Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी और उच्च संकल्प दो photon माइक्रोस्कोपी के लिए माउस Vestibular संवेदी उपकला की एक पृथक अर्द्ध बरकरार तैयारी

doi: 10.3791/50471 Published: June 13, 2013

Summary

Vestibular में बाल सेल समारोह का विश्लेषण खोपड़ी, पथराया हुआ टेम्पोरल हड्डी का सबसे मुश्किल हिस्सा भीतर गहरे अपने स्थान से जटिल है. हाल कार्यात्मक बाल सेल पढ़ाई तीव्रता से पृथक बालों की कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है. यहाँ हम electrophysiological और दो photon माइक्रोस्कोपी अध्ययन के लिए माउस को vestibular उपकला की एक अर्द्ध बरकरार तैयारी का वर्णन है.

Abstract

समझना vestibular बालों की कोशिकाओं के सामान्य परिस्थितियों में कार्य करते हैं, या कैसे आघात, बीमारी, और इस कार्य को बाधित बुढ़ापे में preventative दृष्टिकोण और / या उपन्यास चिकित्सकीय रणनीति के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम है. हालांकि, असामान्य vestibular समारोह को देख अध्ययन के बहुमत सेलुलर स्तर पर किया गया है लेकिन मुख्य रूप से इस तरह की चाल का विश्लेषण करती है और vestibulo नेत्र पलटा प्रदर्शन के रूप में vestibular में शिथिलता के व्यवहार assays पर ध्यान केंद्रित नहीं है. यह काम कोई बात बिगड़ जाए जब क्या होता है के बारे में महत्वपूर्ण डेटा प्राप्त हुए है, वहीं कम जानकारी रोग के मूल कारणों के बारे में gleaned है. Vestibular समारोह आबाद कि सेलुलर और subcellular प्रक्रियाओं पर ध्यान दिया है कि पढ़ाई की, ज्यादातर ने अपने synaptic कनेक्शन और समर्थन सेल वातावरण से रहित तीव्रता से अलग बालों की कोशिकाओं, पर भरोसा किया है. इसलिए, एक प्रमुख तकनीकी चुनौती प्रस्तुत करने में exquisitely संवेदनशील vestibular बालों की कोशिकाओं के लिए उपयोग किया गया हैaration कम physiologically, बाधित है कि. यहाँ हम बाल सेल / प्राथमिक अभिवाही परिसरों सहित स्थानीय सूक्ष्म वातावरण को बरकरार रखे हुए है कि माउस vestibular संवेदी उपकला की एक अर्द्ध बरकरार तैयारी प्रदर्शित करता है.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

हमारे रोजमर्रा के जीवन को vestibular प्रणाली का महत्वपूर्ण योगदान के बावजूद, उम्र के साथ vestibular समारोह में मनाया गिरावट के लिए जिम्मेदार प्रक्रियाओं का एक स्पष्ट समझ मायावी रहते हैं. ज्ञान की इस कमी का एक कारण vestibular समारोह में गिरावट है कि लगभग विशेष vestibulo नेत्र पलटा (VOR), बाह्य vestibular समारोह का एक सटीक सूचक सहित व्यवहार assays, का उपयोग कर पता लगाया गया है, लेकिन आंतरिक घटकों के परिवर्तन में सीमित अंतर्दृष्टि प्रदान करता है . यह स्वास्थ्य, बीमारी, या बुढ़ापे में vestibular बाल सेल समारोह के बारे में हमारी समझ के लिए एक प्रमुख बाधा है.

व्यक्तिगत vestibular बालों की कोशिकाओं के कई अध्ययन किए गए हैं, वहीं एक बड़ी कमी बालों की कोशिकाओं और भी calyx अभिवाही टर्मिनलों यांत्रिक और / या एंजाइमी उपचार के माध्यम से अपने सामान्य वातावरण से हटा रहे हैं जहां तीव्र बाल सेल की तैयारी, पर निर्भरता की गई है. इस तरह के दृष्टिकोण inevitably बाल सेल और calyx, और बाल सेल और समर्थन सेल के बीच नाजुक माइक्रोआर्किटेक्चर बाधित. अर्द्ध बरकरार तैयारी 1-5, और एक अलग माउस भूलभुलैया तैयारी 6 के विकास के साथ, और अधिक बारीकी से vivo में उन जैसे लगते हैं कि शर्तों के तहत अन्तर्ग्रथनी संचार के विभिन्न रूपों का अध्ययन करने का अवसर अब भी है. दरअसल, लिम एट अल. (2011) मैं vestibular बालों की कोशिकाओं neuroepithelium भीतर एम्बेडेड बनी है कि उन लोगों की तुलना में तीव्रता से अलग प्रकार से दर्ज पूरे सेल धाराओं में चिह्नित अंतर दिखाया. विशेष रूप से, पोटेशियम बाल सेल और अभिवाही calyx बीच, कहनेवाला अंतरिक्ष में जमा करने के लिए माना जाता है, और काफी बाल सेल प्रतिक्रिया 7 में परिवर्तन. इस प्रकार की जानकारी यहां वर्णित vestibular संवेदी उपकला की अर्द्ध बरकरार तैयारी के बिना प्राप्त करने के लिए असंभव हो जाएगा. हम माउस शिखा 3 की अर्द्ध बरकरार तैयारी का प्रदर्शन, और पूरे सेल पैच इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी से प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम है, और दो photon कैल्शियम इमेजिंग दिखा.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. पशु

  1. चूहे ऑस्ट्रेलियाई कृंतक सेंटर (एआरसी, पर्थ, ऑस्ट्रेलिया) से प्राप्त किया गया और पर्यावरण संवर्धन के साथ एक सामान्य 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र पर सिडनी बॉश पशु सुविधा के विश्वविद्यालय में आयोजित किया. वर्णित सभी प्रयोगों सिडनी पशु आचार समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया.
  2. नर और मादा चूहों (C57/BL6) इस तनाव सामान्यतः आनुवंशिक हेरफेर के लिए पृष्ठभूमि के रूप में उपयोग किया जाता है के बाद से सभी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया, और 8-9 wildtype के समकक्ष माना जा सकता है.

2. ऊतक तैयारी

  1. 26 3 NaHCO, 11 ग्लूकोज, 250 ग्लिसरॉल, 2.5 KCl, 1.2 नाह 2 पीओ 4, 1.2 2 MgCl, और 2.5 2 CaCl: से मिलकर एक ग्लिसरॉल आधारित कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) (मिमी) की 300 मिलीलीटर की तैयारी. 2 CaCl के अलावा के लिए पहले, गैस carbogen (95% 2 हे और 5% सीओ 2) के साथ समाधान एपी स्थापित करने के लिए7.4 के एच और बचने कैल्शियम वर्षा (बादल). एक बर्फ के घोल का गठन किया है ताकि 45 मिनट के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में समाधान रुक.
  2. गहरा एक अंतर peritoneal इंजेक्शन के माध्यम से ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) (पार्नेल, अलेक्जेंड्रिया, ऑस्ट्रेलिया) के साथ चूहों बेहोश करना.
  3. एक बार हिंद अंग चुटकी सजगता तेज स्टेनलेस स्टील कैंची का उपयोग अनुपस्थित सिर काटना चूहों हैं और खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए एक रेजर ब्लेड (# 22 गोल) का उपयोग कर एक बाण के समान त्वचा चीरा बनाते हैं. इस बिंदु पर और कदम 2.3-2.8 भर कपाल तिजोरी, मस्तिष्क, और अंतर्निहित वेस्टिब्युलर तंत्र ऊतक अधिक ठंडा ACSF की नियमित रूप से आवेदन के द्वारा ही संभव के रूप में अच्छा के रूप में रखा जाना चाहिए.
  4. मानक पैटर्न कैंची का बताया हाथ (एफ एस टी, उत्तर वैंकूवर, कनाडा) का उपयोग लैम्ब्डा पर खोपड़ी में एक छोटा सा चीरा बनाने और बाण के समान सीवन के साथ काटा. मस्तिष्क इस कदम के दौरान कतरनी ब्लेड से "घसीटा" नहीं है कि सुनिश्चित करें.
  5. ध्यान पार्श्वतः दूर पार्श्विका हड्डियों और पश्चकपाल हड्डी posterio छीलरेलवे उथले मोड़ पियर्सन rongeurs (एफ एस टी) का उपयोग कर.
  6. एक छोटे से स्टेनलेस स्टील के रंग तो धीरे मध्यम और पीछे कपाल Fossae की सतह से मस्तिष्क लिफ्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और उजागर vestibulocochlea तंत्रिका (CNVIII) भीतरी कान और ठीक परितारिका कैंची की एक जोड़ी के साथ मस्तिष्क के बीच बीच में कट जाता है. इस तंत्रिका काटना बालों की कोशिकाओं के साथ प्राथमिक afferents और उनके कनेक्शन के axons पर अनुचित तनाव को कम करता है.
  7. सीएन आठवीं की transection के बाद मस्तिष्क पूर्ण रूप से हटा दिया जाता है.
  8. vestibular भूलभुलैया कोक्लीअ anteromedially इशारा करते हुए के साथ, अब मध्य कपाल खात में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है. धीरे पूर्वकाल semicircular नहर मनोरंजक और laterally खींच कर excising पहले vestibular में भूलभुलैया के दोनों ओर Rongeur.
  9. 2.1 खंड में वर्णित ठंडा, लगातार मार डाला ACSF युक्त एक विदारक डिश में excised लेबिरिंथ (चित्रा 1) विसर्जित कर दिया. एक stereomicroscope के तहत करने के लिए भूलभुलैया पकड़कोक्लीअ मनोरंजक द्वारा पकवान के आधार. पूर्वकाल semicircular नहर कलसा overlying हड्डी में दूर खरोंच करने के लिए ठीक संदंश का प्रयोग करें. हड्डी में एक छोटा सा छेद हासिल हो जाने के बाद दूर कलसा से हड्डी झटका लगते हैं. सावधानी यह अंतर्निहित झिल्लीदार भूलभुलैया और संवेदी उपकला को नुकसान हो सकता है के रूप में हड्डी के माध्यम से संदंश धक्का नहीं लिया जाना चाहिए. पूर्वकाल और आसन्न क्षैतिज अर्द्धवृत्ताकार झिल्लीदार नलिकाएं और एम्पुली दोनों (चित्रा 2) के संपर्क में रहे हैं जब तक यह प्रक्रिया जारी है.

चित्रा 1
चित्रा 1. पृथक माउस vestibular भूलभुलैया. ए वाम पैनल) पृथक माउस vestibular में भूलभुलैया के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. Vestibular संवेदी उपकला तक पहुँचने के लिए संदर्भ के महत्वपूर्ण बिंदुओं, कोक्लीअ, पूर्वकाल, और क्षैतिज semicircular नहरों प्रयोगशाला हैंeLED. सितारे vestibular संवेदी उपकला युक्त semicircular नहर कलसा संकेत मिलता है. बी एक 1 महीने की उम्र में माउस से अलग vestibular भूलभुलैया का राइट पैनल) सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़.

चित्रा 2
चित्रा 2. झिल्लीदार vestibular भूलभुलैया का एक्सपोजर. पूर्वकाल और क्षैतिज semicircular नहर एम्पुली overlying हड्डी काला / भूरे धब्बेदार झिल्लीदार एम्पुली और संबद्ध कलशिका तंत्रिकाओं (CNVIII) प्रकट करने के लिए दूर खरोंच कर दिया गया है. नीचे के पैनल में योजनाबद्ध सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़ से प्रकाश डाला क्षेत्र में संरचनाओं का प्रतिनिधित्व करता है और एम्पुली और CNVIII को semicircular नहर नलिकाओं के संबंध को दर्शाता है.

  1. ठीक संदंश का प्रयोग, धीरे सुनिश्चित करने, बोनी भूलभुलैया से दूर एम्पुली और संबद्ध यूट्रिकल उठा कि एम्पुली के मध्य क्षेत्र (contaसंवेदी उपकला) ining क्षतिग्रस्त नहीं है. कुछ मामलों में अर्धवृत्ताकार झिल्लीदार वाहिनी के समीपस्थ हिस्सा हड्डी से एम्पुली जारी करने के लिए परितारिका कैंची से काट होना पड़ सकता है.
  2. लेबोविट्ज़ एल 15 मध्यम संस्कृति (सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, एमओ) के साथ भरा एक पेट्री डिश में दो एम्पुली और यूट्रिकल युक्त त्रय स्थानांतरण. "बैकलाइट" ऊतक के लिए ऑप्टिक फाइबर एक का उपयोग करें. इस एम्पुली भीतर संवेदी उपकला युक्त शिखा का स्पष्ट दृश्य की अनुमति देता है.
  3. ध्यान से ठीक परितारिका कैंची से यूट्रिकल की धब्बेदार "छत" में एक चीरा बनाते हैं. पूर्वकाल की छत और तब क्षैतिज एम्पुली के माध्यम से इस चीरा जारी. यह (चित्रा 3) से संपर्क के बिना संभव के रूप में संवेदी उपकला के किनारे के करीब के रूप चीरा. संवेदी उपकला (3B चित्रा) overlying झिल्ली का कोई टुकड़े कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
  4. एक छोटे gla को पृथक अर्द्ध बरकरार तैयारी स्थानांतरणएस एस तली रिकॉर्डिंग कक्ष एल 15 मीडिया के साथ भरा. एक चपटा यू के आकार प्लैटिनम तार (3B चित्रा) को सुरक्षित कर ठीक नायलॉन फाइबर का एक ग्रिड का उपयोग कर तैयारी नीचे वजन. आदर्श रूप में, ग्रिड के तंतुओं संवेदी उपकला overlie नहीं होना चाहिए, लेकिन अधिक स्थिरता की आवश्यकता है जहां कुछ मामलों में, शायद पसंद किया संवेदी उपकला transecting एक फाइबर.

चित्रा 3
चित्रा 3. अर्द्ध बरकरार तैयारी और इलेक्ट्रोड विन्यास के vestibular संवेदी उपकला. ए योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व के अलग अर्द्ध बरकरार तैयारी. शिखा overlying कलसा संवेदी उपकला (हरा) की सतह को बेनकाब करने के लिए "डी की छत" कर दिया गया है. पूर्वकाल (एसी) और क्षैतिज (कोर्ट) शिखा (यूट्रिकल दिखा अर्द्ध बरकरार 'त्रय' की तैयारी के बी सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़ छिप खehind एसी). रिकार्डिंग कक्ष के आधार पर तैयारी सुरक्षित इस्तेमाल नायलॉन फाइबर ध्यान दें. स्केल पट्टी:. 100 माइक्रोन सी. एक व्यक्ति vestibular में बाल सेल पर तैनात एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड. स्केल पट्टी: 15 माइक्रोन.

3. विद्युतशरक्रिया विज्ञान

  1. लगातार oxygenated एल 15 के माध्यम से अर्द्ध बरकरार तैयारी छिड़कना. मीडिया रिकॉर्डिंग के दौरान निगरानी की जानी चाहिए मध्यम के एक पीएच सूचक (फिनोल लाल) और रंग होता है. ऑक्सीजन के साथ पीएच 7.3-7.4 हो सकता है और एक लाल रंग के अनुरूप होना चाहिए.
  2. एक प्राप्त करने के लिए एक micropipette डांड़ी (मॉडल पीपी-830 Narishige, जापान,) पर:;: एक दो कदम प्रोटोकॉल (50 और गर्मी कदम 2 72 गर्मी कदम 1) का उपयोग 1.5 मिमी (1.19 मिमी आईडी) borosilicate ग्लास से रिकॉर्डिंग pipettes तैयार MΩ 3-4 की अंतिम प्रतिबाधा.
  3. 2 MgCl (मिमी) 110 KF, 12 KCl, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1.8 युक्त पोटेशियम फ्लोराइड आधारित आंतरिक समाधान के 3-4 मिमी के साथ पिपेट की टांग भरें,3 डी ग्लूकोज, और 2 ना एटीपी; KOH के साथ 7.4 पीएच.
  4. जहाँ तक नीचे इलेक्ट्रोड बचाने और विंदुक समाई कम करने के लिए Parafilm की एक पतली पट्टी के साथ संभव के रूप में टिप करने के लिए पिपेट 2-3 बार की टांग लपेटें और.
  5. एक ईमानदार माइक्रोस्कोप (ओलिंप BX51) पर कम शक्ति बढ़ाई (5X) के तहत संवेदी उपकला के ऊपर पिपेट स्थिति. उच्च शक्ति (40X) के लिए स्विच और एक संलग्न सीसीडी कैमरा के साथ व्यक्तिगत vestibular में बाल कोशिकाओं कल्पना.
  6. एक micromanipulator (Sutter उपकरण, कैलिफोर्निया, संयुक्त राज्य अमरीका) का उपयोग कर एक कल्पना बाल सेल (चित्रा -3 सी) की झिल्ली पर स्थिति पिपेट. एक gigaohm मुहर हासिल की है, एक बार टूटना विंदुक धारक पर एक चूषण बंदरगाह के माध्यम से लागू नकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि के साथ कोशिका झिल्ली.
  7. मानक तकनीक 8-9 का उपयोग कर पूरे सेल वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग बनाओ.

4. दो photon माइक्रोस्कोपी

  1. 5 मिमी ओरेगन ग्रीन युक्त 0.9% नमकीन घोल तैयार करें488 BAPTA -1 (OGB-1; hexapotassium नमक, Invitrogen, जर्मनी).
  2. संवेदी उपकला ऊपर से अबाधित सुनिश्चित करना है कि, अभी भी जलमग्न है, जबकि फिल्टर पेपर का एक छोटा सा टुकड़ा (Millipore, जर्मनी 4X4 मिमी मोटी 0.8 माइक्रोन) पर "डी की छत" अर्द्ध बरकरार त्रय तैयारी रखें.
  3. सिंथेटिक कैल्शियम की 5 मिमी समाधान का एक और 5 μl के साथ फिल्टर पेपर और तैयारी एक पल्स जनरेटर और एक व्यापक बैंड एम्पलीफायर के संयोजन से मिलकर electroporator का खारा कवर आधार प्लैटिनम इलेक्ट्रोड (7 μl) पर, और कवर के स्थानांतरण सूचक डाई ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA -1 (चित्रा 4).

चित्रा 4
4 चित्रा. थोक इलेक्ट्रोपोरेशन. ए योजनाबद्ध electroporation के विन्यास के पार अनुभाग दिखा. अर्द्ध बरकरार तैयारी (*) कैल्शियम घ में डूब फिल्टर कागज के एक टुकड़े पर रखा गया हैतु (ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1) और वर्तमान 2 प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के बीच लागू किया. Briggman और यूलर, 2011 10 से अनुकूलित.

  1. ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1 समाधान किया जाता है के साथ संपर्क जब तैयारी के उन्मुखीकरण को बाधित करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, लगभग 2 मिमी की दूरी पर आधार इलेक्ट्रोड के साथ शीर्ष प्लैटिनम इलेक्ट्रोड समानांतर लाओ.
  2. 10-11, तैयारी (13 वी, 10 मिसे पल्स चौड़ाई, 1 हर्ट्ज आवृत्ति, 10 वर्ग तरंग दालों वर्तमान के लिए पैरामीटर) में एक संक्षिप्त वर्तमान नाड़ी गुजरती हैं.
  3. एल 15 मध्यम से भरा एक गिलास तली रिकार्डिंग कक्ष के तल पर, फिर संवेदी उपकला ऊपर से अबाधित है यह सुनिश्चित करना कि यह पर सिलिकॉन तेल और स्थिति अर्द्ध बरकरार तैयारी का एक छोटा सा थपका जगह है. (बिन्दु 2.13 देखें) ऊपर वर्णित के रूप में इमेजिंग भर में स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए तैयारी से अधिक नायलॉन ग्रिड जगह.
  4. दो photon माइक्रोस्कोप का उपयोग spont के ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग करमानक इमेजिंग प्रोटोकॉल 10-11 उपयोग कर संवेदी उपकला (चित्रा 7) में aneous कैल्शियम गतिविधि.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

vestibular बालों की कोशिकाओं की electrophysiological गुण वे 7 एम्बेडेड रहे हैं जो भीतर जटिल माइक्रोआर्किटेक्चर पर निर्भर हैं. अर्द्ध बरकरार vestibular उपकला तैयारी प्रकार के बीच अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि चित्रा 5 से पता चलता है कि मैं बालों की कोशिकाओं (चित्रा 5A), प्रकार द्वितीय बालों की कोशिकाओं (चित्रा 5 ब), और calyx प्राथमिक अभिवाही (चित्रा 5C) विशेषता पूरे सेल conductances पर आधारित है. इन विशेषताओं एक विध्रुवण के दौरान स्पष्ट "शिथिलता" और प्रकार मैं बाल सेल में बड़े "गिर" पूंछ धाराओं, और calyx प्राथमिक अभिवाही में कार्रवाई क्षमता (चित्रा 5C में तीर) का प्रतिनिधित्व क्षणिक आवक सोडियम धाराओं की मौजूदगी में शामिल हैं.

तैयारी भी व्यक्ति vestibular में बाल प्रकार की कोशिकाओं पर उम्र बढ़ने के प्रभाव यों इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 6 चालकता (एफ तुलनाजवान और बूढ़े चूहों में एक नकारात्मक विश्राम क्षमता से विध्रुवण कदम के जवाब में प्रकार द्वितीय vestibular बालों की कोशिकाओं की igure 6A) और निष्क्रियता विशेषताओं (चित्रा 6B). द्वितीय प्रकार के बालों की कोशिकाओं के लिए - कम से कम संवेदनशील उप प्रकार-महत्वपूर्ण मतभेद (चर्चा देखने के लिए) या तो पैरामीटर में नहीं मनाया गया.

पूरे सेल गुणों का विश्लेषण करने के अलावा, अर्द्ध बरकरार तैयारी भी बाल सेल समारोह अंतर्निहित subcellular तंत्र की बड़े पैमाने पर विश्लेषण करने के लिए उधार देता है. 7 चित्रा प्रकार मैं बालों की कोशिकाओं और प्राथमिक calyx के लिए कैल्शियम का अंतर स्थानीयकरण से पता चलता है afferents, साथ ही इन कोशिकाओं के भीतर कैल्शियम के उप सेलुलर संगठन. चित्रा 7A 100 मिमी KCl के अलावा करने के लिए एक व्यक्ति प्रकार मैं बाल सेल में कैल्शियम प्रतिदीप्ति में परिवर्तन को दर्शाता है. इस परिवर्तन के समय पाठ्यक्रम चित्रा 7B में साजिश रची है. महत्वपूर्ण बात है, preparatपृथक बालों की कोशिकाओं और एकल कक्ष इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग संभव नहीं एक विशेषता - आयन एक साथ, और एक "पास" सामान्य वातावरण (चित्रा 7C) में एकाधिक कोशिकाओं में subcellular संकल्प में बाल सेल गतिविधियों की जांच के लिए अनुमति देता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. पूरे सेल धाराओं माउस vestibular संवेदी उपकला में बालों की कोशिकाओं से दर्ज की गई. ए पूरे सेल धाराओं बड़े "गिर" पूंछ धाराओं (तीर) की विशेषता एक प्रकार मैं vestibular में बाल सेल से दर्ज की गई. बी पूरे सेल धाराओं vestibular में एक प्रकार द्वितीय से दर्ज बाल सेल. पूंछ धाराओं के अभाव ध्यान दें. एक calyx प्राथमिक अभिवाही से सी. पूरे सेल रिकॉर्डिंग एक नकारात्मक विश्राम क्षमता (-120 एम वी) से क्षणिक सोडियम की मध्यस्थता धाराओं (तीर) निम्नलिखित विध्रुवण की विशेषता. सभी कोशिकाओं डब्ल्यूअरे -60 एम वी पर आयोजित किया.

चित्रा 6
6 चित्रा. बढ़ती विध्रुवण अवधि के लिए युवा (1 माह) और पुराने (9 माह) के जवाब में चूहों से दर्ज प्रकार द्वितीय बालों की कोशिकाओं के लिए युवा और बड़े चूहों से द्वितीय प्रकार के बालों की कोशिकाओं में संवेदनशीलता और निष्क्रियता की तुलना करें. ए मैं / वी रिश्तों. बी 100 मिसे मैं / वी घटता पर आधारित जवान और बूढ़े चूहों में द्वितीय प्रकार के बालों की कोशिकाओं की औसत चालकता और निष्क्रियता अनुपात.

7 चित्रा
चित्रा 7. दो photon अर्द्ध बरकरार माउस vestibular संवेदी उपकला तैयारी की कैल्शियम इमेजिंग. ए शीर्ष बाएं पैनल) सामान्य एल 15 perfusate के जवाब में BAPTA -1 ओरेगन ग्रीन कैल्शियम सक्रियण दिखा दो photon micrographs(ऊपर) या एल 15 100 मिमी KCl (नीचे) से युक्त. तीर KCl के अलावा पहले और बाद में एक व्यक्ति बाल सेल का संकेत मिलता है. बी सेल के) पैनल सही शीर्ष कैल्शियम प्रतिदीप्ति प्रोफ़ाइल ए. सी. में डाला व्यक्ति के बालों की कोशिकाओं के ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1 लोड दिखा संवेदी उपकला के नीचे पैनल) दो photon माइक्रोग्राफ नीचे पैनल इनसेट:. एक प्रकार आसपास के प्रकार मैं बाल सेल कोशिका द्रव्य (तीर) या calyx प्राथमिक अभिवाही के लिए कैल्शियम की subcellular स्थानीयकरण मैं बाल सेल (डबल तीर).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

संतुलन की हमारी भावना अंतर्निहित तंत्र अन्य संवेदी प्रणाली के साथ तुलना में सीमित ध्यान प्राप्त हुआ है, दृश्य और श्रवण सिस्टम उदा. कर्ण कोटर या संतुलन समारोह में परिवर्तन की जांच की है कि पढ़ाई की, सबसे संतुलन vestibular बालों की कोशिकाओं को खुद के मौलिक निर्माण ब्लॉकों के अधूरे ज्ञान के साथ, vestibulo नेत्र पलटा सहित व्यवहार उपायों पर ध्यान केंद्रित किया है. उनके पैतृक वातावरण से हटा तीव्रता से पृथक बालों की कोशिकाओं का उपयोग कर तो बालों की कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया है कि उन अध्ययनों लगभग हमेशा किया है. इस अनुच्छेद में हम इन नींव पढ़ाई पर फैलता है कि माउस vestibular संवेदी उपकला की एक अर्द्ध बरकरार तैयारी प्रदर्शित करता है.

Vestibular बालों की कोशिकाओं अपेक्षाकृत मजबूत कर रहे हैं, अर्द्ध बरकरार तैयारी की उपयोगिता छांटना की गति पर निर्भर है. आमतौर पर, एक तैयारी roo पर व्यवहार्य रहेगाछांटना के बाद लगभग 2-5 घंटे की अवधि के लिए मीटर तापमान. इसलिए, पशु रिकॉर्डिंग करने के लिए euthanized है जब से लगने वाले समय को कम करने सर्वोपरि है. छांटना (9 माह पुराने चूहों में ऊपर से 25 मिनट) अपेक्षाकृत आसान और एक 3 सप्ताह पुरानी माउस (5-7 मिनट कुल) के लिए जल्दी हो, लेकिन एक बड़े जानवर में उत्तरोत्तर अधिक मुश्किल हो जाता है सकते हैं. इन बड़े जानवरों में, विच्छेदन तापमान एक महत्वपूर्ण निर्धारक है - तैयारी लगातार ठंडा ऑक्सीजन ACSF सामान्य अपचयज प्रक्रियाओं में हिचकते हैं नहाया है कि सुनिश्चित करने के द्वारा.

लेबोविट्ज़ मध्यम, एल 15, और पूरे सेल वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग KF आंतरिक समाधान 12 से भरा गिलास microelectrodes का उपयोग किया गया oxygenated साथ के रूप में खंड 3.1 में वर्णित तैयारी लगातार perfused था. बाह्य और आंतरिक वातावरण के इस संयोजन अन्य पोटाशियम आधारित आंतरिक और / या घंटी की तुलना में अधिक स्थिर और लंबी अवधि रिकॉर्डिंग प्रदान करने के लिए दिखाया गया हैआधारित कोशिकी समाधान 13-14. यह स्थिरता क्रमशः पैच दबाना और दो photon तकनीक का उपयोग कर बालों की कोशिकाओं की electrophysiological गुण और कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए आवश्यक लंबे प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है.

अर्द्ध बरकरार तैयारी के मौलिक उद्देश्य के लिए संभव के रूप में छोटे रूप में परेशान है कि vestibular बालों की कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रदान करना है. तैयारी तीव्रता से पृथक बालों की कोशिकाओं से अधिक स्पष्ट लाभ प्रदान करता है - उदाहरण के लिए, पूरे सेल धाराओं से भरा गतिशीलता केवल अर्द्ध बरकरार तैयारी 3, 7 का उपयोग कर पता चला रहे हैं - अवरोधों को टाला नहीं जा सकता. सबसे पहले, यह सहज बाल संकेतन सेल पर कलसा के "छत" (और शायद संलग्न cupula) को हटाने के प्रभाव का आकलन करने के लिए मुश्किल है. सामान्य शारीरिक शर्तों के तहत, बालों की कोशिकाओं cupula / बाल बंडल परिसर के झुकने का जवाब. इस परिसर के बिना यह बोधगम्य है कि सहज बाल सेलएल संकेत vivo परिस्थितियों में की प्रतिनिधि नहीं हो सकता. अर्द्ध बरकरार तैयारी में दूसरा, electrophysiological रिकॉर्डिंग ज्यादातर नकली प्राकृतिक गतिविधि को सहज गतिविधि या प्रतिक्रिया की माप (बाल सेल या बाल बंडलों के झुकने यांत्रिक में यानी मौजूदा प्रत्यक्ष इंजेक्शन) तक ही सीमित हैं. इसलिए यह वास्तविक जीवन के सक्रियण (यानी सिर आंदोलनों) के जवाब में अंतर्निहित बाल सेल गुणों का अध्ययन करने के लिए संभव नहीं है. फिर भी, अर्द्ध बरकरार तैयारी हमें बाल सेल समारोह को समझने में मदद करने के लिए एक नए उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है, और भविष्य के अनुसंधान के लिए अवसर की एक संख्या को खोलता है.

अर्द्ध बरकरार तैयारी तीव्रता से पृथक बाल सेल तैयारी पर प्रदान करता है कि एक बड़ा लाभ यह है कि अनुमति देता है कई बालों की कोशिकाओं और / या उनके संबद्ध प्राथमिक afferents से एक साथ रिकॉर्डिंग. दोहरी, या बहु - सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग तकनीकों इस सुविधा का उपयोग का आकलन करने का एक साधन प्रदान करता हैसीधे बाल सेल / प्राथमिक अभिवाही संकेत, पारंपरिक पृथक तैयारी के साथ हासिल नहीं किया जा सकता है कुछ. इसके अलावा, दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग, अर्द्ध बरकरार तैयारी संवेदी उपकला की पूर्ण सीमा पार उप सेलुलर समारोह का एक साथ माप के लिए अनुमति देता है. यह संकेत कैल्शियम और सेलुलर चयापचय तेजी से और संदर्भ में अर्जित किया जा सकता है के बारे में जानकारी है कि इसका मतलब है. अंत में, चूहों का उपयोग लक्षित आनुवंशिक हेरफेर के लिए अनुमति देता है (प्रकार के लिए एक मार्कर के रूप calretinin अभिव्यक्ति के लिए टैग जैसे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन मैं बालों की कोशिकाओं और calyx प्राथमिक afferents). अर्द्ध बरकरार तैयारी विभिन्न बालों की कोशिकाओं और प्राथमिक afferents के गतिविधि का अध्ययन, और एक साथ करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है. यह अकेले, vestibular बालों की कोशिकाओं और प्राथमिक afferents पता लगाने के लिए बातचीत और फिर सिर और शरीर की स्थिति के बारे में मस्तिष्क को प्रेषित की जाने वाली सूचना सांकेतिक शब्दों के बारे में कैसे नई जानकारी का खजाना प्रदान करेगा.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस कार्य के लिए अनुदान आर लिम और ए जे शिविर के लिए एक गार्नेट सर्व और रॉडने विलियम्स मेमोरियल फाउंडेशन परियोजना अनुदान द्वारा प्रदान किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Leibovitz medium L-15 Sigma Aldrich L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green Invitrogen O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope Leica Microsystems A60S
Upright microscope Olympus BX51WI
Two-photon microscope Olympus/La Vision BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps FST 11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs FST 16221-14
Standard Pattern Scissors FST 14001-12
InstraTECH A-D converter HEKA ITC-18
Sutter Micromanipulator Sutter MP-225/M
multiclamp amplifier Axon Instruments 700B
Data acquisition software (electrophysiology) Axograph N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon) Max Planck innovation N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
  2. Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, (2009).
  3. Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, (2009).
  4. Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, (2010).
  5. Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, (2010).
  6. Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
  7. Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
  8. Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
  9. Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
  10. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  11. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
  12. Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
  13. Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
  14. Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी और उच्च संकल्प दो photon माइक्रोस्कोपी के लिए माउस Vestibular संवेदी उपकला की एक पृथक अर्द्ध बरकरार तैयारी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).More

Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter