. 이식은 설명 파일입니다. 표 4. 본 연구에 사용 된 효모. 
P (t)는 시간의 총 단백질입니다 T와 γ M은 0.04 분 -1 mRNA의 분해 속도입니다 
그림 1. 프로토콜의 개략도. 프로토콜)를위한 마이크로 유체 문화, 2) 형광, 시간 경과 현미경, 3) 데이터 분석 및 단계에 대해 설명합니다 
그림 2. FormatData GUI. 인터페이스는, 형식, 나중에 계산 및 육안 검사를위한 세그먼트 이미지 데이터를 가져 오는 데 사용됩니다. 숫자는 각 구성 요소에 해당하는 프로토콜 단계를 나타냅니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 
그림 3. SegTest GUI. 인터페이스는 세포의 세그먼트를 테스트하는 데 사용됩니다 ATION 매개 변수를 시각적으로 단계 2.7에서와 같이 분할의 정확성을 확인합니다. 
그림 4. ColorThreshTest GUI. 인터페이스는 단계 2.10로 선택한 형광 채널에서 세포 내 마스크를 만드는 데 필요한 강도 임계 값을 테스트하는 데 사용됩니다. 
그림 5. ProcessTimeSeries GUI. 인터페이스는 측정, 추적, 시각 검사, 셀 지역과 계보 할당을 편집하는 데 사용됩니다. 숫자는 각 구성 요소에 해당하는 프로토콜 단계를 나타냅니다.대상 = "_blank"> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 6. AnalysisParams GUI. 인터페이스는 단계 4.3 및 4.4에서와 같이 시계열 분석에 필요한 매개 변수를 입력하는 데 사용됩니다. 
그림 7. 여러 세대에 걸쳐 미세 문화 ADH1 PR-CFP을 표현하는 반수체 효모의 단일 셀 시계열. (A) 시야 (맨 윗줄)와 CFP (아래쪽 행) 현미경은 실험을 통해 셀의 지정된 시간 지점에 표시됩니다 . 세그먼트 어머니 세포 (파란색 outli에 대한NE)와 그 싹 (녹색 외곽선), 연속 전체 셀은 빨간색으로 설명되어 있습니다. 원시 어머니와 꽃 봉오리 (B) 볼륨 (C) 단백질 농도의 시계열 측정 노이즈를 제거하기 위해 부드럽게되고, (D) 통합 CFP 형광 볼륨과 농도의 제품으로 계산되었다. 전체 셀 (빨간색) 추적이 부문에 걸쳐 미분 평활 스플라인 (B와 D)에 맞게 쉬운 누계를 유지하기 위해 과거의 분열을 연장됩니다. (E) 상대 mRNA의 수준 (F) 순간 전사의 환율을 식 (1-2)와 (D)의 스플라인 맞춤을 사용하여 계산됩니다. 
그림 8. nucleo - 세포질에 발기인 전사 속도 응답단일 효모 세포에서 Pho4-YFP 융합 였죠. (A) 네 개의 지정된 수집 채널에서 현미경은 (B)의 질문에 답변 RFP - 표시된 핵 지역화하는 전환 YFP 융합 Pho4-tetR transactivator와 셀 표시됩니다 인산염과 7xtetOpr - CFP 기자의 (C) 드라이브 식입니다.에 (D) 평균 지역화 (블랙 라인)과와 단일 세포 수준에서 추론 전사 속도 변경 (빨강과 자홍색 선, 빨간색 연속을 나타냅니다 셀 영역)에 빨간색으로 설명했다. 일부 단백질은 딸 셀 손실 된 경우 B에서 CFP 식의 급락은 세포 분열과 일치. 측정 이름 기술 시간 이미지 프레임 번호 지역 총 O 개수영역을 구성하는 F 픽셀 음량 (4 / 3) πabc, 여기서 = 지역의 ½ 장축의 길이, B = ½ 작은 축 길이, C = B 또는 ½ "상공 회의소 높이"(중 작은 값) (X) _ (Y)의 의미 색상 채널의 영역 마스크 (Y) (X)의 픽셀의 강도를 의미 (X) _ (Y) 평균 색상 채널의 영역 마스크의 평균 픽셀 강도 (Y) (X) (X) _ (Y) 표준 색상 채널의 영역 마스크 (Y) (X)의 픽셀 강도의 표준 편차 (X) _ (Y) IQR 25 번째 백분위 수 값 - 75 번째 백분위 색상 채널 (X)의 영역 마스크 (Y)의 픽셀 농도의 분위 범위 (X) _ (Y) T20pct 색상 채널 (X)의 영역 마스크 (Y)의 픽셀 농도의 상위 20 % 강도를 의미합니다. 사용서브 마스크없이 세포 내를 결정하기 위해 다음 측정과 비교에 유용. (X) _ (Y) B80pct 색상 채널 (X)의 영역 마스크 (Y)의 픽셀 농도의 하단 80 % 강도를 의미합니다. 서브 마스크없이 세포 내를 결정하기 위해 이전의 측정과 비교에 유용합니다. (X) _ (Y) M50pct 색상 채널 영역 마스크의 픽셀 농도의 중간 50 %의 (Y) (X)에 대한 강도를 의미 (X) _cellint 전체 셀 (어머니와 연결된 새싹)의 컬러 채널 (X) (픽셀 강도를 의미하는 X 볼륨)의 통합 형광 (Z) 원시 변수 "시계열 분석"에 의해 원시 시계열 데이터 출력 (Z) (Z) 부드러운 변수 "시계열 분석"에 의한 스플라인 부드럽게 원시 시계열 데이터 출력 (Z) (Z) 전체 전체 셀 (M변수 "시계열 분석"의 다른 + 첨부 버드 (Z) Rawsmooth) 시계열 데이터 출력 (Z) (Z) 연속 전체 세포의 시계열 데이터를 변수 "시계열 분석"(Z)에 의해 ( "누적 합계") 부문의 연속 출력했다 (Z) WhSmooth 변수 "시계열 분석"에 의한 스플라인 평활 (Z) 전체 세포의 시계열 데이터 출력 (Z) (Z) DDT 변수 "시계열 분석"에 의한 스플라인 평활의 처음 파생 (Z) 전체 세포의 시계열 데이터 출력 (Z) (Z) d2dt2 변수 "시계열 분석"에 의한 스플라인 부드럽게 두 번째 시간 미분 (Z) 전체 세포의 시계열 데이터 출력 (Z) 셀 ID 색상 리니지 상태 황색 할당 어머니 핑크 새로운 새싹 (할당 어머니 그려진 빨간 선) 녹색 할당 어머니가 없습니다 파일 이름 기술 FormatData.m 데이터를 입력 GUI가 ProcessTimeSeries.m에서 처리 형식으로 영화와 세그먼트 BF 이미지 FormatData.fig FormatData GUI 창 레이아웃 BFsegment.m extractregions2.m 및 segmentregions.m와 BF 분할 모듈, SegTest.m 분할 품질 테스트 GUI SegTest.fig SegTest GUI 창 레이아웃 extractregions2.m 영역을 식별하는 BF 분할 모듈의 첫 번째 구성 요소 segmentregions.m 별도의 깨끗한 세포 지역에 BF 분할 모듈의 두 번째 구성 요소 color2submask.m 형광 기반의 서브 마스크 분할 모듈 ColorThreshTest.m 형광 기반의 임계 값을 마스크 테스트 GUI ColorThreshTest.fig ColorThreshTest GUI 창 레이아웃 tiffread2.m MATLAB에서 사용하기 위해 데이터를 추출 *. TIF 또는 *. STK 파일 imalign.m 차원 간 상관 관계를 사용하여 이미지 등록 ProcessTimeSeries.m 지역을 추적 데이터 처리 GUI는 계보를 할당하고 오류를 시각적으로 교정 할 수 있습니다. 또한 GUI 기반의 그리기 기능을 제공하고 전체 세포 시계열 데이터를 출력 ProcessTimeSeries.fig ProcessTimeSeries GUI 창 레이아웃 cleanMask.m ProcessTimeSeries GUI에서 매개 변수를 기반으로 마스크 영역을 제거 track.m 지역 중심들을 기반으로 셀 영역을 추적 OptimizeLineages.m 리니지 할당 모듈은 물리적 인 거리와 과거와 미래의 신진 이벤트를 기반으로 최적의 어머니 봉오리의 관계를 결정 getClosestObjects.m 각각의 새로운 세포 ID (BUD)에 대한 인접 셀을 찾습니다 SelectVariables.m 그 변수를 선택하기위한 측정 선택 GUI SelectVariables.fig SelectVariables GUI 창 레이아웃 GeneratePlots.m ProcessTimeSeries 창에서 데이터에 대한 GUI를 세우고 GeneratePlots.fig GeneratePlots GUI 창 레이아웃 AnalyzeCellSeries.m 시계열 분석 모듈은 세포 분열 시간을 결정하고 텍스트에 설명 된대로 전체 셀 측정을 출력 assignDivisionsInf2.m 새싹 세포 분열 시간에게 새싹 지정 AnalysisParams.m 세포 시계열 분석 매개 변수 입력 AnalysisParams.fig AnalysisParams GUI 창 레이아웃 스트레인 ID 유전자형 (W303 기반) 참고 Y47 MAT leu2 :: ADH1pr-CFP-hisG :: URA3 :: kanR :: hisG 19 Y962 MAT ADE + NHP2 :: RFP-NAT spl2Δ :: LEU2 pho4 :: TRP1 pho84Δ :: klura3 phm4 :: HIS3MX6 leu2Δ :: TEF1m7pr-PHO4ΔP2-tetR-cYFP URA3 :: 7xtetOpr-CFP 9
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Discussion
위의 프로토콜은 마이크로 유체 또는 소프트웨어 개발에 대한 경험과 형광 시계열 데이터를 확보하고 분석하는 간단한 방법을 설명합니다. 그것은 하나의 단일 효모 세포의 시간 경과 형광 영화를 얻을 수 있습니다, 부목사 추적 및 계보 할당; 해당 셀 크기와 표현 측정을 추출하고 상업적으로 이용 가능한 미세 배양 장치를 사용하여 시간과 다양한 그래픽 사용자를 통해 전체 세포의 동작을 분석 인터페이스 (GUI). 실험, 분할 및 추적 단계는 다양한 방법으로 이전 11,13,14으로 접근하고 있지만, 위의 절차는 생물학 사회의 광범위한 집합에 이러한 기술에 더 쉽게 액세스 할 수 있도록 설계되었습니다. 위의 절차가 특정 미세 배양 장치에 최적화되어 있지만, 전반적인 분석은 저렴하고 더 정의가 기성 미세 배양 기술로 유사한 장치에 적용 할 수 있습니다. fundam을entally, 우리는 고용 분할 및 지역 측정 알고리즘은 기존의 방법 13,14 비슷하지만 이식 소프트웨어는 시각적 영역 추적 및 계보 할당을 부젓가락하고 정확하게 세포주기 단계를 할당하는 기능을 추가합니다. 이러한 기능은 모두 정확하게 데이터 계열의 시간 파생 상품을 계산에 매우 중요합니다.
크게 결과 시계열 데이터의 품질에 영향을 미칠 프로토콜의 여러 단계가 있습니다. 처음에는 세포 배양 챔버를 오버로드하면 (실 재생 시간이 중요한 운동 실험에서 특히 눈에 띄는) 챔버에 관류 감소하고, 전면에 자라 난 이전 실험 시간 과정에서 발생합니다. 이것은 가장 짧은 시간에 대한 낮은 세포 로딩 압력으로 시작하고 적절한 세포 밀도가 달성 될 때까지 점차적으로 하나 또는 모두를 증가 방지 할 수 있습니다. 이미징 단계 위치 선택 관련과 동등하게 중요 consid입니다eration. 얼마나 많은 세포가 시간이 지남에 따라 이미지 프레임의 수 및 밀집 미디어 확산에 미치는 영향을 예상합니다 변형, 계획의 배로 시간을 알고. 열 분산 된 세포는 10 microcolonies으로 성장하지만, 처음 그룹화 열 세포가 하나의 큰 식민지 (이것은 직경 ~ 14 세포보다 큰 경우 우리는 식민지의 중심으로 6 PSI에 영양 보급의 한계를 발견했습니다)로 성장할 것 . 상위 프로토콜 단계에있는 여분의 노력은 나중에 수동 데이터 큐 레이션을 용이하게하고, 출력 시계열을 향상시킵니다. 플레이트가 단단히 무대에 설치되어 있는지 확인하고 크게 자동으로 시간을 통해 하나의 세포를 추적하는 정확도를 향상시키기 위해 FormatData GUI에서 이미지 등록 옵션을 사용합니다. 주의가 필요한 오류의 수를 줄이기 위해 또한 최상의 분할 매개 변수를 선택하는 시간 고객 관리. 를 remerging 때문에 추적 소프트웨어는 약간의 셀 영역 oversegmentation보다는 undersegmentation 가장 잘 작동합니다셀 분할 영역을 분할하는 선을 그리는 것보다 간단한 작업이지만, 증가 oversegmentation은 false, 새로운 영역의 존재로 인해 계보 할당에 오류가 증가합니다. 또한, 전체 셀에 대한 측정이 정확 않도록 모든 어머니 봉오리 관계가 제대로 지정되어 있는지 확인합니다. 꽃 봉오리가 분할에 의해 누락 또는 이미지 경계의 외부에 성장하는 경우, 스퓨리어스 결과를 방지하기 위해 어머니의 데이터 계열을 종료 고려하십시오. 이것은 쉽게 잘못된 프레임에서 고유 한 ID ( "0"의 ID를 입력)에 어머니 영역을 변경하고 새 ID 이후의 모든 인스턴스를 제거하려면 "삭제 ALL"기능을 사용하여 수행됩니다. 다음 단계에주의를 크게 원시 시계열 데이터의 정확도를 높일 것입니다.
"시계열 분석"을 누르면 데이터 출력의 유효한 해석을 확립하기 위해, 우리는 몇 가지 추가 질문을 추천합니다. 꽃 봉오리의 출현과 분열 시간을 확인 정확하게 사용자 inpu에 따라 결정됩니다t 매개 변수를 설정합니다. 수동 테스트 영화 세트 신진과 분열 시간을 기록하고 알고리즘 결과를 비교합니다. 시각적으로 시간 세포질은 어머니와 딸 사이에 완료 예상하려면 좁고 어두워 자신의 경계를 찾습니다. (NB :. 분할 시간을 수동으로 관찰에서 찬란 - 표시된 핵 보조와 시험 균주 또 다른 방법은 플라즈마 막 형광 마크 프로그램을 종료 어머니와 딸 세포 사이의 간격을보고하는 것입니다.). 또한, 촬영 한 빛에서 유래 할 때 셀의 총 형광 나은 (볼륨 곱한 평균 지역 강도 (캡처 빛이 세포의 얇은 단면에서 유래하는 경우) 또는 영역에 대한 통합 형광으로 계산되어 있는지 확인 전체 셀). 셀에 걸쳐 형광 프로파일이 지역 7의 메이저와 마이너 축으로 설명 반 타원의 곡선을 일치하면, 캡처 한 빛은 전체 셀에서 만들어진, 총 형광 소X (지역) (강도를 의미)과 같이 계산할 수 ULD. 셀 높이보다 훨씬 적은 필드의 깊이 63X에서 우리의 경우, 형광 프로파일은 비교적 평평하고 총 형광 X (볼륨) (평균 강도)로 계산됩니다. 또 다른 고려 사항은 형광의 photobleaching에 있습니다. 이 소프트웨어는 분석에 photobleaching에 고려하지 않습니다, 따라서 형광 시계열 출력은 관측 기자를 나타냅니다. photobleaching에 프로세스는 인수 설정 및 형광 이미지, 형광의 특성, 및 기타 다양한 실험을 특정 매개 변수를 얻을하는 데 사용되는 시간 간격에 크게 의존한다. photobleaching에 또한 그것의 처리에 대한 일반적인 알고리즘을 방지하는 간단한 일차 속도 식에 의해 잘 설명되지 않을 수 있습니다. 따라서 우리는 시계열 출력에 photobleaching에 대한 계정을하지 않지만, 분석 방법은 사용자의 해석을 돕기 위해이 과정의 반응 속도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로, smoothi을 선택관찰 된 시계열에 적합한 NG 매개 변수입니다. 데이터의 실제 기능을 유지하면서 이상적으로, 부드럽게 스플라인은 고주파 측정 잡음을 제거합니다. 이 작업을 수행하는 데 필요한 매개 변수는 특정 시계열의 특성에 따라 다르며 실험 사이에 차이가있을 수 있습니다.
이 소프트웨어는 다양한 시간 경과 형광 현미경 데이터 분석을 위해 유연하게 구성되었다. 색상 채널의 수를 포함 할 수 있으며, 어떤은 하위 영역 마스크를 만들 수 있습니다. 알고리즘 신진 효모 세포의 영화를 위해 잘 작동하지만, 기능의 많은뿐만 아니라 다른 생물의 영화를 확장해야합니다. 지역 측정 (볼륨을 제외하고), 추적, 큐 레이션은 셀 마스크에만 의존하므로 적응할 수 있습니다. 세분화, 혈통 할당, 세포 분열 결정하고, 시계열 분석 모듈은 독립적으로 특정 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 또한이 아니라 포함 된 SE를 사용하는 것보다gmentation 모듈은 사전 분할 마스크 영화는 입력 할 수 있으며, 위상차 또는 차등 간섭 대비 이미지는 시야를 대체 할 수 있습니다. GUI를들은 후 ID와 혈통 할당을 추적하고 부목사하는 데 주로 사용 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 소프트웨어에 대한 의견을 에밀리 잭슨, 여호수아 Zeidman, 그리고 니콜라스 렌 감사합니다. 이 작품은 GM95733 (NM)로, BBBE 103316와 MIT 시작 기금 (NM까지)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Y04C Yeast Perfusion Plate | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Microfluidic Perfusion Platform | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Cascade II EMCCD camera | Photometrics | ||
| Lumen 200 metal-halide arc lamp | PRIOR Scientific | ||
| Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set | Chroma Technology Corp | set #89006 | Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato) |
| MAC 5000 controller and filter wheels | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | 64-bit version handles large data files better than 32-bit |
References
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