Summary
نحن هنا وصف طريقة البيوكيميائية دقيقة وقابلة للتكرار ومريحة للمعايرة من الجليكوجين في المختبر. يستخدم هذا الأسلوب عدة مقايسة Abcam الجليكوجين ويقوم على التحلل المتعاقبة من الجليكوجين إلى جلوكوز والجلوكوز المعايرة من قبل مضان.
Abstract
الجليكوجين هو بوليمر حيوية الرئيسي من الجلوكوز في الحيوانات الفقارية، ويلعب دورا حاسما في التمثيل الغذائي في الجسم كله، وكذلك في عملية الأيض الخلوية. العديد من الطرق للكشف عن الجليكوجين موجودة بالفعل ولكن فقط عدد قليل من الكمية. نحن هنا وصف طريقة استخدام عدة فحص Abcam الجليكوجين، والتي تقوم على تدهور محددة من الجليكوجين إلى جلوكوز عن طريق غلوكوأميلاز. ثم يتأكسد الجلوكوز خصيصا لمنتج أن يتفاعل مع التحقيق OxiRed لإنتاج مضان. المعايرة دقيقة وحساسة ويمكن أن يتحقق على مقتطفات الخلية أو أقسام الأنسجة. ومع ذلك، وعلى النقيض من تقنيات أخرى، فإنه لا يعطي معلومات حول توزيع الجليكوجين في الخلية. كمثال على هذه التقنية، وصفنا هنا المعايرة من الجليكوجين في اثنين من خطوط الخلايا والصينية CCL39 الليفية الهامستر الرئة والقولون وسرطان الإنسان LS174، المحتضنة في normoxia (21٪ O 2) مقابل نقص الأكسجة (1٪ O 2). افترضنا أن نقص الأكسجين هو سيجنال التي تعد خلايا لتجميع وتخزين الجليكوجين من أجل البقاء على قيد الحياة 1.
Introduction
الجليكوجين هو بوليمر multibranched من بقايا الجلوكوز، والتي هي موجودة في السيتوبلازم العديد من أنواع الخلايا. وهي واحدة من أهم أشكال تخزين الطاقة في الخلايا ويلعب دورا هاما في أيض الجلوكوز. معظم خلايا الثدييات هي قادرة على انتاج وتخزين الجليكوجين، والتي يمكن أن يتحلل سريعا إلى جلوكوز لتعزيز إنتاج وتحلل ATP أثناء الإجهاد الأيضي. خلايا الكبد تنتج كميات هائلة من الجليكوجين لتنظيم مستوى السكر في الدم وبالتالي توفير امدادات مستمرة من الجلوكوز في الجسم. في المقابل، فإن تركيز الجليكوجين في خلايا أخرى (العضلات، وخلايا الدم الحمراء، الخ) منخفضة نسبيا. ومع ذلك، محليا، وهذه الكميات كافية لتوفير الطاقة على المدى القصير عند فجأة تتعرض الخلايا لبيئة المحرومين من المواد المغذية.
توليف الجليكوجين والجليكوجين انهيار يتبع نفس الخطوات في جميع الأنسجة (الشكل 1). أولا، الجلوكوزيدخل الخلايا عن طريق ناقلات الجلوكوز (افراط)، ويتم تحويلها بسرعة من الجلوكوز 6 فوسفات (G6P) إلى جلوكوز-1-الفوسفات (G1P) من خلال فسفوغلوكوموتاز. ثم يتم تعديل G1P الى UDP الجلوكوز، ويتم إرفاق C1 الكربون من UDP الجلوكوز إلى بقايا التيروزين من glycogenin، البروتين رسو الجليكوجين. هذا الجزيء، يعتبر التمهيدي الجليكوجين، تم تمديده عن طريق الحجز من UDP الجلوكوز إلى جلوكوز عن طريق محطة α (1 → 4) السندات عن طريق سينسيز الجليكوجين. أخيرا، عندما يتم تشكيل سلسلة خطية من أكثر من 11 بقايا الجلوكوز، انزيم المتفرعة نقل وقليل السكاريد محطة مكونة من ما لا يقل عن 6 إلى بقايا الجلوكوز الجلوكوز آخر من سلسلة المجاورة من خلال α (1 → 6) الربط. تكرار هذه العملية يعطي هيكل كسورية ضخمة تحتوي على الفروع التي تشكل الحلزون مع 6.5 الجلوكوز في المقابل. الجليكوجين يمكن أن يكون باتجاهين معاكسين تحلل إلى جلوكوز عن طريق العمل المتضافرمن المشذب الانزيمات التي يتحلل لα (1 → 6) ملزمة والجليكوجين فسفوريلاز أن hydrolyzes وα (1 → 4) غليكوزيدية المربوطة بين بقايا الماضي من الجلوكوز من فرع وجزيء الجليكوجين. يتم تنشيط هذا التفاعل يسمى تحلل الغليكوجين من خلال زيادة مستويات AMP (التي تعكس استهلاك ATP)، وتحول دون الجلوكوز وATP 2،3.
بواسطة المجهر الإلكتروني، وقد وصفت جزيئات الجليكوجين في العديد من أنواع الخلايا جزيئات β كما حرة (أو monoparticles الجليكوجين) من 15-30 نانومتر في القطر. في أنواع معينة من الخلايا مثل خلايا الكبد، والجسيمات β يمكن تجميعها في مجمع لتشكيل ريدات، والمعروف أيضا باسم جسيمات α التي تختلف في القطر من 80 نانومتر إلى حد أقصى قدره 200 نانومتر 4 5، الرابطة الهيدروجينية، أو حتى من خلال تفاعلات البروتين البروتين 6. كمية الجليكوجين المخزن في الخلايا يعتمد على الكثير من العوامل: (I) كمية glycogenin في الخلية التي يبدأ تخليق الجليكوجين، (الثاني) نشاط سينسيز الجليكوجين وفسفوريلاز ينظمها البروتين الفسفرة / نزع الفسفات، (الثالث) تركيز الجلوكوز في الخلايا، والتي تعتمد على عدة معايير مثل توريد الجلوكوز من الأوعية الدموية وامتصاص الجلوكوز من قبل الخلايا. وينظم مخازن الجليكوجين بإحكام من قبل تنظيم تفارغي الهرمونات السكروز من خلال نواتج وسيطة، من خلال الهرمونات التي تنظم عملية التمثيل الغذائي والطاقة، والمواد الغذائية الاستشعار عن مسارات إشارات 7.
من المهم أن تكونقادرة على تحديد الجليكوجين في العينات البيولوجية إلى فهم أفضل لأهمية التمثيل الغذائي الجليكوجين في الجسم كله والمستوى الخلوي. نحن هنا وصف دقيق البيوكيميائية، واستنساخه ومريحة في فحص المختبر لالجليكوجين. ويستند هذا الأسلوب على مضان الجلوكوز الكمي قبل وبعد التحلل محددة من الجليكوجين.
توجد طرق أخرى لتقدير مستوى الجليكوجين في الخلايا، ولكن معظمهم ليسوا الكمي. واستند واحدة من التقنيات أول وصف لتقدير حجم الجليكوجين في الخلايا على قياس التأسيس [14 C] الجلوكوز في الجليكوجين 8،9. استخدام النشاط الإشعاعي يجعل هذه العملية أكثر صعوبة في التعامل معها ولكن له ميزة توفير نسبة الجلوكوز إلى الجليكوجين التأسيس والتمييز بين توزيع بقايا الجلوكوز على الفروع والخارجي في قلب جزيء (فإنه يتطلب أيضا β-amyloly إضافيةجهاز الأمن والمخابرات وخطوة الكروماتوغرافي). وقد تم تطوير تقنية أخرى في الآونة الأخيرة ويقوم على دمج 2-NBDG (2 - {N-[7 nitrobenz-2-oxa-1 ،3-diazol-4-YL]} الأمينية-2-deoxyglucose)، و 2-deoxyglucose مشتقة الفلورسنت، في الجليكوجين 10. قياس كثافة مضان يعكس كمية الجليكوجين إنتاجها ويمكن قياس مع قارئ مضان. ويمكن أيضا توزيع مضان في الخلية يتم تقييمها بواسطة المجهر متحد البؤر.
من بين التقنيات الأخرى nonquantitative، الدوري حمض شيف تلطيخ (PAS) وربما كان الأكثر شيوعا. ويمكن استخدامه للكشف عن الجليكوجين في خلايا ثابتة، أقسام الأنسجة في البارافين أو المجمدة. هذه الألوان تقنية النسيجية تحديدا غير السكريات، السكرية، البروتينات السكرية، والسليلوز mucins محايد باللون الأرجواني. ويمكن زيادة خصوصية هذا الاختبار عن طريق العلاج من خلايا ثابتة أو أقسام الأنسجة مع دياستاز، الذي يساعد على هضم تحديدا الجليكوجين. بعد ذلك،مستوى الجليكوجين يمكن تقدير نوعيا من خلال مقارنة عينات unhydrolyzed (جميع الجزيئات الكربوهيدرات تعديل) لعينات تحلل (الكربوهيدرات تعديل الجزيئات باستثناء الجليكوجين). يوفر تلطيخ PAS والتحليل المجهري، على عكس فحوصات البيوكيميائية من الجليكوجين، معلومات بشأن توزيع الجليكوجين في الخلية، والتي يمكن أن تنتشر أو تتركز في جزء معين من الخلية. ومع ذلك، على الرغم من الاختلافات في التقديرات PAS تلطيخ تراكم الجليكوجين بين ظروف مختلفة، فإنه ليس الكمي 11.
والأضداد وحيدة النسيلة الماوس في الأصل باستخدام الفك السفلي اللقمة الغضروف كما ثبت مستضد لتتفاعل مع الجليكوجين في الخلايا وتنقيته مع الجليكوجين في المختبر 12. كما تعترف هذه الأجسام المضادة على وجه التحديد سلاسل السكر المرتبطة الجليكوجين، بل هو أداة مفيدة للكشف عن الجليكوجين عن طريق المناعية بطريقة أكثر تحديدا من تلطيخ PAS. المجهر الإلكتروني هو أسلوب آخر أن يسمح التصور من الحبوب من الجليكوجين في الخلايا وتقييم درجة تخزين الجليكوجين. في الواقع، الجليكوجين جسيمات β يمكن التعرف عليها بسهولة مع المجهر الإلكتروني والإلكترون حبيبات كثيفة 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين
1. تحلل الخلية
- خلايا البذور بتركيز 0.5-2 × 10 6 لكل 100 ملم طبق القطر.
- العلاج: احتضان خلايا 24، 48، أو 72 ساعة في تركيز الأكسجين المنخفض (نقص الأكسجين) في علة بوكس محطة العمل اللاهوائية (Ruskinn تكنولوجيا Biotrace الدولية بي، كارديف، المملكة المتحدة) وضعت في 1٪ أو 0.1٪ O 2، 94٪ أو 94.9٪ N 2، و 5٪ CO 2. في موازاة ذلك، احتضان الخلايا في normoxia (21٪ O 2، 5٪ CO 2). تغيير المتوسطة (25 ملي المتوسطة التي تحتوي على الجلوكوز) كل 24 ساعة لتقليل الاختلافات في تركيز الجلوكوز خلال فترة التجربة.
- بعد العلاج، وخلايا غسل 2X مع برنامج تلفزيوني لإزالة آثار الجلوكوز من مستنبت. تتخلص من الخلايا في برنامج تلفزيوني الباردة.
- أجهزة الطرد المركزي الحل في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، وتجاهل طاف ويغسل بيليه مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. بيليه يمكن تجميد في -20 درجة مئوية قبل المضي قدما.
- resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر من الماء المقطر. إضافة 100 ميكرولتر من الجليكوجين المخزن المائي المتوفرة مع الفحص كيت الجليكوجين (Abcam). غلي المحللة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتعطيل الإنزيمات.
- وأجهزة الطرد المركزي في دوامة المحللة في 13،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة لإزالة منتجات غير قابلة للذوبان. إبقاء طاف.
- لتطبيع مستويات الجليكوجين لمحتوى البروتين بين العينات، التقدير الكمي للبروتينات يمكن القيام به مع 25-35 ميكرولتر من طاف باستخدام مقايسة حمض Bicinchoninic (BCA-Interchim).
بعض المحللة يمكن استخدامها لقياس تركيز الجلوكوز داخل الخلايا الحرة.
2. التحلل من الجليكوجين
- مزيج 50 ميكرولتر من طاف (الخطوة 1) مع 1 ميكرولتر من التحلل أنزيم ميكس. يحتوي هذا الخليط غلوكوأميلاز. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد منحنى المعايرة عن طريق تمييع الجليكوجين القياسية (2 ملغ / مل) قupplied مع عدة لإيجاد حل من 10 ميكروغرام / مل في المخزن المؤقت التحلل. المقبل، وإعداد ستة أنابيب منفصلة مع 0، 4، 8، 12، 16، و 20 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل القياسية وضبط كل أنبوب إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر مع العازلة المائي لإعطاء تركيز الجليكوجين 0، 0.04 ، 0.08، 0.12، 0.16، و 0.2 ميكروغرام / مل. إضافة 1 ميكرولتر من أنزيم ميكس التحلل في المعايير واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
يجب أن تطرح تركيز الجلوكوز خلفية خط الخلية، التي قدمها قيمة للتركيز الجلوكوز الحرة، من قيمة للتركيز الجلوكوز الإجمالي (الجلوكوز من الجليكوجين التحلل + خالية من الجلوكوز) لتحديد مستوى الجليكوجين في الخلية.
3. التنمية والقراءة من الإسفار
- لكل حالة، وإعداد أنبوب واحد (أنبوب 1) لقياس تركيز السكر الحر واثنين من أنابيب (أنابيب 2 و 3) لقياس مجموع تركيز الجلوكوز (كل الطرافة أنبوبها حجم مختلفة من الجليكوجين تحلل).
- إضافة 15 ميكرولتر من طاف المستخرجة في نهاية الخطوة 1 في أنبوب 1. إضافة 35 ميكرولتر من العازلة المائي لإتمام إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. سوف مضان الحصول إعطاء تركيز الجلوكوز الحرة.
- إضافة ميكرولتر من الجليكوجين X تحلل (التي تم الحصول عليها في الخطوة 2) في أنبوب 2. التكيف مع الحجم النهائي من 50 ميكرولتر. حجم العينة (X ميكرولتر) لابد من تعديلها وفقا لكثافة الخلية و / أو نوع من الخلايا من أجل الحصول على القيم مضان التي لا تتجاوز تركيزات من منحنى المعايرة.
- إضافة 2 ميكرولتر من الجليكوجين X تحلل في أنبوب 3. التكيف مع الحجم النهائي من 50 ميكرولتر.
- إعداد محلول التنمية للعينات والمعايير عن طريق خلط لكل أنبوب 48.7 ميكرولتر من العازلة التنمية، 1 ميكرولتر من التنمية أنزيم ميكس و 0.3 ميكرولتر من OxiRed دقق (مرفق في الجليكوجين الفحص كيت). على سبيل المثال، لمدة 2 الظروف، وإعداد المزيج لمدة 12 أنبوبق (6 لمعايير، 2 للجلوكوز حرة و 4 لمجموع مضان الجلوكوز).
- إضافة 50 ميكرولتر من هذا المزيج إلى كل أنبوب واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- قياس مضان في الطول الموجي من 535 نانومتر الإثارة، والطول الموجي من 587 نانومتر الانبعاثات على النحو الموصى به، وفتحة من 3 نانومتر لالإثارة وانبعاث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وهناك مستوى منخفض من الأكسجين (نقص الأكسجين) في إشارات إلى الخلايا السرطانية الأورام الحاجة إلى تخزين الطاقة للتعامل مع نضوب المغذيات لاحقة، وذلك من أجل البقاء. والجليكوجين هو بوليمر حيوية الرئيسي من الجلوكوز في خلايا الثدييات، درسنا تنظيم تخزين الجليكوجين في نقص الأكسجة. يجب أن يتم تنفيذ العملية الحسابية وتوحيد تركيز الجليكوجين في الخلية لست على البيانات الخام من مضان كما هو مبين في الجدولين 1 و 2 و 3. أكد مقايسة البيوكيميائية للالجليكوجين أن المجاميع الإلكترون الكثيفة لوحظ على الميكروسكوب الإلكترون من الخلايا CCL39 (الشكل 2A) والجليكوجين الجسيمات (الشكل 2B). تراكم الجليكوجين في نقص الأكسجة يعتمد على عامل النسخ نقص الأكسجة، عامل محرض-1 (مؤسسة الحرمين-1) (الشكل 3)، عامل النسخ الرئيسية المشاركة في التكيف الخلوية لنقص الأكسجة. أخيرا، علينا أن نظهر في السرطان المختلفة وخطوط الخلايا noncancer أن تخزين الجليكوجين يمكن استقلاب بسرعة من قبل الخلية في أقل من 6 ساعة (الشكل 4A)، وإلى أن استخدام الجليكوجين يحمي من موت الخلايا تحت ظروف المجاعة الجلوكوز (الشكل 4B) 1.
الجدول 1.
| غلو. (ميكروغرام) | 0 | 0.04 | 0.08 | 0.12 | 0.16 | 0.2 | |
| الخام البيانات الإسفار (RDF) | FLUO. | 60 | 88.8 | 106.7 | 121.8 | 148 | 172.1 |
| RDF - الخلفية (مضان ل0 ميكروغرام في منحنى قياسي) | تصحيح | 0 | <قوية> 28.8 | 46.7 | 61.8 | 88 | 112.1 |
 | |||||||
| الخام فلوو البيانات. (RDF) | RDF - الخلفية | (تصحيح * 1000) / منحدر منحنى القياسية | حجم العينة المستخدمة لمعايرة الجليكوجين | البروتين الخام البيانات تركيزات-الفلترة | γ * حجم العينة | الجلوكوز (نانوغرام) / البروتين الكلي | |
| مجموع تركيز الجلوكوز 1 | FLUO. | تصحيح | الجلوكوز (نانوغرام) | عينة حجم | | البروتين الكلي | الجلوكوز (نانوغرام / ميكروغرام العلاقات العامة.) | |
| نموذج 1 (CCL39-NX 1) | 65.8 | 5.8 | 10.5 | 20 | 0.07 | 1.4 | 7.5 |
| عينة 2 (CCL39-NX 2) | 64.1 | 4.1 | 7.4 | 20 | 0.11 | 2.2 | 3.4 |
| عينة 3 (CCL 39 HX 48 ساعة 1) | 177.3 | 117.3 | 211.5 | 4 | 0.22 | 0.88 | 240.3 |
الجدول 1.5.
| عينة 4 (بال 39 HX 48H 2) | 174.2 | 114.2 | 205.9 | 4 | 0.24 | 0.96 | 214.5 |
| عينة 5 (CCL 39 HX 72 ساعة 1) | 164.7 | 104.7 | 188.8 | 2 | 0.22 | 0.44 | 429.1 |
| عينة 6 (بال 39 HX 72 ساعة 2) | 174.7 | 114.7 | 206.8 | 2 | 0.24 | 0.48 | 430.9 |
| الخام فلوو البيانات. (RDF) | RDF - الخلفية | (تصحيح * 1000) / منحدر منحنى القياسية | حجم العينة المستخدمة لمعايرة الجليكوجين | البروتين الخام البيانات تركيزات-الفلترة | γ * حجم العينة | الجلوكوز (نانوغرام) / البروتينمجموع | |
| مجموع تركيز الجلوكوز 2 | FLUO. | تصحيح | الجلوكوز (نانوغرام) | عينة حجم | γ (ميكروغرام / ميكرولتر) | البروتين الكلي | الجلوكوز (نانوغرام / ميكروغرام العلاقات العامة.) |
| نموذج 1 (CCL39-NX 1) | 63 | 3 | 5.4 | 10 | 0.07 | 0.7 | 7.7 |
| عينة 2 (CCL39-NX 2) | 61.2 | 1.2 | 2.2 | 10 | 0.11 | 1.1 | 2.0 |
| عينة 3 (CCL 39 HX 48 ساعة 1) | 121.6 | 61.6 | 111.1 | 2 | 0.22 | 0.44 | 252.4 |
| عينة 4 (بال 39 HX 48 ساعة 2) | 111.9 | 51.9 | 93.6 | 2 | 0.24 | 0.48 | 195.0 |
| عينة 5 (CCL 39 HX 72 ساعة 1) | 110.3 | 50.3 | 90.7 | 1 | 0.22 | 0.22 | 412.3 |
| عينة 6 (بال 39 HX 72 ساعة 2) | 117.8 | 57.8 | 104.2 | 1 | 0.24 | 0.24 | 434.3 |
الجدول 2.
| الجلوكوز الحرة | FLUO. | تصويبات نشوئها | الجلوكوز (نانوغرام) | عينة حجم | γ (ميكروغرام / ميكرولتر) | البروتين الكلي | الجلوكوز (نانوغرام / ميكروغرام العلاقات العامة.) | تعتبر القيم السالبة ك 0 |
| نموذج 1 (CCL39-NX 1) | 60.2 | 0.2 | 0.4 | 15 | 0.07 | 1.05 | 0.3 | 0.3 |
| عينة 2 (CCL39-NX 2) | 55.3 | -4.7 | -8.5 | 15 | 0.11 | 1.65 | -5.1 | 0 |
| عينة 3 (CCL 39 HX 48 ساعة 1) | 56.5 | -3.5 | -6.3 | 15 | 0.22 | 3.3 | -1.9 | 0 |
| عينة 4 (بال 39 HX 48 ساعة 2) | 56.7 | -3.3 | -6.0 | 15 | 0.24 | 3.6 | -1.7 | 0 |
| عينة 5 (CCL 39 HX 72 ساعة 1) | 57.5 | -2.5 | -4.5 | 15 | 0.22 | 3.3 | -1.4 | 0 |
| عينة 6 (بال 39 HX 72 ساعة 2) | 56.9 | -3.1 | -5.6 | 15 | 0.24 | 3.6 | -1.6 | 0 |
الجدول 3.
| مجموع تركيزات الجلوكوز-1 الفلترة | مجموع تركيزات الجلوكوز-2 الفلترة | مجموع تركيزات الجلوكوز-tratioن المتوسط | الجلوكوز الحرة تركيزات-الفلترة | الجليكوجين (نانوغرام / ميكروغرام العلاقات العامة.) (إجمالي متوسط الجلوكوز - الجلوكوز مجاني) | متوسط الجليكوجين (بين DUPLI-كيتس) | الخطأ ستان-المعيارية | |
| نموذج 1 (CCL39-NX 1) | 7.5 | 7.7 | 7.6 | 0.3 | 7.3 | 5.0 | 3.3 |
| عينة 2 (CCL39-NX 2) | 3.4 | 2.0 | 2.7 | 0.0 | 2.7 | ||
| عينة 3 (CCL 39 HX 48 ساعة 1) | 240.3 | 252.4 | 246.4 | 0.0 | 246.4 | 225.6 | 29.5 |
| سامالتنوير القائل 4 (بال 39 HX 48 ساعة 2) | 214.5 | 195.0 | 204.7 | 0.0 | 204.7 | ||
| عينة 5 (CCL 39 HX 72 ساعة 1) | 429.1 | 412.3 | 420.7 | 0.0 | 420.7 | 426.6 | 8.4 |
| عينة 6 (بال 39 HX 72 ساعة 2) | 430.9 | 434.3 | 432.6 | 0.0 | 432.6 |
الجداول 1 و 2 و 3. حساب ممثل وتطبيع محتوى الجليكوجين من الخلايا CCL39 من دتس الصف مضان. ومعاير الجليكوجين في CCL39 بعد الحضانة في normoxia (NX) أو في نقص الأكسجة 1٪ O 2 (HX) لمدة 48 ساعة أو 72 ساعة. وقد أجريت القياسات الجليكوجين في نسختين لكل حالة. الجزء العلوي من
الشكل 1. الأيض الجليكوجين: نظرة عامة على التوليف وتدهور الجليكوجين يدخل الجلوكوز في السيتوبلازم الخلية من خلال ناقلات الجلوكوز (افراط) للتحول إلى جلوكوز 6 فوسفات بواسطة hexokinases 1 و 2 (هونج كونج). الجلوكوز 6 فوسفات (G6P) عند تقاطع بين تحلل، مسار الفوسفات البنتوز وتكون الغليكوجين. فسفوغلوكوموتاز (PGM) هوانزيم الأولى في تكون الغليكوجين أن يحفز تحويل G6P إلى جلوكوز 1 فوسفات (G1P)، والتي يتم بعد ذلك تحويلها إلى UDP الجلوكوز بواسطة urydylyltransferase الجلوكوز-1-الفوسفات (UGP). يستخدم UDP الجلوكوز بواسطة سينسيز الجليكوجين (GS) لإطالة جزيء مرسى تتألف من glycogenin وبقايا الجلوكوز التي توليها انزيم المتفرعة (BE). سينسيز الجليكوجين والانزيمات المتفرعة التعاون في تشكيل الجليكوجين، وتسمى أيضا تكون الغليكوجين. وتسمى هذه العملية عكس ذلك hydrolyzes الجليكوجين في G1P عبر فسفوريلاز الجليكوجين (GP)، والأنزيمات المشذب (DBE) تحلل الغليكوجين. مقتبس من 3.
الشكل 2. تراكم الجليكوجين في نقص الأكسجين في الخلايا غير السرطانية والخلايا السرطانية. (A) micrografts الكترون من CCL39 في normoxia (NX) (اللوحة اليسرى) ونقص الأكسجة 1٪ O 2 (HX 1٪60؛ 96 ساعة) (اللوحة اليمنى). سهام دلالة مجاميع من الجزيئات الجليكوجين. (B) الكميات من كمية الجليكوجين في CCL39 (أشرطة سوداء) وLS174 (أشرطة بيضاء) الخلايا المزروعة في normoxia (NX) أو نقص الأكسجة 1٪ O 2 (HX 1٪) لمدة 48، 72، و 96 ساعة في 25 ملي المتوسطة التي تحتوي على الجلوكوز.
الرقم 3. تراكم الجليكوجين في نقص الأكسجة تعتمد على مؤسسة الحرمين-1. الكمي لكمية الجليكوجين في LS174 pTerHIF-1α. هذه الخلايا هي استنساخ محرض تعبر عن shRNA ضد مؤسسة الحرمين، 1α في حالة من التتراسيكلين. نمت الخلايا في normoxia (NX) (أشرطة بيضاء) أو نقص الأكسجة 0.1٪ O 2 (HX 0.1٪ - أشرطة سوداء) في غياب (-) أو وجود (+) من التتراسيكلين (تيت).
الشكل 4. الجليكوجين ستوراجنرال الكتريك يحمي من موت الخلايا. (A)، CCL39 (■)، LS174 (▲)، MCF-7 (●)، وMDA-MB231 (خ) تعرض الخلايا إلى 1٪ O 2 نقص الأكسجين لمدة 96 ساعة ومن ثم تربيتها في خالية من السكر في المتوسط لمدة 6 ساعة. وقد تم قياس تركيز الجليكوجين قبل إزالة الجلوكوز ويمثل 100٪. ثم تم قياس الجليكوجين في 1 و 3 و 6 ساعة. النتائج هي ممثل لا يقل عن ثلاث تجارب منفصلة. (ب) قياس موت الخلايا في الخلايا CCL39. وتعرض الخلايا إما normoxia (- تخزين) أو نقص الأكسجة (+ التخزين) لمدة 96 ساعة والمحتضنة في المتوسط خالية من الجلوكوز في نقص الأكسجين لمدة 24 ساعة قبل قياس موت الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المعايرة الكيميائية الحيوية من الجليكوجين في المختبر يسمح الكمي الدقيق للخلايا محتوى الجليكوجين. مقارنة مع بعض التقنيات الأخرى (PAS، المناعي مع الأجسام المضادة الجليكوجين، الخ)، وهذه المعايرة هي محددة جدا وحساسة وقابلة للتكرار. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة مريحة نظرا لأنه لا يتطلب أي نشاط إشعاعي ولكن مطياف مضان. ومع ذلك، هذا الأسلوب هو كمية بحتة ولا يوفر المعلومات حول توزيع الجليكوجين في الخلية.
ويتم تحقيق هذه التقنية الموصوفة في هذه المخطوطة على مقتطفات خلية ولكن يمكن أيضا أن يتحقق على أقسام الأنسجة مع طريقة مناسبة لاستخراج الجليكوجين من الأنسجة. ويستخدم هذا الاختبار في المختبر لتطبيقات وبسبب القياس غير المباشر من الجليكوجين (بعد التحلل إلى جلوكوز)، فإنه لا يمكن تطويرها لمتابعة مخازن الجليكوجين في الجسم الحي.
تلطيخ PAS على نطاق واسع بالفعلتستخدم لتشخيص العديد من الأمراض تخزين الجليكوجين (مرض فون غيركه، وأمراض كوري ومرض مكاردل، وما إلى ذلك). كما انها تستخدم للكشف عن الالتهابات الفطرية أو التمييز بين أنواع فرعية مختلفة من الأورام. من الناحية النظرية، يمكن أن يقترن PAS تلطيخ إلى محلل الصورة لتحديد تركيز الجليكوجين. في الممارسة العملية، وهذا الأسلوب هو الصعب لأداء وأقل ملاءمة من طريقة وصفها هنا للأسباب التالية. أولا، كما PAS تلطيخ الايجابية (البنفسجي) تتداخل مع تلطيخ السلبية (الهيماتوكسيلين الأزرق)، فمن الصعب من الناحية الفنية لاستبعاد إشارة سلبية دون إزالة إشارة إيجابية. بالإضافة إلى ذلك، PAS تلطيخ ليست قابلة للتكرار بما فيه الكفاية لتحديد الجليكوجين، وذلك لأن شدة اللون يمكن أن تعتمد على الوقت من التثبيت، فعالية تلوين، والغسيل، وغيرها. أخيرا، هذه المنهجية البيوكيميائية يعطي متوسط تركيز الجليكوجين لعدد كبير من الخلايا، في حين يركز PAS تلطيخ على حقل معين، وبالتالي هو ممثل أقل من تركيز الجليكوجين الشاملة.
مقايسة البيوكيميائية من الجليكوجين يمكن أن توفر بيانات دقيقة ومفيدة للغاية على مستوى الجليكوجين في الأنسجة. هذه البيانات على سبيل المثال يمكن أن تكون مرتبطة نظريا مع تطور المرض، أو قد يساعد على فهم آثار العلاج على التمثيل الغذائي الجليكوجين. من ناحية أخرى، هذا الأسلوب يتطلب عدة خطوات (الكميات البروتين، والتحلل من الجليكوجين والحد الأدنى من ثلاث قراءات مضان لكل عينة)، ويبدو أقل عملية من تلطيخ PAS. لفهم أفضل لعملية الأيض الفسيولوجية أو المرضية في جسم المريض (السرطان، الخ.)، فمن المهم لتحديد بالضبط الجلوكوز (وATP) التي تقدمها الجليكوجين. ومع ذلك، الجليكوجين الكمي وحدها ليست كافية لفهم عملية التمثيل الغذائي الجليكوجين ويجب أن يقترن مع المجهري لتحديد توزيع الجليكوجين في الخلايا.
الإقليم الشمالي "> ومن المهم أن نشير إلى أنه على الرغم من دقة واستنساخ هذا الاختبار، والاختلاف الصغيرة في محتوى البروتين يمكن أن تؤدي إلى اختلافات كبيرة من القيم تطبيع الجليكوجين. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن هناك زيادة خطية في مضان مع تركيز الجليكوجين، لا يتم الاحتفاظ الخطي في تركيز عال للإشارة التي يسقط بشكل كبير، وبالتالي، فإننا نوصي بعدم تأخذ في الاعتبار القيم مضان تتجاوز تركيزات من منحنى المعايرة. ولذلك نوصي أداء قراءتين مع مجلدين عينة مختلفة. و بهذه الطريقة مضان يعكس الجليكوجين في الخلايا وليس يقابلها انخفاض في مضان.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نحن ممتنون إلى الدكتور تييري Pourcher على إتاحة الفرصة لنا لاستخدام مطياف مضان ومساعدته. ويتم تمويل المختبر من قبل الدوري الفرنسي الوطني كونتر جنيه السرطان (فريق الرياضي labellisée)، وجمعية بحوث صب لا مناهضة جنيه السرطان، والمعهد الوطني للسرطان (إنكا)، والوكالة الوطنية صب لا بحوث، METOXIA (برنامج الاتحاد الأوروبي FP7)، والمركز A. Lacassagne، والمركز الوطني للبحوث العلميه، والمعهد الوطني للسانتيه آخرون دي لا بحوث ميديكال وجامعة نيس ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). نشكر الدكتور كريستيان M الإبراهيمي في القرن لقراءة نقدية وتصحيح التحرير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B | |
References
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).
- Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. Specific features of glycogen metabolism in the liver. Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).
- Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).
- Sullivan, M. A., et al. Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions. Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).
- Chee, N. P., Geddes, R. The structure of liver glycogen. FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochem. J. 441, 763-787 (2012).
- Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. Glycogen metabolism in the normal red blood cell. Blood. 40, 836-843 (1972).
- Agbanyo, M., Taylor, N. F. Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria. Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).
- Louzao, M. C., et al. "Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection. Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).
- Sheehan, D. C. H., B, B. Theory and practice of histotechnology. , 2nd edition, Batelle Press. (1980).
- Baba, O. Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry. Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).
