Summary
우리는 여기에서 체외에서 글리코겐의 적정에 대한 정확한 재현하고 편리한 생화학 적 방법을 설명합니다. 이 기술은 ABCAM 글리코겐 분석 키트를 사용하여 형광 적정 포도당과 포도당 글리코겐의 연속적인 가수 분해에 기초한다.
Abstract
글리코겐은 척추 동물에있는 포도당의 주요 에너지 폴리머 및 중요한 몸 전체의 신진 대사의 역할뿐만 아니라, 세포의 신진 대사를한다. 글리코겐을 감지하는 많은 방법이 이미 존재하지만 몇 가지 양적 있습니다. 우리는 여기에 글루코 아밀라제에 의해 포도당 글리코겐의 분해에 기초하여 특정되는 ABCAM 글리코겐 분석 키트를 사용하는 방법을 설명한다. 포도당이어서 구체적으로 형광을 생성하는 OxiRed 프로브와 반응 생성물로 산화된다. 적정 결과, 정확한 구분하고 세포 추출물 또는 조직 섹션에 달성 될 수있다. 그러나, 다른 기술과 대조적으로, 그 셀의 글리코겐의 분포에 대한 정보를 제공하지 않는다. 이 기술의 예로서, 우리는 정상 산소 상태에서 배양이 세포 선 중국 햄스터 폐 섬유 아세포 CCL39 인간 결장암 LS174, 저산소증 대 (21 % O 2) (1 % O 2) 여기 글리코겐의 적정을 설명한다. 우리는 저산소증이 SIG는 것을 가정NAL 그 세포가 1 살아 남기 위해 합성 및 저장 글리코겐을 준비합니다.
Introduction
글리코겐은 여러 종류의 세포의 세포질에 존재하는 글루코스 잔기의 다 분기 폴리머이다. 그것은 세포의 에너지 저장 장치의 주요 형태 중 하나이며 글루코스 대사에 중요한 역할을한다. 대부분의 포유 동물 세포는 빠르게 대사 스트레스를받는 동안 작용과 ATP의 생산을 촉진하기 위해 포도당으로 분해 할 수 있고, 저장 글리코겐을 생성 할 수있다. 간세포함으로써 신체의 포도당 연속적인 공급을 제공하는 혈당치를 조절하기 위해 글리코겐 대량 생산. 대조적으로, 다른 셀 (근육, 적혈구 등) 글리코겐의 농도는 상대적으로 낮다. 그러나, 국부적으로, 이들 양들은 세포가 갑자기 영양소 박탈 환경에 노출되어 단기간에 에너지를 제공하기에 충분하다.
글리코겐 합성과 글리코겐 분해는 모든 조직에서 동일한 단계 (그림 1)을 다음과 같습니다. 첫째, 포도당포도당 수송 체 (과잉)에 의해 세포를 입력하고 빠르게 포스 포 글루코스 -1 - 포스페이트 (G1P)에 포도당 -6 - 인산 (G6P)에서 변환됩니다. G1P이어서 UDP-글루코스로 변성되고, UDP-글루코스 탄소 C1은 glycogenin, 글리코겐의 고정 단백질의 티로신 잔기에 부착된다. 이 분자는 글리코겐 프라이머 고려, 글리코겐 합성 효소를 통해 α (1 → 4) 결합에 의해 터미널 포도당 UDP-글루코오스의 부착에 의해 확장됩니다. 11 이상의 글루코오스 잔기의 선형 사슬이 형성되면 마지막으로, 브랜칭 효소 부근 α (1 → 6) 결합을 통해 체인의 다른 포도당 6 글루코오스 잔기의 최소로 이루어지는 단자 올리고당을 전송한다. 이 과정의 반복은 다시 6.5 포도당과 나선을 형성하는 지점을 포함하는 대규모의 프랙탈 구조를 제공합니다. 글리코겐은 공동 작용에 의해 포도당 역으로 가수 분해 될 수있다분기의 포도당의 마지막 잔여 물과 글리코겐 분자 사이의 결합 글리코 시드 α (1 → 4)을 가수 분해 α (1 → 6) 결합과 글리코겐 포스를 가수 분해 효소를 debranching의. 글리코겐 분해 불리는이 반응은 (ATP 소모를 반영하는) AMP의 농도 증가에 의해 활성화하고, 글루코스 및 ATP 2,3에 의해 억제된다.
전자 현미경으로 글리코겐 분자는 여러 세포 유형, 직경 15 ~ 30 ㎚의 입자로서 β 무료 (또는 글리코겐 monoparticles)에서 설명되었다. 그러한 간세포 등의 특정 세포 유형에서, β 입자는 80 nm 내지 200 nm의 (4)의 최대 직경이 될 또한 α 입자라고도 로제트를 형성하도록 복합체로 조립 될 수있다 4.0, 수소 결합, 또는 단백질 - 단백질 상호 작용을 통한 6 의해 결합 될 수 있다는 것을 증명하는 경향이있다. 세포에서 저장된 글리코겐의 양은 많은 변수에 의존한다 : (I) 글리코겐 합성을 개시 셀 glycogenin의 양, 단백질 인산화 / 탈 인산화에 의해 조절 글리코겐 신타 제 및 포스 포 릴라 제의 (II) 활성, (III) 농도 이러한 혈관 시스템에서 포도당의 공급과 세포의 포도당 흡수 등 여러 가지 매개 변수에 의존하는 세포에 포도당. 글리코겐 저장 단단히 에너지 대사를 조절하는 호르몬에 의해, 중간 대사 물질을 생합성 호르몬의 알로 스테 릭 조절에 의해 조절하고, 영양이 감지 신호 전달 경로 7로됩니다.
그것은하는 것이 중요합니다더 나은 몸 전체 및 세포 수준에서 글리코겐 대사의 중요성을 이해하는 생물학적 샘플에서 글리코겐을 정할 수. 우리는 여기에서 글리코겐을위한 체외 분석에서, 정확한 재현하고 편리한 생화학을 설명합니다. 이 기술은 글리코겐의 구체적인 가수 분해 전후 정량화 포도당 형광에 기초한다.
다른 방법은 세포에서의 글리코겐 수준을 추정하기 위해 존재하지만, 대부분은 정량적 않는다. 세포에있는 글리코겐의 정량화 한 제 방법 중 하나는 글리코겐 8,9에 [14 C] - 포도당 결합 측정을 기반으로했다. 방사능 사용 취급이 과정을 더욱 어렵게 만들지 만이 글리코겐으로 그리고 외측 분기와 분자의 코어에서 글루코오스 잔기의 분포를 구별 글루코스 혼입 비율을 제공하는 이점이있다 (또한 필요합니다 추가 β-amylolySIS 및 크로마토 그래피 단계). 또 다른 기술은보다 최근에 개발되었고, 2-NBDG의 혼입에 기반 (2 - {N-[7-nitrobenz-2-옥사 -1,3 - diazol -4 - 일] 아미노} -2 - 데 옥시 글루코오스) 글리코겐 (10)에 2 - 데 옥시 글루코오스 형광 유도체. 측정 된 형광 강도는 제조 글리코겐의 양을 반영하고 형광 판독기로 측정 할 수있다. 셀에서 형광의 분포는 공 초점 현미경에 의해 평가 될 수있다.
다른 nonquantitative 기술 중, 요오드 산 쉬프 염색 (PAS)는 아마도 가장 일반적입니다. 그것은 고정 된 세포, 파라핀 조직 절편 또는 냉동 글리코겐의 검출을 위해 사용될 수있다. 보라색이 조직 학적 기술의 색깔이 아닌 구체적으로 다당류, 당지질, 당 단백질, 셀룰로오스 및 중립 뮤신. 이 테스트의 특이도는 특별히 글리코겐 소화 디아스타아제, 고정 세포 또는 조직 섹션의 처리에 의해 증가 될 수있다. 그 후,글리코겐의 수준은 질적 (탄수화물 글리코겐 제외한 고분자를 변경됨) 가수 분해 된 샘플을 가수 분해되지 않은 샘플 (전체 탄수화물 고분자 변경됨)을 비교함으로써 추정 될 수있다. 글리코겐의 생화학 적 분석법 달리 PAS 염색 및 현미경 분석은, 확산 또는 셀의 특정 부분에 집중 될 수있는 셀 글리코겐의 분포를, 관련된 정보를 제공한다. 심지어 다른 조건 사이의 글리코겐 축적 PAS 염색 추정치의 차이하지만 그러나, 11 양적 없습니다.
단일 클론 마우스 항체는 원래 항원 체외 12 세포에서 글리코겐으로 정제 글리코겐과 반응을 보여줘왔다로서 하악 과두 연골을 사용했다. 이러한 항체는 특히 글리코겐 관련 당 사슬 인식로서, PAS 염색보다 더 구체적인 방법으로 면역 조직 화학에 의해 글리코겐의 검출을위한 유용한 도구이다. 전자 현미경은 세포와 글리코겐 저장의 정도의 평가에 글리코겐의 곡물의 시각화를 허용 다른 기술이다. 사실, 글리코겐 β 입자는 전자 조밀 한 과립과 같은 전자 현미경으로 용이하게 인식 할 수있다.
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Protocol
글리코겐의 생화학 적정
1. 세포 용해
- 100mm 직경 접시 당 0.5 × 106의 농도로 시드 세포.
- 치료 : 세포를 품어 24, 1 % 또는 0.1 % O 2, 94 % 또는 설정 버그 박스 혐기성 워크 스테이션 (Ruskinn 기술 Biotrace 국제적인 Plc, 브리 젠드, UK)에서 낮은 산소 농도 (저산소증)에서 48, 또는 72 시간 94.9 %의 N 2, 5 % CO 2. 병행 (21 % O 2, 5 % CO 2) 정상 산소 상태에서 세포를 배양한다. 실험의 시간 동안 포도당 농도의 변화를 최소화하기 위해 모든 24 시간 (25 mM의 포도당 함유 매체) 매체를 변경합니다.
- 처리 후, 세척 세포는 배양 배지에서 포도당의 흔적을 제거하기 위해 PBS로 2 배. 차가운 PBS의 세포를 다 쳤어요.
- 5 분 동안 1,000 rpm에서 솔루션을 원심 분리기, 상층 액을 버리고 PBS로 한번 펠렛을 씻으십시오. 펠렛을 더 진행하기 전에 -20 ° C에서 얼 수있다.
- 증류수 100 μL에 펠렛을 재현 탁. 글리코겐 분석 키트 (ABCAM)와 함께 제공되는 글리코겐 가수 분해 버퍼 100 μl를 추가합니다. 효소를 불 활성화하기 위해 5 분 동안 95 ° C에서 용해 액을 끓인다.
- 불용성 제품을 제거하는 10 분 동안 13,000 rpm으로 소용돌이 원심 분리기 해물. 뜨는을 유지합니다.
- 샘플 사이의 단백질 함량에 글리코겐 수준을 정상화하기 위해, 단백질의 정량은 Bicinchoninic 산성 분석 (BCA-Interchim)를 사용하여 상청액의 25-35 ㎕를 사용하여 수행 할 수있다.
파쇄물 중 일부는 세포 내부에서 자유롭게 글루코스 농도를 측정하기 위하여 사용될 수있다.
2. 글리코겐의 가수 분해
- 가수 분해 효소 믹스 1 μL와 상층 액 (1 단계) 50 μl를 섞는다. 이 혼합물은 글루코 아밀라아제가 포함되어 있습니다. 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- 표준 글리코겐 희석하여 검량선을 작성 (2 ㎎ / ㎖)의가수 분해 완충액에서 10 ㎍ / ㎖의 용액으로 키트 upplied. 다음에, 여섯 별도 0으로 튜브, 4, 8, 12, 16 및 10 ㎍ / ㎖의 표준의 20 μL를 준비하여 0으로 글리코겐의 농도를 제공하기 위해 가수 분해 완충액 50 μL의 최종 부피로 각각의 튜브를 조정 0.04 , 0.08, 0.12, 0.16, 0.2 ㎍ / ㎖의. 기준에 가수 분해 효소 믹스 1 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 품어.
자유 글루코스 농도 값에 의해 주어진 세포주의 배경 글루코스 농도는, 셀의 글리코겐의 수준을 결정하기 위해 전체 글루코스 농도 (글리코겐 분해 + 자유 글루코오스로부터 글루코오스)의 값으로부터 감산되어야한다.
3. 개발 및 형광의 읽기
- 각 조건에 대해 무료 포도당 농도와 두 개의 튜브를 측정하기 위해 (튜브 1) 하나의 튜브를 준비 (관 2, 3) 총 포도당 농도 (각 관의 지혜를 측정하는가수 분해 된 글리코겐의 하 다른 볼륨).
- 관 (1) 1 단계의 끝에서 추출 상층 액의 15 μl를 추가합니다. 50 μL의 최종 볼륨에 완료하기 위해 가수 분해 버퍼의 35 μl를 추가합니다. 획득 형광 무료 포도당 농도를 줄 것이다.
- 튜브 2 (2 단계에서 얻은) 가수 분해 된 글리코겐의 X의 μl를 추가합니다. 50 μL의 최종 볼륨을 조정합니다. 시료량 (X μL)는 검량선의 농도를 넘지 않은 형광 값을 얻기 위해서는, 세포 밀도 및 / 또는 세포 종류에 따라 조정되어야한다.
- 관 (3)의 가수 분해 된 글리코겐의 2 개의 X μl를 추가합니다. 50 μL의 최종 볼륨을 조정합니다.
- 각각의 튜브에 대한 개발 버퍼의 48.7 μL, 개발 효소 믹스 1 μL와 (글리코겐 분석 키트에 제공) OxiRed 프로브 0.3 μL를 혼합하여 시료와 표준의 개발 솔루션을 준비합니다. 예를 들어, 2 조건을, 12 관을위한 혼합 준비초 (표준 6, 무료 혈당 2 총 포도당 형광 4).
- 각각의 튜브에이 믹스의 50 μl를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- 권장 535 nm의, 587 ㎚의 발광 파장의 여기 파장에서 형광과 여기 및 발광을위한 3 ㎚의 슬릿을 측정한다.
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Representative Results
종양 세포에 종양 신호의 산소 (저산소증) 살아남도록 후속 영양분 고갈을 처리하기 위해 에너지를 저장할 필요 저역. 글리코겐은 포유 동물 세포에서 포도당의 주요 에너지 폴리머, 우리는 저산소증에있는 글리코겐 저장의 규칙을 공부했다. 표 1, 2 및 3에 나타낸 바와 같이 세포 용 해물에서의 글리코겐 농도의 계산 및 표준화 형광의 원시 데이터에 대해 수행되어야한다. 글리코겐의 생화학 적 분석은 전자 밀도가 집계 (그림 2A) (그림 2B) 입자를 글리코겐했다 CCL39 세포의 전자 현미경에서 관찰 된 것을 확인했다. 저산소증에있는 글리코겐의 축적은 전사 인자 저산소증 유도 인자-1 (HIF-1) (그림 3), 저산소증 세포 적응에 관련된 주요 전사 인자에 따라 달라집니다. 마지막으로, 우리는 다른 암에 입증하고저장된 글리코겐이 빠르게 미만으로 10 시간 (도 4a)에서 셀에 의해 대사 및 글리코겐의 사용은 글루코스 고갈 상태 (도 4b)하에 세포 사멸을 방지하는 수 noncancer 세포주 1.
표 1.
| 글루. (μg) | 0 | 0.04 | 0.08 | 0.12 | 0.16 | 0.2 | |
| 원시 데이터 형광 (RDF) | FLUO. | (60) | 88.8 | 106.7 | 121.8 | 148 | 172.1 |
| RDF - 배경 (표준 곡선을 0 μg에 대한 형광) | 보정 | 0 | <강한> 28.8 | 46.7 | 61.8 | 88 | 112.1 |
 | |||||||
| 원시 데이터 플루오 (Fluo). (RDF) | RDF - 배경 | (* 1000 교정) / 기울기 표준 곡선 | 글리코겐을 적정하는 데 사용되는 시료의 양 | 원시 데이터 단백질 집중도 | γ * 볼륨 샘플 | 포도당 (NG) / 전체 단백질 | |
| 다운로드 글루코스 농도 1 | FLUO. | 보정 | 포도당 (NG) | 볼륨 샘플 | | 단백질의 총 | 포도당 (NG / μg 홍보.) | |
| 샘플 1 (CCL39-NX 1) | 65.8 | 5.8 | 10.5 | (20) | 0.07 | 1.4 | 7.5 |
| 샘플 2 (CCL39-NX 2) | 64.1 | 4.1 | 7.4 | (20) | 0.11 | 2.2 | 3.4 |
| 샘플 3 (CCL 39 HX 48 시간 1) | 177.3 | 117.3 | 211.5 | 4 | 0.22 | 0.88 | 240.3 |
표 1.5.
| 샘플 4 (CCL 39 HX의 48 시간 2) | 174.2 | 114.2 | 205.9 | 4 | 0.24 | 0.96 | 214.5 |
| 샘플 5 (CCL 39 HX 72 시간 1) | 164.7 | 104.7 | 188.8 | 2 | 0.22 | 0.44 | 429.1 |
| 샘플 6 (CCL 39 HX 72 시간 2) | 174.7 | 114.7 | 206.8 | 2 | 0.24 | 0.48 | 430.9 |
| 원시 데이터 플루오 (Fluo). (RDF) | RDF - 배경 | (* 1000 교정) / 기울기 표준 곡선 | 글리코겐을 적정하는 데 사용되는 시료의 양 | 원시 데이터 단백질 집중도 | γ * 볼륨 샘플 | 포도당 (NG) / 단백질합계 | |
| 다운로드 글루코스 농도 둘 | FLUO. | 보정 | 포도당 (NG) | 볼륨 샘플 | γ (㎍ / μL) | 단백질의 총 | 포도당 (NG / μg 홍보.) |
| 샘플 1 (CCL39-NX 1) | 63 | 3 | 5.4 | 10 | 0.07 | 0.7 | 7.7 |
| 샘플 2 (CCL39-NX 2) | 61.2 | 1.2 | 2.2 | 10 | 0.11 | 1.1 | 2.0 |
| 샘플 3 (CCL 39 HX 48 시간 1) | 121.6 | 61.6 | 111.1 | 2 | 0.22 | 0.44 | 252.4 |
| 샘플 4 (CCL 39 HX 48 시간 2) | 111.9 | 51.9 | 93.6 | 2 | 0.24 | 0.48 | 195.0 |
| 샘플 5 (CCL 39 HX 72 시간 1) | 110.3 | 50.3 | 90.7 | 1 | 0.22 | 0.22 | 412.3 |
| 샘플 6 (CCL 39 HX 72 시간 2) | 117.8 | 57.8 | 104.2 | 1 | 0.24 | 0.24 | 434.3 |
표 2.
| 무료 포도당 | FLUO. | 수정에 기 | 포도당 (NG) | 볼륨 샘플 | γ (㎍ / μL) | 단백질의 총 | 포도당 (NG / μg 홍보.) | 음의 값은 0으로 간주됩니다 |
| 샘플 1 (CCL39-NX 1) | 60.2 | 0.2 | 0.4 | 15 | 0.07 | 1.05 | 0.3 | 0.3 |
| 샘플 2 (CCL39-NX 2) | 55.3 | -4.7 | -8.5 | 15 | 0.11 | 1.65 | -5.1 | 0 |
| 샘플 3 (CCL 39 HX 48 시간 1) | 56.5 | -3.5 | -6.3 | 15 | 0.22 | 3.3 | -1.9 | 0 |
| 샘플 4 (CCL 39 HX 48 시간 2) | 56.7 | -3.3 | -6.0 | 15 | 0.24 | 3.6 | -1.7 | 0 |
| 샘플 5 (CCL 39 HX 72 시간 1) | 57.5 | -2.5 | -4.5 | 15 | 0.22 | 3.3 | -1.4 | 0 |
| 샘플 6 (CCL 39 HX 72 시간 2) | 56.9 | -3.1 | -5.6 | 15 | 0.24 | 3.6 | -1.6 | 0 |
표 3.
| 총 포도당 집중도 1 | 총 포도당 집중도 2 | 총 포도당 집중 한 - tratioN 평균 | 무료 혈당 집중도 | 글리코겐 (NG / μg 홍보.) (총 평균 포도당 - 포도당 무료) | (에서 중복있는 Cates 사이) 평균 글리코겐 | 표 준 오류 | |
| 샘플 1 (CCL39-NX 1) | 7.5 | 7.7 | 7.6 | 0.3 | 7.3 | 5.0 | 3.3 |
| 샘플 2 (CCL39-NX 2) | 3.4 | 2.0 | 2.7 | 0.0 | 2.7 | ||
| 샘플 3 (CCL 39 HX 48 시간 1) | 240.3 | 252.4 | 246.4 | 0.0 | 246.4 | 225.6 | 29.5 |
| 샘PLE 4 (CCL 39 HX 48 시간 2) | 214.5 | 195.0 | 204.7 | 0.0 | 204.7 | ||
| 샘플 5 (CCL 39 HX 72 시간 1) | 429.1 | 412.3 | 420.7 | 0.0 | 420.7 | 426.6 | 8.4 |
| 샘플 6 (CCL 39 HX 72 시간 2) | 430.9 | 434.3 | 432.6 | 0.0 | 432.6 |
표 1, 2, 3. 대표 계산 및 형광 행 데이타에서 CCL39 세포의 글리코겐 함량의 정상화는. 글리코겐은 48 시간 또는 72 시간 동안 1 % O 2 (HX) 정상 산소 상태 (Nx를) 또는 저산소증에 배양 한 후 CCL39으로 적정 하였다. 글리코겐의 측정은 각 조건에 대해 중복으로 수행되었다. 의 상단 부분
그림 1. 글리코겐 대사 :. 글리코겐의 합성과 분해의 개요 포도당은 헥소 키나제 1과 2 (HK)에 의해 포도당 -6 - 인산으로 변환 포도당 수송 체 (과잉)을 통해 세포의 세포질에 들어갑니다. 글루코스 -6 - 포스페이트 (G6P)이 작용, 펜 토스 포스페이트 경로 및 라이 코젠의 접합부에있다. 포스 포 (PGM)가있다다음 포도당 -1 - 인산 urydylyltransferase (UGP)에 의해 UDP-글루코오스로 변환됩니다 포도당 -1 - 포스페이트 (G1P)로 G6P의 전환을 촉매 라이 코젠 첫 번째 효소. UDP-글루코오스는 glycogenin으로 구성 앵커리지 분자 분기 효소 (BE)에 의해 부착 된 포도당 잔류 물을 연장하기 위해 글리코겐 합성 효소 (GS)에 의해 사용된다. 글리코겐 신타 제 및 분지 화 효소는 라이 코젠이라는, 글리코겐의 형성에 공동. 글리코겐 포스 (GP)와 debranching 효소 (DBE)를 통해 G1P에 글리코겐을 가수 분해 역 과정은 글리코겐 분해라고합니다. 3에서 적응.
그림 2. 비 암 세포와 암 세포의 저산소증에있는 글리코겐 축적. (A) 정상 산소 상태에서 CCL39의 전자 마이크로 그라프 (Nx를) (왼쪽 패널)와 저산소증 1 % O 2 (HX 1 %60, 96 시간) (오른쪽 패널). 화살표는 글리코겐 입자의 집계를 나타냅니다. CCL39에있는 글리코겐의 양 (검은 막대)와 25에서 48, 72, 96 시간 동안 정상 산소 상태 (Nx를) 또는 저산소증 1 % O 2 (HX 1 %)에서 재배 LS174 (흰색 막대) 세포 (B) 정량 mM의 글루코스 - 함유 배지.
그림 3. 저산소증에있는 글리코겐 축적 LS174 pTerHIF-1α의 글리코겐 양의 HIF-1. 정량에 따라 달라집니다. 이러한 세포는 테트라 사이클린의 상태에 HIF-1α에 shRNA를 발현 유도 클론입니다. 테트라 사이클린 (구정) 또는 존재 (+) (-)가없는 경우 - 셀 NX () (흰색 막대) 또는 저산소증 0.1 % O 2 (검은 막대의 Hx 0.1 %), 정상 산소 상태에서 성장했다.
그림 4. 글리코겐 스토GE는 세포 죽음에서 보호합니다. (A), CCL39 (■), LS174 (▲), MCF-7 (●) 및 MDA-MB231 (x)의 세포는 96 시간 동안 1 %의 O 2 저산소증을 실시하고 6 포도당 배지에서 배양 하였다 시간. 글리코겐 농도는 단지 포도당을 제거하기 전에 측정 된 100 %를 차지했다. 글리코겐이어서 1,3에서 측정하고, 6 시간했다. 결과는 적어도 세 개의 별도 실험의 대표이다. CCL39 세포에서 세포 사멸 (B) 측정. 96 시간 동안이나 저산소증 (+ 저장) 및 세포 사멸을 측정하기 전에 24 시간 동안 저산소증에있는 포도당 배지에서 배양 - (저장) 세포는 정상 산소도 실시 하였다.
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Discussion
체외에서 글리코겐의 생화학 적정 세포 글리코겐 함량을 정확하게 정량화 할 수 있습니다. 다른 기술 (글리코겐 항체 PAS, 면역, 등.)에 비교해서,이 적정 매우, 특정 민감하고 재현. 그것은 어떠한 방사능하지만 형광 분광기가 필요하지 않기 때문에 더욱, 방법은 편리하다. 그러나,이 방법은 순전히 정량적이고 셀 글리코겐 분포에 대한 정보를 제공하지 않는다.
이 논문에 설명 된 기술은 세포 추출물에서 달성되지만 또한 조직에서 글리코겐의 추출을위한 적절한 방법으로 조직 절편에서 달성 될 수있다. 이 분석은 시험 관내 용도에 사용되며 의한 글리코겐 간접 측량 (포도당으로 가수 분해 후), 이는 생체 내에서 글리코겐 저장소를 수행하기 위해 개발 될 수 없다.
PAS 염색 널리 이미많은 글리코겐 저장 질환 (폰 Gierke 병, 코리 병, McArdle 병 등)을 진단하는 데 사용. 또한 진균 감염을 검출하거나 종양의 다른 서브 타입을 구별하기 위해 사용된다. 이론적으로, PAS 염색은 글리코겐 농도를 결정하기 위하여 화상 분석기에 결합 될 수있다. 실제로,이 방법은 수행하기 어렵고, 다음과 같은 이유로 여기에서 설명한 방법보다 덜 적절하다. PAS 염색 양성 (바이올렛) 부정적 염색법 (헤 마톡 - 블루)과 중첩 첫째로, 그것은 양의 신호를 제거하지 않고 음의 신호를 제외하는 기술적으로 곤란하다. 색의 강도가 착색, 세정 등의 고정, 효능 제 시간에 의존 할 수 있기 때문에, PAS 염색은 글리코겐을 정량화 충분히 재현하지 않다. PAS 염색에서 다루는 동안에 마지막으로, 생화학 적 방법은, 다수의 셀을위한 글리코겐의 평균 농도를 준다 그러므로 특정 필드는 전체 글리코겐 농도 이하 나타낸다.
글리코겐의 생화학 적 분석은 조직에 글리코겐의 수준에 매우 정확하고 유익한 자료를 제공 할 수 있습니다. 이러한 데이터는 예를 들어 가정 해 질병의 진행과 상관 될 수도 있고, 글리코겐 대사 치료의 효과를 이해하는 것을 도울 수있다. 한편,이 기술은 여러 단계 (단백질 정량, 글리코겐 분해 및 샘플 당 세 형광 판독 값의 최소값)이 필요하고, PAS 염색보다 덜 실용적인 보인다. 생리 학적 또는 병태 생리 학적 대사 (암, 등.)의 더 나은 이해를 위해, 그것은 정확하게 글리코겐 제공 글루코스 (및 ATP)를 정량화하는 것이 중요하다. 그러나, 단독 글리코겐 정량화 글리코겐 대사를 이해하기에 충분하지 않으며 세포에서 글리코겐의 분포를 결정하기 위해 현미경과 결합되어야한다.
NT ">은이 분석의 정확성 및 재현성에도 불구하고, 단백질 함량의 작은 편차가 글리코겐의 정규화 된 값의 큰 변화로 이어질 수 있다는 점을 지적하는 것이 중요하다. 또, 형광의 선형 증가로 존재하지만 글리코겐 농도, 선형성은 신호가 극적으로 인하하는 높은 농도로 유지되지 않습니다. 따라서, 우리의 계정에 검량선의 농도 이상으로 형광 값을하지 않는 것이 좋습니다. 따라서 우리는 두 개의 서로 다른 샘플 볼륨과 두 개의 판독을 수행하는 것이 좋습니다.에서 이 방법은 형광 세포에서 글리코겐을 반사 형광의 감소에 의해 상쇄되지 않는다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이익에 대한 갈등을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 우리가 형광 분석기를 사용할 수 있도록과 그의 도움을 박사 티에리 Pourcher에게 감사의 말씀을 전합니다. 연구소는 리그 국립 Contre 르 암 (키프의 labellisée)에 의해 자금 지원, 협회는 라 공들인 contre 르 암, 문화원 국립 뒤 암 (INCA)을 부어, 직원은 국립 라 공들인, METOXIA (EU 프로그램 FP7), 센터에게 부어 A. 위치 : Lacassagne, 센터 내셔널 드 라 공들인 Scientifique, 문화원 국립 드 라 상테 외 드 라 공들인 Médicale 니스의 대학 ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). 우리는 비판적 읽기 및 편집 보정 박사 M 크리스티안 Brahimi를 혼 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B | |
References
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