Förvärva Fluorescens Time-lapse filmer av knoppande jäst och analysera Encelliga Dynamics med transplantat

Summary

Vi presenterar ett enkelt protokoll för att erhålla fluorescensmikroskopiska filmer av växande jästceller, och en GUI-baserad programvara paket för att extrahera encelliga tidsseriedata. Analysen omfattar automatiserad härstamning och division tidstilldelning integreras med visuell inspektion och manuell curation spårade uppgifter.

Abstract

Fluorescens tidsförlopp mikroskopi har blivit ett kraftfullt verktyg i studiet av många biologiska processer vid encelliga nivå. I synnerhet filmer som skildrar den tidsmässiga beroendet av genuttryck ge insikt i dynamiken i dess reglering, men det finns många tekniska utmaningar för att erhålla och analysera fluorescens filmer av enskilda celler. Vi beskriver här ett enkelt protokoll med ett kommersiellt tillgängligt mikrofluidikanordning kultur anordning för att generera sådana uppgifter, och en MATLAB-baserad, grafiskt användargränssnitt (GUI)-baserad programvara för att kvantifiera fluorescens bilder. Programvaran segmenten och spår celler, gör det möjligt för användaren att visuellt komminister fel i uppgifterna, och automatiskt tilldelar härstamning och tider division. Den grafiska analyserar vidare tidsserierna att producera hela celler spår samt deras första och andra derivat tid. Medan programvaran var utformad för S. cerevisiae, bör dess modularitet och flexibilitet gör det möjligt to fungera som en plattform för att studera andra celltyper med några modifikationer.

Introduction

Single-cell analys av genuttryck har främjat vår förståelse av många aspekter av genreglering. Statiska ögonblicksbilder av fluorescerande reporter uttryck med flödescytometri eller mikroskopi ger användbar information om fördelningen av encelliga uttryck, men saknar historia och utvecklingen av tidsseriedata som krävs för att direkt informera dynamiken genuttryck. Fluorescens tidsförlopp mikroskopi utgör ett medel för att erhålla både encelliga mätningar och deras historia. Olika experimentella och analytiska tekniker har utvecklats för att erhålla och kvantifiera filmer av fluorescerande reporter uttryck, därmed förmedla insikter funktioner genreglering (se ¹ för en översikt) såsom cell-till-cell variation ^2,3, bakteriell persister formation ^4, transkription initiering och töjning ^5, transkriptionella spricker ^6,7, cell-cykeln beroendet ^8,9, och ärftlighet ^10. Emellertid OBTaining kvalitet encelliga fluorescens tidsserier innebär stora tekniska utmaningar inom odling ett monoskikt av celler i en kontrollerbar miljö och i high-throughput kvantifiering av de förvärvade fluorescens filmer. Här beskriver vi ett förfarande för att skaffa och analysera fluorescens filmer av S. cerevisiae utan erforderlig erfarenhet cellodlingsanordning tillverkning eller inom mjukvaruutveckling (Figur 1).

Först, detalj vi ett exempel protokoll för att generera fluorescens filmer tidsserier för spirande jäst som uttrycker en eller flera fluorescerande reportrar. Även kundanpassade mikrofluidiska kultur kammare har byggts och framgångsrikt använts tidigare ^11-13, använder vi en kommersiellt tillgänglig mikrofluidikanordning från CellAsic (Hayward, CA). Systemet begränsar celler till monoskikt tillväxt och möjliggör kontinuerlig kontroll av perfusionen miljön. Den mikroskopi protokoll vi presenterar är ett enkelt sätt att få fluorescerENCE filmer av spirande jäst, men något modifierad experimentellt protokoll (en anpassad kultur enhet, alternativa medier förhållanden, osv.), vilket gav liknande fluorescens filmen data för enstaka jästceller kan ersättas.

Därefter skisserar vi en analys av filmer med ett grafiskt användargränssnitt (GUI)-baserad mjukvara i MATLAB (Mathworks, Natick, MA), dubbat GUI för snabb analys av fluorescens Time Series (transplantat), för att extrahera tidsseriedata för enskilda celler. Transplantat har likheter med den mångsidiga, open-source mjukvara Cell-ID ¹⁴ i segmentera och spåra celler och utvinna fluorescens intensitet och geometrisk information. Dock ger transplantat ytterligare viktiga funktioner. Först erbjuder det lätt interaktiv redigering av segmentering och spårning resultat för att verifiera uppgifternas korrekthet, snarare än bara statistiska slussning av utanförliggande region spår efter analys. Dessutom sträcker den analysen till automatically nominerade härstamning och cell-cykel punkter av intresse i spirande jäst. Bestämma när mor och dotter delar för att bilda två självständiga celler regioner är avgörande för att bestämma hela cellen (mor, inklusive alla anslutna knopp) mätningar under hela cellcykeln ^8. Sviten består av tre moduler för att utföra dessa uppgifter. De första segmenten cell regioner bygger på kontrasten mellan fokuserad och ofokuserad ljusfält bilder, och tillåter användaren att definiera och visuellt testa segmentering parametrar. De andra spår (. Använder Blair och Dufresne s MATLAB genomförandet av Crocker et al IDL rutin, finns på: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) och mäter cell regioner genom tiden, tilldelar automatiskt härstamningar, och möjliggör visuell inspektion och felkorrigering. En enkel plottning GUI ingår att fråga encelliga egenskaper. Den tredje modulen tillskriver knopp uppkomst och division times, och matar hela celler tidsseriedata samt deras första och andra derivat tid (vilket diskuteras i ^9). Analysen Modulen matar datan som en rymd-textfil för senare studier i statistisk programvara val. Således möjliggör paketet för användaren att extrahera högkvalitativa tidsseriedata genom ett grafiskt gränssnitt. Vi har använt denna metod för att uppskatta realtid transkription klassar i enkla spirande jästceller som en funktion av cellcykeln ^9. Medan de moduler har optimerats för spirande jäst, parametrarna eller, om så är nödvändigt, kan den fritt tillgängliga koden anpassas för andra organismer och bildtyper. Segmentering, tracking, och härstamning tilldelning algoritmer kan vara specifika för olika typer av särskilda imaging och organismen i fråga. De befintliga algoritmer kan ersättas, men ändå behålla det grafiska gränssnittet som tillåter användarvänlig visuell inspektion och korrigering av segmentering och följningsfel som undantagslöst yrkesr med någon algoritm.

Protocol

Ett. Skaffa fluorescensmikroskopi filmer av Single Jäst celler som växer i en Microfluidic avdelningen

1. Inokulera 1 ml SC-medium (syntetiska definierade media med 2% glukos och fullständig komplement av aminosyror) med celler från en nyligen växande platta och inkubera över natten kultur ~ 16 timmar på en berg trumma vid 30 ° C. Förbered kulturen så att den slutliga OD _600nm är ~ 0,1 för tidig log-fas tillväxt.
2. Späd startkulturen som behövs och avkrävdes 1 ml i ett nytt provrör ytterligare 6-8 timmar till OD _600nm = 0,1. Detta ger celler som växer på en näringsrik varaktighetstillstånd vid en densitet lämpliga för laddning in i mikroflödessystem enhet. (Alternativt, byt steg 1,1-1,2 med det förfarande som krävs för att framställa celler som krävs för experimentet.)
3. Förbered en Y04C mikrofluidisk kultur plattan från CellAsic: ta bort fraktlösning, skölj brunnarna med sterilt vatten, och använda ONIX flow perfusionssystemetvatten genom brunnar 1-6 vid 6 psi för 5 min att spola kanalerna. Sedan, flödet från satsrummet 8 vid 6 psi under 10 sek (inmatningskanal har mycket högre flödeshastigheter och bör spolas separat).
4. Ta bort vatten från alla brunnar och ersätta med 250 pl SC i inloppet brunnarna 1-6 och 50 ul av kultur från steg 1,2 i cell lastning väl 8. (Alternativt, placera de önskade media i inloppet brunnarna 1-6 för experiment som kräver växling mellan olika förhållanden.)
5. Täta ONIX grenröret till plattan, och börja grundning kanalerna och kultur kammare med strömmar från inloppet brunnarna 1-6 vid 6 psi under 2 minuter följt av minst 5 min vid 6 psi från endast inloppet väl håller utgångspunkterna media för experiment. Flow detta kontinuerligt tills steg 1.7.
6. Förbered mikroskop för experimentet. Vi använder en Zeiss Axio Observer.Z1 widefield mikroskop med en Cascade II bakbelyst EMCCD kamera (Photometrics, Tuscon, AZ) och Lumen 200 metallhalogenlampa bågelampa (föregående vetenskaplig, Rockland, MA) för fluorescens excitation dämpas till 10% för att förhindra fotoblekning. För att minimera byta tid som krävs för att få in flera fluorescerande kanaler, vi paret en singel, trippel-bandpass dikroiskt filter kub till lämpliga excitation / emission filter för GFP, YFP, och RFP (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, set 89006) satt i externa, snabbt byta filter hjul (Ludl elektroniska produkter, Novato, CA).
7. Placera några droppar nedsänkning vätska på målet (om det behövs, vi använder en Zeiss Plan-Apochromat 63X/1.40 Olja DIC), och montera mikrofluidanordningen säkert i det skede av inverterat mikroskop. Säkerställa plattan inte flytta alls i det skede under hela experimentet förbättrar cell tracking under dataanalys. Vi tejpar helt enkelt plåten till scenen fästet för att förhindra dess förskjutning.
8. Fokus på den vänstra tredjedelen av den första kulturen kammaren (där kammaren höjden är minsta) med hjälp av någon av de inbäddade positiontion markörer. Stäng av flödet från media inlopp väl, och flödet från cell satsrummet 8 vid 6 psi i 5 sek skurar. Flytta scenen för att titta runt på kultur kammare för celler. Öka lastning flöde tid och tryck tills önskad cell densitet uppnås, men undvika överbelastning och igensättning längst till vänster barriären där färskt medium in i kammaren.
9. Börja strömmar från media inloppet väl innehåller utgångspunkterna media vid 6 psi.
10. I metamorfa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) eller annan mikroskopi automation och kontroll programvara, installera ett mångdimensionellt förvärvet att ta flera bilder vid flera scenens position över tiden. Ange antal och intervall mellan tidpunkter. Välj flera scenens position med ~ 10 celler vardera (fler kommer överbefolka snabbt). Vi använder vanligtvis 5 min intervaller och bild upp till 16 positioner, som var och kräver ~ 11 sekunder för förvärvet vid varje tidpunkt.
11. Setup förvärvet så att i varje skede position vid varje tidpunkt the Programmet kommer: att fokusera på det utsända ljuset ljusa fält (BF) bild med MetaMorph s inbyggda autofokus metoden (genomförande av autofokus som en anpassad skriftlig journal vid starten av varje etapp ställning ger större kontroll över fokus noggrannhet), förvärva BF bild på ett pm till fokalplanet (fp), förvärva BF ofokuserad (BFOOF) bild på -4 um till fp (använda anpassade skrivna tidskrifter ändrar inriktning som krävs mellan bilderna), och skaffa en gråskala bild för varje fluorescerande reporter på fp använda optimerade för snabba förvärv med minimal fotoblekning.
12. Om det behövs, skaffa bakgrund och skuggning korrigering bilder för varje fluorescerande reporter i ett område av kulturen kammaren med inga celler.
13. Förbered flödet programmet för experiment i ONIX styrprogram. Samtidigt börjar förvärvet programmet i metamorfa och flödet programmet på Onix styrprogram.
14. Vid slutet av experimentet, korrigera unens bakgrund och skuggor i de fluorescerande bilder (om det behövs), och eventuellt kombinerar. tif-filer för varje bild kanal vid varje steg ställning till en. stk filmfil (t.ex. skapa BF, BFOOF, GFP, YFP och RFP filmer för position 1 ).

2. Format och Segment Data för Tracking Använda FormatData GUI i MATLAB (figur 2)

1. Kör FormatData.m filen i MATLAB att öppna GUI datainmatning. På toppen, ange eller bläddra till den mapp som innehåller de bildfiler för att ställa in uppgifter katalogen, och sedan använda det grafiska användargränssnittet för att specificera datatyper och bildfiler som spelats in i experimentet.
2. Till höger markerar du alternativknappen bredvid "Time-lapse" för att ange vilka analys typ att utföra. "Time-lapse" kommer att behandla bildserie som en tidsserie (t.ex. en film av celler som växer i en mikroflödessystem kammare). "Static" kommer att behandla varje bildserie som en uppsättning av ögonblicksbilder tagna från en population (t.ex. flera bilder tas på DIFka positioner på en enda bild prov). I detta transplantat versionen, kan tidsförlopp data för flera positioner behandlas utan som en separat fil för varje position (se steg 2,14).
3. Kryssa i rutan för bilden registrering för att korrigera för oprecisa arrangerar rörelser genom att skifta varje bild i filmerna för att minimera synliga cell rörelse inom ramen. Vi rekommenderar starkt detta eftersom det avsevärt förbättrar spårning (minskad manuell spår curation senare), men kommer att lägga slumpmässiga, "white noise" pixelvärden att fylla i där bilder har skiftat vid gränsen. Det kan också väljas efter att ha tittat segmenterade BF bilder i steg 2.7 eller vid någon punkt tills steg 2.13.
4. Kontrollera "Bright Field" rutan i "Data Channels" panel. Klicka på "Välj" till höger för att ladda BF bilderna. För *. TIF-filer, markerar alla BF bilder som motsvarar en enda film genom att hålla Shift-tangenten samtidigt som du väljer, och klicka sedan på "Öppna". För *. STK-filer, välj bara BF stapeln av intresse. Om bilderna är framgångerkännas fullt ut, kommer filnamnen listas i popupmenyn till höger i "erkända uppgifter" panel. . För * TIF-filer, se filnamnen visas i rätt ordning (spara filer med sekventiella namn under förvärv - BF_t001, etc.).
5. Kontrollera "Bright Field (ur fokus)" rutan och använd "Välj"-knappen som i steg 2.4 att ladda BFOOF filer, som kommer att listas i popup till höger. (BFOOF erhölls som BF -4 um relativt fp vid 63x segment också.)
6. Kontrollera "Cell Mask" rutan. I "Mask Källa" väljer du alternativknappen bredvid "Segment BF". Tryck på "Parameters" knappen för att öppna segmenteringen GUI. (Alternativt kan du välja ett pre-segmenterad mask film genom att markera alternativknappen bredvid "Select Mask File" knappen, tryck på denna och välja filmen som i steg 2.4. I detta fall är en BFOOF film inte behövs, och kan hoppa till steg 2.8.)
7. Ange de olika segmentering parametrar (beskrivningar av varje kan visaed genom att trycka "Parameterbeskrivningar"), och testa segmentering kvaliteten genom att klicka på "Test" (Figur 3). Framgångsrikt segmenterade regionerna kommer att vara grön med magenta gränser. Var noga med att använda skjutreglaget för att kontrollera flera tidpunkter i filmen. När segmenteringen är tillfredsställande, välj "Klar" för att återgå segmenteringen parametrar till FormatData GUI.
8. Kontrollera "färgbilder" rutan. Ange color namn till den första fluorescerande bild kanal i textraden, och tryck sedan på "Lägg till och Välj" för att ladda färgfiler som i steg 2.4. Färgen Namnet läggs till i listrutan till vänster, och filnamnen kommer att läggas till i tabellen till höger. Om ett misstag görs vid lastning färgen filer, välja färg namn i listrutan till vänster och klicka på "Ta bort färg" för att ta bort filerna. Upprepa för varje färgkanal.
9. Om ytterligare sub-region masker baserat på en av de fluorescerande färger (t.ex. fluorescerande nucleus → Nuclsnibbområde mask) önskas, kolla "Color Mask" rutan. Om inte, gå till steg 2.12. I "Color Mask Source"-panelen, ange sub-regionen mask namn i texten redigeringsrutan. Välj en färg i popup-menyn i "Color Mask Source" panel (kräver färgen har lagts i steg 6) och tryck "Parametrar" för att öppna en tröskel testa GUI.
10. Tryck på "Auto-tröskel"-knappen för att automatiskt bestämma tröskeln med Otsu metod ^15, och bilden kommer att belysa de områden som bevarats över tröskelvärdet (Figur 4). Tröskeln kan justeras manuellt med hjälp av textrutan. Använd rullningslisten för att bekräfta tröskeln är lämplig för alla tidpunkter. När du är nöjd, tryck på "Klar" för att återgå tröskeln till FormatData GUI.
11. Tryck "Lägg till och Segment" för att generera sub-regionen mask med tröskeln modulen tillämpas på de valda färgbilder. Färgen mask namn och källa visas i tabellen till vänster, med relevant recognized filnamn som visas i tabellen till höger. (Alternativt, tryck "Lägg till och Välj" för att läsa in färdiga delregionen mask-filer.)
12. Längst ner, ange eller bläddra till önskad mapp som ska användas som spara katalogen.
13. Tryck "Formatera data" för att läsa bildfiler (med hjälp av tiffread2.m kod utvecklad av Francois Nedelec, finns på: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 ), bearbeta data, och skapa en * . matta fil i den angivna mappen. Denna fil kommer att fungera som ingång till ProcessTimeSeries GUI.
14. Upprepa steg från 2,4 till 2,13 för uppsättningen av filmer för varje etapp position.

Tre. Spår Celler och härstamningar genom tiden med ProcessTimeSeries GUI, och adjunkten ID och Uppdrag härstamning (Figur 5)

1. Kör ProcessTimeSeries.m filen i MATLAB att öppna spårning GUI. Ställ in följande parametrar efter att ha öppnatGUI:
   • "Kammarhöjd" ("File I / O"-panelen, uppe till vänster) - detta indikerar höjden av kammaren där cellerna är instängd. Det används som en begränsning när det gäller tillnärmningen cellvolym som en 3D-ellipsoid bygger på större och mindre axel av cellen regionen som i ^8.
   • "Um / pixel" ("File I / O"-panelen) - omräkningsfaktorn för att kalibrera pixel till um avstånd i bilderna så tvärsnittsarea och volym kan beräknas i pm ² och im ^3, respektive.
   • "Filter panelen" (nedan "Fil I / O"-panelen) - set lägsta och högsta parametrar för att filtrera bort skräp regioner i masken: "Area" - region område i pixlar, "Ecc" - excentricitet faktor, mer cirkulär som → 0 , "SF" - formfaktor, mer cirkulär som → 1.
2. Klicka på "Load Images" i "File I / O"-panelen, och välj *. Mattan datafil intresse produktionen av FormatData GUI. Regionen masken (och eventuella sub-region masker) appliceras på varje färgkanal, Och ett antal olika mätningar görs (tabell 1). Den datafil sparas sedan. (Om du laddar en fil till ProcessTimeSeries från en tidigare session, kommer den att be om analysen bör göras om från början VARNING:.. Detta kommer att radera alla spår curation redan slutförts och behandla uppgifterna som om det var färskt från FormatData GUI Om misstag startas om, snabbt slå Ctrl + C i MATLAB kommandot fönstret för att förhindra att tidigare kurator *. matta filen skrivs över.)
3. Därefter spåra cellerna. I "Track Cells" panel (bredvid "Filter"-panelen), ange följande parametrar:
   • "Max Displacement" - det maximala avståndet i pixlar en cell kan färdas mellan närliggande bilder innan stämplas som en annan cell. Högre förskjutningsorgan algoritmen kan stå för celler flyttar mer, men det ökar också komplexiteten i matchande cell regioner i folksamlingar. Vi börjar klockan 12 och minska om ett fel uppstår i spårning (se steg 3.4).
   • "Minsta längd" - minsta antal förekomster för en cell spår som anses vara ett giltigt dataserier. Vi använder 1 för att förhindra avlägsnande av några verkliga spår, men detta kan ökas om segmentering resulterar i kortlivade, falska region spår.
   • "Frame Memory" - maximalt antal konsekutiva ramar en cell region kan försvinna och ges samma ID när den återvänder. Om den försvinner längre än "Frame Memory", kommer det att ges ett nytt ID på att återvända. Vi använder 2 att låta regionerna att missa genom segmentering för 2 ramar innan han återvände.
4. Klicka på "Track Cells" för att spåra regioner från en ram till nästa med hjälp av regionens centroids (Blair och Dufresne MATLAB genomförandet av Crocker, Grier och Weeks IDL rutin, finns på: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) , att tilldela härstamningar för nyligen förekommer knoppar, och för att spara data. Härstamningar tilldelas automatiskt av minimizing avstånd mellan förmodade knoppar och potentiella mödrar i varje bildruta. (Om ett felmeddelande visas i MATLAB kommandot fönstret på grund av "svåra kombinatorik", minskar "Max Displacement" och upprepa spårning.) Ändra parametrar i popup-fönster som behövs för dina data.
5. Curatera dåligt segmenterade regioner och misstag i ID eller uppdrag härstamning med hjälp av olika grafiska verktyg eller kortkommandon (visas i ett popup-fönster genom att trycka på knappen ovan "valda cellen Information"-panelen).
   • Slider, "Föregående bild", "Nästa bild" (Ctrl + vänster / höger) - använda för att visa och flytta mellan ramarna i bildserien.
   • "Bild #" - visar ramnumret av den aktuella bilden i vänster och höger axlar. Flytta till en angiven bildruta genom att skriva dess nummer i rätt "bild #" redigeringsrutan.
   • "Delta ram" - visar skillnaden i ramnummer mellan höger och vänster axlar (Δ = höger - vänster).
   • "Göm text" (Ctrl + T) - växlar mellan visning av cell-ID irätt axlarna eller inte.
   • "Göm Labels" (Ctrl + L) - växlar mellan visning av cell-ID i den vänstra axeln eller inte.
   • "Mask" popup-menyn - välj mellan att visa någon mask, den cellulära masken, eller eventuella användardefinierade sub-masker för visning i den vänstra panelen.
   • "Overlay" popup-menyn (Ctrl 1-9) - väljer att visa BF och lager färg i vänster ram. Visa BF är den enda som växlar BF lagret på eller av i båda axlarna. Växla mellan visning eller inte genom att välja overlay namn i menyn igen ("*" betecknar overlay visas). Ctrl +1 växlar BF overlay, med 2-9 växla färgen överlägg för.
   • "Set Colors" - använder för att bestämma färg för overlay displayen. Ett popup-fönster kommer att fråga vilken fluorescens kanal att ställa in, och sedan färgpaletten visas för användare definition.
   • "Ändra Regioner och Tracks" panel - dessa styr effekt förändringar på cell-regionen mask och spåra information:
     • "Uppdatera spår" (Ctrl + U) - Används för att återtilldela cell-ID. Om inga celler är markerade i högra axeln, kommer det grafiska gränssnittet be om en cell-ID för att ändra. När ID X ändras till Y, kommer alla framtida förekomster av X ändras till Y, och eventuella framtida fall av det aktuella Y, kommer att kopplas till X. (Ibland en cell att växla fram och tillbaka mellan 2 ID, upprepade gånger. Detta beror på spårning försöker rymma flera ID i en oversegmented region snarare än ett fel i uppdateringen ID-funktionen.) Flera celler kan väljas och deras ID ändras samtidigt, men var noga med att ge varje en unik ID. Om du vill tilldela en region till ett ID som inte finns i den aktuella filen, skriv "0", och man kommer att genereras. Använd Ctrl + W för att byta ID för två markerade celler.
     • "Radera markerade spår" (Ctrl + D) - använd för att radera den markerade cellen eller flera regioner cell i den aktuella högra axlar ram. (Om inga celler är markerade, frågar efter ID.) För att permanent ta bort alla instanser av en ID-spår, markera rutan bredvid Delete valda spår-knapp (text kommer att ändras till "Radera ALL"). Detta är användbart för att bli av långlivade skräp regioner, men först kolla framtida ramar för att se till att ID inte byta till ett giltigt cell eller knopp region.
     • "Slå ihop regioner" (Ctrl + A eller M) - slätar ut och kombinerar cell regioner. Klicka på en cell eller celler i rätt axlarna för att välja (region blir röd om vald). Sammanslagning på en region kommer morfologiskt nära att fylla i sprickor eller små saknade bitar med hjälp av en skivformade elementet. Sammanslagning av två eller flera närliggande regioner kommer att kombinera dem till en region och ge den lägsta ID för den nya regionen. Detta är användbart för över-segmenterade regioner (ofta när cellerna har stora vakuoler).
     • "Rita region" - använd musen för att rita en region i rätt axlarna där önskade och dubbelklicka för att avsluta. Ge ett unikt ID inte finns i datamängden (mellan 1 och 65535). Avbryt genom att trycka på Delete på tangentbordet.
   • "Lineage Tracking" panel - efter spårning,härstamning uppdrag genereras automatiskt. När nya ID-regioner visas, visas den nya cell-ID i rosa och en röd linje dras till mamman regionen. Nya områden för stora för att vara knoppar eller för långt borta från potentiella mödrar visas i grönt och tilldelas en mor-ID "NaN" ("inte ett nummer", se tabell 2). Regioner som finns vid den första tidpunkten har en mor-ID för "0". För att fixa enskilda uppdrag, ange mor och ID knopp i textraden fälten och klicka på "Fix". För att radera en cell mamma, skriv "0" som sin mor. En snabbare metod är att välja två regioner i den högra bilden och tryck Ctrl + F. Detta kommer automatiskt att tilldela äldre region som mor och den nyare regionen som dotter, medan radering alla tidigare mor uppdrag för dottern cellen. OBSERVERA: Klicka på "Beräkna Lineages" när som helst kommer att räkna om alla härstamning uppdrag, inklusive användaren tidigare curator.
   • "Valt Cell Information" panel - "får jagNFO "kommer att visa några mätningar av de regioner som valts ut i de rätta axlarna." Mätningar ... "låter användaren bestämma vilka mätningarna visas (liksom definiera standardnamnet listan för andra operationer såsom" Exportera data "). Kan användas att bestämma korrekta ID och härstamningar (t.ex. om cell X har en knopp vid tiden t, det med största sannolikhet inte har en annan knopp Vid tidpunkten t + 5 min).
   • "Spara ändringar" (Ctrl + S) - uppdaterar * mattan filen för att återspegla användarens ändringar.. Använder ofta (det finns ingen ångra-funktion)!
   • "Generera Tomter" - öppnar GeneratePlots GUI. Används för att snabbt rita ut variabel information och enkla beräkningar för encelliga regioner lyfts fram i rätt axlar ProcessTimeSeries GUI, deras medelvärde, eller medelvärdet av alla regioner i varje bildruta. Detta GUI kan beräkna grova första derivat, men var noga med att ange rätt tidsintervall längst upp till vänster. Tomter kan matas ut till en siffra för att spara genom att trycka på "Generera figur".
   • För att korrekt kyrkoherden uppgifter: slå ihop några oversegmented regioner, radera alla regioner inte fånga hela cellen, vara säker på mor-bud relationer har tilldelats (en röd linje visas mellan dem vid tiden för knopp uppkomst, när knoppen ID är rosa, se Tabell 2), och eliminera eventuella gröna ID genom att fixera ID, tilldela regionen en modern, tilldela någon mamma ("0"), eller radera regionen. Bud uppgifter kommer att läggas till den hos modern under den slutliga analysen så att inte slå ihop en knopp region till sin mamma (det kommer att leda till felaktiga volym uppskattning).
   • Inspektera data för varje bildruta upp till den sista tiden av intresse, men det är inget krav för hela tidsserien om du inte använder de senare ramar.
   • Var noga med att spara ändringarna.
   • Upprepa steg 3,1-3,7 för *. Mattan fil för varje etapp position.

4. Exportera data för analys

1. Att helt enkelt exportera rå region mätningar för varje cell genom Time, tryck "Exportera data". Mätningarna av intresse kan väljas i GUI som öppnas, och de kommer att matas ut i en blankstegsavgränsad *. Txt-fil med variabelnamn som kolumnrubriker.
2. För att analysera tidsserier för hela celler över tiden, beräkna cell-cykeln information och ta derivat, tryck "tidsserieanalys". Ett fönster öppnas där du kan välja de mätningar av intresse och inmatning av analysparametrar (Figur 6).
3. Ange sista tidpunkten kurator i GUI (alla efterföljande ramar ignoreras). De förvalda utjämning och cell-cykeln tilldelning parametrar fungerar bra för vår haploida och diploida stammar avbildas i 5 min intervaller, men dessa kan behöva varieras för bästa resultat. (Kontrollera att parametervärdena är lämpligt genom att manuellt bestämma knoppning och division tid för ett test uppsättning uppgifter och jämföra resultatet för den automatiska algoritmen.)
4. När alla parametrar är inställda, tryck på "Analyze" till:
   1. Nackdelartruct arrayer för varje råvara mätning och subtrahera bakgrunden (mätt som den genomsnittliga intensiteten av den icke-cell område av den första bilden i varje fluorescerande film, eller kan specificeras för att redovisa genomsnittliga autofluorescens per cell pixel).
   2. Montera en utjämning spline till de valda mätningarna för att eliminera högfrekvent mätbrus (vilket diskuteras i ^9).
   3. Automatiskt bestämma knopp uppkomst och celltider division för varje cell baseras på förändringar i lutningen av volymen tidsserier som diskuteras i ^9. Knoppen Mätningarna kommer då att läggas till moderns mätningar mellan uppkomst och division varje cykel för en sammanhängande helhet cell tidsserier. En normaliserad cell-cykel progression kommer också att beräknas från 0 till 2 från division till division.
   4. Montera en utjämning spline ta stabil ^{1: a} och 2 derivat ^nd de valda mätningarna. (För väldefinierade derivat, tidsseriegörs kontinuerligt över division genom att flytta data för följande cellcykeln att möta slutpunkten för den föregående cykeln.)
   5. Utgång rå och utjämnad tidsserie för alla regioner, och hela cellen utjämnade, kontinuerlig och differentierad tidsserier som en matris för varje mätning. Det första elementet är en färg index för bakgrundssubtraktion, håller resten av första raden cell-ID, resten av den första kolumnen är ramnumret, och de återstående delarna håller tidsserierna för varje enskild cell i en kolumn med varje rad motsvarar ramen i den första kolumnen. En liknande samling av cell-cykeln progression tidsserier och härstamning information kommer också att matas ut. Matrisen "LineageArray" innehåller en tabell med varje rad representerar en mor-knopp relation och den första till femte kolonner är mor-ID, knopp ID, ram av första knopp region, beräknat spirande ram, och beräknad division ram. Data exporteras till en *. Matta fil (MATLAB datafil).

Representative Results

Ett godkänt resultat och analyserade experiment kommer att ge mestadels kontinuerlig tidsserier för enskilda hela celler med realistiskt tilldelad knopp uppkomst och tider division. Som ett exempel, utförde vi ovanstående protokoll med en haploid jäststam som uttrycker en integrerad kopia av Cerulean fluorescerande protein (GFP) som drivs av den konstitutiva ADH1-promotorn för att observera hur tillväxt och global expression kan variera med tiden i enskilda celler (tabell 4, Y47 ). Vi körde tidsserieanalys för att erhålla hela cellen (Figur 7A) mätningar över tid, och ett beroende av cellcykeln framträder både volym och uttryck som finns i ^9. Efter knoppskottet, ökar den sammanlagda volymen (mor + knopp) snabbare än tidigare knopp uppkomst (i enlighet med ^8,16) medan protein koncentration, eller genomsnittlig intensitet, minskar något (figur 7B och 7C). Uppgången i kombinerad IntegraTed protein (volym x koncentration i det här fallet) påskyndar också efter knoppning (Figur 7D). Jämföra till mamman regionen ensam (figur 7B & D), dessa resultat visar vikten av att korrekt införliva knopp bidrag till hela cellen mätning och belysa behovet av ordentlig knoppskottet och division uppdrag tid. Som vi har rapporterat ^9, kan vi använda differentierade tidsserier för att beräkna en momentan relativ M mRNA-nivå (t) och transkription kurs A (t), som båda också öka efter spirande (Figur 7E och 7F):

där P (t) är det totala proteinet vid tidpunkten t och γ _M är mRNA nedbrytningshastigheten 0,04 min ^-1

Förmågan att generera stabila tidsderivator för mätning tidsserier gynnar även kinetiska studier. Vi använder en jäststam som uttrycker en observerbar, chimär transkriptionsfaktor med omkopplingsbar transkription aktivitet (tabell 4, Y962). Befälhavaren transkriptionsfaktor av fosfat svält vägen, Pho4p, styrs via nucleo-cytoplasmatisk lokalisering som svar på extracellulära fosfat Koncentratio n ^18. Vi ersatte den DNA-bindande domänen av Pho4p med tetR, som binder den tet-operonet (tetO), och C-terminalt smält den nya transkriptionsfaktor till en gul fluorescerande protein för att skapa pHo4-tetR-YFP ^9. Genom omkoppling av fosfat nivå i perfusion medier, kunde vi växla därefter uttryck av en integrerad GFP drivs av en syntetisk promotor består av 7 Teto bindningsställen ennd CYC1 minimala promotorn (7xtetOpr-CFP). En tidsserie analys visar när transkriptionsfaktorn är lokaliserad till kärnan (med användning av en fusion av RFP och det nukleära proteinet Nhp2p att skapa en RFP-baserad nukleär subnätmask såsom i steg från 2,9 till 10), och när målgenen startar och stoppar transkription (Figur 8). Genom att analysera derivatet serie över tid, kan in-och frånkopplingstider av målet promotorn i varje enskild cell härledas även då koncentrationen av den stabila fluorescerande reportermolekylen är hög.

Figur 1. Schematisk av protokollet. Protokollet beskriver steg för 1) mikrofluidisk kultur, 2) fluorescens, tidsförlopp mikroskopi, 3) analys av data, samt

Figur 2. FormatData GUI. Gränssnittet används för att importera, format, och segmentet bilddata för senare beräkningar och okulärbesiktning. Siffrorna visar protokollet steg motsvarar varje komponent. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. SegTest GUI. Gränssnittet används för att testa cell segment ation parametrar och visuellt bekräfta segmentering noggrannhet som i steg 2.7.

Figur 4. ColorThreshTest GUI. Gränssnittet används för att testa intensiteten tröskel som behövs för att skapa en subcellulär mask från den valda fluorescenskanal som i steg 2.10.

Figur 5. ProcessTimeSeries GUI. Gränssnittet används för att mäta, spåra, visuellt inspektera och redigera cell regioner och uppdrag härstamning. Siffrorna visar protokollet steg som motsvarar varje komponent.target = "_blank"> Klicka här för att visa en större bild.

Figur 6. AnalysisParams GUI. Gränssnittet används för att ange parametrar som krävs för tidsserieanalys som i steg 4.3 och 4.4.

Figur 7. Single-cell tidsserier av en haploid jäst som uttrycker ADH1 pr-GFP i mikroflödessystem kultur över flera generationer. (A) Bright fält (övre raden) och den gemensamma fiskeripolitiken (nedre raden) micrographs visas vid de angivna tidpunkterna för en cell genom hela experimentet . För den segmenterade modercellen (blå outline) och dess knoppar (grön kontur), är den sammanhängande hela cellen beskrivs i rött. Raw mor och knopp (B) volym och (C) protein koncentration tidsserierna jämnas att avlägsna mätbruset, och (D) integrerad CFP fluorescens beräknades som produkten av volym och koncentration. Hela cellen (röd) spår förlängs förbi divisionen att hålla en löpande summa som är enkel att ansluta till en deriverbar utjämning spline mellan divisioner (B och D). Den (E) relativa mRNA-nivå och (F) momentan transkription ränta beräknas med hjälp av ekvationerna (1-2) och spline passform i (D).

Figur 8. Arrangören transkription Betygsätt svar nucleo-cytoplasmashuttling av en pHo4-YFP fusion i enstaka jästceller. (A) Micrographs från de fyra angivna förvärv kanaler visas för en cell med en omkopplingsbar YFP-fuserad pHo4-tetR transaktivator att (B) lokaliserar till RFP-märkta kärna som svar till lågt fosfat och (C) driver uttryck av en 7xtetOpr-GFP reporter. (D) härledas transkription kursförändringar med lokalisering i genomsnitt (svart linje) och vid encelliga nivå (röd och linjer magenta, där rött står för den sammanhängande cell region skisseras i rött i A). Kraftiga nedgångar i GFP uttryck i B sammanfaller med celldelning när något protein förloras till dottern cellen.

Mätbeteckning	Beskrivning
Tid	Bild ramnumret
Area	Totalt antal of pixlar innefattande regionen
Volym	(4/3) πabc, där a = ½ huvudaxel region, b = ½ mindre axel längd, och c = b eller ½ "Chamber höjd" (beroende på vilket som är mindre)
(X) _ (Y) innebär	Mean pixelintensiteten för regionen mask (Y) i färgkanal (X)
(X) _ (Y) median	Median pixelintensiteten för regionen mask (Y) i färgkanal (X)
(X) _ (Y) std	Standardavvikelse för pixelintensiteter för regionen masken (Y) i färgkanal (X)
(X) _ (Y) IQR	Kvartilavstånd av pixelintensiteter för regionen masken (Y) i färgkanal (X), 75: e percentilen - 25: e percentilen värde
(X) _ (Y) T20pct	Medelintensitetsuppfattningen för topp 20% av pixelintensiteter för region mask (Y) i färgkanal (X). Användful i jämförelse med nästa mätning att bestämma subcellulära lokalisering utan en subnätmask.
(X) _ (Y) B80pct	Mean intensitet för den nedre 80% av pixelintensiteter för regionmask (Y) i färgkanal (X). Användbar i jämförelse med den föregående mätningen för att bestämma subcellulära lokalisering utan en subnätmask.
(X) _ (Y) M50pct	Medelintensitetsuppfattningen för mellersta 50% av pixelintensiteter för region mask (Y) i färgkanal (X)
(X) _cellint	Integrerad fluorescens färgkanal (X) (betyder pixelintensiteten x volym) för hela cellen (mor och alla anslutna knopp)
(Z) Raw	Raw tidsserier utdata från "Time Series Analysis" för variabel (Z)
(Z) Smooth	Spline-jämnas rå tidsserier utdata från "Time Series Analysis" för variabel (Z)
(Z) Hel	Hel cell (mandra + bifogad knopp (Z) Rawsmooth) tidsserie utdata från "Time Series Analysis" för variabel (Z)
(Z) Cont	Helcells tidsseriedata gjort kontinuerliga vid divisioner ("löpande summa") produktionen av "Time Series Analysis" för variabel (Z)
(Z) WhSmooth	Spline-utjämnade (Z) Whole cell tidsserier utdata från "Time Series Analysis" för variabel (Z)
(Z) DDT	Första gången-derivat av spline-utjämnade (Z) Whole cell tidsserier utdata från "Time Series Analysis" för variabel (Z)
(Z) d2dt2	Andra gången-derivat av spline-utjämnade (Z) Whole cell tidsserier utdata från "Time Series Analysis" för variabel (Z)

Tabell 1. Mätvariabeln nomenklaturen i ProcessTimeSeries GUI.

Cell-ID färg	Lineage status
gul	mor tilldelad
rosa	ny knopp (röd linje till tilldelad mamma)
grön	ingen moder tilldelad

Tabell 2. Cell-ID färgkod för härstamning tilldelning status.

FILNAMN	Beskrivning
FormatData.m	Dataingång GUI som format filmer och segment BF bilder för bearbetning med ProcessTimeSeries.m
FormatData.fig	FormatData GUI fönster layout
BFsegment.m	BF segmenteringsmodul, med extractregions2.m och segmentregions.m
SegTest.m	Segmentering kvalitetstester GUI
SegTest.fig	SegTest GUI fönster layout
extractregions2.m	Första komponenten i BF segmenteringsmodul att identifiera regioner
segmentregions.m	Andra komponenten i BF segmentering modul till separata och rena cell regioner
color2submask.m	Fluorescens-baserad subnätmask segmenteringsmodul
ColorThreshTest.m	Fluorescens-tröskeln malltest GUI
ColorThreshTest.fig	ColorThreshTest GUI fönster layout
tiffread2.m	Extraherar data *. TIF eller *. STK-filer för användning i MATLAB
imalign.m	Image registrering genom användning av 2D korskorrelation
ProcessTimeSeries.m	Databehandling GUI som spårar regioner, tilldelar härstamningar, och möjliggör visuell korrigering av fel. Dessutom ger GUI-baserade plottning förmåga och matar hela-cell tidsseriedata
ProcessTimeSeries.fig	ProcessTimeSeries GUI fönster layout
cleanMask.m	Eliminerar mask regioner baserade på parametrar i ProcessTimeSeries GUI
track.m	Spår cell regioner baserade på region centroids
OptimizeLineages.m	Lineage uppdrag modulen bestämmer optimala mor-bud relationer baserade på fysiska avstånd och tidigare och framtida spirande händelser
getClosestObjects.m	Hittar grannceller för varje ny cell-ID (BUD)
SelectVariables.m	Mätning val GUI för att välja variabler av intresse
SelectVariables.fig	SelectVariables GUI fönster layout
GeneratePlots.m	Plotta GUI för uppgifter i ProcessTimeSeries fönster
GeneratePlots.fig	GeneratePlots GUI fönster layout
AnalyzeCellSeries.m	Tidsserieanalys modulen bestämmer tid celldelning och matar hela celler mätningar som beskrivs i texten
assignDivisionsInf2.m	Tilldelar knopp spira och celldelning gånger
AnalysisParams.m	Cell tidsserieanalys parameterinmatning
AnalysisParams.fig	AnalysisParams GUI fönster layout

Tabell 3. Transplantat fil beskrivningar.

Stam-ID	Genotyp (W303-baserad)	Referens
Y47	MAT a leu2 :: ADH1pr-CFP-hisG :: URA3 :: kan ^ :: hisG	19
Y962	MAT en ADE + NHP2 :: RFP-NAT spl2Δ :: LEU2 pHo4 :: TRP1 pho84Δ:: Klura3 phm4 :: HIS3MX6 leu2Δ :: TEF1m7pr-PHO4ΔP2-tetR-cYFP URA3 :: 7xtetOpr-GFP	9

Tabell 4. Jäststammar som användes i denna studie.

Discussion

Ovanstående protokoll beskriver en enkel metod för att inhämta och analysera fluorescens tidsseriedata med begränsad erfarenhet microfluidicsen eller inom mjukvaruutveckling. Det gör att man kan få tidsförlopp fluorescens filmer av enstaka jästceller, extrahera relevant cellstorlek och mätningar uttryck, komminister spårning och inlämningsuppgifter härstamning, och analysera beteendet hos hela celler över tiden med ett kommersiellt tillgängligt mikrofluidisk kultur-enhet och en mångsidig grafiskt användargränssnitt (GUI). Medan experimentella, segmentering och spårning steg har kontaktats på olika sätt tidigare ^11,13,14, är ovanstående procedur för att göra dessa tekniker mer tillgängliga för en bredare delmängd av biologin community. Medan ovanstående procedur är optimerad för en viss mikrofluidisk kultur enhet, kan den övergripande analysen anpassas till liknande enheter som off-the-shelf mikrofluidiska kultur teknik blir billigare och mer anpassningsbara. FundamEntally, segmentering och region algoritmer mätning vi anställer liknar befintliga metoder ^13,14, men transplantat programvara ger möjlighet att visuellt komminister region spårning och uppdrag härstamning och att tilldela cell-cykel faser korrekt. Båda dessa funktioner är avgörande för att exakt beräkna den tid derivat av dataserier.

Det finns flera steg i protokollet som avsevärt påverka kvaliteten på de tidsseriedata. Initialt överbelasta odlingskammare med celler kommer att minska perfusion i kammaren (särskilt påfallande när kinetiska experiment där kammare refresh time är viktigt) och överväxt sker tidigare i försöket tidsförloppet. Detta kan bäst undvikas genom att börja med lägre cellbelastning tryck under kortare tider och successivt ökande en eller båda till dess en lämplig celltäthet har uppnåtts. Stage ställning val för avbildning är en närstående och lika viktigt Considbete. Att veta fördubblingstiden för stammen, planera hur många celler kommer att vara i bildramen över tiden och förutse hur trängsel kommer att påverka media diffusion. Tio dispergerade celler kommer att växa till tio mikrokolonier, men tio celler initialt grupperade tillsammans kommer att växa till en enda, stor koloni (vi har märkt näringsämnen diffusionsbegränsningar vid 6 psi till centrum av en koloni då det är större än ~ 14 celler i diameter) . Extra insatser i tidigare protokollsteg underlättar också manuell datasäkring senare, och förbättrar serien utgående tid. Se till att plattan är fast monterad i scenen och använda alternativet bildregistrering i FormatData GUI för att avsevärt förbättra noggrannheten vid automatiskt följa enstaka celler genom tiden. Tillbringa tid att välja den bästa möjliga segmentering parametrar också att minska antalet fel som kräver uppmärksamhet. Den mjukvara fungerar bäst med svag oversegmentation av cell regioner istället undersegmentation eftersom remerging ensplit-cell är en enklare uppgift än att dra linjer för att dela regioner, men ökar ökat oversegmentation fel i härstamning uppdrag på grund av förekomsten av falska, nya regioner. Dessutom, se till att alla mor-bud relationer har tilldelats så att mätningar för hela cellen kommer att vara korrekt. Om ett bud är saknad av segmentering eller växer utanför bildgränsen, överväga att avsluta moderns dataserier för att förhindra felaktiga resultat. Detta görs enkelt genom att ändra mamman regionen till ett unikt ID (Ange ID för "0") vid felaktiga ramen, och använda "Ta bort alla" för att ta bort alla framtida instanser av det nya ID. Stor uppmärksamhet åt dessa steg kommer att kraftigt öka noggrannheten rådata tidsseriedata.

Att etablera giltig tolkning av utdata genom att trycka på "tidsserieanalys", rekommenderar vi några ytterligare undersökningar. Verifiera knopp uppkomst och tider division är noggrant bestämmas baserat på användarens-input parametrar. Manuellt registrera spirande och division tider för ett test film set och jämför med algoritmen resultat. För att visuellt uppskatta tiden cytokines klar mellan en mor och dotter, leta efter deras gräns för smal och mörkare. (OBS:. En teststam med ett fluorescerande-märkta nucleus hjälpmedel i manuell observation av division tid En annan metod vore att fluorescens-märka plasmamembranet och leta efter klyftan mellan mor och dotter celler att stänga.). Kontrollera också om total fluorescens för en cell bättre beräknas som genomsnittet regionen intensitet multiplicerat med volymen (när fångade ljuset kommer från ett tunt tvärsnitt av cellen) eller som den integrerade fluorescens över regionen (när fångade ljuset kommer från hela cellen). Om fluorescens profil för en cell matchar kurvan för en halvellips beskrivs av de större och mindre axlar i regionen ^7, härstammar fångas ljus från hela cellen, och total fluorescens shoULD beräknas som (medelvärde intensitet) x (area). I vårt fall vid 63X med en skärpedjup mycket mindre än cellens höjd, är den fluorescens profilen relativt platt och total fluorescens beräknas som (medelintensitet) x (volym). En annan faktor är den fotoblekning av fluoroforen. Programvaran anser inte fotoblekning i analysen, och därmed den fluorescens tidsserier produktion utgör endast det observerbara reporter. Fotoblekning processer är starkt beroende av förvärvet inställningar och tidsintervall som används för att erhålla fluorescens bilder, arten av fluoroforen, och diverse andra experiment-specifika parametrar. Fotoblekning inte heller kan vara väl beskrivna med en enkel, första-ordningens hastighet uttryck, vilket förhindrar en generell algoritm för sin behandling. Vi gör alltså inte hänsyn till fotoblekning i tidsserien utgång, men den analysmetod kan användas för att mäta kinetiken för denna process för att hjälpa användaren tolkning. Slutligen, välj smoothing parametrar lämpliga för den observerade tidsserien. Helst ska de smoothing splines eliminera högfrekvent mätbrus samtidigt verkliga funktioner i uppgifterna. De parametrar som krävs för att uppnå detta beror på egenskaperna hos den speciella tidsserier och kan variera mellan experiment.

Programmet var tänkt att vara flexibel för analys av olika tidsförlopp fluorescensmikroskopiska uppgifter. Valfritt antal färgkanaler kan inkluderas och eventuella kan användas för att skapa en sub-region mask. Medan de algoritmer fungerar bra för filmer av spirande jästceller, bör många av de funktioner utvidgas till filmer av andra organismer som väl. Region mätning (utom volym), spårning, och curation beror enbart på cellen masken och är således anpassas. Segmentering, härstamning uppdrag, celldelning beslutsamhet, och tidsserier moduler analys kan självständigt modifieras för att passa specifika behov. Dessutom, i stället för att använda den medföljande SEgmentation modul, kan en pre-segmenterad mask filmen matas, och fas-kontrast eller differential interferens kontrast bilder kan ersätta ljust fält. Den GUI kan sedan användas främst för att spåra och kyrkoherden ID och uppdrag härstamning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate	CellAsic	Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera	Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp	PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set	Chroma Technology Corp	set #89006	Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64-bit version handles large data files better than 32-bit