Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En isolert Semi-intakt Utarbeidelse av Mouse Vestibular Sensorisk Epitel for Electrophysiology og høy oppløsning To-foton mikroskopi

doi: 10.3791/50471 Published: June 13, 2013

Summary

Analyse av vestibulære hår celle funksjon er komplisert av deres plassering dypt i den vanskeligste delen av skallen, den petrous timelige bein. De fleste funksjonelle hår celle studier har brukt akutt isolerte hårcellene. Her beskriver vi en semi-intakt utarbeidelse av mus vestibular epitel for elektrofysiologiske og to-foton mikroskopi studier.

Abstract

Forstå vestibulære hårcellene fungere under normale forhold, eller hvordan traumer, sykdom og aldring forstyrre denne funksjonen er et viktig steg i utviklingen av forebyggende tilnærminger og / eller nye terapeutiske strategier. Imidlertid har de fleste studier som ser på unormal vestibularfunksjonen ikke vært på cellenivå, men fokusert primært på atferdsmessige analyser av øredysfunksjon som ganglag analyser og vestibulo-okulær refleks ytelse. Mens dette arbeidet har gitt verdifulle data om hva som skjer når ting går galt, er lite informasjon hentet om de underliggende årsakene til dysfunksjon. Av de studier som fokuserer på cellulære og subcellular prosessene som ligger bak vestibularfunksjonen, har mest stolt på akutt isolert hårceller, blottet for sine synaptiske forbindelser og støtte celle miljø. Derfor har en stor teknisk utfordring vært tilgang til de utsøkt sensitive vestibulære hårcellene i en preparation som er minst forstyrret, fysiologisk. Her kan vi demonstrere en semi-intakt utarbeidelse av musen vestibular sensorisk epitel som beholder den lokale mikro-miljøet, inkludert hårcelle / primære afferente komplekser.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Til tross for betydelig bidrag til det vestibulære system til vår hverdag, en klar forståelse av prosessene som er ansvarlige for den observerte nedgangen i vestibularfunksjonen med alderen forblir unnvikende. En årsak til denne mangelen på kunnskap er at nedgangen i vestibularfunksjonen har nesten utelukkende blitt utforsket ved hjelp av atferdsmessige analyser, inkludert vestibulo-okulær refleks (VOR), en presis indikator på ytre vestibularfunksjonen, men gir begrenset innsikt i endringene av iboende komponenter . Dette er et stort hinder for vår forståelse av vestibulære hår celle funksjon i helse, sykdom eller aldring.

Mens det har vært mange studier av individuelle vestibulære hårcellene, har en stor brist vært avhengigheten av akutte hår celle preparater, hvor hårcellene og selv beger afferente terminaler er fjernet fra deres normale miljø via mekanisk og / eller enzymatisk behandling. Slike tilnærminger inevitaBly forstyrre den delikate mikroarkitektur mellom hårcelle og beger, og hår celle og støtte celle. Med utviklingen av halvt-intakte preparater 1-5, og en isolert mus labyrint fremstilling 6, er det nå en mulighet for å studere de forskjellige former av synaptiske kommunikasjon under betingelser som likner mer på de in vivo. Faktisk viste Lim et al. (2011) markerte forskjeller i hele cellen strømmer opp fra akutt isolert type I vestibulære hårcellene sammenlignet med de som forble innebygd i neuroepithelium. Nærmere bestemt er kalium tenkt å akkumulere i det intercellulære rom, mellom hårcelle og beger afferent, og vesentlig endre hårcelle respons 7.. Denne type informasjon vil være umulig å oppnå uten at det semi-intakt fremstilling av den vestibulære sensorisk epitel beskrevet her. Vi viser den halvt intakt utarbeidelse av musen crista 3, Og viser representative resultatene fra hel-celle patch elektrofysiologi, og to-foton kalsium bildebehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En. Dyr

  1. Mus ble hentet fra den australske gnager Centre (ARC, Perth, Australia) og holdt ved University of Sydney Bosch Dyreavdelingen på en normal 12-timers lys / mørke-syklusen med miljøberikelse. Alle eksperimentene som er beskrevet ble godkjent av The University of Sydney Animal Ethics Committee.
  2. Mannlige og kvinnelige mus (C57/Bl6) ble brukt for alle eksperimenter siden denne belastningen blir ofte brukt som bakgrunn for genetisk manipulasjon, og kan betraktes som tilsvarer hvete 8-9.

2. Tissue Forberedelse

  1. Forbered 300 ml av en glycerol-basert kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) bestående av (i mM): 26 3 NaHCO, 11 glukose, 250 glyserol, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 4 PO, 1,2 MgCl2, og 2,5 CaCl 2. Før tilsetningen av CaCl 2, gass-løsningen med carbogen (95% O 2 og 5% CO2) for å etablere apH på 7,4 og unngå kalsium nedbør (uklarhet). Fryse løsningen i en -80 ° C fryser i 45 minutter, slik at en is oppslemming dannes.
  2. Dypt anaesthetize mus med ketamin (100 mg / kg) (Parnell, Alexandria, Australia) via en intra-peritoneal injeksjon.
  3. Når hind-lem klype reflekser er fraværende halshogge mus ved hjelp av skarpe rustfritt stål saks og gjøre en sagittal snitt i huden ved hjelp av et barberblad (avrundet nr. 22) for å avsløre skallen. På dette punktet og hele trinn 02.03 til 02.08 den kraniale hvelvet, hjerne, og underliggende vestibular apparater bør holdes så kjølig som mulig ved regelmessig bruk av iskald ACSF over vev.
  4. Ved hjelp av den spisse arm av standard mønster saks (FST, North Vancouver, Canada) gjør et lite snitt i skallen på Lambda og kutt langs sagittal suture. Sørg for at hjernen ikke er "dratt" av skjærebladkonstruksjonen under dette trinnet.
  5. Trekk forsiktig parietal bein unna lateralt og nakkeknøl posteriorly hjelp grunt bend pearson rongeurs (FST).
  6. En liten spatel av rustfritt stål brukes deretter forsiktig den hjerne fra overflaten av den midtre og bakre kranial fossae, og den eksponerte vestibulocochlea nerve (CNVIII) kuttet midt mellom det indre øret, og hjernestammen med et par av fine iris saks. Cutting dette nerve reduserer unormal belastning på axons av de primære afferente og deres forbindelser med hårceller.
  7. Etter transection av CN VIII hjernen fjernes i toto.
  8. Vestibular labyrinten er nå godt synlig i midten kraniale fossa, med cochlea peker anteromedially. Rongeur hver side av vestibular labyrinten før forsiktig excising ved å ta tak fremre halvsirkelformet kanalen og trekke sideveis.
  9. Fordype skåret labyrinter (figur 1) i en dissekere fatet inneholder iskald, kontinuerlig gasset ACSF beskrevet i kapittel 2.1. Under et stereomikroskop, holder labyrinten tilbunnen av fatet ved å ta tak i sneglehuset. Bruk fin pinsett til å skrape bort på benet overliggende fremre halvsirkelformet kanalen ampulla. Når et lite hull i beinet oppnås begynne å flikke beinet vekk fra ampulla. Forsiktighet bør utvises for ikke å presse tang gjennom benet da dette kan forårsake skade på underliggende membran labyrinten og sensorisk epitel. Fortsett med dette inntil både fremre og tilstøtende horisontale halvsirkelformet membran kanaler og ampullae er utsatt (figur 2).

Figur 1
Figur 1. Den isolerte mus vestibular labyrinten. A. Venstre panel) Skjematisk fremstilling av det isolerte mus vestibular labyrinten. Viktige referansepunkter for tilgang til vestibular sensorisk epitel, cochlea, anterior, og horisontale halvsirkelformet kanalene er labeLED. Stjernene indikerer halvsirkelformet kanalen ampulla inneholder vestibulære sensoriske epitelet. B. Høyre panel) Mikrofotografi av den isolerte vestibular labyrint fra en en-måneder gamle mus.

Figur 2
Figur 2. Eksponering av Membranous vestibular labyrinten. Benet overliggende fremre og horisontale halvsirkelformet kanalen ampullae har blitt skrapet bort for å avsløre svart / brun-flekkete membranøs ampullae og tilhørende ampullary nerver (CNVIII). Skjematisk i det nedre panelet representerer strukturene i den markerte regionen på mikrofotografiet og viser forholdet mellom den halvsirkelformede kanalen kanalene til ampullae og CNVIII.

  1. Ved hjelp av fine tang, forsiktig løft ampullae og tilhørende utricle bort fra den benete labyrinten, slik at den sentrale regionen av ampullae (Containing sensorisk epitel) ikke er skadet. I noen tilfeller den proksimale del av den halvsirkelformede membran duct kan trenge å bli kuttet med iris saks for å frigjøre ampullae fra benet.
  2. Overfør triaden inneholder to ampullae og utricle inn i en petriskål fylt med Leibovitz L-15 kultur medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri). Bruk en fiberoptisk til "bakgrunnslys" vevet. Dette gjør klar visualisering av crista inneholder sensorisk epitel i ampullae.
  3. Nøye lage et snitt i den flekkete "taket" av utricle med de fine iris saks. Fortsett dette snittet gjennom taket av fremre og deretter den horisontale ampullae. Gjør snittet så nær kanten av sensorisk epitel som mulig uten å kontakte den (figur 3A). Pass på at det ikke er noen biter av membran overliggende den sensoriske epitelet (Figur 3B).
  4. Overfør den isolerte semi intakt forberedelse til en liten GLAss-bunn opptak kammer fylt med L-15 media. Tynge fremstillingen ved hjelp av et nett av fine nylonfibre festet til en flat U-formet platinatråd (figur 3B). Ideelt sett bør fibrene i rutenettet ikke ligge over den sensoriske epitelet, men i noen tilfeller hvor mer stabilitet er nødvendig, en enkelt fiber transecting den sensoriske epitelet kanskje foretrukket.

Figur 3
Figur 3. Den isolerte semi-intakt forberedelse av vestibulære sensoriske epitelet. A. Skjematisk fremstilling av semi-intakt forberedelse og elektrode konfigurasjon. Ampulla overliggende crista har vært "de-tak" for å eksponere overflaten av den sensoriske epitel (grønn). B. fotomikrografi over den semi-intakt 'triade' fremstilling som viser den fremre (ac) og de ​​horisontale (HC) crista (utricle skjult behind ac). Legg merke til den nylonfiber brukt for å sikre fremstillingen til bunnen av opptaket kammeret. Scale bar:. 100 mikrometer C. Et opptak elektrode plassert på en individuell vestibulære hår celle. Scale bar: 15 mikrometer.

3. Elektrofysiologi

  1. Perfuse den semi-intakt forberedelse med kontinuerlig oksygenrikt L-15 medium. Mediene inneholder en pH-indikator (fenol rød) og fargen på mediet bør overvåkes gjennom opptakene. PH-verdien med oksygen bør være 7,3-7,4, og tilsvarer en rød farge.
  2. Forbered opptak pipetter fra 1,5 mm (1,19 mm ID) borsilikatglass ved hjelp av en to-trinns protokoll (varme Trinn 1: 72, og varme-trinn 2: 50) på en mikropipette avtrekker (Narishige, Japan, modell PP-830) for å oppnå en endelig impedans på 3-4 MΩ.
  3. Fyll skaftet av pipetten med 3-4 mm av Kaliumfluorid-baserte indre løsning inneholdende (i mM) 110 KF, 12 KCl, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1,8 MgCl2,3-D-glukose og 2 Na-ATP, pH 7,4 med KOH.
  4. Vikle skaftet av pipetten 2-3 ganger og så langt ned til spissen som mulig med en tynn strimmel av parafilm for å isolere elektroden og redusere pipette kapasitans.
  5. Plasser pipette over sensorisk epitel under lavt strøm forstørrelse (5X) på en oppreist mikroskop (Olympus BX51). Bytt til høy effekt (40X) og visualisere individuelle vestibulære hårcellene med et vedlagt CCD-kamera.
  6. Posisjon pipette på membranen av en visualisert hårcelle (figur 3C) ved hjelp av en mikromanipulator (Sutter Instruments, California, USA). Når en gigaohm tetning er oppnådd, ruptur cellemembranen med en liten mengde av negativt trykk påføres gjennom en sugeport på pipetteholder.
  7. Gjøre hel-celle spenning klemme opptak med standard teknikker 8-9.

4. To-foton mikroskopi

  1. Forbered en 0,9% saltløsning inneholdende 5 mM Oregon Grønn488 BAPTA-en (OGB-1; Hexapotassium salt, Invitrogen, Tyskland).
  2. Mens han fortsatt under vann, plassere "de-tak" semi-intakt triaden forberedelse på et lite stykke filterpapir (4X4 mm, 0,8 mikrometer tykke, Millipore, Tyskland) sikre at den sensoriske epitelet er uhindret ovenfra.
  3. Overfør filterpapiret og forberedelse på saltløsning dekket basen platina elektrode (7 ul) av en electroporator bestående av kombinasjonen av en pulsgenerator og en bredbåndet forsterker, og dekk med en ytterligere 5 pl av 5 mM løsning av det syntetiske kalsium indikator fargestoff Oregon Grønn 488 BAPTA-en (figur 4).

Figur 4
Figur 4. Bulk electroporation. A. skjematisk viser tverrsnitt av elektroporering konfigurasjon. Den semi-intakt preparat (*) er plassert på et stykke filterpapir nedsenket i kalsium-dye (Oregon Grønn 488 BAPTA-1) og strøm brukt mellom to platina elektroder. Tilpasset fra Briggman og Euler, 2011 10.

  1. Bring den øverste platina elektroden parallelt med base-elektroden i en avstand på tilnærmet 2 mm, være forsiktig for ikke å forstyrre orienteringen av blandingen ved kontakt med Oregon Grønn 488 BAPTA-en oppløsning fremstilles.
  2. Passere en kort strømpuls over forberedelse (parametere for den nåværende, 13 V, 10 ms puls bredde, 1 Hz frekvens, 10 kvadrat-bølge pulser) 10-11.
  3. På bunnen av et glass bunn opptak kammer fylt med L-15 medium, plasserer en liten skvett av silisium olje og plasser semi-intakt forberedelse på det, igjen sikrer at den sensoriske epitelet er uhindret ovenfra. For å sikre stabilitet i hele bildebehandling, erstatte nylon rutenett over forberedelser som beskrevet ovenfor (se punkt 2.13).
  4. Ved hjelp av to-foton mikroskop lage optiske opptak av spontaneous kalsium aktivitet i sensorisk epitelet (figur 7) ved hjelp av standard protokoller tenkelig 10-11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De elektrofysiologiske egenskaper av vestibulære hårceller er avhengig av den komplekse microarchitecturen innen hvilken de er integrert 7.. Figur 5 viser at den halv-intakt vestibulære epitel preparatet kan benyttes for å skille mellom type I hårceller (figur 5A), type II hårceller (fig. 5B), og begeret primære afferente (figur 5C) er basert på karakteristika helcelle konduktans. Disse egenskapene inkluderer uttales "sag" under depolarisering og store "kollapser" halen strømmer i type I håret celle, og tilstedeværelsen av forbigående innover natrium strømmer representerer aksjonspotensialer i begeret primære afferente (Arrow i figur 5C).

Preparatet kan også anvendes for å anslå virkningen av aldring på individuelle vestibulare hår celletyper. Figur 6 sammenlikner den konduktans (Figur 6A) og inaktivering karakteristikker (figur 6B) av type II vestibulare hår-cellene i respons til trinn depolarisering fra en negativ hvilepotensialet hos yngre og eldre mus. For type II hårcellene - den minst følsomme subtype-signifikante forskjeller ble ikke observert i noen parameter (se diskusjon).

I tillegg til analysen av hel-celle egenskaper, gir den semi-intakt preparatet også i seg selv til storskala analyse av de subcellulære mekanismer som fører til hår cellefunksjon. Figur 7 viser differensial lokalisering av kalsium til type I hårceller og beger primære afferenter, så vel som sub cellulær organisering av kalsium i disse cellene. Figur 7A viser endringen i fluorescens kalsium i en individuell type I hårcelle til tilsetning av 100 mM KCl. Tidsforløpet for denne forandring er plottet i figur 7B. Viktigere, forberedelseion åpner for etterforskningen av hår celle aktivitet på subcellular oppløsning, i flere celler samtidig, og i en "nær normal" miljø (figur 7C) - en funksjon ikke er mulig å bruke isolerte hårceller og enkelt celle elektrofysiologi.

Figur 5
Figur 5. Helcelle strømninger spilt inn fra hårcellene i musen vestibular sensorisk epitel. A. Whole celle strømmer opp fra en type I vestibular hårcelle preget av store "kollapse" halen strøm (pil). B. Whole celle strømmer opp fra en type II vestibular hårcelle. Legg merke til fraværet av halen strømninger. C. Whole celle opptak fra et beger primære afferente preget av forbigående natrium-mediert strøm (pil) etter depolarisering fra en negativ hvilepotensialet (-120 mV). Alle celler were holdt på -60 mV.

Figur 6
Figur 6. Sammenligning av følsomhet og inaktivering i type II hårcellene fra unge og eldre mus. A. I / V relasjoner for type II hårcellene tatt opp fra ung (1 måned) og eldre (9 mnd) mus i respons til økende depolarization varighet. B. Den gjennomsnittlige ledningsevne og inaktivering forholdet mellom type II hårcellene hos unge og gamle mus basert på 100 ms I / V kurver.

Figur 7
Figur 7. To-foton kalsium avbildning av den halvt intakt mus vestibular sensorisk epitel forberedelse. A. Øverst til venstre panel) To-foton mikrografer viser BAPTA-en Oregon Grønn kalsium aktivering i respons til normal L-15 perfusate(Øverst) eller L-15 med 100 mM KCl (nederst). Pilene viser et enkelt hår cellen før og etter tilsetning av KCl. B. Øverst til høyre panel) Kalsium fluoresenceprofil av cellen uthevet i A. C. Nedre panel) To-foton micrograph av sensorisk epitel viser Oregon Grønn 488 BAPTA-en lasting av individuelle hårceller Bunnpanel Innfelt:. Subcellular lokalisering av kalsium til type I hårcelle cytoplasma (pil) eller begeret primære afferente rundt en type Jeg hårcelle (doble piler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mekanismene bak vår følelse av balanse har fått begrenset oppmerksomhet i forhold til andre sensoriske systemer, for eksempel de visuelle og auditive systemer. Av de studier som har undersøkt endringer i vestibular eller balanse funksjon, har mest fokusert på atferdsmessige tiltak, inkludert vestibulo-okulær refleks, med ufullstendig kunnskap om de grunnleggende byggesteinene i balanse-vestibular hårcellene selv. De studier som har konsentrert seg om hårcellene har nesten alltid gjort det ved hjelp av akutt isolerte hårcellene fjernet fra sitt opprinnelige miljø. I denne artikkelen viser vi en semi-intakt utarbeidelse av musen vestibular sensorisk epitel som utvider på disse grunnstudium.

Mens vestibulære hårcellene er relativt robust, er nytten av den halvt intakt forberedelse kritisk avhengig av hastigheten på excision. Vanligvis vil en forberedelse forbli levedyktig på room temperatur i en periode på omtrent 2-5 timer etter eksisjon. Derfor minimere tiden tatt fra når dyret er avlivet til opptak er det viktigste. Den eksisjon kan være relativt enkelt og raskt for en 3 ukers gammel mus (5-7 min totalt), men blir gradvis vanskeligere i en eldre dyr (opptil 25 min i 9 måneder gamle mus). I disse eldre dyr, er disseksjon temperatur en kritisk faktor - ved å sikre at preparatet er kontinuerlig badet i iskaldt oksygenrikt ACSF normale katabole prosesser er sperret.

Som beskrevet i kapittel 3.1 utarbeidelsen ble stadig perfused med oksygenrikt Leibovitz medium, L-15, og hel-celle spenning klemme opptakene ble gjort ved hjelp av mikroelektroder av glass fylt med KF intern løsning 12. Denne kombinasjon av ytre og indre omgivelser har vist seg å gi mer stabile og over en lengre varighet enn andre opptak kalsiumbasert innvendige og / eller Ringersbaserte ekstracellulære løsninger 13-14. Denne stabiliteten er avgjørende for de lange protokoller som kreves for å studere elektrofysiologiske egenskaper og kalsium dynamikk hårcellene som bruker patch-clamp og to-foton teknikker henholdsvis.

Det grunnleggende formålet med den semi-preparatet er intakt for å gi en modell for studiet av vestibulære hår celler som er forstyrret så lite som mulig. Mens fremstillingen gir klare fordeler i forhold til akutt isolerte hårceller - for eksempel, er hele dynamikken av helcelle strømmer bare avslørte med den halvt intakt Fremstilling 3, 7 - forstyrrelser kan ikke unngås. For det første er det vanskelig å vurdere virkningen av å fjerne "taket" av ampulla (og antagelig den vedlagte cupula) på spontan hår celle signalisering. Under normale fysiologiske forhold, hårcellene svare på bøying av cupula / hår bundle kompleks. Uten dette komplekset kan det tenkes at spontan hår cell signalering kan ikke være representative for in vivo-forhold. Sekund, elektrofysiologiske opptak i semi-intakt forberedelse er stort sett begrenset til målinger av spontan aktivitet eller svar på simulert naturlig aktivitet (dvs. likestrøm injeksjoner i håret celle eller mekanisk bøying av hårbunter). Derfor er det ikke mulig å studere de underliggende hårcelle egenskaper som reaksjon på virkelige aktivering (dvs. hodebevegelser). Likevel representerer den semi-intakt forberedelse et nytt verktøy for å hjelpe oss å forstå hår celle funksjon, og åpner en rekke muligheter for fremtidig forskning.

En stor fordel at den semi-intakt forberedelse gir over akutt isolerte hår celle forberedelser er at det tillater samtidige opptak fra flere hårceller og / eller deres tilknyttede primære afferenter. Bruke doble, eller multi-cell patch clamp opptak teknikker denne funksjonen gir et middel for å vurderedirekte hårcelle / primære afferente signaler, noe som ikke kan oppnås med tradisjonelle isolerte preparater. I tillegg, ved bruk av to-foton mikroskopi, kan den semi-intakt preparat for simultan måling av sub-cellulær funksjon over hele omfanget av det sensoriske epitel. Dette betyr at informasjon om kalsium signalisering og cellenes stoffskifte kan påløpt raskt og i sammenheng. Til slutt, ved hjelp av mus gir mulighet for målrettet genetisk manipulering (f.eks grønt fluorescerende protein knyttes til calretinin uttrykk som en markør for type I hårceller og beger primære afferente). Den semi-intakt forberedelse gir en metode for å studere aktiviteten til hårcellene og primære afferenter forskjellig, og samtidig. Dette alene vil gi et vell av ny informasjon om hvordan vestibulære hårcellene og primære afferenter samhandle for å oppdage og deretter kryptere informasjon som skal overføres til hjernen om hode og kropp posisjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Midler til dette arbeidet ble gitt av en Garnett Passe og Rodney Williams Memorial Foundation Prosjekt tilskudd til R. Lim og AJ Camp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Leibovitz medium L-15 Sigma Aldrich L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green Invitrogen O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope Leica Microsystems A60S
Upright microscope Olympus BX51WI
Two-photon microscope Olympus/La Vision BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps FST 11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs FST 16221-14
Standard Pattern Scissors FST 14001-12
InstraTECH A-D converter HEKA ITC-18
Sutter Micromanipulator Sutter MP-225/M
multiclamp amplifier Axon Instruments 700B
Data acquisition software (electrophysiology) Axograph N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon) Max Planck innovation N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
  2. Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, (2009).
  3. Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, (2009).
  4. Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, (2010).
  5. Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, (2010).
  6. Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
  7. Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
  8. Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
  9. Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
  10. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  11. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
  12. Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
  13. Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
  14. Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
En isolert Semi-intakt Utarbeidelse av Mouse Vestibular Sensorisk Epitel for Electrophysiology og høy oppløsning To-foton mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).More

Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter