Summary
התכנון וההרכבה של microdrives בקלטות אלקטרו vivo של אותות מוח של העכבר מתואר. על ידי הצמדת צרורות microelectrode לספקי driveable חסונים, טכניקות אלה יאפשרו להקלטות עצביות ארוכת טווח ויציבים. העיצוב קל משקל מאפשר ביצועי התנהגות בלתי מוגבל על ידי השתלת הדיסק הבאה של בעלי החיים.
Abstract
קלטות אלקטרו מדינה-of-the-art ממוחותיהם של בעלי חיים המתנהגים באופן חופשי תאפשר לחוקרים לבחון בו זמנית פוטנציאל בתחום מקומי (LFPs) מאוכלוסיות של תאי עצב ואת פוטנציאל פעולה מתאי בודדים, כמו בעלי החיים עוסק במשימות בניסוי רלוונטיות. microdrives המושתל כרוני לאפשר להקלטות במוח שעבר מעל לתקופות של מספר שבועות. כוננים זעירים ורכיבים קלים לאפשר להקלטות ארוכות טווח אלה להתרחש ביונקים קטנים, כגון עכברים. באמצעות tetrodes, שמורכב מצרורות קלועות הדוק של ארבע אלקטרודות שבו יש לכל חוט בקוטר של 12.5 מיקרומטר, אפשר לבודד תאי עצב פעיל מבחינה פיזיולוגית באזורים השטחיים של מוח, כגון קליפת מוח, בהיפוקמפוס הגבי, וsubiculum, כמו גם כאזורים עמוקים יותר כגון הסטריאטום ובאמיגדלה. יתר על כן, בטכניקה זו מבטחת הקלטות עצביות יציבות, באיכות גבוהה כמו בעלי החיים הוא אתגר עם varieטיי של משימות התנהגותיות. כתב יד זה מתאר כמה שיטות שמוטבו כדי להקליט ממוח העכבר. ראשית, אנו מראים כיצד לפברק tetrodes, לטעון אותם לתוך צינורות driveable, וזהב, צלחת העצות שלהם על מנת להפחית את העכבה שלהם מMΩ לטווח KΩ. שנית, אנו מראים כיצד לבנות הרכבה Microdrive מותאמת אישית לביצוע והעברת tetrodes אנכי, עם השימוש בחומרים זולים. שלישית, אנו מציגים את השלבים להרכבת Microdrive זמין מסחרי (Neuralynx VersaDrive) שנועד לשאת tetrodes באופן עצמאי מטלטלין. לבסוף, אנו מציגים תוצאות מייצגות של פוטנציאל בתחום מקומי ואותות המתקבלים יחידה אחת בsubiculum הגב של עכברים. יכולות להיות שונה בטכניקות אלה בקלות כדי להתאים לסוגים שונים של מערכי אלקטרודה וערכות הקלטה במוח העכבר.
Introduction
השימוש בטכניקת microelectrode להקלטת אותות עצביים תאיים in vivo יש מסורת ארוכת שנים ומוערכת במדעי המוח 1, 2. היכולת להקליט פעילות חשמלית מאזורים רבים במוח בבעלי חיים מתנהגים באופן חופשי, עם זאת, טכנולוגיה חדשה יותר שהופכת נפוצה יותר ויותר כחבילות התוכנה לרכישה, הניתוח והאפליה של אותות עצביים הופכת להיות יותר מתוחכם וידידותי למשתמש 3, 4. ההתקדמות הטכנולוגית בצד התוכנה יש גם מלווה בירידה במשקל וחלק הארי של מכשירים להשתלה, שקוצץ במידה מספקת להקלטה ביונקים קטנים, כגון עכברים. על ידי שימוש בפלסטיק (בעיקר) מרכיבים קלים, חוקרים מסוגלים לבנות microdrives המאפשרים למיצוב עצמאי של אלקטרודות או tetrodes למקד מגוון רחב של אזורים במוח 5-7. מבנים מוחיים אפילו עמוקים, כגוןהאמיגדלה 6 וסטריאטום 5, יכולות להיות ממוקד באופן שגרתי עם מבחר של בורג נסיעה ארוך כראוי. טכניקות הקלטה אלו מאפשרים לחוקרים לקבל אותות עצביים באיכות גבוהה ונמצאות בלהירשם עם את הפעילות החשמלית של תאי עצב בודדים נרשמו intracellularly 8, 9. שימוש בסוגי microdrives אלה, יש לנו נרשמו הצלחה יחידה יחידות מעכברים לתקופה של עד חודשים לאחר השתלת 10. בנוסף, הטבע קל של המכשירים (כ 1.5-2.0 גר ') הביא לביצועי התנהגות שדומה לעכברים שאינם מושתלים במשימות התנהגותיות רבות. בפרט, יש לנו הראו כי עכברים מושתלים להציג ביצועים נורמלי במשימת זיהוי אובייקט רומן 10 והמשימה מקום האובייקט (נתונים שלא פורסמו).
השימוש בmicrodrives מצמידים tetrodes מרובים מאפשר לחוקרים לעקוב ולנתח פעילות עצבית ברמת הרשתגם בעת הקלטה מ-יחידות בודדות מרובות בתוך המוח. יש הקלטה עם tetrodes אלה יש מספר יתרונות עיקריים למטרות זיהוי יחידה ומאפשרת רכישת הדיוק הגבוהה ואפליה של יחיד יחידות מרובות 11. אנו מתארים כיצד לפברק וחבילות tetrode זהב צלחת ואז לאחר מכן לטעון אותם לתוך ספקי אלקטרודה driveable. סוג אחד של מנשא כונן שאנו מתארים הוא זמין באופן מסחרי, והשני הוא עיצוב פשוט, אבל להרחבה בקלות, כונן שיכול להכיל מספר רב של ספקים והסדרי tetrode ללא השקעה משמעותית של משאבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tetrode ייצור
- התחל על ידי שימוש 12.5 מיקרומטר מבודד (0.0005 ") תיל הפלטינה אירידיום ליבת קוטר מתיל דק קליפורניה. אורך החוט יש לחתוך לאורך המתאים למבנה היעד. לדוגמה, לחתוך את החוט לאורך של לפחות 30 ס"מ למיקוד subiculum הגבי או היפוקמפוס.
- מקפלים את החוט על במרכז, כך שיש שני חוטים מקבילים שיהיו 15 סנטימטר האורך. לעטוף את נקודת האמצע של החוט הזה על זרוע אופקית ליצירת ארבעה חוטים מקבילים של 7.5 ס"מ באורך. הבא לצרף את הקליפ מצופה גומי בחלקו התחתון של החוט העטוף, יצירת חבילה של ארבעה חוטים.
- הנח את סרטון הגומי לספינר tetrode הממונעת, ולוודא כי החוט מתוח, אבל לא יותר מדי משקל מתוח או נושא כפי שהוא ישבור במהלך תהליך ספינינג.
- לעבור ספינר tetrode למצב "ידני" ולדחוף את הג'ויסטיק ל" נכון "כדי לסובב את החוט בכיוון השעון. ספינריסתובב בכ 2 הרץ, יצירת חבילה הדוקה של ארבעה חוטים כדי ליצור tetrode.
- החל 80 סיבובים בכיוון שעון ואז להפסיק על ידי דחיפה "למעלה" בג'ויסטיק. זה יהיה להשהות את הצנטריפוגה הממונעת. הבא, להחיל 20 ("שמאל") סיבובים נגד כיוון השעון כדי לשחרר את המתח על tetrode. המספר הסופי של סיבובים לאורכו של חוט צריך להיות 8 סיבובים למיקרון.
- השתמש באקדח החימום בהגדרה הנמוכה 1, שמגיעה למקסימום של 400 מעלות, כדי למזג את החוטים יחד על ידי המסת האג"ח מעיל VG. החזק את אקדח החום ~ 2 ס"מ מהחוט ולהפעיל את האקדח למעלה ולמטה הישר אורכו של החוט לכ -5 שניות מכמה זוויות שונות. הקפד לטאטא כל הזמן אקדח החום ולא להחזיק אותו בכל מקום אחד כמו זה יהיה להמס את בידוד HML ולגרום את החוטים לפתיל יחד בתוך החבילה.
- ביצוע חתך בחלק העליון של tetrode (ליד הזרוע אופקית) ולאחר מכן שחרר את tetrode מהסרטון בתחתית. חותכים את הלולאה אחת, כך שיש ארבעה חוטים נפרדים בקצה אחד של tetrode, חוטים אלו יהיו מחוברים חשמליים לפיני זהב או מעגלים בשלב מאוחר יותר.
- הנח את tetrode הושלמה בתיבת החזקה נטולת אבק לאחסון עד הכונן הושלם.
2. אישית Microdrive עצרת
- ראשית לבנות את הבסיס שיחזיק Microdrive (ים). הבסיס של Microdrive המושתל הוא בדרך כלל יציב ביותר אם הוא מאובטח ואת מיקומו לאורך קו האמצע של הגולגולת. פרוטוקול זה מתאר את שלבים לבניית בסיס עם Microdrive יחיד להחזיק ארבעה ספקי צינור פוליאמיד. ניתן להוסיף microdrives וצינורות נוספים בקלות במידת צורך.
- התחל עם חתיכה כ 20 מ"מ מרובע של אקריליק פרספקס (5 מ"מ עובי) וחול אקרילי לצורה שתאפשר בעכבר כדי לנוע בחופשיות עם הכונן לאחר שהוא מושתל על הראש.
- בשלב הבא, להרכיב את יחידת הכונן. השתמש אישית 30.3 מ"מ x 6.3 מדריכי פליז שישאו את בורג הכונן. , שני מדריכים הראשונים הלחמת פליז יחד ניצב. מדריך פליז האנכי יחזיק את בורג הכונן ואלקטרודות, בעוד פיסה אופקית תהיה דבוקה לבסיס אקרילי.
- לאחר חתיכות פליז הלחמה ביחד, מתחיל הרכבה של הכונן עצמו על ידי העברת בורג נחושת ראש fillister דרך החלק העליון של המדריך ולגוש פלסטיק Delrin. בלוק הכיכר מתוכנן כך שהחור הוא נושא מרכז את מעט (ב -0.2 מ"מ), וכתוצאה מכך אחד פנים של הגוש הבולט מעט מאוד מהמדריך. זה הצד שבו צינורות פוליאמיד נושאים את האלקטרודות יהיו לשבת.
- עם Delrin הבלוק בתוך המדריך, ואת הבורג לכל אורך הדרך, חוט פליז אגוז hex עד האגוז הוא כמעט נוגע בתחתית המדריך. לא להדק את האום באופן מלא, אלא להמס כמות קטנה של הלחמה על הסוף כדי להצטרף לאגוז ואת הבורג, אבל נזהר שלא ההלחמה anytהינג למדריך. עכשיו, לסובב את הבורג צריך להזיז את בלוק Delrin (בכיוון השעון) ולמטה (נגד כיוון השעון) אנכית לאורך חוט הבורג. לחתוך את החוט שבולט עבר האגוז המולחם.
- ברגע שהכונן כבר התאסף, לחזור לבסיס אקרילי וחותך חריץ רחב 3 מ"מ שבו כונן האלקטרודה יהיה. לעבור את מדריך פליז האופקי דרך החריץ ולאחר מכן להשתמש בדבק cryanoacrylate כדי לאבטח את פיסה לבסיס.
- הנח את בסיס אקרילי במלחציים כדי לאבטח אותו במקום. הנח לוח ממשק אלקטרוני (EIB) על גבי הבסיס ולסמן את מיקומם של שני חורי הברגים. EIBs הם שבבים המספקים חיבור אות בין חוטי אלקטרודה וheadstage קדם מגבר. שימוש במקדח 1.5 מ"מ קצה, לקדוח חורים בזהירות את הסימנים לברגים שמחזיקים את EIB במקום בחלק העליון של הבסיס. הנח את EIB החוט ושני ברגי נחושת לתוך החורים.
- השתמש במספריים לנתח מיקרו לחתוך ארבע חתיכות ארוכות 7 מ"מ של polyamצינורות IDE. קו ארבעה צינורות אחד ליד שני על חתיכת סרט מעבדה מקופלת. החל cyanoacrylate למרכז להצטרף יחד אותם, אבל לקחת בזהירות שלא לקבל דבק בתוך הצינורות עצמם. לאפשר את הצינורות הצטרפו לייבוש מלא.
- סובב את בסיס המרחק של 90 מעלות, כך ששבב EIB הוא אנכי ואופקי הכונן ממוקם בבלוק Delrin הבולט פונה כלפי מעלה. מבט דרך מיקרוסקופ לנתח, בזהירות טיפת כמות קטנה של cyanoacrylate על הפנים Delrin לאחר מכן למקם את ארבעה צינורות הצטרפו בדבק. אפשר מדביק להגדיר לחלוטין לפני שאנסה להזיז את הכונן.
- מבחן כי צינורות פוליאמיד מחוברים היטב ושכל ההרכבה נעה בצורה חלקה בלי לגעת במדריך או פגישת כל התנגדות.
- בשלב הבא, להכין את קרקע הבורג ולחבר את חוט הקרקע לבנק האירופי להשקעות. הפוך בורג קרקע על ידי לקיחת בורג נחושת (3/32 ") ומלטש את החוטים עד שיישארו רק 1-2 אשכולות. זה צריך להיות ~1 מ"מ כמו בורג זה יהיה לשבת בתוך הגולגולת ולא נועד לחדור לרקמות מוח.
- גזור אורך 30 מ"מ של חוט נחושת (האורך המדויק יהיה תלוי בו בגולגולת למקום קרקע בעלי החיים). חוטי הנחושת צריכים להיות 100-500 מיקרומטר (.004-.02 ") בקוטר, זה שווה בערך 38 חוט AWG AWG דרך 24 החל שטף הלחמה לשני הקצוות של חוטי הנחושת בקצה אחד, לרתך את הבורג לקרקע.. התיל. בצד השני, הלחמת סיכת זהב EIB. חוט קרקע זו ניתן להפריש ומחוברת לEIB מאוחר יותר במהלך ניתוח ההשתלה.
- השלב הבא הוא להנחות את האלקטרודות דרך צינורות פוליאמיד ולחבר אותם לחורי הערוץ בשבב EIB. סובב את בורג כיוון השעון הכונן באופן מלא, כך שהצינורות נמצאים במיקום העליון שלהם.
- לאלקטרודות בודדות, לחתוך אורך 50 מ"מ של חוט Stableohm 50 מיקרומטר ולהדריך אותו דרך צינור פוליאמיד אחד, המאפשר לה להאריך לפחות 2.0 מ"מ עבר קצה הצינור (למיקוד subiculum אוהיפוקמפוס). יחול ירידה קטנה של cyanoacrylate בחלק העליון של הצינור, הדבקת החוט לצינור ומונע כל תנועת תיל. בשלב הבא, לחבר את הקצה הרופף של החוט לחור ערוץ EIB באמצעות סיכת זהב. חתוך את כל חוטים עודפים עם מספריים עדינים. חזור על פעולה עבור microelectrodes אחר.
- לחיבור tetrodes, לקחת אחד הושלם tetrode מחוץ לקופסא האחסון. מדריך הסוף התמזגו של tetrode דרך צינור פוליאמיד אחד ולאפשר לו להרחיב לפחות 2.0 מ"מ עבר קצה הצינור (לsubiculum או היפוקמפוס). תחול ירידה קטנה של cyanoacrylate בחלק העליון של הצינור, הדבקת tetrode לצינור ומונע כל תנועה. קח את ארבעה חוטים רופפים בקצה השני של tetrode ולחבר כל חוט לחור ערוץ EIB באמצעות סיכת זהב. חתוך את כל חוטים עודפים. חזור לtetrodes האחרים.
3. VersaDrive עצרת
- בגין בניית VersaDrive tetrode ארבע, זה מורכב מבסיס, מארז, וכובע pieces.
- חותכים צינורות פוליאמיד אחד עד 10 מ"מ, ולהנחות אותו דרך החור הקטן במנשא tetrode. לאפשר את הצינור להארכת עבר המנשא מעט מאוד (0.5 מ"מ). השתמש אפוקסי 5 דקות לדבק צינור פוליאמיד במקום, נזהר שלא לאפשר אפוקסי ללכת לתוך הצינור עצמו. חזור על פעולה זו במשך שלושה צינורות וספקים אחרים.
- לאחר אפוקסי קבע באופן מלא, להדריך את כל צינור פוליאמיד באמצעות אחד מארבעת החורים שבבסיס VersaDrive. ברגע שכל ארבעת הצינורות הם דרך החורים שלהם, לדחוף סיכת חרק דרך החור החיצוני, זה יחזיק מנשא tetrode בקו ומשמש כמעקה למוביל לנסוע הלאה. חזור על פעולה זו במשך שלושת ספקים האחרים.
- קח את כובע ואת הקו אותו עם ארבע סיכות החרקים כך שהכובע מכסה את הבסיס ואת ספקי tetrode מתגוררים בתוך הכובע. בורג אשכול 1 מ"מ x 5 מ"מ מכונה דרך החור המתאים בכובע ולתוך מנשא tetrode. זה יהיה בורג הכונן לנע מעלה ומטה המנשא. נציגלאכול את זה לשלושה ברגים האחרים.
- הפעל את כל הברגים עם כיוון השעון עד שנישאי tetrode נמצאים במיקום העליון שלהם ואת צינורות פוליאמיד גלויים דרך הפתח הכובע. בעזרת מספריים בסדר מיקרו לנתח, לחתוך את הצינור מתחת (1 מ"מ) הבסיס כך שכל ארבעת צינורות פוליאמיד הם מאותו האורך.
- באמצעות מיקרוסקופ לנתח, חוט tetrode אחד בזהירות דרך צינורית פוליאמיד. זה חשוב כדי לשמור על חוט tetrode ישר לגמרי כפי שהוא מקדם דרך הצינור כמו כל סטיות או עיקולים יעשו את זה קשה מאוד להשחיל tetrode באופן מלא עד הסוף. חזור על פעולה עבור שלוש tetrodes אחר.
- ברגע שכל tetrodes נמצאים בצינורות שלהם, להחיל בזהירות טיפה קטנה של cyanoacrylate לחלק העליון של צינור אחד, הבטחת tetrodes בתוך הצינורות שלהם. לקחת בזהירות שלא לקבל כל cyanoacrylate בין הספקים או על החוטים הרופפים tetrode המזדקרים מבעד לכובע.
- חותכים את tetrodes, כך שהם להאריך רק בעבר את הצינורותמ"מ 2.0 (לsubiculum או היפוקמפוס). לאחר מכן הנח את בסיס הכונן (עם ארבע סיכות החרקים הוכנסו) ללנענע VersaDrive. את החצי השני של לנענע יחזיק את כובע VersaDrive כי יש את כל חורי קיבול ליצירת חיבורי הערוץ.
- סובב את הבורג נגד כיוון השעון הכונן לחלוטין, כך שtetrodes נמצא במיקום הנמוך ביותר שלהם.
- לפני חיבור חוטי tetrode לקיבול הזהב, ראשון לחבר את חוטי הקרקע לכובע. יש כובע VersaDrive שני חורי פינים בחיבורי הארקה במיקום המרכז של שתי השורות של חורים. לחתוך חוטי נחושת של לפחות 30 מ"מ (תלוי איפה בגולגולת למקום הקרקע) ולהדריך אותו דרך אחד החורים האלה במרכז. חוטי הנחושת צריכים להיות 100-500 מיקרומטר (.004-.02 ") בקוטר, זה שווה בערך 38 חוט AWG AWG דרך 24 Push קיבול זהב דרך החור כדי לתפוס את חוטי הנחושת במקום ולחתוך כל חוט עודף.. בקצה השני של החוט נחושת, להחיל שטף וsolder סוף זה חוט לבורג קרקע (ראה 2.11.). חזור על פעולה עבור חוט הקרקע השני.
- בשלב הבא, תנחה את כל החוטים הרופפים tetrode (שלא צריך להיות בת שש עשרה בסך הכל) דרך חורי קיבול שלהם בכובע. זה הטוב ביותר להתחיל עם tetrode אחד ולהשחיל את החוטים הבודדים לארבעת החורים המתאימים שסופו של דבר בדיוק מעליו. את חוטי tetrode הבודדות צריכים להיות מטופלים עם לחץ קל כמו שהם שבירים ויכולים בקלות אם crimp אחז גם בתקיפות. התקן את הכובע על ידי הזדנבות את חורי סיכות חרקים ולחצו הולם לבסיס.
- עם חוטי tetrode בולטים באמצעות כובע, לחץ להתאים את קיבול הזהב כדי ללכוד את חוטי tetrode במקום ולבצע את חיבורי החשמל. כ -50% מהחוטים יהיו קטומים (מעל המכסה) פעם אחת קיבול הזהב הוא דחף כלפי מטה. לחתוך כל חוט עודף שנשאר בולטים מהחלק העליון של הכובע. במקרים נדירים (פחות מ -5%), דוחף את זהב הקיבול יהיה למחוץ את החוטולשבור אותו מתחת לקיבול, וכתוצאה מערוץ מנותק. ניתוק זה עשוי שלא להתממש עד לבדיקת העכבה וגלוון צעדים (ראה 4.7).
- חזור על תהליך העיתונות הראוי לשלוש tetrodes האחרים. הפעל את ברגי הכונן בכיוון השעון כדי להעביר אותם בחזרה לצמרת ולהבטיח כי תנועת הכונן חלקה.
4. זהב ציפוי של טיפים אלקטרודה
- לא משנה איזה סוג של microelectrodes בשימוש, את הטיפים של האלקטרודות צריכים להיות מצופים זהב כדי להפחית עכבת קצה. זה יהיה למקסם את היכולת להקליט באופן מהימן ולהפלות פוטנציאל פעולת יחידה אחת. בדוק את עכבת אלקטרודה באמצעות מכשיר nanoZ Neuralynx. NanoZ הוא מכשיר מבוסס מחשב המודד את העכבה ומאפשר לגלוון אוטומטי.
- ראשית להפוך את ברגי Microdrive למטה (נגד כיוון השעון) למיקום הנמוך ביותר שלהם. ואז בטוח לעלות על Microdrive מהדק שיאפשר הפחתה שלאת עצות האלקטרודה לתוך פתרון ציפוי הזהב.
- מלא אחד Delrin מגדל עם פתרון זהב SIFCO ומגדל האחר עם מים מזוקקים. מנמיכים את הטיפים אלקטרודה לפתרון הזהב.
- חבר את כבל USB nanoZ למחשב המבוסס על Windows ולאחר מכן פתח את תכנית nanoZ. תכנית זו תיתן קריאות עכבה ולבצע ציפוי זהב על כל ערוץ מחובר לMicrodrive.
- עבור להתקנים הנפתח ובחר את nanoZ, לאחר שזה יראה "חיבור הוקם" בחלק התחתון של החלון. בשלב הבא, בחר את המתאם המתאים לבדיקה בתפריט הנפתח. לחץ על "עכבות מבחן" ולהגדיר את תדירות הבדיקה ל1004 הרץ (40 מחזורים, להשהות אלפיות שני 0). לחץ על "בדיקה מבחן", שייפתח חלון "הבדיקה הדו"ח" שמציג את כל ערוצים הזמינים עימם MΩ קריאות. שמור ערכי עכבה אלה על ידי לחיצה על סמל הדיסק או על ידי בחירה "קובץ", ואז "שמור דו"ח".
- לאחר מכן, לחץ על "DC Electroplate" ולהקצותאת הערכים הבאים: מצב = התאמת עכבות, ציפוי = -1.0 μA, target = 350 kΩ ב1,004 הרץ, 5 ריצות, 5 שניות מרווח, להשהות 2 שניות נוכחית.
- לחץ על "Autoplate". התכנית ראשונה תהיה לקרוא את העכבה של כל ערוץ, ולאחר מכן להחיל הנוכחי צוין לערוץ זה, לבחון מחדש את העכבה ולהחיל נוכחי לפי הצורך עד לעכבת היעד (או ערך נמוך יותר) הוא הגיע. בעוד המטרה היא להפחית עכבת אלקטרודה, זה אפשרי, כי ערוצים יהיו electroplate להלן ערכים של 100 kΩ. במקרים כאלה, ייתכן כי חוטים שכנים על tetrode היו לקצר יחד. אם זה יקרה, להפוך את הקוטביות הנוכחית (1.0 + μA) כדי להסיר את חלקיקי זהב עודפים, מחדש לבדוק את העכבה של ערוץ זה, ולאחר מכן לחזור על הגלוון. ערכי עכבה אופייניים סופיים על חבילה של ארבעה חוטים 12.5 מיקרומטר נעים 150-325 kΩ.
- אם יש ערוץ אחד שלא מצופה להלן 350 kΩ, חזור על תהליך אלקטרוליטי.התכנית תהיה לדלג על ערוצים שכבר הגיעו ליעד ורק ערוצי צלחת שלא.
- ברגע שכל הערוצים היו מצופה לעכבה מקובלת, לסגור את תכנית nanoZ ונתקו את המכשיר. לגייס את האלקטרודות מפתרון הציפוי ולהוריד את הטיפים למגדל Delrin מים מזוקקים כדי לשטוף את חלקיקי זהב עודפים.
- הפעל את ברגי הכונן עם כיוון השעון עד שהם העלו את האלקטרודות למיקום העליון שלהם. עכשיו Microdrive ואלקטרודות מוכנים להשתלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לנו תאר קבוצה של טכניקות לבניית microdrives קל וקומפקטי להקלטה של יחידה ופעילות תאית פוטנציאל שדה בעכברים. על ידי בניית microdrives מותאם אישית עם בסיסים עצבו מזכוכית אקרילית (מתיל), ניתן להתאים את מערכת הליבה בקלות למספר כוננים ולמיקוד של מגוון רחב של אזורים עצביים. יש לנו שונה בהצלחה את המערכת להקלטה ממטרות מוח מרובות ועם מערכים גדולים יותר להקלטות בעכברים. עם שינוי נוסף, ניתן לשלב אלמנטי כונן ממונעים, כדי לאפשר למרחוק, ושעלול להיות יותר מדויק, מיקום האלקטרודה 7.
ברצוננו להדגיש כי מכשירי הקלטה אלה לתת את הגמישות חוקרת בניצול או תילי מתכת בודדות או צרורות תיל, כגון tetrodes. תילי מתכת בודדות בקוטר גדול יותר הם חזקות יותר ומתאימים יותר להקלטה של LFPs בתוך רקמת המוח. WHItetrodes le יכול לשמש גם כדי להקליט LFPs, הם מותאמים לבידודה של פעולת יחידה אחת הפוטנציאלים 8, 11. במעבדה שלנו, הקלטות יציבות של אחת יחידות התקבלו לתקופה של עד 8 שבועות לאחר השתלה. עם זאת, הקלטות אלה אינן מאותן יחידות המשוערת על זה כל הזמן. בידיים שלנו, יחידה אחת יכולה להיות אחרי על פני מספר מפגשי הקלטה (30 דקות כל אחד) שמשתרעים על פני תקופה של 3 ימים, המשקפת בין מושב יציבות 10. מצד השני, יכולים להיות מוקלטים LFPs חזק ותנודות ברשת לאורך כל התקופה שלאחר ההשתלה כולו, במיוחד עם השימוש בחוט קוטר גדול יותר כגון חוט 50 מיקרומטר (0.002 "). שים לב שהשיטות שתוארו כאן תחולנה על הקלטה חד צדדית של מבנים מוחיים, אבל הם יכולים להיות שונה בקלות להקלטות בין שתי המדינות. לדוגמה, בעת בניית microdrives מותאם אישית, המרחק המתאים בין הכוננים צריך להיקבע מראש כדי לתמוךמבנים מוחיים היעד erly ילטרלי.
כרכיבי Microdrive הפכו קלים יותר ואת התוכנה כדי לנתח אותות עצביים משתפרת, הספרייה של מטרות פוטנציאליות במוח והשערות הניתנות לבדיקה במסגרת מדעי המוח ממשיכה להתרחב. ברור כי, מאז תחילת פעילותם 1, 12, הקלטות חיות מהמוח מתנהגים ערות התקדמה ההבנה של איך נוירונים ורשתות נוירונים לקודד התנהגותית אירועים רלוונטיים 3, 4,13,14 במידה רבה. בפרט, הקלטות מוח מעכברים מהונדסים גנטי אפשרו זיהוי של מפלים מולקולריים כי הם מעורבים באופן מכריע קידוד עצבי 15-17. חשוב מכך, את הטכניקה יש רק לאחרונה הוחל על נושאים קליניים אוריינטציה 17, 18.
התקדמות בייצור של tetrodes והזמינות המוגבר של פתרונות מתוצרת תהיה עוד יותר להקל על התנועה זו technologY לטיפול במחלות ומכאובים 19, 20 בני אדם. ובעוד החדירה של אלקטרודות לתוך רקמת המוח היא פולשני בטבע, הקלטות אלה מציעים מידע רב ערך מתא עצב בודדים שלא ניתן להשיג עם טכנולוגיות כגון הדמיה תפקודית. לפיכך, בשני מודלים של בעלי חיים ובני אדם, הקלטות מתנהגות ערות באמצעות microdrives ניד ימשיכו לספק מידע חיוני על הרכבים עצביים, קידוד העצבי, סגולית טופוגרפי, ותנודות ברשת בתוך המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים דניאל קארפי לעזרה והתרומות מוקדמות לפרויקט הזה שלו. אנו מודים גם לוקרסיה Novoa על סיועה ביצירות אמנות ותמונות. עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIAID תכנית מענק 5P01AI073693-03.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.0005" (12.5 μM) diameter Platinum-Iridium wire | California Fine Wire | CFW#100-167 | HML VG insulated www.calfinewire.com |
| 0.002" (50 μM) diameter Stableohm 675 wire | California Fine Wire | CFW# 100-188 | HML insulated Ni-Cr |
| polyamide tubing | Polymicro Technologies | 1068150020 | 99 micron I.D., 166 micron O.D. www.polymicro.com |
| brass guides | World Plastics Inc | 3.3 x 6.6 mm | |
| Delrin blocks | World Plastics Inc | 3.13 x 2.5 mm | |
| Fillister head brass screws | J.I. Morris Co. | 00-90 x 1/2 | drive screw www.jimorrisco.com |
| hex brass nuts | J.I. Morris Co. | 00-90 | |
| Fillister head brass screws | J.I. Morris Co. | 000-120 x 3/32 | EIB mount and ground screw |
| plexiglass acrylic | Canal Street Plastics | 5 mm thick, clear, www.cpcnyc.com | |
| cyanoacrylate | Krazy Glue | 2 g tube | |
| electronic interface board | Neuralynx | EIB-18 | www.neuralynx.com |
| non-cyanide gold solution | SIFCO | SIFCO 5355 | www.sifcoasc.com |
| VersaDrive 4 | Neuralynx | four tetrode model | |
| tetrode assembly station | Neuralynx | ||
| motorized tetrode spinner | Neuralynx | tetrode spinner 2.0 | |
| VersaDrive jig | Neuralynx | ||
| soldering iron | Radio Shack | 64-2802B | www.radioshack.com |
| nanoZ | Neuralynx | ||
| small bit drill/driver | Ram Products | Rampower 35 | with footpedal controller, www.ramprodinc.com |
| drill bits | Small Parts, Inc. | 3/32" bits, www.smallpartsinc.com | |
| dissecting microscope | Olympus | SZ-60 | www.olympusamerica.com |
| heat gun | Alphawire | Fit gun 3 | use setting "1" only, www.alphawire.com |
| 26 AWG copper wire | Arcor Electronics | F26 | for ground wires, www.arcorelectronics.com |
| soldering flux | Eagle | 2 oz, #205 | |
| 0.02" diameter solder | Kester | 24-6337-0010 | www.kester.com |
| benchtop vise | Vacu-Vise | Model 300 | |
| fiber optic light | Nikon | MKII | dual light arms, www.nikon.com |
| 5-min epoxy | Allied Electronics | 25 ml, www.alliedelec.com | |
| fine tweezers | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-4907, RS-5010 | INOX material, www.roboz.com |
| micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5880 | |
Table 1. Materials and reagents used for constructing tetrodes and microdrives. |
|||
References
- Recce, M. L., O'Keefe, J. The tetrode: a new technique for multi-unit extracellular recording. Soc. Neurosci. Abstr. 15, 1250 (1989).
- O'Keefe, J., Recce, M. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3, 317-330 (1993).
- Chen, G., Wang, L. P., Tsien, J. Z. Neural population-level memory traces in the mouse hippocampus. PLoS ONE. 4 (12), e8256 (2009).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents -- EEG, ECoG, LFP, and spikes. Nat. Rev. Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Tort, A. B., Kramer, M. A., et al. Dynamic cross-frequency coupling of local field potential oscillations in rat striatum and hippocampus during performance of a T-maze task. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105 (51), 20517-20522 (2008).
- Seidenbecher, T., Laxmi, R., et al. Amygdalar and hippocampal theta rhythm synchronization during fear memory retrieval. Science. 301 (5634), 846-850 (2003).
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).
- Harris, K. D., Henze, D. A., et al. Accuracy of tetrode spike separation as determined by simultaneous intracellular and extracellular measurements. J. Neurophysiol. 84 (1), 401-414 (2000).
- Henze, D. A., Borhegyi, Z., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84 (1), 390-400 (2000).
- Chang, E. H., Huerta, P. T. Neurophysiological correlates of object recognition in the dorsal subiculum. Front. Behav. Neurosci. 6, 46 (2012).
- Gray, C. M., Maldonado, P. E., et al. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. J. Neurosci. Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).
- O'Keefe, J., Dostrovsky, J. The hippocampus as a spatial map. Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat. Brain Res. 34 (1), 171-175 (1971).
- Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
- Buzsáki, G. Rhythms of the Brain. , Oxford University Press. Oxford, U.K. (2006).
- McHugh, T. J., Blum, K. I., et al. Impaired hippocampal representation of space in CA1-specific NMDAR1 knockout mice. Cell. 87 (7), 1339-1349 (1996).
- Resnik, E., McFarland, J. M., et al. The effects of GluA1 deletion on the hippocampal population code for position. J. Neurosci. 32 (26), 8952-8968 (2012).
- Cacucci, F., Yi, M., et al. Place cell firing correlates with memory deficits and amyloid plaque burden in Tg2576 Alzheimer mouse model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (22), 7863-7868 (2008).
- Sigurdsson, T., Stark, K. L., et al. Impaired hippocampal-prefrontal synchrony in a genetic mouse model of schizophrenia. Nature. 464 (7289), 763-767 (2010).
- Engel, A. K., Moll, C. K., et al. Invasive recordings from the human brain: clinical insights and beyond. Nat. Rev. Neurosci. 6 (1), 35-47 (2005).
- Cash, S. S., Halgren, E., et al. The human K-complex represents an isolated cortical down-state. Science. 324 (5930), 1084-1087 (2009).
