Summary
안구 이식 및 공 촛점 현미경을 결합 새로운 접근 방식은 이식 조직 내에서 단일 셀 해상도 세로, 비 침습적 실시간 이미징을 가능하게
Abstract
Intravital 영상은 생물학적 연구에 필수적인 도구로 떠오르고있다. 이 과정에서 많은 이미징 기술이 아닌 invasively 동물에서 다른 생물학적 과정을 연구하기 위해 개발되었습니다. 그러나, 기존의 intravital 이미징 modalities의 주요 기술적 인 제한은 단일 셀 해상도 기능으로 비 침습적, 길이 방향의 영상을 결합 할 수 없다는 것입니다. 우리는 눈 앞 챔버 내로 이식은 생체 내 세포 해상도 비 침습적, 세로 이미지 수있는 다양한 실험 플랫폼을 제공하는 등 상당한 제한을 circumvents 방법을 여기에 표시됩니다. 우리는 마우스에 이식 절차를 설명하고, 즉 임상 관련성, 췌장 췌장 이식과 모델을 사용 대표적인 결과를 제공합니다. 눈의 앞쪽 챔버 내로 이식 조직의 다양한 직접 시각화를 지원하는 것 외에도,이 방법은 애추 할 수있는 플랫폼을 제공합니다수행하여 N 약물의 장기 후속 및 대상 조직의 모니터링. 때문에 눈 혜택 이식 요법뿐만 아니라 앞쪽에 챔버로의 다양성, 조직 / 세포 이식의, 이건 정말 신호 전달과 암이나 면역 질환 개발과 같은 생리와 pathophysiological 과정을 공부하고 생체 응용 프로그램에서 다른 확장합니다.
Introduction
intravital 현미경의 발전은 체외 연구 1에 의해 예측하지 생리 현상을 보여 왔습니다. 이것은 살아있는 동물로 체외 방법에 기존하여 얻은 결과를 번역에 도전을 강조 표시합니다. 지난 10 년 간, 생활 동물 조직의 시각화는 상당히 이미징 modalities 2, 3, 4, 5, 6에 기술 진보에 의해 개선되었다. 이 비 invasively 대상 조직의 길이 방향 시각화를 사용하는 실험 동물 모델에서 가능한 응용 프로그램과 생체 이미징 접근에 대한 필요성을 가했다 있습니다.
이러한 자기 공명 영상 및 양전자 방출 단층 촬영이나 bioluminescence와 같은 이미징 기술은 신체 7-8, 9에서 깊은 장기 / 조직의 비 침습적 영상을 사용했습니다. 그러나 이러한 기술을 사용 O에도 불구하고, 높은 배경 신호와 낮은 공간 해상도로 인해 휴대 해상도 하나를 달성 할 수 없습니다F 고 대비 자료 나 조직 별 발광을 4. 이것은 두 광자 형광 공 촛점 현미경 (10)의 도래와 함께 해결되었습니다. 두 광자 현미경은 intravital 이미징 연구 시각화하고 전례가없는 세부 사항 11, 12로 휴대 이벤트를 정할 수있었습니다. 이 건강과 질병 13, 14, 15, 16의 주요 생물학적 과정의 특성을 이끌었습니다. 선구 intravital 이미징 연구가 주로 excised 조직 (예 : 림프절)의 생체 조건에서 "없잖아?"동안, 다른 연구는 시츄 17, 18, 19, 20, 21 이미지 노출 대상 조직에 침투 방법을 사용했습니다. 다른 연구는 또한 침습적 방법과 생체 22, 23, 24, 25 제한된 영상 해상도와 관련된 제한을 회피하기 위해 '창 챔버 모델 "을 사용했습니다. 창 챔버 모델에서 투명 창 챔버는 수술 diffe의 피부에 이식되어동물의 임대 위치 (등쪽이나 귀 피부, 유방 지방 패드, 간, 등) (예 : 마우스, 쥐, 토끼). 이 방법이 명확하게 생체 이미징에 높은 해상도를 수 있지만, 챔버 이식 해 침습적 수술을 필요하며 몇 주 또는 몇 달 22여 종 방향 이미징 연구를 수용 할 수없는 경우가 있습니다.
그것은 최근 눈의 앞쪽 챔버에, 즉 최소한 침략 절차, 이식과 고해상도 공 촛점 현미경을 결합하는 (ACE)로 "자연 몸 창"을 제공하는 입증 된 강력하고 생체 이미징 플랫폼 26, 27의 다양한. ACE에 이식이 조직 28, 29, 30의 다양한 생물학적 측면을 연구하기 위해 지난 몇 수십 년 동안 사용되었습니다, 그리고 고해상도 영상과의 최근 조합은 단일 셀 해상도로 췌장 섬의 생리를 공부 활성화 비 invasively 및 길이 방향 <> 26, 27 논의하게 될 것입니다. 이 방법은 동물 모델에서 제 1 형 당뇨병 (게시되지 않은 데이터)의 개발 기간 동안 면역 반응을 연구하는 데 사용되었습니다. 또한 각각 ACE의 췌장 꽃 봉오리 또는 개별 신장 glomeruli, (게시되지 않은 데이터)에 이식하여 신장 기능의 연구에서, 췌장 개발을 공부뿐만 아니라하는 데 사용되었습니다. 이 방법을 사용하는 최근의 보고서는 더 췌장 췌장 이식 31 일 이후 면역 반응을 연구하기위한 응용 프로그램을 보여 주었다. 중요한 것은,이 연구는 수행 할 천연 바디 창 제공하는 눈의 앞쪽 챔버에 그 이식을 보여 주었다 : 생체에 이식 된 조직 (1) 길이, 비 침습적 영상을, (2) 생체에서의 세포 표현형 및 생존 능력을 평가하기 위해 cytolabeling 현장, 대상 조직에 면역 세포에 침투 (3) 실시간으로 추적하고, 국소 응용 프로그램 또는 안구 내 주사로 (4) 지역 개입했습니다.
여기, 우리는 D췌장 섬을 사용하여 눈의 앞쪽 챔버 내로 이식을 수행하는 방법을 emonstrate.
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Protocol
다음 절차는 2 단계로 입체경에서 수행되며, 첫 번째 단계는 캐뉼라로 섬을로드 포함하고 두 번째 단계는 ACE에 실제 이식입니다. 동물에서 수행 모든 절차는 마이애미 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 이식을위한 정맥의로드 섬
- 축소 서클 요리를 회전하여 센터 배양 접시에있는 섬입니다.
- "저수지"에서 캐뉼라를 분리하고 깨끗한 표면에 캐뉼라와 연결 튜브를 놓습니다. 저장소는 필터 (그림 1a)없이 300 μl 일회용 플라스틱 피펫 팁으로 만든 할 수 있습니다.
- 저수지에 aspirating 때 섬의 지속적인 흐름을 보장하기 위해 저수지에서 기포를 제거. 저수지를 플러싱하는 것은 발 페달을 사용하여 핸즈프리 동력 주사기 - 드라이버를 앞으로 운전하면됩니다(그림 1b, C). 이것은 또한 저수지 (예 : 생리, PBS 또는 문화 미디어로 살균 솔루션으로 사전로드)로 섬의 열망을 허용하도록 주사기에 공간을 할 것입니다.
- 부드럽게 저수지에 섬의 원하는 금액을 대기음. 사람들이 저수지를 입력하고 하단을 향해 함께 남아있게됩니다 섬은 소용돌이 경향이 있습니다. 흡인이 발 페달을 사용하여 이전 버전과 동력 주사기 - 드라이버를 구동하여 이루어집니다.
- 연결 튜브를 통해 저수지에 캐뉼라를 다시 연결하십시오.
- 배양 접시에 다시 캐뉼라 팁을 놓고 캐뉼라로 다음 튜브에 저수지의 섬을 플러시. 당신은 부드럽게 (도청) 튜브 (그림 1D) "을 flicking"에 의해 튜브 / 캐뉼라를 백업 채울 때 섬이 함께 남아 있는지 확인합니다. 캐뉼라를 밖으로 내보냈 아르 앞서 섬의 모든 기포 전이나 후에 중지합니다. 확실하지 않은 경우, 섬이 남아 공기로 캐뉼라의 뒷면을 입력으로 중지앞서 섬의 거품은 ACE의 섬의 역류 (역류)을 방지 할 수 있습니다. 밤새 분산됩니다.
- 이 단계에서, 당신은 ACE (다음 단계 참조)에 섬을 삽입 할 수 있습니다.
2. 눈의 앞쪽 상공 회의소에 작은 섬 이식
- 입체경 아래 따뜻한 패드에 anesthetized 마우스를 배치합니다.
- 산소 / isoflurane 마취 기계에 연결 마취 "마스크"에 마우스의 코를 놓습니다. 마스크 1 ML 일회용 플라스틱 피펫 팁 (필터없이)으로 만든과 좁은 끝 (그림 2A, B)를 통해 마취 튜브에 연결되어 있습니다.
- 부드럽게 손가락과 엄지 손가락 무료 손과 "팝업"더 나은 노출과 접근이 용이합니다 (그림 2C)를 밖으로 눈을 사용하여 이식 할 눈의 눈 뚜껑을 철회. 이에 과도한 압력에 의해 마우스의 호흡을 방해하지 않고 완벽하게 연습을 필요로합니다목이나 머리에 혈액 흐름을 차단.
- 일회용 인슐린 주사기 (29 - 31G)를 사용 메스로 신중하게 각막 만 끝을 관통하고 하나의 측면 절개를합니다. ACE (그림 2D)의 아웃 분사 동안 섬의 환류을 최소화하기 위해 각막과 limbus의 꼭대기 사이의 중간 지점에 절개를합니다.
- 조심스럽게 절개를 통해 캐뉼라 (섬과 미리로드) 삽입합니다.
- 천천히 캐뉼라의 섬을 추출하고 홍채의 상단에이를 입금. ACE에 과도한 압력 축적으로 인해 작은 섬 역류를 방지하려면 절개로 사분면의 맞은 편에 가능한 한 작은 볼륨 (들)로 한때 thrusts에있는 섬을 꺼냅니다. 이것은 더 캐뉼라 (단계 1.6 참조)로드하는 동안 튜브에 섬을 압축하여 보장 할 수 있습니다.
- 천천히 ACE의 캐뉼라를 철회. 섬의 큰 볼륨 시장을 대표로 인해 작은 섬 환류로 주입 된 경우, 특히 중요한 단계입니다확인 ACE 내부에 구축 피할 수 있습니다. 캐뉼라 주위의 절개를 통해 과도한 압력을 출시 할 ACE 내부하면서 작은 섬 역류를 최소화 / 제거하려면 부드럽게 캐뉼라를 회전 할 수 있습니다. 당신이 캐뉼라를 철회하고, 필요한 경우, ACE의 완전히 retracting하기 전에 압력이 가라까지 캐뉼라를 기다려야 시도로 환류의 흔적이 있는지 확인합니다.
- 멸균 PBS 또는 식염수에 이식 눈을 씻어.
- 처음 48 시간에 대한 수술 진통제 (피하 0.05-0.1 밀리그램 / kg)에 buprenorphine를 삽입.
- 바로 이식 후 이식 눈에 에리스로 마이신의 안과 항생제 연고를 적용 할 수 있습니다.
- 마취에서 회복을 허용 할 수있는 가온 케이지에 다시 동물을 놓으십시오.
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Representative Results
"좋은"이식을 정의하는 몇 가지 매개 변수가 있습니다. 좋은 이식은 비디오에서 볼 수 있듯이 절개 할 때 출혈이없이 진행이 하나입니다. 출혈은 ACE (그림 3A)에 메스 (바늘) 만 팁을 관통하여 예방 / 최소화합니다. 이 또한 홍채의 접촉과 주사를 방지하는 데 도움이됩니다. 또한 시간 (그림 3C, D)을 통해 각막의 변화를 유발하지 않고 잘 치유 될 소형 절개를 보장합니다. 성공적인 이식에 대한 또 다른 중요한 점은 ACE의 환류 출력으로 인해 손실없이 섬의 총 원하는 금액을 이식 할 수 있습니다. 같은 프로토콜 단계 1.6에서 언급이는 ACE (그림 3B)의 최종 캐뉼라의 철회 아웃시 절개를 밀봉하기 위해 기포를 사용하여, 적어도 가능한 볼륨에서 꺼내기 섬 및 적용 가능한에 의해 최소화 할 수 있습니다. 또한, 전을 제공 학생 및 limbus의 가장자리 사이의 홍채의 상단에 slets은 생체 이미징 (그림 3D)에서 매우 의무 위치에 섬 자리 잡았. 실제 관점에서 아이리스의 중간 위치에 섬을 갖는 것은 전체 섬을 (그림 4)에 걸쳐하는 데 필요한 이미지 Z-스택의 두께를 줄일 수 있습니다. 이 생체 이미징에 형광 공 촛점 / 두 광자 동안 특히 중요합니다있는 Z-스택보다 XY과 조직에 의해 더 적은 빛이 산란에 의한 Z 해상도와 이미징 조직의 깊은 부분에서 특정 형광 신호를보다 효율적으로 복구 할 수있는 작은. 또한, 두꺼운 Z-스택은 특히 생체 이미징의 동안 역할을 또는 동물 드리프트의 가능성을 증가 이상 획득 시간을 필요로합니다.
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1 그림. 모든 부분 등의 이식 장치의 사진이 있습니다. (A) 튜브, 저수지, 그리고 캐뉼라로 유리 주사기를 조립했습니다. (b)는 동력 주사기와 주사기 - 드라이버가 장착. (C) 듀얼 발 페달은 동력 주사기 드라이버를 작동 할 수 있습니다. 두 페달을 누르면 주사기 플런저 뒤로 (흡인) 또는 앞으로 (분사)를시킵니다. (D)을 클로즈업 캐뉼라와 캐뉼라의 뒷면에 포장 섬을 보여주는 연결 튜브의. 이 구성은 섬의 환류와 손실을 줄이기 위해 최소한의 볼륨으로 눈의 앞쪽 챔버에 섬의 전송을 할 수 있습니다.
그림 2. transplantati 묘사눈의 앞쪽 챔버 (ACE).에 절차에 (A) 마우스 마취 마스크의 사진. 필터없이 1 ML 일회용 플라스틱 피펫 팁 만든 마취 마스크의 (B) 닫기 - 쉽게 볼 수 있습니다. 여러 구멍은 마우스를 도달하기 전에 isoflurane과 산소의 혼합 수 있도록 끝에서 만들어졌다. (C) 닫기 업이 더 액세스 노출 이식 할 눈에 보여주는 볼 수 있습니다. 눈이 엄지와 검지 손가락을 사용하여 머리의 피부를 스트레칭에 의해 노출되어 있습니다. 각막의 정점과 limbus 사이의 중간 지점에있는 절개의 위치를 강조 이식 절차 (D) 도식의 묘사는. 캐뉼라는 ACE에 섬을 제공 할 수있는 절개를 통해 삽입됩니다. 섬은 그들이 뿌리 박게하다 홍채의 상단에 입금됩니다.
그림 3. 성공적인 결과를 보장에서 중요한 단계를 강조 "좋은"이식의 대표 이미지. 절개을하면서 메스 (바늘)의 끝이 각막에 밀려하는 방법까지 보여주는 이미지 (A) 시리즈. 작은 절개는 출혈없이 이루어집니다. 절개는 캐뉼라보다 약간 큰 것입니다. (b)는 역류를 방지하기 기포를 사용하는 동안 홍채의 상단에있는 캐뉼라 밖으로 배출되는 섬을 보여주는 이미지의 시리즈. 캐뉼라가 ACE 내부에 한 번 굴절에 불 때문에 표시하는 방법 "구부러진"확인할 수 있습니다. (C) 이식 후 바로 ACE의 명확성을 강조 이식 눈의 대표 이미지입니다. (D) 시리즈 지정된에 인수 같은 눈의 이미지 수술 일 (POD) 생체 IMA에 대한 섬의 바람직한 위치를 강조ging과 잘 치료하고 지역화 절개가 있으며, 이식 후 육주에서 각막의 명확성.
4 그림. 아이리스의 작은 섬 위치 및 생체 이미징의 기간 동안 개별 셀을 해결 할 수있는 능력의 이점을 강조 마우스 눈 (ACE)의 앞쪽 챔버에 이식 췌장 췌장 대표 형광 공 촛점 이미지 () 최대 돌출부 (2. - 활성 및 메모리 T-세포 32 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 C57BL / 6 마우스 유전자 변형의 홍채의 상단에 작은 섬 (점선으로 설명)의 Z-스택의 D보기). 이미지가 T-세포를 (녹색) 침투 몇이 작은 섬을 둘러싸고있는 홍채에서 발견 된 이식 후 5 일 인수되었습니다. 작은 섬과 창포는 레이저 후방 산란 또는 r로 시각화했다eflection (회색). (b)는 같은 작은 섬 (3-D) 3 차원 전망이 전체 작은 섬 볼륨과 주변 구조와 면역 세포를 얻기 위해 Z-스택 두께를 줄이기 위해 /보기 이미지 각도의 장점을 강조. 이미지의 회전에 대한 XYZ 축를 확인합니다.
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Discussion
손쥐 췌장 섬은 이전에 33 설명한 바와 같이, 밀도 기울기에 정화에 이어 collagenase의 소화를 사용하여 분리 하였다. 절연 섬은 이식 전에 하룻밤 배양 하였다. 이것이 필요하지 않을 수도 있지만,이 섬은 격리 절차에서 복구 할 수 있도록하는 것이 좋습니다. 가 / 강력한 섬을 생존의 이식을 보장하므로이 이식이 당뇨병 수신자에 수행 할 때 중요합니다.
이식은 산소 / isoflurane 혼합물 (1.5-3 %) 효과에 흡입으로 일반화 마취하에 수행됩니다. 다른 흡입 또는 주입 anesthetics (예 케타민) 사용할 수 있습니다. 주입 마취를 사용하는 경우, 프로토콜에 2.2 단계를 건너 뛰십시오. 절차를 수행하는 동안 저체온증을 방지하기 위해 열 소스를 사용하여 anesthetized 동물을 제공합니다. 일반적으로 avascular 공동으로 절개를 할 때 일부 마우스에서는 혈관을 깰 수 있습니다rnea. 예를 들어, 누드 마우스의 각막이 vascularized하는 경향, vascularized 지역 가능한 경우를 피할 수 있습니다. 절개 당 새 주사기를 사용하십시오. 절개를 할 때 바늘로 방어막을 펑 쳐링하지 마십시오. 아이리스과의 접촉을 방지하는 것은 더 아이리스쪽으로 바늘 끝의 beveled 쪽을 향해에 의해 보장 될 수 있습니다. 건조 / 절개 후 수성 유머 기음하지 마십시오. 그것은 "서부 유럽 표준시"각막의 절개를 통해 캐뉼라을 관통하는 것이 더 쉽습니다, 필요한 경우 각막에 멸균 PBS 나 문화 미디어 몇 방울을 추가합니다.
수술 진통제는 피하 buprenorphine (0.05-0.1 밀리그램 / kg) 또는 처음 48 시간에 대한 선호하는 진통제 (들)을 주입하여 얻을 수 있습니다. 동물이 전신 마취하에 깊이 이미 같은 단계 2.9에서, 우리는 절차 후 즉시 진통제를 관리 할 수 있습니다. 원하는 경우, 그러나, 단계 2.9는 (귀하의 지역에 문의 눈에 국소 마취와 함께 또는없이 프로토콜의 단계 2.2 이후에 수행 할 수 있습니다IACUC 또는 수의사). 다른 안과 항생제도 사용할 수 있습니다.
여기, 우리는 기음하는 100 μl 정밀 유리 주사기 (부하)을 유도하고 ACE (그림 1)에 캐뉼라의 섬을 추출하기 위해 발 페달을 통해 운영하는 맞춤식 microinjection 장치를 사용했습니다. 이것은 기음 / 섬을 추출하기 위해 수동으로 조작 할 수있는 나사 구동 플런저이있는 100 μl 가스 기밀 정밀 유리 주사기로 대체 할 수 있습니다,이하지만 가능성이 작동하는 다른 사람의 도움이 필요합니다. 각각의 경우에, 필요하지 않지만 우리는 섬의 원활한 흡인과 배출을 보장 할 수있는 살균 용액 (생리, PBS 또는 문화 미디어)로 조립 주사기, 튜브 및 저장소를 사전로드하는 것이 좋습니다. 포장 섬의 캐뉼라를 방해하는 경우 / 때 특히 중요합니다.
우리는 일반적으로 바이오 안전성 택시 내부에 깨끗한 조건에서의 이식 절차를 수행감염의 위험없이 inet. 모든 사용 솔루션, 주사기, 캐뉼라, 튜브, 그리고 거즈는 autoclaved 또는 가스 소독되어 있습니다. 하지만, 우리는 절차 중에 마우스로 손 접촉 규명 전체 불임 할 수 없어, 우리는 위의 권장 단계에 따라 작은 섬 오염에 문제가 없었어요.
우리는 적은 섬이 이식하는 데 필요한 이미징 목적으로 ACE에 췌장 섬을 이식하는 방법을 여기에 보여 주었다. 당뇨병 반전을받는 동물에 원하는하는 경우에, 섬의 큰 금액은 27 26 이식해야합니다. 이식 절차는 우리가 무슨 일이 일어나는 지와 동일하지만, 특히주의 단계 2.6 및 환류로 인한 이식 섬의 손실을 방지 할 수있는 프로토콜의 2.7에 지불해야합니다.
일단 마스터,이 이식 절차는 마우스 당 ~ 5 분에 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 tissu의 다양한 이식하는 데 사용할 수 있습니다눈의 앞쪽 챔버에 에스. 위에서 언급 한 바와 같이, 우리는 신장 glomeruli뿐만 아니라 생체 내 눈의 앞쪽 챔버에 췌장 개발을 공부하는 배아 조직 (췌장 눈을) 이식했습니다.
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Disclosures
PO.B. 상용 서비스 플랫폼으로 눈의 앞쪽 챔버를 사용하는 것이다 생명 공학 회사 Biocrine의 창립자 중 하나입니다. AC는이 기술을 보호 특허에 있습니다.
Acknowledgments
우리는 Drs을 인정합니다. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, 스테판 Speier 유익한 토론 다니엘 Nyqvist. 우리는 또한 비디오 녹화와 관련하여 도움이 Eleut 헤르 난 데스와 디에고 에스피노사 - Heidmann 기술 지원 및 마이크 발데스와 마가렛 Formoso 감사드립니다. 바이런 말도 나도는 편집 기록, 최종 비디오를 제작했다. 연구 지원은 당뇨병 연구소 재단 (에서 제공 한 www.DiabetesResearch.org ), NIH / NIDDK / NIAID (MHA에 F32DK083226, AC에 대한 NIH RO3DK075487, PO.B.에 U01DK089538). PO.B에 대한 추가 연구 지원은 Karolinska Institutet, 스웨덴 연구위원회, 스웨덴 당뇨병 재단, 가족 Erling - 페르손 재단, 가족 Knut와 앨리스 발렌 버그 재단, 활기찬 Skandia 보험 회사 (주)에서 자금을 통해 제공되었다 ( Karolinska Inst에서 당뇨병의 FP7 - 228933-2), 전략적 연구 프로그램itutet, 노보 Nordisk 재단, 그리고 부두 폰 Kantzow의 재단.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IsoTHESIA (Isoflurane) | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% Isoflurane/ml |
| Ketaset (Ketamine HCL) | Fort dodge Animal Health | 0856-2013-01 | Alternative injectable anesthesia |
| Beprenex (Buprenorphine HCL) | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| Erythromycin Ophthalmic Ointment USP, 0.5% | Akron | 17478-070-35 | Applied prophylactically to transplanted eye |
| 0.9% Sodium Chloride (Saline) | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | For iv injection. Sterile |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X. Sterile |
| CMRL medium 1066 | Cellgro | 98-304-CV | Supplemented, CIT modification. Preferred media for islets |
References
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