Summary
يوصف تصميم وتجميع ميكرودريفيس لفي التسجيلات الكهربية في الجسم الحي من إشارات الدماغ من الماوس. عن طريق ربط حزم مسرى مكروي لشركات الطيران دريفبل قوي، وهذه التقنيات تسمح للتسجيلات العصبية طويلة الأمد ومستقرة. تصميم خفيف الوزن يسمح للأداء السلوكي غير مقيد من قبل حيوان التالية غرس محرك الأقراص.
Abstract
دولة من بين الفن التسجيلات الكهربية من أدمغة الحيوانات تتصرف بحرية تسمح للباحثين لدراسة في وقت واحد امكانات الحقل المحلي (LFPs) من السكان من الخلايا العصبية وإمكانات العمل من الخلايا الفردية، كما يشارك الحيوان في تجريبيا المهام ذات الصلة. ميكرودريفيس مزروع مزمنة تسمح للتسجيلات الدماغ لتستمر على مدى فترات من عدة أسابيع. محركات المنمنمة ومكونات خفيفة الوزن تسمح لهذه التسجيلات على المدى الطويل أن يحدث في الثدييات الصغيرة، مثل الفئران. باستخدام tetrodes، والتي تتكون من حزم مضفر بإحكام من أربعة أقطاب في كل سلك والتي يبلغ قطرها 12.5 ميكرون، فمن الممكن لعزل الخلايا العصبية نشطة من الناحية الفسيولوجية في مناطق الدماغ سطحية مثل القشرة الدماغية، الحصين الظهرية، ومرفد، فضلا كما مناطق أعمق مثل المخطط واللوزة. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يؤمن استقرارا، عالية الدقة التسجيلات العصبية كما يتم الطعن في الحيوان مع VARIEتاي من المهام السلوكية. يصف هذا المخطوط العديد من التقنيات التي تم الأمثل لتسجيل من مخ الفأر. الأول، وتبين لنا كيفية تلفيق tetrodes، تحميلها في أنابيب دريفبل، والذهب لوحة النصائح الخاصة بهم من أجل الحد من مقاومة بهم من MΩ إلى مجموعة أوم. الثاني، وتبين لنا كيفية بناء الجمعية ميكرودريفي مخصصة لنقل وتحريك tetrodes عموديا، مع استخدام مواد غير مكلفة. ثالثا، نقدم لك مجموعة من الخطوات لتجميع ميكرودريفي المتاحة تجاريا (Neuralynx VersaDrive) التي تم تصميمها لتحمل tetrodes المنقولة بشكل مستقل. وأخيرا، فإننا نقدم نتائج ممثل امكانات الحقل المحلية وإشارات وحدة واحدة تم الحصول عليها في مرفد الظهرية من الفئران. هذه التقنيات يمكن تعديلها بسهولة لاستيعاب أنواع مختلفة من صفائف الكهربائي ومخططات تسجيل في مخ الفأر.
Introduction
استخدام تقنية مسرى مكروي لتسجيل الاشارات العصبية خارج الخلية في الجسم الحي لديها تقليد طويل وقيمتها في علم الأعصاب 1، 2. القدرة على تسجيل النشاط الكهربائي من العديد من مناطق الدماغ في الحيوانات تتصرف بحرية، مع ذلك، وهي تقنية أكثر حداثة التي أصبحت شائعة على نحو متزايد مع حزم البرمجيات لاقتناء وتحليل وتمييز الاشارات العصبية يصبح أكثر تطورا وسهلة الاستخدام 3، 4. وقد واكب التقدم التكنولوجي على الجانب البرمجيات من خلال تخفيضات في الوزن وكبيرة الحجم من الأجهزة القابلة للزرع، والتي تم تقليصها بما فيه الكفاية لتسجيل في الثدييات الصغيرة، مثل الفئران. باستخدام مكونات خفيفة الوزن (ومعظمهم من البلاستيك)، والباحثين قادرون على بناء ميكرودريفيس التي تسمح لتحديد المواقع المستقلة من الأقطاب الكهربائية أو tetrodes لاستهداف مجموعة واسعة من مناطق الدماغ 5-7. هياكل الدماغ حتى العميقة، مثلاللوزة (6) والمخطط 5، ويمكن أن تستهدف بشكل روتيني مع اختيار لالمسمار حملة طويلة بشكل مناسب. هذه التقنيات تسجيل تسمح للباحثين للحصول على إشارات العصبية عالية الدقة وتكون في التسجيل مع النشاط الكهربائي للخلايا العصبية واحدة سجلت داخل الخلية 8، 9. باستخدام هذه الأنواع من ميكرودريفيس، لقد سجلت بنجاح وحدات واحد من الفئران لمدة تصل إلى شهرين بعد زرع 10. وبالإضافة إلى ذلك، فقد أدت طبيعة خفيفة من الأجهزة (حوالي 1.5-2.0 ز) في أداء السلوكية التي هي مماثلة لالفئران غير مزروع في العديد من المهام السلوكية. على وجه الخصوص، وقد أثبتنا أن الفئران مزروع يحمل الأداء العادي في الرواية كائن مهمة الاعتراف (10) ومهمة ووضع وجوه (بيانات غير منشورة).
استخدام ميكرودريفيس بالإضافة إلى tetrodes متعددة يسمح للباحثين لرصد وتحليل النشاط العصبي في مستوى الشبكةفي حين تم تسجيل أيضا من عدة وحدات واحد داخل الدماغ. تسجيل مع هذه tetrodes ديها العديد من المزايا الرئيسية لأغراض تحديد الهوية وحدة ويمكن اكتساب درجة عالية من الدقة والتمييز من عدة وحدات واحد 11. ونحن تصف كيفية تصنيع والذهب لوحة حزم tetrode ثم تحميل في وقت لاحق لهم في ناقلات القطب دريفبل. نوع واحد من محرك الناقل وصفنا متاح تجاريا والآخر هو بسيط، ولكن قابلة للتوسيع بسهولة، تصميم محرك الأقراص الذي يمكن أن تستوعب عدة شركات والترتيبات tetrode بدون استثمارات كبيرة من الموارد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tetrode تلفيق
- ابدأ باستخدام معزولة 12.5 ميكرون (0.0005 ") قطر الأساسية سلك البلاتين إيريديوم من كاليفورنيا سلك الجميلة. يجب أن تقطع طول السلك إلى طول مناسب للهيكل المستهدف، فعلى سبيل المثال، قطع الأسلاك إلى 30 سم على الأقل طويل لاستهداف مرفد الظهرية أو قرن آمون.
- طي السلك في أكثر من مركز حتى لا يكون هناك نوعان من الأسلاك المتوازية والتي سوف تكون 15 سم في الطول. ثنى منتصف هذا السلك أكثر من ذراع أفقي لتشكيل أربعة أسلاك متوازية من 7.5 سم في الطول. نعلق المقبل مقطع المغلفة بالمطاط بالقرب من أسفل السلك رايات، وخلق مجموعة من أربعة أسلاك.
- وضع مقطع المطاط في Tetrode سبينر الميكانيكيه، والتأكد من أن السلك هو مشدود، ولكن الوزن لا مشدود جدا أو تحمل لأنها سوف كسر أثناء عملية الغزل.
- تبديل سبينر Tetrode إلى وضع "يدوي" ودفع عصا التحكم إلى "الحق" في السلك تدور في اتجاه عقارب الساعة. الدوارستدور في ما يقرب من 2 هرتز، وخلق حزمة ضيقة من أربعة أسلاك لتشكيل tetrode.
- تطبيق التناوب في اتجاه عقارب الساعة ثم 80 توقف عن طريق دفع "وحتى" على عصا التحكم. هذه وقفة الدوار بمحركات. المقبل، تطبيق 20 عكس اتجاه عقارب الساعة تناوب ("اليسار") من أجل الافراج عن التوتر على tetrode. يجب أن العدد النهائي للتناوب في طول السلك يكون التناوب في 8 ميكرون.
- استخدام بندقية التدفئة في الجزء الأسفل من الإعداد 1، والتي تصل إلى حد أقصى قدره 400 درجة، من أجل صهر الأسلاك معا بصهر معطف السندات VG. عقد بندقية الحرارة ~ 2 سم من السلك وتشغيل بندقية صعودا ونزولا على طول مستقيم من السلك لمدة 5 ثوانى من عدة زوايا مختلفة. تأكد من أن يكتسح باستمرار بندقية الحرارة وليس لأنه عقد أي موقع واحد حيث سيؤدي ذلك إلى إذابة العزل HML وتتسبب في الأسلاك لتلتحم مع بعضها ضمن حزمة.
- اجراء خفض في الجزء العلوي من tetrode (بالقرب من الذراع الأفقي) ثم حرر tetrode من مقطع في الجزء السفلي. قطع حلقة واحدة حتى ان هناك أربعة أسلاك منفصلة في واحدة من نهاية tetrode، وسيتم ربط هذه الأسلاك كهربائيا إلى دبابيس الذهب أو لوحة الدوائر في خطوة لاحقة.
- وضع tetrode أنجزت في مربع القابضة خالية من الغبار لتخزين حتى تم الانتهاء من محرك الأقراص.
2. الجمعية ميكرودريفي مخصص
- بناء أول قاعدة من شأنها أن الاستمرار على ميكرودريفي (ق). قاعدة ميكرودريفي مزروع عموما الأكثر استقرارا إذا تم تأمينها ووضعها على طول خط الوسط من الجمجمة. يصف هذا البروتوكول خطوات لبناء قاعدة للميكرودريفي واحد لعقد أربع ناقلات أنبوب البولي أميد. ميكرودريفيس وأنابيب إضافية يمكن إضافتها بسهولة حسب الحاجة.
- تبدأ مع 20 ملم تقريبا قطعة مربعة من زجاجي الاكريليك (5 مم) والرمل والاكريليك في شكل من شأنها أن تسمح الماوس للتحرك بحرية مع محرك الأقراص بعد ذلك يتم زرع على رأسه.
- المقبل، تجميع وحدة محرك الأقراص. استخدام تخصيص 3.3 X 6.3 ملم من النحاس الأصفر أدلة من شأنها أن تحمل محرك المسمار. أولا، لحام دليلين النحاس معا عموديا. وسوف دليل النحاس عمودي الاستمرار على المسمار محرك الأقراص والأقطاب الكهربائية، في حين سيتم لصقها على قطعة الأفقي في قاعدة الاكريليك.
- بعد لحام قطعة من النحاس الأصفر معا، تبدأ الجمعية من محرك الأقراص نفسه عن طريق تمرير النحاس رئيس الفرزة المسمار من خلال الجزء العلوي من الدليل وإلى كتلة من البلاستيك Delrin. تم تصميم كتلة مربعة بحيث ثقب مسنن هو قليلا قبالة مركز (بنسبة 0.2 ملم)، مما أدى إلى وجها واحدا من كتلة جاحظ قليلا جدا من دليل. هذا هو الجانب حيث أنابيب البولي أميد تحمل الأقطاب سيجلس.
- مع كتلة Delrin داخل الدليل، والمسمار على طول الطريق من خلال، والخيط الجوز النحاس عرافة الجوز حتى لمس ما يقرب من الجزء السفلي من دليل. لا تشديد الجوز بالكامل، بدلا من ذلك تذوب كمية صغيرة من لحام إلى نهاية من أجل الانضمام إلى الجوز والمسمار ولكن الحرص على عدم لحام anytهينج إلى دليل. الآن، وتناوب المسمار يجب أن تتحرك لأعلى كتلة Delrin (اتجاه عقارب الساعة) وأسفل (عكس عقارب الساعة) عموديا على طول الخيط المسمار. قطع الخيط الذي يبرز الماضية الجوز ملحوم.
- مرة واحدة وقد تم تجميع محرك الأقراص، والعودة إلى قاعدة الاكريليك وقطع فتحة واسعة 3 مم حيث محرك الأقراص القطب سيكون. تمرير دليل النحاس الأفقي من خلال فتحة ثم استخدام الغراء cryanoacrylate لتأمين قطعة إلى القاعدة.
- وضع قاعدة الاكريليك في ملزمة لضمان الحصول عليها في المكان. وضع واجهة اللوحة الالكترونية (بنك الاستثمار الأوروبي) على رأس القاعدة وبمناسبة مواقع اثنين من الثقوب المسمار. EIBs هي الرقائق التي توفر اتصال إشارة بين الأسلاك الكهربائي وheadstage قبل مكبر للصوت. باستخدام 1.5 ملم غيض مثقاب، حفر ثقوب بعناية في علامات للمسامير التي ستعقد بنك الاستثمار الأوروبي في مكان على رأس القاعدة. وضع بنك الاستثمار الأوروبي والخيط اثنين من البراغي النحاس في الثقوب.
- استخدام مقص تشريح الصغيرة لخفض أربعة 7 قطع طويلة ملم من POLYAMIDE الأنابيب. خط الأنابيب أربعة بجانب بعضها البعض على قطعة من الشريط مختبر مطوية. تنطبق فورية الغراء إلى مركز للانضمام اليهم معا ولكن أخذ الحيطة والحذر على عدم الحصول على الغراء داخل أنابيب أنفسهم. تسمح هذه الأنابيب انضم لتجف تماما.
- وتناوب على قاعدة مسافة 90 درجة بحيث رقاقة بنك الاستثمار الأوروبي هو عمودي ويتم وضع محرك الأقراص أفقيا مع جاحظ كتلة Delrin تواجه التصاعدي. يبحث من خلال مجهر تشريح، بعناية الداب كمية صغيرة من فورية الغراء على الوجه Delrin ثم ضع أربعة أنابيب انضم على الغراء. السماح للالغراء لتعيين تماما قبل محاولة نقل محرك الأقراص.
- اختبار أنابيب البولي أميد أن يتم بإحكام وأن الجمعية بأكمله يتحرك بسلاسة دون لمس أي دليل أو مواجهة المقاومة.
- المقبل، وإعداد المسمار الأرض وتوصيل سلك الأرض إلى بنك الاستثمار الأوروبي. جعل المسمار الأرض عن طريق أخذ المسمار النحاس (3/32 ") والرملي أسفل المواضيع حتى تبقى فقط عن المواضيع 1-2. هذا ينبغي أن يكون ~1 مم لأن هذا المسمار سوف يجلس داخل الجمجمة وليس المقصود بها أن تخترق أنسجة المخ.
- قطع بطول 30 مم من الأسلاك النحاسية (فإن طول الدقيق يعتمد على مكان وعلى الجمجمة لوضع أرضية الحيوان). يجب أن تكون الأسلاك النحاسية 100-500 ميكرومتر (0،004-،02 ") في قطر، وهذا ما يعادل تقريبا 38 AWG من خلال 24 AWG سلك تطبيق تدفق لحام لكلا طرفي الأسلاك النحاسية في نهاية واحدة، لحام المسمار الأرض ل. السلك. على الطرف الآخر، لحام على دبوس من الذهب بنك الاستثمار الأوروبي. هذه الأسلاك الأرضية يمكن أن توضع جانبا ومتصلا بنك الاستثمار الأوروبي في وقت لاحق خلال جراحة زرع.
- والخطوة التالية هي لتوجيه الأقطاب من خلال أنابيب البولي أميد وربطها الثقوب قناة على رقاقة بنك الاستثمار الأوروبي. تحويل محرك المسمار في اتجاه عقارب الساعة تماما بحيث الأنابيب هي في موقفهم أعلى.
- لأقطاب واحدة، وقطع مم طول 50 Stableohm من 50 ميكرومتر الأسلاك وتوجيهها من خلال أنبوب بولي أميد واحد، والسماح لها لتوسيع 2.0 مم على الأقل بعد نهاية أنبوب (لاستهداف مرفد أوالحصين). ضع قطرة صغيرة من فورية الغراء في الجزء العلوي من الأنبوب، الالصاق السلك إلى الأنبوب ومنع أي حركة السلك. المقبل، وربط نهاية فضفاض من السلك إلى حفرة قناة بنك الاستثمار الأوروبي باستخدام دبوس من الذهب. تقليم قبالة أي سلك الزائدة مع مقص غرامة. كرر لmicroelectrodes الأخرى.
- لربط tetrodes، واتخاذ اكتمال أحدى tetrode من خارج منطقة الجزاء التخزين. توجيه نهاية تنصهر من tetrode من خلال أنبوب بولي أميد واحد والسماح لها لتوسيع 2.0 مم على الأقل بعد نهاية أنبوب (على مرفد أو قرن آمون). ضع قطرة صغيرة من فورية الغراء في الجزء العلوي من الأنبوب، الالصاق tetrode إلى الأنبوب ومنع أي حركة. خذ أربعة أسلاك فضفاض في الطرف الآخر من tetrode وربط كل سلك لثقب قناة بنك الاستثمار الأوروبي باستخدام دبوس من الذهب. تقليم قبالة أي سلك الزائد. كرر لtetrodes الأخرى.
3. الجمعية VersaDrive
- البدء في بناء tetrode VersaDrive أربعة، وهذا يتكون من قاعدة، الضميمة، وكاب PIECES.
- قطع واحد أنابيب البولي أميد إلى 10 ملم وتوجيهها من خلال أصغر ثقب على الناقل tetrode. السماح للأنبوب تمديد الماضية الناقل قليلا جدا (0.5 ملم). استخدام 5 مين الايبوكسي لالغراء أنبوب البولي أميد في المكان، والحرص على عدم السماح للالايبوكسي للذهاب في أنبوب نفسها. كرر هذا لمدة ثلاثة أنابيب وشركات الطيران الأخرى.
- بعد غروب الايبوكسي تماما، وتوجيه كل أنبوب بولي أميد من خلال واحدة من أربعة ثقوب على قاعدة VersaDrive. مرة واحدة كل أربعة أنابيب هي من خلال جحورهم، ودفع لدبوس الحشرات من خلال ثقب الخارجي، وهذا سوف يعقد الناقل tetrode في خط وتكون بمثابة السكك الحديدية للناقل للسفر على. كرر هذا للشركات الثلاث الأخرى.
- أخذ قبعة ويبطن هذا الامر مع دبابيس الحشرات أربعة بحيث قبعة تغطي قاعدة وشركات الطيران tetrode يقيمون داخل الغطاء. الموضوع قطرها 1 مم × 5 مم آلة المسمار من خلال ثقب في الغطاء المناسب وإلى الناقل tetrode. وستكون هذه هي المسمار محرك لتحريك الناقل صعودا وهبوطا. ممثلأكل هذا لثلاثة مسامير أخرى.
- تحويل جميع مسامير اتجاه عقارب الساعة حتى شركات الطيران tetrode هي في موقفهم العلوي وأنابيب البولي أميد مرئية من خلال فتح الغطاء. باستخدام مقص تشريح غرامة الصغيرة، وقطع الأنابيب أدناه فقط (1 مم) قاعدة حتى يتسنى لجميع أنابيب البولي أميد الأربعة هي من نفس الطول.
- باستخدام مجهر تشريح، والخيط بعناية tetrode واحد من خلال أنبوب البولي أميد. فمن المهم للحفاظ على الأسلاك tetrode مستقيم تماما كما السلف من خلال أنبوب مثل أي مكامن الخلل أو الانحناءات سوف تجعل من الصعب جدا على الخيط بشكل كامل من خلال tetrode. كرر لمدة ثلاثة tetrodes الأخرى.
- مرة واحدة كل tetrodes هي في أنابيب، وتطبق بعناية قطرة صغيرة من فورية الغراء إلى الجزء العلوي من كل أنبوب، وتأمين tetrodes داخل أنابيب كل منها. أخذ الحيطة والحذر بعدم الحصول على أي فورية الغراء بين الناقلين أو على الأسلاك tetrode فضفاض التي يتم جاحظ من خلال الغطاء.
- قطع tetrodes بحيث تشمل سوى الماضي الأنابيب2.0 مم (لمرفد أو قرن آمون). ثم ضع قاعدة محرك الأقراص (مع دبابيس الحشرات أربعة إدخالها) في رقصة VersaDrive. فإن النصف الآخر من رقصة عقد الغطاء VersaDrive أن لديه كل الثقوب وعاء لصنع وصلات القناة.
- تحويل محرك المسمار عكس عقارب الساعة تماما بحيث tetrodes هي في أدنى موقفهم.
- قبل توصيل الأسلاك tetrode إلى أوعية الذهب، وربط لأول مرة الأسلاك الأرضية إلى الحد الأقصى. الغطاء VersaDrive ديه اثنين من الثقوب دبوس للاتصالات الأرضية في موقف وسط صفين من الثقوب. قطع الأسلاك النحاسية من 30 مم على الأقل (يعتمد فيها على الجمجمة لوضع الأرض) وتوجيهها من خلال واحدة من هذه الثقوب المركز. يجب أن تكون الأسلاك النحاسية 100-500 ميكرومتر (0،004-،02 ") في قطر، وهذا ما يعادل تقريبا 38 AWG من خلال 24 AWG سلك ادفع وعاء الذهب من خلال ثقب للقبض على الأسلاك النحاسية في مكان وتقليم أي سلك الزائد. على الطرف الآخر من الأسلاك النحاسية، وتطبيق التمويه وsoldeR هذه الغاية سلك للولب الأرض (انظر 2.11). كرر لسلك الأرض الثانية.
- المقبل، وتوجيه جميع الأسلاك tetrode فضفاضة (يجب أن يكون هناك ستة عشر في المجموع) من خلال ثقوب في وعاء منها على الغطاء. فمن الأفضل أن تبدأ مع tetrode واحد والخيط الأسلاك الفردية إلى أربعة ثقوب المناسبة التي من شأنها في نهاية المطاف فوقه مباشرة. وينبغي التعامل مع الأسلاك tetrode الفردية مع الضغط الخفيف لأنها هشة ويمكن بسهولة تجعيد إذا عصفت بقوة أيضا. تثبيت الغطاء بواسطة اصطفاف دبابيس الحشرات الثقوب والصحافة المناسب للقاعدة.
- مع الأسلاك tetrode جاحظ من خلال الغطاء، اضغط تناسب أوعية الذهب لالتقاط الأسلاك tetrode في مكان وجعل التوصيلات الكهربائية. سيتم قطع ما يقرب من 50٪ من أسلاك قبالة (فوق الحد الأقصى) مرة واحدة يتم الضغط على وعاء من الذهب أسفل. تقليم أي سلك الزائد الذي لا يزال جاحظ من أعلى الغطاء. في حالات نادرة (أقل من 5٪)، ودفع إلى أسفل وعاء الذهب سوف سحق السلكوكسرها أدناه عاء، مما أدى إلى قطع قناة. قد لا تتحقق هذه انقطاع حتى اختبار مقاومة وخطوات الطلاء بالكهرباء (انظر 4.7).
- كرر العملية الصحافة لتركيب لtetrodes الثلاثة الأخرى. تحويل مسامير محرك اتجاه عقارب الساعة لنقلها مرة أخرى إلى الأعلى وتأكد من أن محرك الأقراص حركة على نحو سلس.
4. الذهب تصفيح من نصائح الكهربائي
- بغض النظر عن أي نوع من microelectrodes المستخدمة، يجب على نصائح من الأقطاب تكون مطلية بالذهب من أجل الحد من مقاومة الإكراميات. يعمل هذا على زيادة القدرة على تسجيل موثوق وتميز إمكانات العمل وحدة واحدة. اختبار مقاومة الكهربائي باستخدام الجهاز nanoZ Neuralynx. وnanoZ هو جهاز يعمل بنظام الكمبيوتر الذي يقيس مقاومة، ويسمح لالكهربائي الآلي.
- اول منعطف مسامير ميكرودريفي أسفل (عكس اتجاه عقارب الساعة) إلى أدنى موقفهم. ثم تحميل بشكل آمن على ميكرودريفي على المشبك من شأنها أن تسمح خفض مننصائح الكهربائي في محلول طلاء الذهب.
- ملء برج Delrin واحد مع SIFCO حل الذهب وبرج الأخرى مع الماء المقطر. خفض نصائح الكهربائي في محلول الذهب.
- قم بتوصيل كابل USB nanoZ إلى جهاز كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل Windows ثم قم بفتح برنامج nanoZ. هذا البرنامج سوف تعطي قراءات مقاومة وأداء الذهب تصفيح على كل قناة اتصال من ميكرودريفي.
- انتقل إلى جهاز المنسدلة واختر nanoZ، وبعد ذلك سوف تظهر "تأسيس اتصال" في الجزء السفلي من الإطار. بعد ذلك، حدد المحول المناسب لاختبار في القائمة المنسدلة. انقر على "ممانعات اختبار" وتعيين تردد اختبار ل1004 هرتز (40 دورة، 0 مللي ثانية إيقاف مؤقت). انقر على "اختبار مسبار"، الذي سيفتح "دقق تقرير" إطار يعرض جميع القنوات المتاحة مع بهم MΩ القراءات. حفظ هذه القيم مقاومة من خلال النقر على رمز القرص أو عن طريق اختيار "ملف"، ثم "حفظ التقرير".
- المقبل، انقر على "DC بالكهرباء" وتعيينالقيم التالية: وضع = ممانعات المباراة، والطلاء الحالي = -1.0 أمبير، والهدف = 350 أوم في 1،004 هرتز، و 5 أشواط، 5 ثانية فاصل، 2 ثانية وقفة.
- انقر على زر "Autoplate". سيقوم البرنامج قراءة أول مقاومة من كل قناة، ثم تطبيق محدد الحالي لتلك القناة، وإعادة اختبار مقاومة وتطبيق الحالية حسب الحاجة حتى يتم الوصول إلى الهدف مقاومة (أو انخفاض قيمة). في حين أن الهدف من ذلك هو تقليل مقاومة القطب، فمن الممكن أن القنوات سوف بالكهرباء أدناه القيم من 100 أوم. في مثل هذه الحالات، فمن الممكن أن الأسلاك المجاورة على tetrode وقد قلل معا. إذا حدث هذا، عكس القطبية الحالية (+ 1.0 أمبير) لإزالة جزيئات الذهب الزائدة، وإعادة اختبار مقاومة من تلك القناة، ثم كرر الكهربائي. نموذجي القيم مقاومة النهائية على حزمة من أربعة أسلاك 12.5 ميكرومتر تتراوح 150-325 أوم.
- إذا كان هناك أي قناة واحدة لم مطلي أدناه 350 أوم، كرر عملية الطلاء الكهربائي.سيقوم البرنامج تخطي القنوات التي وصلت بالفعل الهدف ولن يؤدي إلا إلى قنوات لوحة التي لم تفعل ذلك.
- مرة واحدة وقد تم مطلي جميع القنوات لمقاومة مقبولة، إغلاق البرنامج nanoZ وافصل الجهاز. رفع الأقطاب من حل الطلاء وخفض نصائح في برج Delrin الماء المقطر من أجل شطف جزيئات الذهب الزائدة.
- تحويل مسامير محرك اتجاه عقارب الساعة حتى يتم رفع الأقطاب إلى وضعها أعلى. الآن ميكرودريفي وأقطاب مستعدون لزرع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفناها مجموعة من التقنيات لبناء ميكرودريفيس خفيفة وصغيرة لتسجيل وحدة خارج الخلية ونشاط محتمل الميدانية في الفئران. من خلال بناء ميكرودريفيس المخصصة مع قواعد صنعت من زجاج الاكريليك (ميتاكريليت الميثيل)، جوهر النظام يمكن تكييفها بسهولة لمحركات متعددة و لاستهداف مجموعة واسعة من المناطق العصبية. قمنا بتعديل بنجاح نظام لتسجيل الأهداف من الدماغ متعددة ومع صفائف أكبر للتسجيلات في الفئران. مع مزيد من التعديل، ويمكن إدراج عناصر القيادة الآلية للسماح لبعيد، ويحتمل أن تكون أكثر دقة، وضع قطب كهربائي 7.
ونود أن نؤكد أن هذه الأجهزة تسجيل إعطاء المرونة الباحث في استخدام إما microwires واحد أو حزم الأسلاك، مثل tetrodes. أكبر microwires قطر واحدة هي أكثر قوة وأكثر ملاءمة للتسجيل LFPs داخل أنسجة المخ. مبادرة الخوذ البيضاءويمكن أيضا أن تستخدم tetrodes جنيه لتسجيل LFPs، أنها هي الأمثل لعزل العمل وحدة واحدة إمكانات 8، 11. في المختبر لدينا، وقد تم الحصول على تسجيلات مستقر من وحدات واحد لمدة تصل إلى 8 أسابيع بعد الزرع. ومع ذلك، هذه التسجيلات ليست من نفس الوحدات المفترضة خلال ذلك الوقت كله. في أيدينا، يمكن أن يتبع واحد وحدة على مدى عدة جلسات التسجيل (30 دقيقة لكل منهما) التي تمتد مدة 3 أيام، مما يعكس الاستقرار بين الدورات 10. من ناحية أخرى، يمكن تسجيل LFPs قوية والتذبذبات شبكة طوال فترة ما بعد الزرع بأكمله، وخاصة مع استخدام أسلاك قطرها أكبر مثل 50 ميكرون (0.002 ") سلك. لاحظ أن الأساليب المذكورة هنا تنطبق على تسجيل من جانب واحد هياكل الدماغ، ولكن يمكن تعديلها بسهولة للتسجيلات الثنائية. على سبيل المثال، عند بناء ميكرودريفيس العرف، لا بد من تحديد مسافة مناسبة بين محركات الأقراص مسبقا من أجل دعمerly الهدف هياكل الدماغ على المستوى الثنائي.
كما أصبحت مكونات ميكرودريفي أكثر وخفيفة الوزن والبرمجيات لتحليل الإشارات العصبية ويحسن، مكتبة أهداف الدماغ المحتملة والفرضيات القابلة للقياس في علم الأعصاب لا تزال تتوسع. فمن الواضح أنه، منذ نشأتها 1، 12، تسجيلات الدماغ من مستيقظا الحيوانات تتصرف تقدمت إلى حد كبير فهمنا لكيفية الخلايا العصبية وشبكات من الخلايا العصبية ترميز سلوكيا الأحداث ذات الصلة 3، 4،13،14. على وجه الخصوص، وقد سمحت التسجيلات الدماغ من الفئران المعدلة وراثيا تحديد شلالات الجزيئية التي تشارك بصورة حاسمة في ترميز العصبية 15-17. الأهم من ذلك، وقد تم تطبيق هذه التقنية إلا في الآونة الأخيرة إلى القضايا الموجهة سريريا 17، 18.
وسوف تقدم في تلفيق tetrodes وزيادة توافر الحلول المصنعة مزيد من تسهيل حركة هذه التكنولوجيا!Y في معالجة الأمراض التي تصيب الإنسان والأمراض 19، 20. وعلى الرغم من تغلغل من الأقطاب الكهربائية إلى أنسجة المخ هو الغازية في الطبيعة، وهذه التسجيلات تقدم معلومات لا تقدر بثمن من الخلايا العصبية الفردية التي لا يمكن الحصول عليها مع تقنيات مثل التصوير وظيفية. وهكذا، في كل من النماذج الحيوانية والبشر، وسوف يتصرف مستيقظا التسجيلات باستخدام ميكرودريفيس المنقولة مواصلة تقديم معلومات لا غنى عنها حول الفرق العصبية، الترميز العصبية، والنوعية الطبوغرافية، وشبكة التذبذبات داخل الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر دانيال كاربي لمساعدته والمساهمات في وقت مبكر لهذا المشروع. كما نشكر وكريشيا نوفوا للحصول على المساعدة لها مع الأعمال الفنية والصور. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIAID برنامج المنح 5P01AI073693-03.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.0005" (12.5 μM) diameter Platinum-Iridium wire | California Fine Wire | CFW#100-167 | HML VG insulated www.calfinewire.com |
| 0.002" (50 μM) diameter Stableohm 675 wire | California Fine Wire | CFW# 100-188 | HML insulated Ni-Cr |
| polyamide tubing | Polymicro Technologies | 1068150020 | 99 micron I.D., 166 micron O.D. www.polymicro.com |
| brass guides | World Plastics Inc | 3.3 x 6.6 mm | |
| Delrin blocks | World Plastics Inc | 3.13 x 2.5 mm | |
| Fillister head brass screws | J.I. Morris Co. | 00-90 x 1/2 | drive screw www.jimorrisco.com |
| hex brass nuts | J.I. Morris Co. | 00-90 | |
| Fillister head brass screws | J.I. Morris Co. | 000-120 x 3/32 | EIB mount and ground screw |
| plexiglass acrylic | Canal Street Plastics | 5 mm thick, clear, www.cpcnyc.com | |
| cyanoacrylate | Krazy Glue | 2 g tube | |
| electronic interface board | Neuralynx | EIB-18 | www.neuralynx.com |
| non-cyanide gold solution | SIFCO | SIFCO 5355 | www.sifcoasc.com |
| VersaDrive 4 | Neuralynx | four tetrode model | |
| tetrode assembly station | Neuralynx | ||
| motorized tetrode spinner | Neuralynx | tetrode spinner 2.0 | |
| VersaDrive jig | Neuralynx | ||
| soldering iron | Radio Shack | 64-2802B | www.radioshack.com |
| nanoZ | Neuralynx | ||
| small bit drill/driver | Ram Products | Rampower 35 | with footpedal controller, www.ramprodinc.com |
| drill bits | Small Parts, Inc. | 3/32" bits, www.smallpartsinc.com | |
| dissecting microscope | Olympus | SZ-60 | www.olympusamerica.com |
| heat gun | Alphawire | Fit gun 3 | use setting "1" only, www.alphawire.com |
| 26 AWG copper wire | Arcor Electronics | F26 | for ground wires, www.arcorelectronics.com |
| soldering flux | Eagle | 2 oz, #205 | |
| 0.02" diameter solder | Kester | 24-6337-0010 | www.kester.com |
| benchtop vise | Vacu-Vise | Model 300 | |
| fiber optic light | Nikon | MKII | dual light arms, www.nikon.com |
| 5-min epoxy | Allied Electronics | 25 ml, www.alliedelec.com | |
| fine tweezers | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-4907, RS-5010 | INOX material, www.roboz.com |
| micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5880 | |
Table 1. Materials and reagents used for constructing tetrodes and microdrives. |
|||
References
- Recce, M. L., O'Keefe, J. The tetrode: a new technique for multi-unit extracellular recording. Soc. Neurosci. Abstr. 15, 1250 (1989).
- O'Keefe, J., Recce, M. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3, 317-330 (1993).
- Chen, G., Wang, L. P., Tsien, J. Z. Neural population-level memory traces in the mouse hippocampus. PLoS ONE. 4 (12), e8256 (2009).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents -- EEG, ECoG, LFP, and spikes. Nat. Rev. Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Tort, A. B., Kramer, M. A., et al. Dynamic cross-frequency coupling of local field potential oscillations in rat striatum and hippocampus during performance of a T-maze task. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105 (51), 20517-20522 (2008).
- Seidenbecher, T., Laxmi, R., et al. Amygdalar and hippocampal theta rhythm synchronization during fear memory retrieval. Science. 301 (5634), 846-850 (2003).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Harris, K. D., Henze, D. A., et al. Accuracy of tetrode spike separation as determined by simultaneous intracellular and extracellular measurements. J. Neurophysiol. 84 (1), 401-414 (2000).
- Henze, D. A., Borhegyi, Z., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84 (1), 390-400 (2000).
- Chang, E. H., Huerta, P. T. Neurophysiological correlates of object recognition in the dorsal subiculum. Front. Behav. Neurosci. 6, 46 (2012).
- Gray, C. M., Maldonado, P. E., et al. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. J. Neurosci. Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).
- O'Keefe, J., Dostrovsky, J. The hippocampus as a spatial map. Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat. Brain Res. 34 (1), 171-175 (1971).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
- Buzsáki, G. Rhythms of the Brain. , Oxford University Press. Oxford, U.K. (2006).
- McHugh, T. J., Blum, K. I., et al. Impaired hippocampal representation of space in CA1-specific NMDAR1 knockout mice. Cell. 87 (7), 1339-1349 (1996).
- Resnik, E., McFarland, J. M., et al. The effects of GluA1 deletion on the hippocampal population code for position. J. Neurosci. 32 (26), 8952-8968 (2012).
- Cacucci, F., Yi, M., et al. Place cell firing correlates with memory deficits and amyloid plaque burden in Tg2576 Alzheimer mouse model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (22), 7863-7868 (2008).
- Sigurdsson, T., Stark, K. L., et al. Impaired hippocampal-prefrontal synchrony in a genetic mouse model of schizophrenia. Nature. 464 (7289), 763-767 (2010).
- Engel, A. K., Moll, C. K., et al. Invasive recordings from the human brain: clinical insights and beyond. Nat. Rev. Neurosci. 6 (1), 35-47 (2005).
- Cash, S. S., Halgren, E., et al. The human K-complex represents an isolated cortical down-state. Science. 324 (5930), 1084-1087 (2009).
