Summary
Lytische faag biosensoren en antilichaam kralen zijn in staat onderscheid te maken tussen methicilline resistente (MRSA) en gevoelige stafylokok bacteriën. De fagen werden geïmmobiliseerd door een Langmuir-Blodgett methode op een oppervlak van een kwartskristal microbalans sensor en werkte als breed staphylococcus probes. Antilichaam kralen herkennen MRSA.
Abstract
Een structureel getransformeerd lytische bacteriofagen met een breed gastheerbereik van Staphylococcus aureus-stammen en een penicilline-bindende eiwitten (PBP 2a) antilichaam geconjugeerd latex kralen zijn gebruikt om een biosensor ontwikkeld voor discriminatie van methicilline resistente (MRSA) en gevoelige (MSSA) S creëren . aureus soorten 1,2. De lytische fagen zijn omgebouwd tot faag spheroids door contact met water-chloroform-interface. Faag spheroïde monolagen werden op een biosensor oppervlak bewogen door Langmuir-Blodgett (LB) techniek 3. De gecreëerde biosensoren werden onderzocht door een kwartskristalmicrobalans met dissipatie tracking (QCM-D) om bacteriën-faag interacties te evalueren. Bacterie-spheroïde interacties leidden tot lagere resonantiefrequentie en een stijging van de dissipatie energie voor zowel MRSA en MSSA-stammen. Nadat het bacteriële bleken deze sensoren verder blootgesteld aan de penicilline-bindende eiwit antilichaam latex bolletjes. Sensoren geanalyseerd met MRSA gereageerd 2a antilichaam kralen PBP; hoewel sensoren geïnspecteerd met MSSA gaf geen antwoord. Deze experimentele onderscheid bepaalt een ondubbelzinnig onderscheid tussen methicilline resistente en gevoelige S. aureus-stammen. Evenzeer gebonden en ongebonden bacteriofagen onderdrukken de groei van bacteriën op oppervlakken en in het water schorsingen. Zodra lytische fagen worden veranderd in bolletjes, ze behouden hun sterke lytische activiteit en vertonen een hoge bacteriële capture-mogelijkheid. De faag en faag sferoïden kunnen worden gebruikt voor het testen en sterilisatie van antibioticaresistente micro-organismen. Andere toepassingen kunnen het gebruik in bacteriofaagtherapie en antimicrobiële oppervlakken.
Introduction
Methicilline resistente stammen van Staphylococcus aureus zijn gesuggereerd als een factor in essentiële infecties en nosocomiale uitbraken 4-8. Voorkomende manieren van de erkenning van methicilline resistentie, zoals de disk diffusie oxacillin agar screentest, of bouillon microverdunnings, vertrouwen op maat kweekomstandigheden om de uitdrukking van de weerstand te verbeteren. Veranderingen omvatten het gebruik van oxacilline, incubatie bij 30 of 35 ° C in plaats van 37 ° C, en de toevoeging van NaCl aan het groeimedium. Verder is het voor juiste detectie bij dit soort technieken, een lange incubatietijd van 24 uur in plaats van 16 tot 18 uur vereist. Snelle technieken met de juiste (> 96%) niveau van gevoeligheid voor de identificatie van meticillineresistentie omvatten geautomatiseerde microverdunningsplaten technieken zoals het Vitek GPS-SA-kaart, de Rapid ATB Staphylococcus-systeem, en de Rapid Microscan Panel systeem dat resultaten opleveren na 3-11 uur 9-11. De Crystal MRSA ID systeem is een snelle methode, gebaseerd op de erkenning van de groei van S. aureus in aanwezigheid van 2% NaCl en 4 mg oxacilline per liter met een zuurstof-gevoelige fluorescentie sensor. Beweerde gevoeligheden variëren tussen 91 tot 100% na 4 uur incubatie 12-14. Deze fenotypische methoden zijn beperkt in hun nauwkeurigheid door de impact van de heersende stammen die heterogene weerstand uiten. Daarom is de beste algemeen aanvaarde methoden voor de erkenning van methicilline resistentie is PCR of DNA hybridisatie van het mecA gen 15. Deze techniek vereist echter gezuiverd DNA en is zeer gevoelig voor verschillende hulpstoffen (verontreinigingen) die celresten 16 omvatten.
Bovendien zijn deze technieken hebben een lange tijd uit te voeren. Strategieën voor de herkenning van het mecA genproduct eiwit PBP 2a, kunnen worden gebruikt om resistentie te bepalen en kan betrouwbaarder vergelijking met standaard testtechnieken 17.
Staphylococcus aureus stammen inbegrip van die met meticillineresistentie 1,2,18. In dit werk een nieuwe techniek in de specifieke herkenning en detectie van MRSA, zoals de herkenning van bacteriën met conformatie van MRSA in real time wij voorgesteld. Daarvoor speciaal een S. aureus bacteriofaag met een breed spectrum van systemen (waaronder MRSA) in combinatie met monoklonale antilichamen tegen eiwit (PBP 2a) gebruikt. PBP 2a is een celwand-eiwit en is de oorzaak van antibiotische weerstand van MRSA. Echter PBP 2a antilichaam niet specifiek voor S. aureus omdat sommige andere bacteriën hebben antibiotische bindende eiwitten met sequentie-overeenkomst aan PBP 2a 19,20. Dus ook in dit werk, S. aureus bacteriofagen en antilichamen tegen PBP 2a eiwit zijn gebruikt. Om een biosensor ontwikkelen specificatisch detecteren en identificeren MRSA een apparaat met een twee stappen is gebruikt. De eerste stap die een S. aureus bacteriofaag monolaag als sensor probe, terwijl de tweede stap gebruikt PBP 2a specifieke antilichamen. Daarom is de eerste stap zal S. herkennen aureus bacteriën, zoals de andere zal gevoelig zijn voor het antibioticum-bindend eiwit. Bij ontvangst van twee stappen signalen positief, duidt de specifieke detectie van MRSA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Instellen van het podium
- Verkrijgen type stam S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 en Bacillus subtilis ATCC 6051. Methicilline-resistente stammen van S. aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; De lytische faag 12.600.
- Verkrijgen PBP 2a antilichaam geconjugeerd latexparels.
- Bereid NZY medium zoals beschreven 21.
- Verkrijgen fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Bereid gedemineraliseerd water als subfase voor Langmuir-Blodgett (LB) monolaag depositie.
2. Bacteriofaag Voortplanting en titratie
- Incubeer 5 ml overnacht cultuur van S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 8 kolonievormende eenheden (CFU) / ml) met 500 ul van faag (3 x 10 9 </ Sup> PFU / ml) in 500 ml NZY medium in 2 L Flack on shaker-incubator bij 37 ° C geïncubeerd.
- Centrifugeer cultuur bij 4424 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Re-gecentrifugeerde supernatant bij 11.325 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Filter supernatant door een 0,22 urn Millipore filter.
- Centrifugeer het filtraat bij 75.395 xg gedurende 1,5 uur.
- Los pellet in 100 pl gedestilleerd water.
- Bereid 10-voudige verdunningen van faagsuspensie in NZY medium.
- Plaat 1 ml overnachting (ON) cultuur van S. aureus ATCC 12600 op elk van 2 platen met NZY agar om ervoor te zorgen dat alle oppervlak is bedekt. Verwijder de overmaat aan cultuur en laat het oppervlak drogen gedurende 30 minuten.
- Spot een monster (10 ui) van faag passende verdunning op het oppervlak van de plaat en incubeer bij 37 ° C gedurende 18-24 uur.
- Onderzoekt de vorming van plaques en bereken de faag titer. Bacteriofaag titers (T) worden geschat op basis van het aantal pLaques (N) gevormd per 10 ul volume (v) van faagsuspensie en de verdunningsfactor (F). De titer werd berekend met de formule:. T = N / (VXF) Voor bijvoorbeeld het aantal plaques 75 bij een verdunning 10 -7 en volume 10 pi (10 x 10 -3 ml), de titer gelijk 75 / (10 x 10 -3 x 10 -7) = 7,5 x 10 10 plaque vormende eenheden (PFU) per ml suspensie.
3. Goud-geïmmobiliseerde faag
- Schoon goud gecoate kwarts stukken (60 mm 2) van plasma-etsen in argon gedurende 10 min en vervolgens steriliseren gedurende 6 uur onder UV-licht in een steriele kast.
- Voeg 50 microliter van 1 x 10 9 PFU / ml faagsuspensie het goud oppervlak van elk stuk in een steriele petrischaal, en incubeer overnacht in een vochtige kamer bij kamertemperatuur.
- Verwijder titreren de resterende faagsuspensie.
- Wassen stukken met gebonden faag 5 maal met PBS om ongebonden te verwijderenfaag.
4. Testen van geïmmobiliseerde faag infectiviteit op een droog oppervlak
- Verspreid een O / N cultuur van S. Aureus ATCC 12600 op een NZY agar plaat en laat het drogen.
- Plaats een goudstuk met geïmmobiliseerde faag op de plaat naar beneden.
- Neem een zone van lysis na 12 uur incubatie bij 37 ° C aangeeft dat infectiviteit.
- Met goud bedekt stukken zonder faag in controle-experimenten.
5. Testen van lytische activiteit van vrije en gebonden faag in Liquid
- Voeg een ON cultuur van S. aureus ATCC 12.600-10 ml NZY in elk van vier 300 ml kolven zijarm (6 x 10 6 CFU / ml in elke kolf).
- Voeg toe op twee kolven 2 x 10 6 PFU / ml gratis faag.
- Gebruik de beide andere kolven als controles.
- Bewaak het tijdsverloop van S. aureus cellysis voor 570 min door optische dichtheid meting (OD 600) op 30 min. intervallen voor alle kolven.
- Neem een laatste meting op 24 uur.
- Herhaal de stappen 5,1-5,5, maar gebruik goudstukken met gebonden fagen in plaats van vrij fagen, en goudstukken zonder faag in control kolven.
6. Verlies van gebonden fagen Tijdens Incubation
- Voeg 50 ul van 1 x 10 9 PFU / ml faag aan het oppervlak van steriele goudstuk in een petrischaal die wordt geplaatst in een vochtige kamer gedurende de nacht bij kamertemperatuur.
- Verwijder de ophanging met ongebonden faag uit de gouden oppervlak en titer.
- Was de gouden stuk met gebonden faag 5 maal met PBS en in 1 ml NZY oplossing in 15 ml buis shaker-incubator bij 37 ° C gedurende 8 uur.
- Bepaal de titer van de vrijstaande faag zoals beschreven in 2.
7. Faag Sferoïden Voorbereiding
- Combineren 400 pl stock faag 12600 suspensie (10 11 PFU / ml) met een gelijk volume chloroform spectrofotometrische graad in 1 ml flaconbij kamertemperatuur.
- Voorzichtig vortex de faag-chloroform ophanging 5-6 keer (5 sec interval) meer dan een minuut duren.
- Mag de schorsing te stabiliseren gedurende 30 seconden en vervolgens pipet van de bovenste fase die spheroids afgepipetteerd voor monolaag voorbereiding.
- Neem een paar microliter van de sferoïden suspensie voor de transmissie en scanning elektronenmicroscopie.
- Gebruik een resterende spheroïde suspensie voor biosensor productie.
8. Biosensor Voorbereiding
- Clean QCM-D sensors plasma etsen in argon gedurende 10 min PDC-32G Harrick plasma cleaner.
- Spoel de sensor met hexaan om eventuele organische verontreinigingen te verwijderen.
- Bereiden en schoon een dieptepunt van de film evenwicht zoals beschreven in 22.
- Vul LB trog met een subfase oplossing en reinig deze met een trog barrière en stabiliseren de trog bij 20 ± 0,1 ° C
- Verspreid 300 pi aliquot van faag 12.600 in waterige suspension (10 11 PFU / ml) op LB subfase.
- Bereid faag monolaag op LB subfase oplossing doordat 300 pi aliquot van faag 12.600 waterige suspensie (10 11 PFU / ml) te lopen naar beneden een hellend bevochtigbaar glazen staaf die gedeeltelijk wordt ondergedompeld in de subfase 22,23.
- Stabiliseer de bereide monolaag gedurende 10 min, en vervolgens te comprimeren met een snelheid van 30 mm / min (45 cm 2 / min), totdat een constante druk 19 N / m wordt bereikt.
- Voer een verticale film depositie op loodrecht QCM-D sensor met een snelheid van 4,5 mm / min door achtereenvolgens dompelen sensor in en uit de monolaag zeven keer. Elektronenmicroscopie van neergeslagen faag monolagen vóór blootstelling aan bacteriële monsters bleek dat de lagen werden continu, homogeen en uniform (gegevens niet getoond).
- Herhaal stappen 4,5-4,8 met een faag sferoïde suspensie die wordt bereid in 3.
- Gebruik gefabriceerd faag biosensoren voor MRSA-detectie, elektronmicroscopie en ellipsometrie.
9. Biosensor testen, Discriminatie van Methicilline Resistente en gevoelige Staphylococcus Bacteriën
- In dit protocol zijn biosensoren met ongemodificeerde en gemodificeerde faag en faag spheroids voorbereid. Een kwartskristalmicrobalans met vier sensor stromingskamers wordt gebruikt om toezicht te houden binding van bacteriën aan de fagen geïmmobiliseerd op QCM sensoroppervlak. PBP 2a geconjugeerd latex korrels worden gebruikt om tussen methicilline resistente (MRSA) en gevoelige Staphylococcus bacteriën. Alle metingen worden uitgevoerd in de stroom-modus (50 ul / min) en 5 MHz.
- Een basis lijn resonantiefrequentie van de QCM sensor in water (~ 30 min).
- Teken een schorsing van levende methicilline gevoelige Staphylococcus bacteriële cellen in water (10 9 CFU / ml) door de test cel.
- Voortdurend veranderingen in de sensoren resonantiefrequentie en energie dissipatie monitor voor de eerste boventoon, USIng van de Q-Soft-software.
- Als de veranderingen in de resonantiefrequentie sensoren en afbraak bereikt verzadigingsniveaus, voeg de suspensie van PBP geconjugeerd latex korrels (6,77 x10 10 parels / ml) om de stroming tijdens de continue monitoring van de frequentie en dissipatie.
- Herhaal de stappen 9,2-9,5 voor methicilline resistente staphylococcus bacteriële cellen (MRSA).
- Definieer een frequentie verandering door de massale verandering als gevolg van bacteriën, door de Sauerbrey vergelijking 24,25 = Af-Δm xn / C, waarbij C de massa gevoeligheid constante (C = 17,7 ng x cm -2 x Hz -1 bij 5 MHz ), m is massa en n het getal boventoon (n = 1).
- Definieer een energie dissipatie verandering (Δ D) uit de opname van de exponentieel verval van de trilling (frequentie en amplitude demping, die kwantificering van de energie afgevoerd en opgeslagen gedurende een periode van trilling toegestaan,E verdreven en E opgeslagen, respectievelijk: Δ D = E afgevoerd / 2 πE opgeslagen. Δ D wordt gemeten in dissipatie eenheden (DU), een DU = 10 -6 relatieve eenheden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De faag gedemonstreerd lytische activiteit tegen alle geteste stammen van S. aureus, waaronder MRSA-stammen, zoals aangegeven door de faag spot test. Plaque groottes algemeen varieerden van 5 tot 15 mm. Geen activiteit werd gevonden tegen andere test kweken (tabel 1).
Een normale groei van S. aureus ATCC 12600 in NZY middelgrote on shaker-incubator bij 37 ° C is weergegeven in figuur 1A (een curve gemerkt met lege cirkels). Het aantal bacteriën toegenomen van 3,2 x 10 6-4,0 x 10 8 CFU / ml. Figuur 1A (a curve aangeduid door gevulde cirkels) toont de resultaten van de co-kweken van 2,0 x 10 6 PFU / ml vrij faag gelijktijdig toegevoegd, dezelfde concentratie S. aureus ATCC 12600. Faag, geïmmobiliseerd op het gouden oppervlak, toonde de lytische activiteit vergelijkbaar met de activiteit van faag suspensie (figuur 1A, kromme gelabeld door bovenaf driehoeken). Geïmmobiliseerd faag infectief bleef bij de gouden stuk met faag werd eerst gebruikt in 24-uur kweken experiment, vervolgens werd 5 keer gewassen en opgeslagen in PBS gedurende 6 dagen bij 4 ° C, en tenslotte opnieuw met een verse bacteriële suspensie. (Figuur 1A, curve gelabeld door bijvullen driehoeken). Het lijkt erop dat geïmmobiliseerde fagen injecteren hun DNA in bacteriën, waardoor lege capsiden die niet in staat nieuwe bacteriën zijn. Onze hypothese is dat geïmmobiliseerde fagen op een gouden ondergrond diende als primaire "katalysatoren" om een paar bacteriën infecteren, die gratis fagen die op hun beurt infecteren nieuwe bacteriën enzovoort genereren. Daarom is het grootste deel van geïmmobiliseerde fagen waarschijnlijk niet in de eerste 24 uur kweken experiment en kan daarom worden gebruikt voor de tweede keer. De oppervlaktedichtheid van fagen afgezet door fysische adsorptie ongeveer -0,7 faagdeeltje / um 2. Deze concentratie is hoog, maar het kan groeien tot 10 maal 2. Daarom kon de gouden plaat s te nemenome van de vrije levensvatbare fagen vrijgegeven door geïnfecteerde bacteriën in de eerste 24 uur kweken experiment.
Figuur 1B toont de lysis zone rond het goudstuk, wat aangeeft dat de geïmmobiliseerde fagen kunnen lyseren bacteriële cellen waren. In de controle-experimenten, heeft de lege gouden plaat niet de groei van bacteriën remmen. Vandaar de effectieve vermindering van bacteriële groei vond bij de co-cultuur van bacteriën en geïmmobiliseerd faag is een gevolg van primaire interactie van water zwevende bacteriën en gebonden faag zoals getoond in figuur 1C. De faag onthechting van het goud oppervlak tijdens co-incubatie van gebonden faag en bacteriën was klein. Om te schatten hoeveel fagen werden losgemaakt van het goud oppervlak tijdens incubatie werden monsters van gebonden faag ondergedompeld in NZY oplossing geschud in de shaker-incubator bij 37 ° C gedurende 8 uur, en een vrije concentratie faag supernatant werd beoordeeld. We hebben vastgesteld dat 4,1 x 10 7 PFU waren Bound een 60 mm 2 goudstuk (~ 0,7 faagpartikel / um 2), wanneer er slechts 3 x 10 4 PFU werden losgemaakt (0.007% onthechting).
De transmissie en scanning elektronen microfoto van intacte lytische faag 12600 op de gouden substraat oppervlak wordt getoond in de figuren 2A en 2B. Bij de faag suspensie werd onderworpen aan behandeling chloroform, werd de faag uiterlijk verandert. De staart gecontracteerd in lengte en verdikt. De veelhoekige hoofd werd afgerond (figuren 2D en 2E). We noemen de structureel gemodificeerde lytische faag "sferoïde" vergelijkbaar met de naam van de chloroform behandeld filamenteuze faag 26. Ondanks de grote structurele veranderingen resulteerden uit chloroform behandeling, heeft het bolvormige lytische activiteit gemeten door plaque nummers niet veranderd (Figuren 2C en 2F). De gemiddelde lytische activiteit van faag en sferoïden werden (7,4 ± 1,5 (SD)) x 10 10 (N = 4) en (7,5 ± 1.0 (SD)) x 10 10 (N = 7), PFU / ml. Op het niveau van 0,05, de activiteiten van faag en sferoïden niet significant verschillend (figuur 2C en 2F).
De QCM sensoren met geïmmobiliseerde lytische fagen toonde geen significante veranderingen in de resonantiefrequentie of energiedissipatie wanneer ze werden blootgesteld aan MRSA (Figuur 3A). Deze gegevens geven aan dat MRSA / faag samenwerking kende een geen massa veranderen volgens QCM, en toch de electronenmicroscoop van na biosensoren getest bleek significant bacteriële binding aan het sensoroppervlak (Figuur 3B).
Wanneer MRSA suspensies werden geïnjecteerd in de stroomcel met faag sferoïde biosensoren, een aanzienlijke daling in de frequentie (Δ f ≈ -105 Hz) en een verhoging van de dissipatie (waarde van te meten ≈ 26 DU) waargenomen (figuur 3C). Na faag sferoïde-bacteriële (MRSA) bindingsinteracties, getest sensors werden blootgesteld aan PBP2a geconjugeerd latexparels suspensies. Deze MRSA getest biosensors reageerde op de PBP2a geconjugeerd latexparels suspensies, aangezien een verdere daling van de frequentie (Δ f ≈ -45 Hz) en een verhoging van de dissipatie (waarde van te meten ≈ 15 DU) waargenomen (figuur 3C). Binding van MRSA om probes en PBP2a geconjugeerd latex korrels faag werd bevestigd met behulp van scanning elektronenmicroscopie onderzoeken (Figuur 3D).
Als de faag bolvormige biosensor is blootgesteld MSSA suspensies, een aanzienlijke daling van de frequentie (Δ f ≈ -200 Hz) en een verhoging van de dissipatie (waarde van te meten ≈ 55 DU) waargenomen (figuur 3E). Na faag sferoïde-MSSA bindingsinteracties, werden getest sensoren uitgedaagd met PBP2a antilichaam geconjugeerd latexparels schorsingen. Aanvankelijk, de MSSA getest biosensor toonde korte transiënten vantoename in frequentie en daling van dissipatie. Na een paar minuten van MSSA en PBP2a antilichaam geconjugeerd latexparels interacties, frequentie terug naar PBP2a antilichaam introductie niveaus plaatsen, maar de dissipatieve energie toegenomen (figuur 3E). Binding van MSSA om faag sondes werd bevestigd met scanning elektronenmicroscopie, maar geen binding tussen MSSA en PBP2a antilichaam geconjugeerd latexparels werd waargenomen (Figuur 3F). Ellipsometrische dikteprofiel, 3D-dikte kaart van lytische fagen en staphylococcus bacteriën worden getoond in Aanvullende figuren S1 en S2.
Na contact van de sensoren met LB geïmmobiliseerde fagen of sferoïden om de schorsing van 10 9 cellen / ml van MRSA of MSSA, werden de bacteriën waargenomen op fagen of sferoïden binden op dichtheid (ρ) van 9,1 x 10 7 (MRSA / intact fagen), 7,9 x 10 7 (MRSA / sferoïden) en 7,2 x 10 7 (MSSA / sferoïden) cellen / cm 2. Inproeven met 5 verschillende lytische fagen en 2 gastheerbacteriën 27 onderzoekers onderworpen fagen geïmmobiliseerd door covalente binding methode 10 9 cellen / ml bacteriën, en bepaalde de faag afvangrendement in verschillende (2,5-8,9) x 10 5 cellen / cm 2 . De faag afvangrendement in dit werk ~ 100 keer hoger.
| Gastheer | Spannen | Strain gegevens | Methicilline gevoeligheid | Faag gevoeligheid |
| S. aureus | 12600 | ATCC | S | + |
| S. aureus | 27690 | ATCC | S | + |
| S. aureus | 10292 | IA | S | + |
| 10378 | IA | S | + | |
| S. aureus | 10497 | IA | S | + |
| S. aureus | 10686 | IA | S | + |
| S. aureus | MRSA 1 | AU | R | + |
| S.aureus | MRSA 2 | AU | R | + |
| S. aureus | MRSA 5 | AU | R | + |
| S. aureus | MRSA 13 | AU | R | + |
| S.aureus | MRSA 26 | AU | R | + |
| S. aureus | MRSA 34 | AU | R | + |
| S. aureus | MRSA 45 | AU | R | + |
| B. anthracis | Sterne | AU | NA | - |
| Salmonella typhimurium | LT2 | AU | NA | - |
| Shigella flexneri | onbekend | AU | NA | - |
| Yersinia enterocolitica | onbekend | AU | NA | - |
| Proteus mirabilis | onbekend | AU | NA | - |
| Klebsiella pneumoniae | 13882 | AU | NA | - |
| Bacillus subtilis | 6051 | ATCC | NA | - |
Tabel 1. Faag 12600 gevoeligheid van bacteriële streinen IA - uit dieren zijn geïsoleerd;. AU - bacteriecultuur collectie van Auburn University, NA - niet van toepassing, een - lytische activiteit van faag werd bepaald door plaques vorming, +, gevoelig, -, niet gevoelig. Overnachtkweken van geteste stammen werden uitgeplaat op de platen met NZY agar. Na drogen van het oppervlak werd een monster (10 ul) van 10 11 PFU faagsuspensie gespot op het oppervlak van de plaat. Platen werden gedurende 18-24 uur geïncubeerd bij 37 ° C. Lytische activiteit van de fagen werd gedetecteerd door de vorming van plaques.
Figuur 1. Infectieuze eigenschappen van gebonden en vrije faag. A. Bacteriële groei in de afwezigheid (lege cirkels) en aanwezigheid (dichte cirkels) vrije faag, in de aanwezigheid van faag gebonden aan goud oppervlak (bijvullen triangles), en in aanwezigheid van faag gebonden aan goud oppervlak na 6 uur bij 4 ° C (top down driehoekjes). Insert: De lijn (1) toont een lineaire aanpassing van de faag geen groei experimentele data aan de vergelijking (4) (R = -0,99, p <0,0001). De lijn (2) toont een fit van de experimentele gegevens van bacteriële groei in de vrije faag aanwezigheid op dezelfde vergelijking. Bacteriegroei constante (k) in de afwezigheid en aanwezigheid van vrije faag, gelijk zijn 0,88 en 0,64, (-0,048, daling fase). Representatieve gegevens van drie onafhankelijke experimenten worden getoond in paneel A. Een gemiddelde relatieve fout OD600 metingen niet meer dan 5%. B. Faag geïmmobiliseerd op het goud oppervlak is besmettelijk, zoals aangegeven door de lysis rond het goudstuk. 1 - het fragment van de agar plaat met bacteriën; 2 - het goudstuk met geïmmobiliseerde fagen;. 3 - de remming zone rond het goudstuk C. Schematische weergave van de bacterie lyse door faag bevestigd aan de gouden oppervlak. 1 -goud gecoate kwarts stuk, 2 - faag gebonden aan het goud oppervlak, 3 - bacterie verankerd door gebonden fagen, 4 - gratis fagen zijn vrijgegeven door barsten geïnfecteerde bacterie. Gebruikt met toestemming van: Guntupalli, R., et al., 2012.. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Eigenschappen van intacte en gemodificeerde faag A en B - Transmissie en scanning electronenmicroscoop van intacte faag, respectievelijk;.. C - faag lytische activiteit op een agar plaat met MRSA D en E - Transmission en scanning electronenmicroscoop van intacte faag sferoiden, respectievelijk; F - lytische faag sferoïden eenctivity op een agar plaat met MRSA. De gemiddelde activiteit van faag en sferoïden zijn (7,4 ± 1,5 (SD)) x 10 10 (N = 4) en (7,5 ± 1,0 (SD)) x 10 10 (N = 7) PFU / ml. T-toets: t = 0,15682, p = 0,87851. Op het 0,05-niveau, de activiteiten van de faag en spheroids zijn niet significant verschillend. Bars: A, B, D en E: 200 nm. Gebruikt met toestemming van:. Guntupalli, R., et al., 2012.
Figuur 3. Gecombineerde QCM-D en EM analyse van faag-bacterie interacties. Bacteriën werden aan de sensor geleverd in een concentratie van 10 9 CFU / ml suspensie in water bij een stroomsnelheid van 50 pl / min. 1, 2 representeren veranderingen in de resonantiefrequentie en de energiedissipatie respectievelijk. A. Faag coated QCM-D sensor respons op MRSA. Pijl toont thij MRSA levertijd aan het sensoroppervlak. B. Scanning electronen microscoop van de post getest MRSA gebonden aan lytische faag geïmmobiliseerd op de QCM sensor. M-MRSA, P-fagen op het sensoroppervlak. C. Opeenvolgende reacties van de faag sferoiden gecoate QCM-D sensor om MRSA eerst en daarna om antilichamen kralen PBP. Pijlen geven MRSA en PBP antilichaam levertijd aan het sensoroppervlak, respectievelijk. D. Scanning electronen microscoop van de post getest biosensor met faag spheroids, MRSA, en PBP antilichaam kralen. Dikke en dunne pijlen toont typische MRSA cel en antilichaam kraal, respectievelijk. E. Opeenvolgende reacties van de faag sferoiden gecoate QCM-D sensor aan S. aureus eerst en daarna om antilichamen kralen PBP. Pijlen geven S. aureus en PBP antilichaam levertijd aan het sensoroppervlak, respectievelijk. F. Scanning electronen microscoop van de post getest biosensor met faag sferoiden, S. aureus, en PBP antilichaam kralen. Dikke en dunne pijlen toont typische S. aureus cellen en antilichamen kraal, respectievelijk. Gebruikt met toestemming van: Guntupalli, R., et al., 2012.. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Aanvullende Cijfers
Figuur S1. Aanvullende Figuur 1. (A) en (b) een ellipsometrische dikte profiel en 3D dikte plan van een lytische faag, respectievelijk (effectieve brekingsindex = 1,05). Dikte profielen tonen gemiddelde, RMS-ruwheid, minimale en maximale dikte van de monolaag. Een lijn over de dikte kaart werd getrokken om de dikte profiel te genereren.
50474/50474figs2.jpg "/>
Figuur S2. Aanvullend Figuur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is bekend dat fagen kunnen worden gebruikt als biosensor probes voor bacteriële pathogenen 28. Het is aangetoond dat dit werk faag met PBP 2a antilichamen kunnen worden gebruikt om het oude probleem: snelle discriminatie antibiotica resistente en gevoelige stammen.
Het bleek echter deze normale ongewijzigde Staphylococcus fagen zijn niet geschikt voor detectie met bacteriën QCM apparaten, hoewel ze bacteriën binden. De faag staart is zo lang dat akoestische golven niet kunnen "bereiken" de bacteriën gebonden aan het einde van faag staarten. Deze voorwaarde resulteerde in een "ontbrekende massa" effect 29 en onvermogen om resonantiefrequentie en afbraak wijziging vast ondanks de significante binding getoond door EM afbeeldingen (Figuren 3A en 3B). Dit probleem werd snel opgelost door het vervangen van de intacte faag met bolletjes, de faag gewijzigd door chloroform-waterbehandeling. Deze behandeling resulteerde in volledig functioneel phage met korte, dikke en niet-flexibele staart (figuren 2D, 2E en 2F). Wanneer fagen werden vervangen door sferoïden in biosensoren werden de MRSA gemakkelijk gedetecteerd door QCM-D apparaat.
Toen faagpartikels waren gebonden aan goud oppervlakken op een juiste oriëntatie, hun receptoren waren toegankelijk voor het gastheerbacteriën. Als direct fysiek contact tussen een vast oppervlak met fagen en een gedroogde bacteriële laag ontstaan, de geïmmobiliseerde fagen in staat zijn van het injecteren van virale genoom in gastheerbacteriën (figuur 1C). Deze resultaten komen goed overeen met die verkregen met lytische fagen geïmmobiliseerd op glazen schijf oppervlakken door een covalente binding techniek 27. Het vermogen van gebonden lytische fagen gastheerbacteriën vangen werden ook aangetoond door een gebiotinyleerde faag immobilisatietechniek 30. In tegenstelling, heeft een zeer eenvoudige fysische adsorptie methode voor het bevestigen van goed georiënteerd fagen aan vaste oppervlakken zijn gebruikt 31. Thij hoge faag sferoïde afvangrendement kan worden voor het effectief antimicrobiële oppervlakken. Een totale time-to-verantwoorden voor de voorgestelde test is ongeveer 16 min. per monster. Deze tijd kan aanzienlijk worden verkort door QCM apparaten met een groot aantal kamers. De verwachte houdbaarheid van de faag sensoren ongeveer 3-4 maanden bij kamertemperatuur. Met een biopolymeer bescherming kon worden verlengd tot enkele jaren 32. De detectielimiet van S. aureus werd gemeten voor deze faag door oppervlakte plasmon resonantie spectroscopie, en bleek 10 4 CFU / ml 18.
Een van de belangrijkste voorwaarden voor het gebruik van werkwijzen beschreven in dit artikel is om te voldoen aan schone en steriele condities 33 voorschriften voor alle experimenten met fagen en bacteriën.
Veelgebruikte methoden voor detectie van MRSA, zoals de disk diffusie oxacillin agar screentest, of bouillon microdilutie nemen normally tot 24 uur voor het uitvoeren van de test. Snelle technieken die geautomatiseerde technieken zoals het Vitek GPS-SA-kaart, de Rapid ATB stafylokok-systeem, de Rapid Microscan Panel-systeem, en de Crystal MRSA-ID systeem zijn resultaten ook na 3-11 uur 9-14. PCR of DNA-hybridisatie van het mecA-gen 15 is een relatief snelle en nauwkeurige methode maar vereist gezuiverd DNA en uiterst gevoelig onzuiverheden. In tegenstelling, de in dit werk beschreven werkwijze is snel, DNA-extractie niet nodig en is niet gevoelig voor hulpstoffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Het werk hierin gemeld werd ondersteund door subsidies van Auburn University AUDFS en USAF CRADA 07-277-60MDG-01. De standpunten in dit artikel zijn die van de auteurs en geven niet de officiële beleid of standpunt van de United States Air Force, Ministerie van Defensie, of de Amerikaanse regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P4417 | |
| spectrophotometric-grade chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 154733 | (99.8% A.C.S.) |
| Hexane-Anhydrous | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 29609-0 | (95%) |
| Ethyl Alcohol | Pharmco products Inc. Brookfield, CT | 64-17-5 | 190 Proof |
| Equipment | |||
| PBP 2a antibody conjugated latex beads | Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan | The MRSA-Screen test | |
| S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from | American Type Culture Collection (Manassas, VA); | ||
| MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 | The culture collection of Auburn University, Auburn, AL | ||
| Centrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K Ultra Centrifuge | |
| KSV 2200 LB film balance | KSV Chemicals, Finland | ||
| Light microscope optical system | CitoViva Technology Inc., Auburn, AL | ||
| QCM-D | Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden | E4 | |
| Scanning electron microscope (SEM) | JEOL USA Inc., Peabody, MA | JEOL-7000F SEM | |
| Transmitting electron microscopy (TEM) | JEOL USA Inc., Peabody, MA | JEOL, JEM 2010 | |
| Stericup, Presterilized | Millipore Corporation, Billerica, MA | SCGPU05RE | 0.22 μm, GP Express PLUS membrane |
| Bio-Assay dish | NUNC A/S, Denmark | 240835 | Dimensions(mm), 245 x 245 x 25 |
| Pipettes | Gilson, Pipetman, France | P100, P200, P1000 | |
| C24 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific, CT | Classic C24 | |
| Gold-coated quartz pieces | Auburn University, AL | Homemade | |
| Petri dishes | Fisher Brand, USA | 0875713 | 100 mmX15 mm |
| SterilGard III Advance | The Baker Company, ME | SG403 | |
| Culture Growing Flasks | Corning Incorporated, NY | 4995 | PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks |
| Optical Spectrometer | Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. | 4001 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma, USA | PDC-32G | |
| Millipore water purification system | Millipore | Direct-Q | |
| Imaging Ellipsometer | Accurion, USA | nanofilm_ep3se | |
| Software | Q-Sense AB, Sweden | QSoft, QTools | |
References
- Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes. Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).
- Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements. J. Microbiol. Methods. 90, 182-191 (2012).
- Guntupalli, R., Sorokulova, I., Long, R., Olsen, E., Neely, W., Vodyanoy, V. Phage Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films. Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 82, 182-189 (2011).
- Barie, P. S. Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice. World. J. Surg. 22, 118-126 (1998).
- Byun, D. E., Kim, S. H., Shin, J. H., Suh, S. P., Ryang, D. W. Molecular epidemiologic analysis of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens. J. Korean Med. Sci. 12, 190-198 (1997).
- Duan, L., Lei, H., Huang, E., Yi, G., Fan, W. Drug resistance of Staphylococcus aureus from lower respiratory tract. Zhonghua Yiyuanganranxue Zazhi. 21, 1667-1668 (2011).
- Giamarellou, H., Papapetropoulou, M., Daikos, G. K. Methicillin resistant' Staphylococcus aureus infections during 1978-79: clinical and bacteriologic observations. J. Antimicrob. Chemother. 7, 649-655 (1981).
- Knopf, H. J. Nosocomial infections caused by multiresistant pathogens. Clinical management exemplified by multiresistant Staphylococcus aureus. Urologe A. 36, 248-254 (1997).
- Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of differential inoculum disk diffusion method and Vitek GPS-SA card for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 433-436 (1994).
- Struelens, M. J., Nonhoff, C., Van, D. A., Philippe Mertens, R., Serruys, E. Evaluation of rapid ATB Staph for 5-hour antimicrobial susceptibility testing of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 33, 2395-2399 (1995).
- Woods, G. L., LaTemple, D., Cruz, C. Evaluation of MicroScan rapid gram-positive panels for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 1058-1059 (1994).
- Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of BBL crystal MRSA ID system. J. Clin. Microbiol. 32, 2588-2589 (1994).
- Qadri, S. M., Ueno, Y., Imambaccus, H., Almodovar, E. Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Crystal MRSA ID System. J. Clin. Microbiol. 32, 1830-1832 (1994).
- Zambardi, G., Fleurette, J., et al. European multicentre evaluation of a commercial system for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 747-749 (1996).
- Chambers, H. F. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).
- Brown, D. F. J., Edwards, D. I., et al. Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J. Antimicrob. Chemother. 56, 1000-1018 (2005).
- Gerberding, J. L., Miick, C., Liu, H. H., Chambers, H. F. Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 35, 2574-2579 (1991).
- Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., Simonian, A. L. Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus-A surface plasmon resonance spectroscopic study. Biosens. Bioelectron. 22, 948-955 (2007).
- Popham, D. L., Young, K. D. Role of penicillin-binding proteins in bacterial cell morphogenesis. Current Opinion in Microbiology. 6, 594-599 (2003).
- Wei, Y., Havasy, T., McPherson, D. C., Popham, D. L. Rod shape determination by the Bacillus subtilis class B penicillin-binding proteins encoded by pbpA and pbpH. J. Bacteriol. 185, 4717-4726 (2003).
- Grieco, S. H. H., Lee, S., Dunbar, W. S., MacGillivray, R. T. A., Curtis, S. B. Maximizing filamentous phage yield during computer-controlled fermentation. Bioprocess and Biosystems Engineering. 32, 773-779 (2009).
- Olsen, E. V., Pathirana, S. T., Samoylov, A. M., Barbaree, J. M., Chin, B. A., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment. J. Microbiol. Methods. 53, 273-285 (2003).
- Pathirana, S. T., Barbaree, J., Chin, B. A., Hartell, M. G., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Rapid and sensitive biosensor for Salmonella. Biosens. Bioelectron. 15, 135-141 (2000).
- Sauerbrey, G. The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing. Z. Phys. 155, 206-222 (1959).
- Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy Dissipation Kinetics for Protein and Antibody-Antigen Adsorption under Shear Oscillation on a Quartz Crystal Microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
- Griffith, J., Manning, M., Dunn, K. Filamentous bacteriophage contract into hollow spherical particles upon exposure to a chloroform-water interface. Cell. 23, 747-753 (1981).
- Hosseinidoust, Z., Van de Ven, T. G. M., Tufenkji, N. Bacterial Capture Efficiency and Antimicrobial Activity of Phage-Functionalized Model Surfaces. Langmuir. 27, 5472-5480 (2011).
- Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (53), e2740 (2011).
- Voinova, M. V., Jonson, M., Kasemo, B. Missing mass" effect in biosensor's QCM applications. Biosens. Bioelectron. 17, 835-841 (2002).
- Gervals, L., Gel, M., et al. Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces. Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).
- Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption. Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).
- Sorokulova, I., Watt, J., et al. Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage. J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).
- Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
