Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En isolerad Semi-intakt Beredning av Mouse Vestibular sensoriska epitelet för elektrofysiologi och Högupplöst Två-foton mikroskopi

doi: 10.3791/50471 Published: June 13, 2013

Summary

Analys av vestibulär hår cellernas funktion kompliceras av deras läge djupt inne den svåraste delen av skallen, den STENAKTIG temporal ben. Mest funktionella hårcell studier har använt akut isolerade hårceller. Här beskriver vi en semi-intakt beredning av mus vestibulära epitel för elektrofysiologiska och två-photon mikroskopi studier.

Abstract

Förstå vestibulära hårcellerna fungerar under normala förhållanden, eller hur trauma, sjukdom och åldrande störa denna funktion är ett viktigt steg i utvecklingen av förebyggande insatser och / eller nya terapeutiska strategier. Dock har de flesta studier som ser onormala vestibulära funktionen inte varit på cellnivå, men främst inriktad på beteendemässiga analyser av vestibulär dysfunktion såsom gångsvårigheter analyser och vestibulo-okulär reflex prestanda. Även detta arbete har gett värdefulla data om vad som händer när saker går fel, är lite information som samlats om de bakomliggande orsakerna till dysfunktion. Av de studier som fokuserar på de cellulära och subcellulära processer som ligger bakom vestibulär funktion, har mest förlitat sig på akut isolerade hårceller, saknar deras synapsförbindelser och stödjande celler miljö. Därför har en stor teknisk utmaning har tillgång till de utsökt känsliga vestibulära hårcellerna i ett prepdelser som är minst störd, fysiologiskt. Här visar vi en semi-intakt beredning av musen vestibulära sensoriska epitelet som behåller den lokala mikro-miljö, inklusive hårcell / primära afferenta komplex.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trots den betydande bidrag i det vestibulära systemet till vår vardag, en tydlig förståelse av de processer som är ansvariga för den observerade nedgången i vestibulär funktion med åldern förblir svårfångade. En orsak till denna brist på kunskap är att nedgången i vestibulär funktion har nästan uteslutande undersökts med hjälp av beteendemässiga analyser, inklusive vestibulo-okulära reflexen (VOR), en exakt indikator för yttre vestibulär funktion, men ger begränsad insikt i de förändringar av inneboende komponenter . Detta är ett stort hinder för vår förståelse av vestibulära hår cellernas funktion i hälsa, sjukdom, eller åldrande.

Även om det har gjorts många studier av enskilda vestibular hårceller, har en stor brist varit beroende av akuta förberedelser hårceller, där hårceller och även foderblad afferenta terminaler avlägsnas från sin normala miljö via mekanisk och / eller enzymatisk behandling. Sådana metoder inevitanolikt störa den känsliga mikroarkitekturen mellan hårceller och blomfoder, och hår cell och stödjande celler. Med utvecklingen av semi-intakta preparat 1-5, och en isolerad mus labyrint förberedelse 6, finns det nu en möjlighet att studera olika former av synaptisk kommunikation under förhållanden som mer liknar dem som in vivo. Det framgick Lim et al. (2011) markerade skillnader i hela celler strömmar inspelade från akut isolerad typ I vestibulära hårcellerna jämfört med dem som var inbäddad i neuroepitelet. Närmare bestämt är kalium tänkt att ackumuleras i det intercellulära utrymmet, mellan håret cellen och blomfoder afferent, och signifikant förändra svaret hårcell 7. Denna typ av information skulle vara omöjligt att få utan semi-intakt preparat i vestibulära sensoriska epitelet beskrivs här. Vi visar semi-intakt beredning av musen Crista 3, Och visar representativa resultat från hel-cell patch elektrofysiologi, och två-photon kalcium avbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ett. Djur

  1. Möss erhölls från Australian Gnagare Centre (ARC, Perth, Australien) och hölls vid University of Sydney Bosch Animal Facility på en normal 12-h ljus / mörker-cykel med miljöberikning. Samtliga beskrivna experimenten godkändes av University of Sydney Animal etikkommitté.
  2. Manliga och kvinnliga möss (C57/BL6) användes för alla experiment eftersom denna stam vanligen används som bakgrund för genetisk manipulation, och kan anses likvärdiga med vildtyp 8-9.

2. Tissue Preparation

  1. Bered 300 ml av en glycerol-baserad artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) bestående av (i mM): 26 NaHCO 3, 11 glukos, 250 glycerol, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 1,2 MgCl2 och 2,5 CaCl2. Före tillsatsen av CaCl2, gas lösningen med karbogen (95% O2 och 5% CO2) för att etablera apH av 7,4 och undvika utfällning av kalcium (grumlighet). Frys lösningen i en -80 ° C frys under 45 minuter så att en is uppslamning bildas.
  2. Djupt söva möss med ketamin (100 mg / kg) (Parnell, Alexandria, Australien) via en intra-peritoneal injektion.
  3. När hind-limb nypa reflexer är frånvarande Halshugg möss med användning av vassa rostfria sax och göra en sagittal hudsnitt hjälp av ett rakblad (avrundat # 22) för att exponera skallen. Vid denna punkt, och i hela steg 2,3-2,8 för skalle, hjärna, och underliggande vestibulära apparaten ska förvaras så svalt som möjligt genom regelbunden användning av iskall ACSF över vävnaden.
  4. Använda den spetsiga arm vanliga mönster sax (FST, North Vancouver, Kanada) gör ett litet snitt i skallen på Lambda och skär längs sagittal sutur. Se till att hjärnan inte "dras" med saxbett under detta steg.
  5. Skala försiktigt parietalben bort sidled och pannben posteriorly med grunt böj pearson rongeurs (FST).
  6. En liten spatel av rostfritt stål används sedan för att försiktigt lyfta hjärnan från ytan av den mellersta och bakre cranial fossae, och den exponerade vestibulocochlea nerven (CNVIII) skära halvvägs mellan innerörat och hjärnstammen med ett par fina iris sax. Kapning denna nerv minimerar onödig spänning på axoner av de primära afferenterna och deras förbindelser med hårceller.
  7. Efter transektion av KN VIII hjärnan avlägsnas i sin helhet.
  8. Det vestibulära labyrint är nu tydligt i mitten kraniella fossa, med snäckan pekar anteromedially. Rongeur vardera sidan av den vestibulära labyrinten innan försiktigt excising genom att gripa den främre halvcirkelformade kanalen och drar i sidled.
  9. Sänk de utskurna labyrinter (figur 1) i ett dissekera skålen med iskall, kontinuerligt gasades ACSF beskrivs i avsnitt 2.1. Under en stereomikroskop, håll labyrintbasen av skålen genom att greppa snäckan. Använd fin pincett för att skrapa bort på benet överliggande främre halvcirkelformade kanalen ampulla. En i ett litet hål i benet uppnås börjar flick benet bort från ampulla. Försiktighet bör iakttas att inte skjuta pincetten genom benet eftersom detta kan orsaka skador på underliggande membranous labyrint och sensoriska epitelet. Upprepa tills både den främre och angränsande horisontella halvcirkelformade membranösa kanaler och ampuller är exponerade (Figur 2).

Figur 1
Figur 1. Den isolerade musen vestibulära labyrint. A. Vänster panel) Schematisk representation av den isolerade mus vestibulära labyrint. Viktiga referenspunkter för åtkomst vestibulära sensoriska epitelet, snäckan, främre, och horisontella båggångarna är labeled. Asterisker indikerar halvcirkelformade kanalen ampulla innehåller vestibulära sensoriska epitelet. B. Höger panel) mikrofotografi av den isolerade vestibulära labyrinten från en 1-månader gammal mus.

Figur 2
Figur 2. Exponering av Membranös vestibulära labyrinten. Benet överliggande främre och horisontella halvcirkelformade kanalen ampullae har skrapat bort för att avslöja den svart / brun-spräcklig membranous ampuller och tillhörande nerver ampullary (CNVIII). Den schematiska i den nedre panelen representerar strukturerna i det markerade området av mikrofotografiet och visar förhållandet av de halvcirkulära kanalen kanaler till ampullae och CNVIII.

  1. Med fin pincett, försiktigt lyfta ampullae och tillhörande utricle bort från den beniga labyrinten, se till att den centrala regionen av ampullae (containing det sensoriska epitelet) inte är skadad. I vissa fall kan den proximala delen av den halvcirkulära membranös kanalen kan behöva skäras med iris sax för att frigöra ampullae från benet.
  2. Överför triaden innehållande två ampuller och utriculus i en petriskål fylld med Leibovitz L-15 odlingsmedium (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Använd en fiberoptisk att "backlight" vävnaden. Detta möjliggör tydlig visualisering av Crista innehåller sensoriska epitelet i ampuller.
  3. Försiktigt göra ett snitt i spräcklig "tak" av utriculus med de fina iris sax. Fortsätt detta snitt genom taket av den främre och sedan den horisontella ampuller. Gör snittet så nära kanten av det sensoriska epitelet som möjligt utan att den bringas i kontakt (figur 3A). Se till att det inte finns några bitar av membran som ligger ovanför den sensoriska epitelet (figur 3B)
  4. Överför isolerade semi intakt förberedelse till ett litet glass-bottnad inspelning kammare fylld med L-15 media. Tynga framställningen med hjälp av ett rutnät av fina nylonfibrer fästa vid en tillplattad U-formad platinatråd (figur 3B). Helst bör fibrerna i nätet inte ligga över sensoriska epitelet, men i vissa fall där mer stabilisering krävs, en enda fiber transecting det sensoriska epitelet kanske föredras.

Figur 3
Figur 3. Det isolerade semi-intakt beredning av det vestibulära sensoriska epitelet. A. Schematisk representation av den semi-intakt förberedelse och elektrodkonfiguration. Den ampulla överliggande crista har varit "de-takformiga" för att exponera ytan av det sensoriska epitelet (grön). B. mikrofotografi av den semi-intakta 'triaden beredning som visar den främre (ac) och horisontell (hc) crista (utriculus skyms varahind ac). Notera den nylon fiber som används för att fästa beredningen till basen på inspelningen kammaren. Skala bar:. 100 um C. En inspelning elektrod placerad på en enskild vestibulära hår cell. Scale bar: 15 | im.

Tre. Elektrofysiologi

  1. BEGJUTA semi-intakt beredning med kontinuerligt syresatt L-15-medium. Mediet innehåller en pH-indikator (fenolrött) och färgen på substratet bör övervakas under inspelningarna. PH med syre bör vara 7,3 till 7,4 och motsvarar en röd färg.
  2. Förbered inspelning pipetter från 1,5 mm (1,19 mm innerdiameter) borosilikatglas med användning av en två-stegs protokoll (värme steg 1: 72, och värme steg 2: 50) på en mikropipett avdragare (Narishige, Japan, modell PP-830) för att uppnå en slutlig impedans 3-4 Mohm.
  3. Fyll skaftet av pipetten med 3-4 mm av Kaliumfluorid-baserad inre lösning innehållande (i mM) 110 KF, 12 KCl, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1,8 MgCl2,3 D-glukos, och två Na-ATP, pH 7,4 med KOH.
  4. Slå in skaftet på pipetten 2-3 gånger och så långt ner till spetsen som möjligt med en tunn remsa av parafilm för att isolera elektroden och minska pipett kapacitans.
  5. Placera pipetten över sensoriska epitelet under låg effekt förstoring (5X) i en upprätt mikroskop (Olympus BX51). Växla till hög effekt (40X) och visualisera enskilda vestibular hårceller med en bifogad CCD-kamera.
  6. Position pipett på membranet hos en visualiserad hårcell (fig 3C) med användning av en mikromanipulator (Sutter Instruments, Kalifornien, USA). En i en gigaohm tätning uppnås, bristning cellmembranet med en liten mängd negativt tryck appliceras genom en sugport på pipetten hållaren.
  7. Gör hela-cell inspelningar spänningsklämma använder standardmetoder 8-9.

4. Två-foton mikroskopi

  1. Bered en 0,9% saltlösning innehållande 5 mM Oregon Grön488 BAPTA-1 (OGB-1; hexapotassium salt, Invitrogen, Tyskland).
  2. Medan han fortfarande nedsänkt, placera "de-tak" semi-intakt triaden förberedelse på en liten bit filterpapper (4X4 mm, 0,8 um tjockt; Millipore, Tyskland) se till att den sensoriska epitelet är fri från ovan.
  3. Överför filterpappret och förberedelse på den täckta saltlösning bas platinaelektrod (7 | il) av en elektroporator bestående av kombinationen av en pulsgenerator och en bredbandig förstärkare, och täck med en ytterligare 5 | il av 5 mM lösning av det syntetiska kalcium indikatorfärgämne Oregon Grön 488 BAPTA-1 (Figur 4).

Figur 4
Figur 4. Bulk elektroporering. A. schematiskt visar tvärsnitt av elektroporation konfiguration. Den semi-intakta preparat (*) är placerad på en bit filterpapper nedsänkt i kalcium dye (Oregon Grön 488 BAPTA-1) och ström appliceras mellan två platinaelektroder. Anpassad från Briggman och Euler, 2011 10.

  1. Ta den övre parallella platina elektrod med baselektroden på ett avstånd av ca 2 mm, är noga med att inte störa orienteringen av preparatet då kontakt med Oregon Grön 488 BAPTA-1-lösning görs.
  2. Passera en kort ström puls hela beredningen (parametrar för innevarande, +13 V, 10 ms pulsbredd, 1 Hz frekvens, 10 kvadrat-vågpulser) 10-11.
  3. På botten av ett glas botten inspelning kammare fylld med L-15-medium, placera en liten klick silikon olja och placera den semi-intakt förberedelser på det, återigen se till att den sensoriska epitelet är fri från ovan. För att säkerställa stabiliteten i hela avbildning, byt nylon rutnät över preparat som anges ovan (se punkt 2.13).
  4. Använda två-photon mikroskop gör optiska inspelningar av spontantgena kalcium aktivitet i sensoriska epitelet (fig 7) med användning av standardförfaranden avbilda protokoll 10-11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De elektrofysiologiska egenskaperna hos vestibulära hårceller är beroende av den komplexa mikroarkitektur inom vilken de är inbäddade 7. Figur 5 visar att den semi-intakt vestibulära epitel beredning kan användas för att skilja mellan typ I hårceller (figur 5A), typ II hårceller (figur 5B), och om blomfodret primär afferent (figur 5C) baserat på karakteristiska helcells konduktanser. Dessa egenskaper inkluderar en uttalad "sag" under depolarisation och stora "kollapsande" strömmar svans i typ I hårceller, och närvaron av transienta inåt natrium strömmar representerar aktionspotentialer i blomfoder primära afferenta (pilen i figur 5C).

Preparatet kan även användas för att kvantifiera effekterna av åldrandet på enskilda vestibulära typer hårceller. Jämför konduktans (F Figur 6igure 6A) och inaktivering egenskaper (figur 6B) av typ II vestibulära hårceller i gensvar till steg depolarisation från en negativ vilopotential i unga och äldre möss. För typ II hårcellerna - den minst känsliga subtyp-signifikanta skillnader observerades inte i någon parameter (se diskussion).

Utöver analysen av helcell-egenskaper, lånar den semi-intakt preparat sig också att storskalig analys av de subcellulära mekanismer som ligger bakom funktionen hårcell. Figur 7 visar den differentiella lokaliseringen av kalcium till typ I hårceller och blomfoder primär afferenter, samt sub cellulära organisationen av kalcium inuti dessa celler. Figur 7A visar förändringen i kalcium fluorescens i en individuell typ I hårcell på tillsatsen av 100 mM KCl. Tidsförloppet av denna förändring är uppritad i figur 7B. Viktigt är preparation möjliggör för utredning av håret cell aktivitet vid subcellulärt upplösning, i flera celler samtidigt, och i en "nära normal" miljö (figur 7C) - en funktion som inte är möjligt med hjälp av isolerade hårceller och enda cell elektrofysiologi.

Figur 5
Figur 5. Helcell strömmar registrerades från hårceller i musen vestibulära sensoriska epitelet. A. Hela cell strömmar spelats in från en typ I vestibulär hårcell kännetecknas av stort "kollapsa" svans strömmar (Pil). B. helcell strömmar spelats in från en typ II vestibulär hårcell. Notera avsaknaden av svans strömmar. C. Hel cell inspelning från en blomfoder primära afferenta kännetecknas av övergående natrium-medierade strömmar (Arrow) efter depolarisation från en negativ vilopotential (-120 mV). Alla celler were hölls vid -60 mV.

Figur 6
Figur 6. Jämförelse av känslighet och inaktivering hos typ II hårceller från unga och äldre möss. A. I / V relationer för typ II hårceller som spelats in från unga (1 månad) och äldre (9 månader) möss som svar på ökande depolarisation varaktighet. B. Den genomsnittliga konduktans och inaktivering förhållandet typ II hårceller i unga och gamla möss baserat på 100 ms I / V-kurvor.

Figur 7
Figur 7. Två-foton kalcium avbildning av semi-intakt mus vestibulära sensoriska epitelet beredning. A. Överst till vänster) Två-foton micrographs visar BAPTA-1 Oregon Grön kalcium aktivering som svar på vanliga L-15 perfusat(Överst) eller L-15 innehållande 100 mM KCl (underst). Pilar indikerar en individuell hår cell före och efter tillsats av KCl. B. Övre högra panelen) Kalcium fluorescens profilen av cellen markeras i A. C. Undre panel) Två-foton mikroskop av den sensoriska epitelet visar Oregon Grön 488 BAPTA-1 lastning av enskilda hårceller Botten Infällt:. Subcellulära lokalisering av kalcium till typ I håret cellcytoplasma (pil) eller blomfoder primära afferenta kring en typ Jag hårcell (dubbla pilar).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mekanismerna bakom vårt balanssinne har fått begränsad uppmärksamhet i jämförelse med andra sensoriska system, t.ex. visuella och auditiva system. Av de studier som har undersökt förändringar i vestibulär eller balans funktion, har mest fokuserat på beteendemässiga åtgärder inklusive vestibulo-okulär reflex, med ofullständiga kunskaper i de grundläggande byggstenarna i balans-vestibulära hårcellerna själva. De studier som har koncentrerat sig på hårcellerna har nästan undantagslöst gjort så med akut isolerade hårceller avlägsnats från sin ursprungliga miljö. I den här artikeln visar vi en semi-intakt beredning av musen vestibulära sensoriska epitelet som expanderar på dessa fundament studier.

Medan vestibulära hårcellerna är relativt robusta, är nyttan av semi-intakta förberedelser kritiskt beroende av hastigheten på excision. Vanligtvis kommer en beredning förbli livskraftig på room temperatur under en period av ca 2-5 tim efter excision. Därför minimerar den tid det tar från det att djuret avlivas på inspelningen är av största vikt. Den excision kan vara relativt lätt och snabbt för en 3 veckor gammal mus (5-7 min totalt), men blir gradvis svårare i ett äldre djur (upp till 25 min i 9 månader gamla möss). I dessa äldre djur är dissektion temperatur en avgörande faktor - genom att se till att preparatet ständigt badar i iskallt syresatt ACSF normala katabola processer hämmas.

Som beskrivs i avsnitt 3.1 preparatet kontinuerligt perfusion med syresatt Leibovitz medium, L-15 och hel-cellspänning inspelningar klämma gjordes med hjälp glasmikroelektroder fyllda med KF intern lösning 12. Denna kombination av yttre och inre miljö har visat sig ge mer stabila och längre varaktighet inspelningar än andra kalium-baserade interna och / eller Ringersbaserade extracellulära lösningar 13-14. Denna stabilitet är avgörande för de långa protokoll som krävs för att studera elektrofysiologiska egenskaper och dynamik kalcium av hårceller med patch-clamp och två-photon teknik respektive.

Det grundläggande syftet med semi-intakta preparat är att skapa en modell för att studera vestibular hårceller som störs så lite som möjligt. Medan preparatet ger klara fördelar jämfört akut isolerade hårceller - till exempel är de fulla dynamiken i hela celler strömmar endast avslöjas med hjälp av semi-intakta preparat 3, 7 - störningar kan inte undvikas. För det första är det svårt att bedöma konsekvenserna av att ta bort "taket" av ampulla (och förmodligen den bifogade cupula) om spontan hår cellsignalering. Under normala fysiologiska förhållanden, hårceller reagerar på böjning av cupula / hår bunt komplex. Utan denna komplexa är det tänkbart att spontan hår cell signalering kan inte vara representativt för in vivo-förhållanden. Det andra elektrofysiologiska inspelningar i semi-intakta preparat är främst begränsad till mätningar av spontan aktivitet eller ett svar på simulerad naturlig aktivitet (dvs. direkta aktuella injektioner i håret cellen eller mekanisk böjning av hår buntar). Därför är det inte möjligt att studera de underliggande fastigheterna hårceller som svar på verkliga livet aktivering (dvs. huvudrörelser). Ändå representerar den semi-intakt preparat ett nytt verktyg för att hjälpa oss att förstå funktionen hår cell, och öppnar ett antal vägar för framtida forskning.

En stor fördel som den semi-intakta preparat ger över akut isolerade preparat hårceller är att det tillåter samtidiga inspelningar från flera hårceller och / eller deras tillhörande primära afferenter. Använda dubbla, eller multi-cell patch clamp inspelningsteknik här funktionen ger en möjlighet att bedömadirekt hårcell / primära afferenta signalering, något som inte kan uppnås med traditionella isolerade preparat. Dessutom, med hjälp av två-foton-mikroskopi, tillåter den semi-intakt beredning för samtidig mätning av sub-cellulära funktion över den fulla omfattningen av det sensoriska epitelet. Detta innebär att information om kalcium signalering och cellulär metabolism kan periodiseras snabbt och i ett sammanhang. Slutligen, med hjälp av möss möjliggör riktad genetisk manipulation (t.ex. grönt fluorescerande proteinet taggade till calretinin uttryck som en markör för typ I hårceller och foderblad primära afferenter). Den semi-intakta preparatet ger en metod för att studera aktiviteten av hårceller och primära afferenter differentiellt, och samtidigt. Bara detta skulle ge en mängd ny information om hur vestibular hårceller och primära afferenter samverkar för att upptäcka och sedan koda information som skall sändas till hjärnan om huvudet och kroppsställning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Finansieringen för detta arbete lämnades av en Garnett Passe och Rodney Williams Memorial Foundation Projektbidrag till R. Lim och AJ Camp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Leibovitz medium L-15 Sigma Aldrich L4386-10X1L
BAPTA-1-oregon green Invitrogen O6806
EQUIPMENT
Stereo microscope Leica Microsystems A60S
Upright microscope Olympus BX51WI
Two-photon microscope Olympus/La Vision BX51WI/ TriMScope II
Dumont #5 SF Forceps FST 11252-00
Friedman-Pearson Rongeurs FST 16221-14
Standard Pattern Scissors FST 14001-12
InstraTECH A-D converter HEKA ITC-18
Sutter Micromanipulator Sutter MP-225/M
multiclamp amplifier Axon Instruments 700B
Data acquisition software (electrophysiology) Axograph N/A
Imspector Data acquisition software (two-photon) Max Planck innovation N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses. J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).
  2. Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, (2009).
  3. Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, (2009).
  4. Chatlani, S., Goldberg, J. M. Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, (2010).
  5. Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, (2010).
  6. Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear. J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).
  7. Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista. Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).
  8. Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro. J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).
  9. Camp, A. J., et al. Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons. Neuroscience. 170, 348-360 (2010).
  10. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).
  11. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471, 183-188 (2011).
  12. Rennie, K. J., Streeter, M. A. Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals. J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).
  13. Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
  14. Rennie, K. J., Ashmore, J. F. Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris. Hear. Res. 51, 279-291 (1991).
En isolerad Semi-intakt Beredning av Mouse Vestibular sensoriska epitelet för elektrofysiologi och Högupplöst Två-foton mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).More

Tung, V. W. K., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50471, doi:10.3791/50471 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter