Summary
Une nouvelle approche combinant la greffe intraoculaire et la microscopie confocale permet longitudinale, non-invasive imagerie en temps réel avec une seule cellule de résolution au sein des tissus greffés
Abstract
Intravitale imagerie est devenue un outil indispensable dans la recherche biologique. Dans le processus, les techniques d'imagerie nombreux ont été développés pour étudier différents processus biologiques chez les animaux non-invasive. Cependant, une limitation technique majeur existants modalités d'imagerie intravitale est l'incapacité de combiner non invasive, l'imagerie longitudinale avec des capacités de résolution unicellulaires. Nous montrons ici comment la transplantation dans la chambre antérieure de l'œil contourne cette limitation significative en offrant une plate-forme expérimentale polyvalente qui permet aux non-invasive, l'imagerie longitudinale avec une résolution cellulaire in vivo. Nous démontrons la procédure de transplantation chez la souris et de fournir des résultats représentatifs à l'aide d'un modèle avec pertinence clinique, à savoir transplantation d'îlots pancréatiques. En plus de permettre une visualisation directe dans une variété de tissus transplantés dans la chambre antérieure de l'œil, cette approche fournit une plate-forme d'éboulisn en effectuant des médicaments à long terme de suivi et de surveillance dans les tissus cibles. En raison de sa polyvalence, le tissu / la transplantation de cellules dans la chambre antérieure de l'œil non seulement les thérapies de transplantation avantages, elle s'étend à d'autres applications in vivo pour étudier les processus physiologiques et physiopathologiques tels que la transduction du signal et de cancers ou développer maladie auto-immune.
Introduction
Les progrès de la microscopie intravitale ont révélé des phénomènes physiologiques non prévus par les études in vitro 1. Cela met en évidence le défi de traduire les résultats obtenus par des méthodes in vitro conventionnelle dans l'animal vivant. Dans la dernière décennie, la visualisation des tissus chez les animaux vivants a été considérablement améliorée par les avancées technologiques en 2 modalités d'imagerie, 3, 4, 5, 6. Cela a suscité un besoin pour des approches d'imagerie in vivo avec une application possible dans des modèles animaux expérimentaux pour permettre la visualisation longitudinale des tissus cibles de façon non invasive.
Les techniques d'imagerie telles que l'imagerie par résonance magnétique et la tomographie par émission de positons ou bioluminescence ont permis à l'imagerie non invasive des organes / tissus profonds dans le corps 7-8, 9. Mais ces techniques ne peuvent pas réaliser seule cellule de résolution en raison de signaux de fond élevés et la faible résolution spatiale, en dépit de l'utilisation of matériaux à fort contraste ou tissu-spécifique 4 luminescence. Cela a été abordée avec l'avènement de la microscopie à deux photons de fluorescence confocale 10. Microscopie à deux photons a permis des études d'imagerie intravitale de visualiser et de quantifier les événements cellulaires avec des détails sans précédent 11, 12. Cela a conduit à la caractérisation des processus biologiques essentiels en matière de santé et de la maladie 13, 14, 15, 16. Alors que pionnier des études d'imagerie ont principalement intravitale "imité" in vivo dans le tissu excisé (ganglions lymphatiques, par exemple), d'autres études ont utilisé des approches invasives dans les tissus cibles d'images exposées in situ 17, 18, 19, 20, 21. D'autres études ont également utilisé des "modèles" fenêtre de la chambre de contourner les limitations associées à des approches invasives et la résolution d'imagerie in vivo limitée 22, 23, 24, 25. Dans le modèle de fenêtre de chambre, une chambre avec une fenêtre transparente est implanté chirurgicalement sous la peau à difféemplacements de loyer (peau du dos ou de l'oreille, mammaire coussinet adipeux, le foie, etc) sur l'animal (par exemple souris, rat, lapin). Bien que cette approche permet clairement à haute résolution pour l'imagerie in vivo, il nécessite une chirurgie invasive pour implanter la chambre et peut ne pas être en mesure d'accueillir les études d'imagerie longitudinales sur plusieurs semaines ou mois 22.
Il a été récemment démontré que la combinaison de haute résolution microscopie confocale à une procédure minimalement invasive, à savoir la transplantation dans la chambre antérieure de l'œil (ACE) offre une «fenêtre naturelle du corps" comme un. Puissant et polyvalent d'imagerie in vivo plate-forme 26, 27 Transplantation dans le ACE a été utilisé dans les dernières décennies pour étudier les aspects biologiques d'une grande variété de tissus 28, 29, 30, et sa combinaison récente avec l'imagerie haute résolution a permis l'étude de la physiologie des îlots pancréatiques avec une seule cellule de résolution non- invasive et longitudinalement <sup> 26, 27. Cette approche a été utilisée pour étudier les réactions auto-immunes au cours du développement du diabète de type 1 dans des modèles animaux (données non publiées). Il a également été utilisé pour étudier le développement du pancréas, ainsi que, dans les études de la fonction rénale par la transplantation dans les bourgeons pancréatiques de l'ECA ou individuels glomérules rénaux, respectivement (données non publiées). Un rapport récent de cette approche en outre démontré son application à étudier les réponses immunitaires après transplantation d'îlots pancréatiques 31. Surtout, cette étude a montré que la transplantation dans la chambre antérieure de l'oeil offre une fenêtre naturelle du corps pour effectuer: (1) longitudinal, l'imagerie non-invasive de tissus transplantés in vivo, (2) in vivo pour évaluer cytolabeling phénotype cellulaire et la viabilité de situ, (3) suivi en temps réel de l'infiltration des cellules immunitaires dans le tissu cible, et (4) une intervention locale en application topique ou par injection intra-oculaire.
Ici, nous avons Demonstrate comment effectuer la transplantation dans la chambre antérieure de l'oeil à l'aide des îlots pancréatiques.
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Protocol
La procédure suivante est réalisée dans le stéréoscope en 2 étapes, la première étape consiste à charger les îlots dans la canule et la seconde étape est la transplantation réelle dans l'ACE. Toutes les procédures effectuées sur des animaux ont été approuvés par les soins des animaux des établissements et des comités utilisation (IACUC) de l'Université de Miami.
1. Chargement en îlots Canule destinés à la transplantation
- Centre des îlots en boîte de culture en faisant tourner le plat dans les milieux rétrécissement.
- Débrancher le canule du «réservoir» et placer la canule et tubulure de raccordement sur une surface propre. Le réservoir peut être faite de pointe de 300 ul pipette jetable en plastique sans filtre (figure 1a).
- Rincer les bulles d'air hors du réservoir pour assurer flux continu d'îlots lors de l'aspiration dans le réservoir. Rinçage du réservoir se fait en faisant avancer le mains-libres motorisée pousse-seringue à l'aide de la pédale(Figure 1b, c). Cela permettra également de libérer de l'espace dans la seringue pour permettre l'aspiration des îlots dans le réservoir (pré-chargé avec une solution stérile de sérum physiologique tels que les médias, la culture ou PBS).
- Aspirer la quantité désirée d'îlots dans le réservoir. Îlots aura tendance à tourbillonner comme ils entrer dans le réservoir et restera ensemble vers le bas. L'aspiration se fait par l'arrière du volant moteur pousse-seringue à l'aide de la pédale.
- Reconnecter la canule dans le réservoir par l'intermédiaire de la tubulure de raccordement.
- Placer la pointe de la canule de retour dans la boîte de culture et la vidange des îlots sur le réservoir dans le tube puis dans la canule. Assurez-vous que les îlots restent ensemble que vous sauvegardez-remplir la tubulure / canule en douceur "pichenette" (taraudage) du tube (figure 1d). Arrêter, avant ou après que toutes les bulles d'air avant de les îlots sont évacués de la canule. En cas de doute, arrêtez-vous îlots entre l'arrière de la canule que l'air restebulles qui viennent d'îlots peut aider à prévenir le reflux (reflux) des îlots de l'ACE. Permettra de dissiper la nuit.
- A ce stade, vous êtes prêt à injecter des îlots dans le ACE (s'il vous plaît voir les prochaines étapes).
2. Transplantation d'îlots dans la chambre antérieure de l'oeil
- Positionnez la souris anesthésiée sur un tapis chaud sous stéréoscope.
- Placez le museau de la souris dans l'anesthésie "masque" connecté à l'oxygène / machine anesthésie à l'isoflurane. Le masque est réalisé en une matière plastique de 1 ml embout de pipette jetable (sans filtre) et relié à un tube d'anesthésie par l'extrémité étroite (Figure 2a, b).
- Doucement rétracter les paupières de l'œil pour être transplantés avec l'index et le pouce de votre main libre et "pop" l'oeil pour une meilleure exposition et un accès facile (figure 2c). Cela nécessitera un peu de pratique pour perfectionner sans gêner la respiration de la souris par une pression excessive sur lecou ou bloquer l'écoulement du sang à la tête.
- En utilisant une seringue à insuline jetable (29 - 31G) comme un scalpel, bien que la pointe pénètre dans la cornée et faire une incision latérale unique. Réaliser l'incision à mi-chemin entre le sommet de la cornée et du limbe de minimiser le reflux des îlots lors de l'injection sur l'ACE (figure 2d).
- Soigneusement insérer la canule (préchargé avec îlots) à travers l'incision.
- Lentement éjecter îlots sur la canule et les déposer sur le dessus de l'iris. Pour éviter le reflux îlot en raison de l'accumulation de pression excessive dans l'ACE, éjectez les îlots de coups brefs que peu de volume (s) possible dans le quadrant opposé à l'incision. Cela peut être également assurée par compactage îlots dans le tube pendant le chargement de la canule (s'il vous plaît voir l'étape 1.6).
- Lentement retirer la canule de l'ACE. Il s'agit d'une étape cruciale, en particulier, si un grand nombre d'îlots a été injecté sous forme de reflux îlot en raison de pressionsque s'accumuler à l'intérieur de l'ACE peut-être inévitable. Pour éliminer / réduire les reflux îlot, faites tourner doucement la canule tout l'intérieur de l'ACE pour relâcher la pression en excès à travers l'incision autour de la canule. Vérifiez les signes de reflux que vous essayez de retirer la canule et, si nécessaire, attendez jusqu'à la disparition de la pression avant de se rétracter complètement la canule de l'ACE.
- Rincer l'œil greffé avec du PBS stérile ou une solution saline.
- Injecter de la buprénorphine pour l'analgésie postopératoire (0,05-0,1 mg / kg, voie sous-cutanée) pour les 48 premières heures.
- Appliquer une pommade ophtalmique antibiotique érythromycine à l'oeil transplanté immédiatement après la transplantation.
- Placez l'animal dans une cage arrière réchauffé pour permettre la récupération de l'anesthésie.
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Representative Results
Il ya quelques paramètres qui définissent une «bonne» la transplantation. Une transplantation bonne est celle qui se déroule sans saignement lors de l'incision comme on peut le voir dans la vidéo. Le saignement est empêché / minimisée en pénétrant que la pointe du scalpel (aiguille) dans le ACE (figure 3a). Cela aidera également à éviter tout contact et à la perforation de l'iris. Il assurera également une petite incision qui va guérir très bien sans causer de trouble de la cornée au cours du temps (figure 3c, d). Un autre aspect important d'une transplantation réussie est d'être en mesure de transplanter le montant total désiré d'îlots sans perte due à des reflux de l'ACE. Comme mentionné dans l'étape du protocole 1.6, cela peut être minimisée par l'éjection des îlots dans le volume le moins possible et, le cas échéant, à l'aide de bulles d'air pour aider à sceller l'incision lors de la rétraction finale de la canule de l'ACE (figure 3b). Par ailleurs, la livraison du i slets sur le dessus de l'iris entre le bord de la pupille et le limbe positionne les îlots dans un endroit très accommodant pour l'imagerie in vivo (figure 3d). Du point de vue pratique, les îlots ayant à cette position intermédiaire du diaphragme réduit l'épaisseur des empilements d'imagerie z requis pour couvrir l'ensemble des îlots (figure 4). Ceci est particulièrement important lors de fluorescence confocale / à deux photons d'imagerie in vivo où un petit z-pile permet une meilleure récupération de certains signaux de fluorescence en sections plus profondes du tissu imagé avec une meilleure xy et z résolutions raison de se disperser moins de lumière par les tissus. En outre, plus épais z piles besoin de temps d'acquisition plus ce qui augmente la probabilité d'une dérive instrumentale ou animale, en particulier pendant l'imagerie in vivo.
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Figure 1. Photos de notre appareil de transplantation, y compris toutes les pièces. (A) les articles assemblés avec des tubes en verre de la seringue, réservoir, et la canule. (B) motorisé pousse-seringue avec seringue montée. (C) Double pédale pour faire fonctionner le pousse-seringue motorisée. Appuyant sur la pédale vers l'arrière entraîne le piston de la seringue (aspiration) ou avant (éjection). (D) Close-up de la canule et tubulure de raccordement montrant les îlots emballés à l'arrière de la canule. Cette configuration permet la livraison des îlots dans la chambre antérieure de l'œil dans un volume minimal à réduire le reflux et la perte d'îlots.
Figure 2. Représentation de l'transplantatisur la procédure dans la chambre antérieure de l'œil (ACE). (a) Photographie de la souris masque d'anesthésie. (b) Vue rapprochée du masque d'anesthésie faite d'un plastique de 1 ml embout de pipette jetable sans filtre. Plusieurs trous ont été faits dans la pointe pour permettre un mélange d'oxygène avec de l'isoflurane avant d'atteindre la souris. (C) Close-up vue montrant l'œil pour être transplantés exposée pour un meilleur accès. L'oeil est exposée à l'extérieur par étirage de la peau de la tête à l'aide du pouce et de l'index. Représentation schématique (d) de la procédure de transplantation mettant en évidence l'emplacement de l'incision à mi-chemin entre le sommet de la cornée et du limbe. La canule est insérée à travers l'incision pour fournir des îlots dans l'ACE. Îlots sont déposées sur le dessus de l'iris où ils se greffer.
Figure 3. Des images représentatives de «bon» en soulignant la transplantation des étapes cruciales pour assurer de bons résultats. (A) de la série d'images montrant à quel point la pointe du scalpel (aiguille) est poussé dans la cornée tout en faisant l'incision. Une petite incision est faite sans saignement. L'incision est légèrement plus grande que la canule. (B) Série d'images montrant des îlots étant éjectées hors de la canule au-dessus de l'iris en utilisant des bulles d'air pour empêcher le reflux. Remarquez comment "plié" la canule semble due à la lumière réfraction fois à l'intérieur de l'ACE. (C) image représentant un œil transplanté mettant en évidence la clarté de l'ACE immédiatement après la transplantation. (D) Série d'images de l'œil même acquis à l'emplacement indiqué jours post-opératoires (POD) mettant en évidence le lieu de prédilection des îlots in vivo pour imaganisation et comment bien guéri et l'incision est localisée et la clarté de la cornée à 6 semaines après la transplantation.
Figure 4. Représentant l'image confocale de fluorescence d'une îlots pancréatiques transplantés dans la chambre antérieure de l'œil de la souris (ACE) mettant en évidence les avantages de la position de l'îlot sur l'iris et la capacité de résoudre les cellules individuelles pendant l'imagerie in vivo (a) de projection maximale (2. - D vue) d'une pile en Z de l'îlot (indiqué par la ligne en pointillés) sur le dessus de l'iris d'une souris C57BL / 6 transgénique qui exprime la protéine fluorescente verte (GFP) et activé dans les cellules T mémoire 32. L'image a été acquise 5 jours après la transplantation où quelques infiltration de cellules T (vert) ont été détectés dans l'iris entourant l'îlot. L'îlot et de l'iris ont été visualisés par rétrodiffusion laser ou rEFLEXION (gris). (b) vues en trois dimensions (3-D) de l'îlot mettant en exergue les avantages de l'imagerie angle de visualisation / de réduire l'épaisseur z-pile à acquérir le volume îlot entier et la structure environnante et les cellules immunitaires. Constater les axes XYZ de la rotation de l'image.
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Discussion
Îlots pancréatiques murins ont été isolés par digestion à la collagénase suivie d'une purification sur gradient de densité, comme décrit précédemment 33. Îlots isolés ont été cultivées pendant une nuit avant la transplantation. Bien que cela ne soit pas nécessaire, il est recommandé de permettre aux îlots de se remettre de la procédure d'isolement. Cela est essentiel si la transplantation est effectuée chez les receveurs diabétiques car elle garantit la transplantation d'îlots survivants / robustes.
La transplantation est réalisée sous anesthésie généralisée avec mélange oxygène / isoflurane (1,5-3%) par inhalation à effet. Alternative anesthésiques par inhalation ou par injection (kétamine, par exemple) peuvent être utilisés. Si une anesthésie par injection est utilisé, ignorez l'étape 2.2 dans le protocole. Fournir à l'animal anesthésié avec une source de chaleur pour éviter l'hypothermie lors de la procédure. Chez certaines souris, il est possible de briser les vaisseaux sanguins lors de l'incision de la coopération en général avasculaireRNEA. Par exemple, la cornée de souris nude tendance à être vascularisé; éviter les zones vascularisées lorsque cela est possible. Utilisez une nouvelle seringue par incision. Éviter de percer le diaphragme avec l'aiguille lors de l'incision. Empêcher le contact avec l'iris peut en outre être assuré par la face latérale biseautée de la pointe de l'aiguille vers l'iris. Ne pas faire sécher / aspirer l'humeur aqueuse après l'incision. Il est plus facile de pénétrer dans la canule à travers l'incision dans une "voie humide" cornée; ajouter quelques gouttes de PBS ou supports de culture stérile de la cornée, si nécessaire.
L'analgésie postopératoire peut être obtenue par l'injection sous-cutanée buprénorphine (0,05-0,1 mg / kg) ou analgésique préféré (s) pour les 48 premières heures. Dans l'étape 2.9, nous administrons une analgésie immédiatement après la procédure, l'animal est déjà profondément sous anesthésie générale. Si vous le souhaitez, cependant, étape 2.9 peut être réalisée après l'étape 2.2 dans le protocole, avec ou sans un anesthésique topique à l'oeil (consulter votre régionIACUC ou vétérinaire). Antibiotiques ophtalmiques alternatives peuvent également être utilisés.
Ici, nous avons utilisé un appareil de micro-injection sur mesure exploité par l'intermédiaire d'une pédale pour conduire la seringue de 100 ul de précision en verre pour aspirer (charge) et éjecter les îlots de la canule dans l'ACE (Figure 1). Cela peut être substitué par un 100 pi étanche aux gaz seringue en verre de précision avec un piston à vis mécanique qui peut être actionné manuellement pour aspirer / expulser les îlots, ce qui ne sera cependant probablement besoin de l'assistance d'une autre personne à utiliser. Dans les deux cas, mais pas obligatoire, nous vous recommandons de pré-chargement de la seringue assemblée, tubes, et un réservoir avec une solution stérile (solution saline, PBS ou milieux de culture) pour assurer une aspiration douce et d'éjection des îlots. Ceci est particulièrement important si / quand les îlots emballés obstruer la canule.
En général, nous effectuons nos opérations de transplantation dans des conditions propres à l'intérieur d'une cabine de biosécuritéinet sans risque d'infections. Toutes les solutions utilisées, seringues, canules, tubes, et de la gaze sont autoclave ou au gaz stérilisé. Alors, nous ne pouvons pas vérifier la stérilité complète en raison du contact des mains avec la souris durant la procédure, nous n'avons pas eu de problèmes avec la contamination îlot en suivant les étapes ci-dessus recommandées.
Nous avons montré ici comment transplanter les îlots pancréatiques dans le ACE à des fins d'imagerie où moins îlots sont nécessaires à la transplantation. Dans le cas où l'inversion du diabète est souhaitée dans l'animal receveur, une plus grande quantité d'îlots doit être transplanté 26, 27. Alors que la procédure de transplantation est identique à ce que nous avons montré ici, une attention particulière devrait être accordée aux étapes 2.6 et 2.7 dans le protocole pour éviter la perte des îlots transplantés en raison de reflux.
Une fois maîtrisée, cette procédure de transplantation peut être effectuée dans ~ 5 min par souris. Cette technique peut être utilisée pour greffer une variété de tissues dans la chambre antérieure de l'oeil. Comme mentionné ci-dessus, nous avons transplanté glomérules rénaux ainsi que des tissus embryonnaires (bourgeons pancréatiques) pour étudier le développement du pancréas dans la chambre antérieure de l'œil in vivo.
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Disclosures
PO.B. est l'un des fondateurs de la société de biotechnologie Biocrine, qui va utiliser la chambre antérieure de l'œil comme une plate-forme de service commercial. AC est sur le brevet protégeant cette technologie.
Acknowledgments
Nous reconnaissons les Drs. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier et Daniel Nyqvist pour des discussions fructueuses. Nous remercions également Eleut Hernandez et Diego Espinosa-Heidmann pour l'assistance technique, et Mike Valdes et Margaret Formoso de l'aide pour l'enregistrement vidéo. Byron Maldonado a enregistré, édité et produit la vidéo finale. Soutien à la recherche a été fourni par la Fondation Diabetes Research Institute ( www.DiabetesResearch.org ), le NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 à MHA; NIH RO3DK075487 à AC; U01DK089538 à PO.B.). Soutien additionnel à la recherche PO.B a été fournie par des fonds provenant du Karolinska Institutet, le Conseil de recherche suédois, la Fondation du diabète suédois, la famille Erling Persson-Foundation, la famille Knut et Alice Wallenberg Foundation, le Skandia Insurance Company Ltd, VIBRANT ( FP7-228933-2), le Programme stratégique de recherche sur le diabète au Karolinska institutet, la Fondation Novo Nordisk, et la Fondation Berth von Kantzow l'.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
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