Summary
我们在这里描述的糖原体外滴定准确，重现性好，方便的生化方法。这种技术使用了Abcam公司糖原测定试剂盒和基于糖原的连续水解的荧光成葡萄糖和葡萄糖滴定。
Abstract
糖原是葡萄糖在脊椎动物的主要精力充沛的聚合物和起着全身代谢以及细胞代谢至关重要的作用。许多方法来检测糖原已经存在，但只有少数是定量的。我们在这里描述使用Abcam公司糖原测定试剂盒，它是基于糖原的特异性降解由葡糖淀粉酶对葡萄糖的方法。葡萄糖被再具体地说被氧化，因为与OxiRed探针，以产生荧光反应产物。滴定法准确，灵敏，可在细胞提取物或组织切片来实现。然而，相对于其他技术，它不提供有关糖原在细胞中分布的信息。作为这种技术的一个例子，我们在这里描述的糖原滴定在两种细胞系，中国仓鼠肺成纤维细胞CCL39和人结肠癌LS174，孵育在常氧（21％O 2）与低氧（1％O 2）。我们假设，缺氧是SIGNAL，准备细胞合成和储存糖原为了生存1。
Introduction
糖原是葡萄糖残基的多分支聚合物，其存在于许多类型的细胞的细胞质中。它的能量储存在细胞中的主要形式之一，在糖代谢中起重要作用。大多数哺乳动物细胞能够生产和储存的糖原，可迅速降解成葡萄糖代谢应激过程中，以促进糖酵解和ATP生产。肝细胞糖原产生大量的调节血糖水平，从而提供给身体一个连续供应的葡萄糖。与此相反，糖原在其它细胞（肌肉，红细胞等 ）的浓度相对较低。然而，在当地，这些量足以在短期内，当细胞被突然暴露于被剥夺营养物质的环境中提供能量。
糖原合成和糖原分解如下在所有组织中相同的步骤（ 图1）。首先，葡萄糖进入细胞的葡萄糖转运蛋白（生产过剩）和葡萄糖-6 - 磷酸（G6P）由磷酸变迅速转化成葡萄糖-1 - 磷酸（G1P）。 G1P然后修改成UDP-葡萄糖，和UDP-葡萄糖的碳C1被附加到糖原生成，糖原的锚定蛋白的酪氨酸残基。这种分子，被认为是糖原引物，由附着了UDP-葡萄糖到终端葡萄糖的延长通过糖原合成酶的α（1→4）键。最后，当形成超过11个葡萄糖残基的直链，分支酶转移一个终端寡糖附近通过α（1→6）键由至少6个葡萄糖残基组成的链的另一个葡萄糖。这一过程的重复给出包含形成与每转6.5葡萄糖螺旋分支大规模分形结构。糖原可以反向水解由协调一致的行动，以葡萄糖脱支该水解α（1→6） 约束和糖原磷酸化酶能够水解的α（1→4）糖苷结合的一个分支的葡萄糖的最后一个残基与糖原分子之间的酶。此反应称为糖原分解是通过增加AMP水平（反映ATP消耗）激活，并且由葡萄糖和ATP 2,3抑制。
通过电子显微镜，糖原分子已被许多细胞类型中，直径15-30纳米，β自由粒子（或糖原monoparticles）中所述。在特定的细胞类型，例如肝细胞，β粒子可被组装成一个复合物形成玫瑰花结，也称为α粒子，在不同的直径从80纳米至最多为200nm的4 5，氢键，或什至通过蛋白质-蛋白质相互作用6键合。糖原储存在细胞的量取决于许多参数：（Ⅰ）在糖原生成发起糖原合成的细胞的数量;由蛋白质磷酸化/去磷酸化调节糖原合酶和磷酸化酶（Ⅱ）的活性;（Ⅲ）的浓度葡萄糖在细胞内，这是依赖于几个参数，如葡萄糖从血管系统的供应和葡萄糖被细胞吸收。肝糖的储存是通过中间代谢产物严格的监管由生物合成的激素变构调节，受激素调节能量代谢，并通过营养感应信号通路7。
是很重要的能够量化的糖原生物样品中更好地了解糖原代谢的整个身体和细胞水平的重要性。我们在这里描述的糖原体外测定准确，重现性好，方便生化。这个技术是基于之前和之后的糖原水解特定的量化葡萄糖荧光。
其他方法存在估计糖原水平在细胞内，但其中大多数是不定量的。一种用于糖原在细胞的定量描述的第一方法是基于[14 C]-葡萄糖掺入糖原8,9的测量值。使用的放射性使得这一过程更难以处理，但它具有提供葡萄糖掺入率成糖原和葡萄糖残基上的外分支和在该分子的核心分布之间进行区分的优点（它也需要一个额外的β-amylolySIS和层析步骤）。另一种技术被开发，最近，是基于2-NBDG的掺入对（2 - {N-[7 - 硝基苯并-2 - 氧杂-1,3 - 二唑-4 - 基]氨基} -2 - 脱氧葡萄糖），一2 -脱氧葡萄糖荧光衍生物，成糖原10。所测量的荧光强度反映了糖原的产生量，并可以用荧光阅读器进行测定。荧光在细胞中的分布，也可以通过共聚焦显微镜评价。
在其他的非定量技术，高碘酸 - 希夫染色（PAS）可能是最常见的。它可用于糖原在固定的细胞，组织切片中的石蜡或冰冻的检测。这种组织学技术的色彩非特异性多糖，糖脂，糖蛋白，纤维素和中性粘蛋白在紫色。本试验的特异性可提高治疗固定细胞或组织切片与淀粉酶，其特异性地消化糖原。此后，糖原的水平可以通过比较未水解样品（所有碳水化合物大分子修饰），以水解样品（碳水化合物大分子修饰糖原除外）进行定性估计。 PAS染色和显微镜分析，与糖原的生化分析，提供关于糖原在细胞中的分布，从而可以扩散或集中在细胞的特定部分的信息。然而，即使在不同条件之间的糖原累积PAS染色估计的差异，这是不定量11。
单克隆抗体的小鼠最初做用下颌骨髁状突软骨作为抗原已被证明与糖原的细胞和用纯化糖原在体外 12反应。作为该抗体特异性地识别糖原相关的糖链，它是糖原在比PAS染色的更具体的方式的检测用免疫组织化学的有用工具。 电子显微镜是另一种技术，它允许在细胞和糖原贮积的程度的评价晶粒糖原的可视化。事实上，糖原β粒子很容易辨认用电子显微镜作为电子致密颗粒1。
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Protocol
糖原生化滴定
1。细胞裂解
- 种子细胞以0.5-2×10 6个，每100毫米直径的培养皿的浓度。
- 治疗方法：细胞培养24，48，或72小时的氧气浓度低（缺氧）的一个Bug盒厌氧工作站（Ruskinn科技Biotrace INTERNATIONAL PLC，英国Bridgend）定为1％或0.1％的O 2，94％或94.9％N 2和5％CO 2。同时，培养细胞在常氧（21％O2，5％CO2）。改变培养基（25mM的含有葡萄糖的培养基中），每24小时以在实验的时间变化最小的葡萄糖浓度。
- 治疗后，用PBS洗涤细胞2倍，从培养基中除去葡萄糖的痕迹。刮去细胞冷PBS。
- 离心溶液以1,000 rpm离心5分钟，弃去上清，用PBS洗涤沉淀一次。沉淀可在-20°C进一步处理之前被冻结。
- 重悬沉淀在100μl蒸馏水中。加入100μl的糖原水解缓冲器提供与糖原测定试剂盒（Abcam公司）。煮沸裂解物在95℃下5分钟，以灭活酶。
- 涡旋并离心溶胞产物以13,000 rpm离心10分钟以除去不溶性产物。保留上清液。
- 正常化糖原水平到样本之间的蛋白质含量，蛋白质的定量可以用25-35微升使用二喹啉甲酸测定（BCA-INTERCHIM）的上清液进行。
一些裂解物可用于测量细胞内的游离葡萄糖浓度。
2。糖原水解
- 混合50微升上清液（步骤1）与1微升的水解酶混合物的。该混合物中含有淀粉酶。孵育30分钟，在室温下进行。
- 通过稀释标准糖原制备校准曲线（2毫克/毫升）■upplied与试剂盒，以10微克/毫升在水解缓冲液的溶液。接着，准备6 0分离的管，4，8，12，16，和20微升的10微克/毫升的标准和每个管调整到50微升与水解缓冲液的最终体积，得到的0糖原的浓度，0.04 ，0.08，0.12，0.16，和0.2微克/毫升。加入1μl水解酶混合物的标准中并孵育30分钟，在室温下进行。
该细胞系的背景葡萄糖浓度，按值的游离葡萄糖浓度给出，必须先减去该值的总葡萄糖浓度（从糖原水解+游离葡萄糖葡萄糖）来确定糖原在细胞中的水平。
3。发展与阅读荧光
- 对于每个条件，（管1）准备一管来测量游离葡萄糖浓度和两管（管2和3）来测量总的葡萄糖浓度（每管机智哈哈不同的卷水解糖原）。
- 加15微升上清液在管1步骤1的端部抽出。加35微升的水解缓冲液来完成的，以50微升的最终体积。得到的荧光将得到游离葡萄糖浓度。
- 在管2添加水解糖原（在步骤2中获得的） 第 X微升。调整到50微升的最终体积。样品的体积（倍微升）必须根据为了获得所没有超出校准曲线的浓度的荧光值的细胞密度和/或细胞类型进行调整。
- 添加水解糖原的2×μl，以管3。调整到50微升的最终体积。
- 通过将每个管48.7微升发展缓冲区，1微升开发酶混合物和0.3微升OxiRed探头（在糖原检测试剂盒提供）准备样品和标准开发的解决方案。例如，对于2的条件下，准备一个混合的12管S（6标准，2个免费的葡萄糖和4总葡萄糖荧光）。
- 加50μl的此混合物至每个管并孵育30分钟，在室温下在黑暗中。
- 测量的荧光在535纳米，587纳米的发射波长的激发波长的建议，并为3nm用于激发和发射的狭缝。
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Representative Results
氧气（缺氧）肿瘤中的信号对肿瘤细胞需要存储能量来处理后续的养分耗竭，以便生存的低水平。糖原是葡萄糖在哺乳动物细胞中的主要高能聚合物，我们研究了糖原储存在缺氧的调节。糖原的细胞裂解液中的浓度的计算和标准化，必须对荧光的原始数据，进行如表1，2，和3。的生物化学测定糖原证实，电子致密聚集体上CCL39细胞的电子显微镜照片观察到（ 图2A）进行糖原颗粒（ 图2B）。糖原在缺氧的积累是依赖于转录因子低氧诱导因子-1（HIF-1）（ 图3），涉及细胞适应低氧的主要转录因子。最后，我们展示了在不同的癌症，该储存的糖原可以迅速被细胞在小于6小时（ 图4A）被代谢，而葡萄糖饥饿的（ 图4B）的条件下使用糖原防止细胞死亡的非癌性细胞系1。
表1中。
| 谷氨酸。 （微克） | 0 | 0.04 | 0.08 | 0.12 | 0.16 | 0.2 | |
| 原始数据荧光（RDF） | 荧光。 | 60 | 88.8 | 106.7 | 121.8 | 148 | 172.1 |
| RDF -背景（荧光为0微克的标准曲线） | 更正 | 0 | <STRONG> 28.8 | 46.7 | 61.8 | 88 | 112.1 |
 | |||||||
| 原始数据荧光粉。 （RDF） | RDF -背景 | （修正* 1000）/斜率标准曲线 | 样品的体积用来滴定糖原 | 原始数据的蛋白浓度，tration | γ*体积的样品 | 葡萄糖（NG）/总蛋白 | |
| 总葡萄糖浓度1 | 荧光。 | 更正 | 葡萄糖（NG） | 体积的样品 | | 总蛋白 | 葡萄糖（毫微克/微克公关。） | |
| 样品1（CCL39-NX 1） | 65.8 | 5.8 | 10.5 | 20 | 0.07 | 1.4 | 7.5 |
| 样品2（CCL39-NX 2） | 64.1 | 4.1 | 7.4 | 20 | 0.11 | 2.2 | 3.4 |
| 样品3（CCL 39 HX 48小时1） | 177.3 | 117.3 | 211.5 | 4 | 0.22 | 0.88 | 240.3 |
表1.5。
| 样品4（CCL 39 HX 48小时2） | 174.2 | 114.2 | 205.9 | 4 | 0.24 | 0.96 | 214.5 |
| 样品5（CCL 39 HX 72小时1） | 164.7 | 104.7 | 188.8 | 2 | 0.22 | 0.44 | 429.1 |
| 样品6（CCL 39 HX 72小时2） | 174.7 | 114.7 | 206.8 | 2 | 0.24 | 0.48 | 430.9 |
| 原始数据荧光粉。 （RDF） | RDF -背景 | （修正* 1000）/斜率标准曲线 | 样品的体积用来滴定糖原 | 原始数据的蛋白浓度，tration | γ*体积的样品 | 葡萄糖（NG）/蛋白质总 | |
| 总葡萄糖浓度2 | 荧光。 | 更正 | 葡萄糖（NG） | 体积的样品 | γ（微克/微升） | 总蛋白 | 葡萄糖（毫微克/微克公关。） |
| 样品1（CCL39-NX 1） | 63 | 3 | 5.4 | 10 | 0.07 | 0.7 | 7.7 |
| 样品2（CCL39-NX 2） | 61.2 | 1.2 | 2.2 | 10 | 0.11 | 1.1 | 2.0 |
| 样品3（CCL 39 HX 48小时1） | 121.6 | 61.6 | 111.1 | 2 | 0.22 | 0.44 | 252.4 |
| 样品4（CCL 39 HX 48小时2） | 111.9 | 51.9 | 93.6 | 2 | 0.24 | 0.48 | 195.0 |
| 样品5（CCL 39 HX 72小时1） | 110.3 | 50.3 | 90.7 | 1 | 0.22 | 0.22 | 412.3 |
| 样品6（CCL 39 HX 72小时2） | 117.8 | 57.8 | 104.2 | 1 | 0.24 | 0.24 | 434.3 |
表2。
| 游离葡萄糖 | 荧光。 | 校正，tion | 葡萄糖（NG） | 体积的样品 | γ（微克/微升） | 总蛋白 | 葡萄糖（毫微克/微克公关。） | 负值被认为是0 |
| 样品1（CCL39-NX 1） | 60.2 | 0.2 | 0.4 | 15 | 0.07 | 1.05 | 0.3 | 0.3 |
| 样品2（CCL39-NX 2） | 55.3 | -4.7 | -8.5 | 15 | 0.11 | 1.65 | -5.1 | 0 |
| 样品3（CCL 39 HX 48小时1） | 56.5 | -3.5 | -6.3 | 15 | 0.22 | 3.3 | -1.9 | 0 |
| 样品4（CCL 39 HX 48小时2） | 56.7 | -3.3 | -6.0 | 15 | 0.24 | 3.6 | -1.7 | 0 |
| 样品5（CCL 39 HX 72小时1） | 57.5 | -2.5 | -4.5 | 15 | 0.22 | 3.3 | -1.4 | 0 |
| 样品6（CCL 39 HX 72小时2） | 56.9 | -3.1 | -5.6 | 15 | 0.24 | 3.6 | -1.6 | 0 |
表3。
| 总葡萄糖浓度-tration 1 | 总葡萄糖浓度-tration 2 | 总葡萄糖浓度，TRATION平均 | 游离葡萄糖浓度-tration | 糖原（毫微克/微克镨）（总平均葡萄糖-游离葡萄糖） | 平均糖原（之间DUPLI-卡特） | 标准错误 | |
| 样品1（CCL39-NX 1） | 7.5 | 7.7 | 7.6 | 0.3 | 7.3 | 5.0 | 3.3 |
| 样品2（CCL39-NX 2） | 3.4 | 2.0 | 2.7 | 0.0 | 2.7 | ||
| 样品3（CCL 39 HX 48小时1） | 240.3 | 252.4 | 246.4 | 0.0 | 246.4 | 225.6 | 29.5 |
| 山姆辉4（CCL 39 HX 48小时2） | 214.5 | 195.0 | 204.7 | 0.0 | 204.7 | ||
| 样品5（CCL 39 HX 72小时1） | 429.1 | 412.3 | 420.7 | 0.0 | 420.7 | 426.6 | 8.4 |
| 样品6（CCL 39 HX 72小时2） | 430.9 | 434.3 | 432.6 | 0.0 | 432.6 |
表1，2，3。代表性的计算和从荧光排景致CCL39细胞糖原含量正常化。糖原48小时或72小时培养常氧（NX），或在缺氧1％的O 2（HX）后滴定CCL39。糖原测量已经重复做过的每个条件。的顶部
图1。糖原代谢：糖原合成和降解的概述葡萄糖进入细胞的细胞质中通过葡萄糖转运蛋白（生产过剩）用于转化成葡萄糖-6 -磷酸通过己糖激酶1和2（HK）。葡萄糖-6 - 磷酸（G6P）是在糖酵解，戊糖磷酸途径和糖原生成之间的交界处。葡萄糖磷酸（PGM）是在糖原生成第一种酶，其催化G6P转化成葡萄糖-1 - 磷酸（G1P），然后将其转化成UDP-葡萄糖通过葡萄糖-1 - 磷酸urydylyltransferase（UGP）。 UDP-葡萄糖是由糖原合成酶（GS），以伸长的锚固分子糖原生成的构成，附属于一个分支酶（BE）中的葡萄糖残基。糖原合成酶和分支酶糖原的形成合作，也被称为糖原。相反的过程是通过糖原磷酸化酶（GP）和去分支酶（DBE）糖原水解成G1P被称为糖原分解。从3调整。
图2。糖原在缺氧的非肿瘤细胞和癌细胞的积累。（A）CCL39在常氧电子微移植物（NX）（左图）和低氧1％的O 2（HX 1％60; 96小时）（右图）。箭头表示糖原颗粒的聚集体。糖原在CCL39量（黑网吧）和48，72，和96小时的25种植在常氧（NX）或低氧1％的O 2（HX 1％）LS174（白条）的细胞（B）定量毫含葡萄糖的培养基中。
图3。糖原在缺氧的积累依赖于HIF-1，定量的LS174 pTerHIF-1α的糖原量。这些细胞诱导克隆的四环素条件表达shRNA的对HIF-1α的。在没有-四环素（TET）或存在（+）（） -细胞常氧增长（NX）（白条）或缺氧0.1％O 2（黑棒HX 0.1％）。
图4。斯道糖原GE免受细胞死亡。 （A），CCL39（■），LS174（▲），MCF-7（●），和MDA-MB231（x）的细胞，进行1％O 2缺氧96小时，然后在培养的葡萄糖的培养基中为6小时。糖原含量的测定只是去除葡萄糖前，代表100％。糖原然后在1，3测量，并且6小时。结果代表了至少三个独立实验。 （二）测量细胞死亡CCL39细胞。细胞进行任一常氧（ - 存储）或缺氧（+存储）为96小时，培养在低氧葡萄糖的培养基中，用于测量细胞死亡之前24小时。
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Discussion
糖原在体外生化滴定允许细胞糖原含量的准确定量。比较一些其他技术（PAS，免疫荧光与糖原抗体等 ），该滴定是非常特异，灵敏，可重复的。此外，该方法是方便的，因为它不需要放射性但荧光光谱仪。然而，这种技术是纯粹的定量和不提供有关在细胞糖原分布的信息。
在这个手稿中描述的技术是实现对细胞提取物中，但它也可以实现对组织切片以用于从组织中提取糖原的适当方法。该测定法被用于体外应用和由于糖原的间接测量（水解成葡萄糖之后），它不能被开发，以遵循糖原储存在体内 。
PAS染色已经被广泛用于诊断许多糖原贮积病（冯基尔克氏病，科里氏病，麦卡德尔病等 ）。它也可以用来检测真菌感染或肿瘤的不同亚型之间进行区分。从理论上讲，PAS染色可以耦合到一个图象分析仪来确定糖原浓度。在实践中，这种技术很难进行并且比这里描述的原因如下所述方法不太适合。首先，作为PAS阳性染色（紫色）与阴性染色（苏木精 - 蓝）重叠时，它在技术上是难以排除的负信号而不除去阳性信号。另外，PAS染色不够重现的量化糖原，因为颜色的强度可以依赖于固定术，疗效显色，清洗等的时间。最后，该生物化学方法使糖原对于大量的细胞的平均浓度，而PAS染色的重点一个特定的领域，因此整体糖原的浓度代表较少。
糖原的生化分析可以提供关于糖原在组织中的水平相当准确信息数据。这些数据例如可以假想地关联与疾病进展，或可能有助于了解治疗对糖原代谢的影响。另一方面，这种技术需要几个步骤（蛋白定量，糖原水解和最低每样本3荧光读数），并且似乎比PAS染色不太实用。为更好地理解本生理或病理生理代谢（癌症等 ）的，它能够精确地量化由糖原提供的葡萄糖（和ATP）是重要的。然而，单独的糖原定量不足以理解糖原代谢和必须加上显微镜来确定糖原在细胞中的分布。
NT“>重要的是要指出，尽管该试验的准确性和再现性，在蛋白质含量的微小变化可导致糖原的归一化值的大的变化是很重要的，此外，虽然在荧光的线性增加与肝糖浓度，线性度不能维持在高浓度的信号急剧下降，因此，我们建议不要考虑超过校准曲线的浓度的荧光值。因此，我们建议进行两个读数有两个不同的样本量。在这样的荧光反映了在细胞中的糖原而不是由在荧光的减少所抵消。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣称没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢蒂埃里Pourcher医生允许我们使用荧光光谱仪和他的帮助。该实验室是由法甲驳国立癌症勒（队报labellisée）资助，该协会倒拉RECHERCHE CONTRE乐巨蟹研究所国家杜癌症（INCA），在国立新电倒拉RECHERCHE，METOXIA（欧盟第七框架计划），该中心A.拉卡萨涅，该中心法国国家科学研究，研究所国家德拉桑特等德拉RECHERCHEMédicale和尼斯大学（ http://www.unice.fr/isdbc/ ）。我们感谢博士M克里斯蒂安卜拉希米 - 霍恩的批判性阅读和编辑更正。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B | |
References
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