Summary
前庭有毛細胞機能の解析は頭蓋骨の最も困難な部分の奥深くの位置、側頭骨錐体によって複雑になる。最も機能有毛細胞研究は、急性単離された有毛細胞を使用している。ここでは、電気生理学的および二光子顕微鏡研究のためのマウス前庭上皮の半無傷の準備について説明します。
Abstract
理解前庭有毛細胞は、正常な条件の下で機能する、またはどのように外傷、疾患、およびこの機能を混乱させる老化、予防的アプローチ、および/または新たな治療戦略の開発に重要なステップです。しかし、異常な前庭機能を見て研究の大半は、細胞レベルではなかったが、このような歩行分析と前庭動眼反射性能として前庭機能障害の行動アッセイに主に焦点を当てた。この作品は物事がうまくいかないときに何が起こるかについての貴重なデータが得られているが、少し情報が障害の根本的な原因に関して収集されます。前庭機能の基礎となる細胞および細胞内のプロセスに焦点を当てている研究のうち、ほとんどは彼らのシナプス接続と支持細胞環境を欠い急性単離し有毛細胞、に頼ってきた。したがって、主要な技術的課題は、準備中で絶妙に敏感前庭有毛細胞にアクセスしている少なくとも生理的に、中断されaration。ここでは、有毛細胞/一次求心錯体を含む地元の微小環境を保持マウス前庭感覚上皮の半無傷の準備を示しています。
Introduction
私たちの日常生活への前庭系の重要な貢献にもかかわらず、加齢に伴う前庭機能の観察された減少の責任のプロセスを明確に理解することは、とらえどころのないまま。知識の欠如のための一つの理由は、その前庭機能の低下がほぼ独占的に前庭動眼反射（VOR）、外因性前庭機能の正確な指標を含む行動のアッセイを使用して検討されているですが、本質的な構成要素の変更に限定された洞察力を提供しています。これは、健康、病気、あるいは老化に前庭有毛細胞機能の理解への大きな障害である。
個々の前庭有毛細胞の多くの研究が行われてきたが、主要な欠点は、有毛細胞、さらには萼求心端子は、機械的および/または酵素的処理により、通常の環境から除去される急性有毛細胞調製物、に依存している。このようなアプローチinevitaブライ有毛細胞や萼、及び有毛細胞と支持細胞との間の微妙なマイクロアーキテクチャを混乱させる。半無傷の準備1-5、及び孤立マウス迷路の準備6の発展に伴い、より密接に、生体内でそれらの似ている条件の下でシナプスのコミュニケーションの様々な形態を勉強する機会が用意されました。実際、林ら （2011）I前庭有毛細胞は神経上皮内に埋め込 まれて残ったものに比べて急性孤立型から記録された全細胞電流の著しい差が認められた。具体的には、カリウム有毛細胞と求心萼間の間隙内に蓄積すると考えられ、著しく有毛細胞応答7を変化させる。この種の情報は、ここで説明した前庭感覚上皮の半無傷準備なし得ることは不可能であろう。我々はマウス稜3の半無傷準備を実証および全細胞パッチ電気生理学から得られた代表的な結果、2光子カルシウムイメージングを示す。
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Protocol
1。動物
- マウスは、オーストラリアの齧歯類センター（ARC、パース、オーストラリア）から入手し、環境エンリッチメントとノーマルの12時間の明/暗サイクルでシドニーボッシュ動物施設の大学で開催された。記載されたすべての実験は、シドニーの動物倫理委員会の大学によって承認された。
- この菌株は一般に遺伝子操作の背景として使用され、 野生型 8-9と同等とみなすことができるので、雄と雌のマウス（C57/BL6）は、すべての実験に使用した。
2。組織標本
- 26のNaHCO 3、11グルコース、250グリセロール、2.5のKCl、1.2のNaH 2 PO 4、1.2のMgCl 2、及び2.5のCaCl 2から成るグリセロールベースの人工脳脊髄液（ACSF）（単位：mm）300mlのを準備します。 CaCl 2を添加する前に、ガスカーボゲン（95％O 2および5％CO 2）を含む溶液は、APを確立する7.4のHとカルシウム沈殿（曇り）を回避。氷スラリーが形成されるように、45分間-80℃の冷凍庫内の溶液を凍結。
- 深く腹腔内注射を介して、ケタミン（100 mg / kg）を（パーネル、アレクサンドリア、オーストラリア）をマウスにanaesthetize。
- 一度後肢ピンチ反射が鋭いステンレス製のハサミを使用して不在首マウスであり、頭蓋骨を露出するためにカミソリの刃を（＃22を四捨五入）を使用して、矢状皮膚切開を行います。この時点で、2.3から2.8までと手順を通して頭蓋、脳、および基礎となる前庭装置は、組織上の氷冷ACSFの定期的なアプリケーションで、できるだけクールに保つ必要があります。
- 標準パターンのはさみの尖った腕（FST、ノースバンクーバー、カナダ）を使用するとラムダで頭蓋骨に小さな切開をし、矢状縫合に沿ってカット。脳は、このステップの間にせん断刃で "ドラッグ"されていないことを確認してください。
- 慎重に横方向に離れて頭頂骨と後頭骨posterioピールRLY浅い屈曲ピアソン骨鉗子（FST）を用いて。
- 小さなステンレス鋼へらがゆっくり真ん中と後頭蓋窩の表面から脳を持ち上げるために使用され、公開されるvestibulocochlea神経（CNVIII）内耳と細かい虹彩はさみのペアで脳幹の中間をカット。この神経を切断すると、有毛細胞を使用して、プライマリ求心性とその接続の軸索上の過度の緊張を最小限に抑えることができます。
- CN VIIIの離断の後脳トトで除去される。
- 前庭迷路蝸牛は前内側方向に指して、今では中頭蓋窩にはっきりと見える。そっと前方半規管を把持し、横方向に引っ張って切除する前に前庭迷路の両側に骨鉗子。
- 2.1節で説明した氷のように冷たい、連続毒ガスACSFを含む解剖皿に切除迷路（ 図1）を浸します。実体顕微鏡下に迷路を保持蝸牛を把持によって料理のベース。前半規管の膨大部を覆う骨で離れてスクラッチする細かい鉗子を使用してください。骨に小さな穴が達成されたら離れて膨大部から骨をフリックし始める。注意これは、基礎となる膜迷路と感覚上皮への損傷を引き起こす可能性がありますように骨を通して鉗子をプッシュしないように注意してください。前方および隣接水平半円膜ダクトと膨大部の両方が（ 図2）が露出されるまでこの手順を続けます。
図1。隔離されたマウス前庭迷路。A.左パネル）孤立マウス前庭迷路の概略図。前庭感覚上皮にアクセスするための基準の重要なポイントは、蝸牛、前方、および水平半規管は、ラボであるELED。アスタリスクは、前庭感覚上皮を含む半規管の膨大部を示している。B.右パネル）1ヶ月齢のマウスから単離された前庭迷路の顕微鏡写真。
図2。膜性前庭迷路の露出。前方と水平半規管の膨大部を覆う骨はブラック/ブラウンの斑点の膜膨大部と関連する膨大部神経（CNVIII）を明らかにするために離れて傷れています。下のパネルの回路図は、顕微鏡写真のハイライト領域内の構造を表しており、膨大部とCNVIIIに半規管ダクトの関係を示しています。
- 細かい鉗子を使用して、静かに確実に、骨迷路から離れて膨大部および関連卵形嚢を持ち上げその膨大部の中心領域（コンタ）感覚上皮をiningが破損していない。いくつかのケースでは半円形膜管の近位部は、骨から膨大部を解放するためにアイリスハサミでカットする必要があるかもしれません。
- リーボビッツのL-15培地（Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO）で満たされたペトリ皿に2膨大部と卵形嚢を含むトライアドを転送します。 "バックライト"組織への光ファイバを使用してください。これは、膨大部内感覚上皮を含む稜の明確な可視化を可能にします。
- 注意深く細かいアイリスはさみで卵形嚢の斑点 "屋根"で切開を行います。前方の屋根、その後水平膨大部を通じて、この切開を続ける。それ（ 図3A）に接触することなく、できるだけ感覚上皮の端の近くに切開を加えます。感覚上皮（ 図3B）を覆う膜のない部分が存在しないことを確認してください
- 小さなGLASに孤立半無傷準備を転送L-15メディアでいっぱいの底記録室。平坦化されたU字状の白金線（ 図3B）に固定された微細なナイロン繊維のグリッドを使用して調製を圧迫。理想的には、グリッドの繊維は感覚上皮を覆うべきではありません、しかし、より多くの安定性が必要とされるいくつかのケースでは、多分好ま感覚上皮を横断する単繊維。
図3。半無傷準備と電極構成の前庭感覚上皮。A.回路図表現の孤立半無傷準備 。稜を覆う膨大部は、感覚上皮（緑）の表面を露出するために"デ屋根"となっています。B.前方を示す半無傷'トライアド'準備の顕微鏡写真（AC）と水平（HC）稜（卵形嚢こと隠さ後肢AC）。記録室のベースに準備を保護するために使用されるナイロン繊維に注意してください。スケールバー：100μmのC.個々の前庭有毛細胞上に位置する記録電極。スケールバー：15μmで。
3。電気生理学
- 継続的に酸素L-15培地で半無傷準備を灌流。メディアは録音を通してモニターされるべきである培地のpH指示薬（フェノールレッド）と色が含まれています。酸素とpHは7.3から7.4であると赤の色に対応する必要があります。
- 達成するために、マイクロピペットプラー（ナリシゲ、日本、モデルPP-830）上：;：ツーステップ·プロトコル（50および熱ステップ2 72ヒートステップ1）を用いて1.5ミリメートル（1.19ミリメートルのID）ホウケイ酸ガラスからの記録ピペットを準備3-4MΩの最後のインピーダンス。
- 含まれているカリウムフッ化物系内部溶液（単位：mm）110 KF、12のKCl、27 KOH、1のNaCl、10 HEPES、10 EGTA、1.8のMgCl 2、3-4 mmにピペットのシャンクを埋める3 D-グルコース、および2のNa-ATP; KOHでpH 7.4。
- ピペット2-3回のシャンクをラップし、限りダウン電極を絶縁し、ピペット容量を低減するためにパラフィルムの薄いストリップできるだけ先端まで。
- 正立顕微鏡（オリンパスBX51）で低消費電力の倍率（5倍）の下で感覚上皮の上にピペットを置きます。ハイパワー（40X）に切り替えて、付属のCCDカメラで、個々の前庭有毛細胞を可視化する。
- マニピュレーター（サッター·インスツルメンツ、カリフォルニア、USA）を用いて可視化有毛細胞（ 図3C）の膜上の位置ピペット。ギガオームシールが達成されると、破断ピペットホルダに吸引口を介して印加される負圧少量の細胞膜。
- 標準的な技術を8-9を用いて全細胞電圧クランプ記録を行います。
4。二光子顕微鏡
- 5mMのオレゴングリーンを含む0.9％生理食塩水を準備488 BAPTA-1（OGB-1;六カリウム塩、Invitrogen社、ドイツ）。
- 感覚上皮が上から障害物がないことを保証する;まだ水没しながら、ろ紙の小片（ミリポア、ドイツ4X4ミリ、厚0.8μm）の上に "デ屋根の"半無傷トライアドの準備を配置。
- パルス発生器と広帯域増幅器の組み合わせからなるエレクトロの生理食塩水覆われ、ベース白金電極（7μl）を上にろ紙および準備を転送し、合成カルシウムの5 mMの溶液をさらに5μlのカバーインジケータ染料オレゴングリーン488 BAPTA-1（ 図4）。
図4。バルクエレクトロ。A.エレクトロポレーション構成の断面を模式的に示す。半無傷の調製は、（*）カルシウムdyの中に浸漬濾紙上に配置される電子（オレゴングリーン488 BAPTA-1）と電流が2白金電極間に印加する。 Briggmanとオイラー、2011年10から適応。
- オレゴングリーン488 BAPTA-1溶液が行われるとの接触時の準備の向きを妨害しないように注意して、約2mmの距離でベース電極と上部白金電極を平行に持参。
- 10-11;準備（+13 V、10ミリ秒のパルス幅は、1 Hzの周波数、10方形波パルス電流のパラメータ）を越え短い電流パルスを渡します。
- L-15培地で満たしたガラス底の記録室の底に、再び感覚上皮は上から障害物がないことを確実に、その上にシリコンオイルと位置の小軽く半無傷準備を配置。 （ポイント2.13を参照）上記のように画像全体の安定性を確保するために、準備上のナイロングリッドを交換してください。
- 自発の光学録音を行う二光子顕微鏡を用いて標準撮像プロトコール10-11を使って感覚上皮（ 図7）でジニアスカルシウム活動。
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Representative Results
前庭有毛細胞の電気生理学的特性は、それらが07埋め込 まれている内に複雑なマイクロアーキテクチャに依存している。 図半無傷の前庭上皮製剤は、タイプI有毛細胞（ 図5A）、タイプIIの有毛細胞を区別するために使用することができることを図5 （ 図5B）、そして特徴的な全細胞コンダクタンスに基づい萼一次求心（ 図5C）。これらの特性は、脱分極とI型有毛細胞、および（ 図5Cの矢印）萼一次求心で活動電位を表す過渡内向きナトリウム電流の存在下で大規模な"崩壊"のテール電流の間に顕著な"たるみ"が含まれています。
製剤は、個々の前庭有毛細胞型に老化の影響を定量化するために使用することができる。 図6は、コンダクタンス（Fを比較若者と高齢マウスで負静止電位からの脱分極をステップ応答におけるII型前庭有毛細胞のigure 6A）と不活化特性（ 図6B）。タイプIIの有毛細胞の場合は - 少なくとも敏感サブタイプ有意差は（説明を参照してください）のどちらかのパラメータでは観察されなかった。
全細胞特性の分析に加えて、半無傷の製剤はまた、毛髪細胞機能の根底にある細胞内の機構の大規模解析に向いている。 図7は、タイプI、有毛細胞および一次萼にカルシウムの差動局在を示す求心性、ならびにこれらの細胞内のカルシウムのサブ携帯組織図7Aは、100mMのKClを添加する個々のI型有毛細胞内カルシウム蛍光の変化を示している。この変化の時間経過を図7Bにプロットされている。重要なのは、preparat隔離された有毛細胞および単一細胞電気生理学を使用不可能な機能-イオンは、同時に複数のセルに、と"正常に近い"環境（ 図7C）で、細胞内の解像度で有毛細胞活動の調査を可能にします。
図5。全細胞電流はマウス前庭感覚上皮における有毛細胞から記録。A.全細胞電流が大きい"崩壊"テール電流（矢印）によって特徴付けI型前庭有毛細胞から記録された。B.全細胞電流は前庭II型から記録有毛細胞。テール電流が存在しないことに注意してください。萼一次求心からC.全細胞記録が負の静止電位（-120 mVの）からの過渡ナトリウム媒介電流（矢印）は、以下の脱分極によって特徴付けられる。すべてのセルのwEREは-60 mVで開催された。
図6。若者と高齢マウスからII型有毛細胞における感度と不活化の比較増加脱分極時間に応じて、若い（1ヶ月）と高齢（9月）したマウスから記録されたII型の有毛細胞のために。A. I / Vの関係。B. 100ミリ秒のI / V曲線に基づいて、老いも若きも、マウスにおけるII型有毛細胞の平均コンダクタンスと不活化比率。
図7。半無傷マウス前庭感覚上皮の準備の二光子カルシウムイメージング。A.左上パネル）通常のL-15灌流液に反応してBAPTA-1オレゴングリーンカルシウム活性化を示す二光子顕微鏡写真（上）またはL-15は、100 mMの塩化カリウム（下）を含む。矢印はKClを添加する前と後の個々の有毛細胞を示す。B.右上のパネル）。Cで強調表示されているセルのカルシウム蛍光プロフィール下のパネル）は 、個々の有毛細胞のローディングオレゴングリーン488 BAPTA-1を示す感覚上皮の二光子顕微鏡ボトムパネル挿入図：タイプIの毛の細胞の細胞質（矢印）またはタイプを取り囲む萼一次求心へのカルシウムの細胞内局在私は、有毛細胞（二重矢印）。
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Discussion
バランス感覚のメカニズムは、視覚と聴覚のシステムを、たとえば 、他の感覚系と比較して限定され注目を集めている。前庭やバランス機能の変化を調べた研究のうち、ほとんどはバランス前庭有毛細胞自体の基本的なビルディングブロックの不完全な知識で、前庭動眼反射を含む行動の対策に焦点を当てている。彼らのネイティブ環境から削除急性孤立有毛細胞を用いたので、有毛細胞に集中しているこれらの研究は、ほとんど常に行っている。この記事では、これらの基礎研究を発展させ、マウス前庭感覚上皮の半無傷の準備を示しています。
前庭有毛細胞は比較的堅牢ですが、半無傷準備のユーティリティは切除の速度に決定的に依存しています。一般的に、準備はカンガルーで実行可能なままになります切除後約2-5時間の期間のためのM温度。したがって、動物が記録に安楽死されたときからの時間を最小限に抑えることが重要です。切除は、3週齢のマウス（5-7分合計）のために、比較的簡単かつ迅速であるが、高齢動物（最大9ヶ月齢のマウスでは25分まで）に徐々に、より困難になることができます。これらの古い動物では、解剖の温度が重要な決定要因である - 準備は継続的に氷のように冷たい酸素ACSF正常異化プロセスを浴びていることを確実にすることによって阻害される。
リーボビッツの培地、L-15、そして全細胞電圧クランプ記録KF内部液12で満たされたガラス微小電極を用いて行ったが、酸素とセクション3.1で説明されるよう準備が絶えず灌流した。外部および内部環境の組み合わせは、他のカリウムベースの内部および/またはリンゲルよりも安定かつ長期持続時間の記録を提供することが示されているベース外ソリューション13-14。この安定性はそれぞれパッチクランプと二光子技術を使用して、有毛細胞の電気生理学的特性とカルシウム動態を研究するために必要な長期のプロトコルのために極めて重要である。
半無傷の調製の基本的な目的は、極力乱される前庭有毛細胞の研究のためのモデルを提供することである。準備が急性孤立有毛細胞上の明確な利点を提供しながら-たとえば、全細胞電流のフルダイナミクスのみ半無傷準備3、7を使用して明らかにされている-混乱を回避することはできません。まず、自発的な聴覚細胞シグナル伝達に膨大部の "屋根"（おそらく添付頂）を除去するの影響を評価することは困難である。正常な生理的条件下では、有毛細胞は頂/毛束複合体の曲げに対応する。この複雑なことなく、その自発的な毛CEL考えられるlのシグナリングは、 生体内条件での代表ではありません。半無傷準備中第二に、電気生理学的記録は主にシミュレートされた天然の活動に自発的な活動や応答の測定（有毛細胞や毛束の曲げ機械的にすなわち直流電流注入）に制限されています。したがって、現実の活性化（ すなわち頭の動き）に応じて、基礎となる有毛細胞の特性を研究することはできません。それにもかかわらず、半無傷の準備は、私たちは、有毛細胞の機能を理解するための新しいツールを表し、今後の研究のための道の数が表示されます。
半無傷の製剤は急性単離された聴覚細胞調製物の上に提供することが一つの大きな利点は、複数の有毛細胞および/またはそれらに関連する一次求心性神経からの同時録画を可能にすることである。デュアルまたはマルチ細胞パッチクランプ記録技術を使用してこの機能を評価するための手段を提供する直接有毛細胞/一次求心シグナリング、伝統的な孤立した準備を達成することができない何か。また、二光子顕微鏡を用いて、半無傷の製剤は、感覚上皮の完全な範囲を越えたサブ細胞機能の同時測定を可能にする。これは、カルシウムシグナル伝達と細胞の代謝が急速に、コンテキストに貯めることができますに関するその情報を意味します。最後に、マウスを使用すると、ターゲット遺伝子操作が可能に（型のマーカーとしてカルレチニン式にタグ付けされた例えば緑色蛍光タンパク質I有毛細胞と萼主求心）。半無傷準備は差動で有毛細胞および一次求心性神経の活動を研究し、同時にする方法を提供する。これだけで、前庭有毛細胞および一次求心性、情報が頭と体の位置に関する脳に伝達されるようにエンコード後に検出しにどのように相互作用するかについての新たな情報を豊富に提供するでしょう。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この仕事のための資金は、R.リムとAJキャンプにガーネットパッシーとロドニーウィリアムズ記念財団プロジェクトの助成金によって提供されていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Leibovitz medium L-15 | Sigma Aldrich | L4386-10X1L | |
| BAPTA-1-oregon green | Invitrogen | O6806 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Two-photon microscope | Olympus/La Vision | BX51WI/ TriMScope II | |
| Dumont #5 SF Forceps | FST | 11252-00 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Standard Pattern Scissors | FST | 14001-12 | |
| InstraTECH A-D converter | HEKA | ITC-18 | |
| Sutter Micromanipulator | Sutter | MP-225/M | |
| multiclamp amplifier | Axon Instruments | 700B | |
| Data acquisition software (electrophysiology) | Axograph | N/A | |
| Imspector Data acquisition software (two-photon) | Max Planck innovation | N/A | |
References
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