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Bioengineering

生物传感器检测抗生素耐药金黄色葡萄球菌细菌

doi: 10.3791/50474 Published: May 8, 2013

Summary

溶解性噬菌体生物传感器和抗体有孔玻璃珠,能够区分耐甲氧西林(MRSA)和敏感的金黄色葡萄球菌细菌。在噬菌体一个石英晶体微天平传感器的表面上固定由LB膜法,担任广泛葡萄球菌探针。抗体珠认识MRSA。

Abstract

甲结构转化的裂解的噬菌体具有广泛的宿主范围的金黄色葡萄球菌菌株和青霉素结合蛋白(PBP 2a)的抗体的乳胶珠已被用于创建的生物传感器设计(MRSA)和耐甲氧西林敏感(MSSA)S歧视。金黄色葡萄球菌1,2。裂解噬菌体噬菌体球体已转换成通过用氯仿接口接触。生物传感器表面上已经移到噬菌体球体单层LB膜技术(LB)3。创建的生物传感器已经由耗散跟踪石英晶体微天平(QCM-D),以评估细菌噬菌体的相互作用的研究。细菌的旋转椭球体的相互作用导致降低了谐振频率和两个MRSA和MSSA菌株中耗散的能量增加。细菌绑定后,这些传感器被进一步暴露的青霉素结合蛋白的抗体乳胶珠秒。分析与MRSA的传感器响应PBP 2a的抗体珠;,虽然传感器与MSSA检查没有任何反应。这个实验的区别确定一个明确的耐甲氧西林敏感的之间的歧视金黄色葡萄球菌菌株。同样绑定和未绑定噬菌体表面上抑制细菌的生长,并在水中悬浮。一旦裂解噬菌体被改变成球体,他们保留自己的强有力的催化活性和大量细菌捕获能力。噬菌体和噬菌体的球状体,可以利用抗生素抗性的微生物进行测试和灭菌。其它应用可能包括利用噬菌体治疗和抗菌表面。

Introduction

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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌已被建议作为必不可少的一个因素,感染及院内爆发4-8。甲氧西林耐药的认可,常见的方式,如纸片扩散法苯唑西林琼脂屏幕测试,或肉汤稀释量身定制的培养条件下,依靠增强表达的阻力。改建包括利用苯唑西林,潜伏期为30或35°C,而不是37℃,并加入氯化钠中的生长培养基。此外,为了正确检测这些类型的技术,一个很长的潜伏期为24小时,而不是16至18小时。快速的技术鉴定耐甲氧西林的灵敏度(> 96%)的水平适当的技术,如维特克GPS-SA卡,快速ATB金黄色葡萄球菌系统,快速迈思肯面板系统包括自动稀释3-11小时后产生的结果9-11。 CRYSTAL MRSA ID系统是一种快速的方法,根据承认生长影响黄色葡萄球菌的存在下,2%NaCl和4毫克每升苯唑西林具有对氧敏感的荧光传感器。声称灵敏度范围91至100%之间,4小时后孵化12-14。这些表型的方法在其精度是有限的流行株表达异构性的影响。因此,甲氧西林耐药的确认最好的被广泛接受的方法是PCR或DNA杂交mecA基因15。然而,这种技术需要纯化的DNA,是极其敏感的各种混合物(杂质),其中包括细胞碎片16。

此外,这些技术需要很长的时间来执行。策略,以确认mecA基因的产品,蛋白PBP 2a中,可以利用,以确定电阻,并可能更可靠的标准测试技术17。

1,2,18甲氧西林耐药性的金黄色葡萄球菌菌株。在这项工作中,我们提出了一种新的技术,例如在特定的识别和检测MRSA细菌一起构象的MRSA实时确认。对于这个特定的目的S.金黄色葡萄球菌噬菌体结合蛋白单克隆抗体的广泛的主机(包括MRSA菌株)(PBP 2a的)已被使用。 PBP 2a是细胞壁蛋白,它是MRSA的抗生素的电阻率的原因。然而PBP 2a的抗体是不特定为S金黄色葡萄球菌,因为一些其他细菌的抗生素结合蛋白序列相似PBP 2a的19,20。因此在这项工作中,S.金黄色葡萄球菌噬菌体和抗PBP 2a的蛋白已被使用。为了能够开发出一种生物传感器,具体新增Cally MRSA的检测和识别设备已动用两个步骤的行动。最初的步骤使用了S。金黄色葡萄球菌噬菌体单层作为传感器探头,而第二个步骤中使用PBP 2a的特异性抗体。因此,加强一眼便认出S。金黄色葡萄球菌的细菌,其他人会敏感抗生素结合蛋白。当从两个步骤中接收到的信号是正的,则表示的特定检测MRSA。

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Protocol

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1。设置舞台

  1. 获取型菌株S。金黄色葡萄球菌 ATCC 12600,S.金黄色葡萄球菌 ATCC 27690和枯草芽孢杆菌 ATCC 6051。耐甲氧西林菌株的金黄色葡萄球菌 - MRSA1,MRSA,MRSA,MRSA MRSA MRSA 5 13 26 34 45,MRSA,B.福氏志贺氏菌,鼠伤寒沙门氏菌 LT2, 炭疽斯特恩耶尔森氏菌enterocolotica,奇异变形杆菌,肺炎克雷伯菌 13882;裂解噬菌体12600。
  2. 获得PBP 2a的抗体乳胶颗粒。
  3. 准备NZY的介质描述21。
  4. 获得的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中。
  5. 准备去离子水为LB膜(LB)单层沉积亚相。

2。噬菌体繁殖和滴定

  1. 孵育5毫升过夜培养S.金黄色葡萄球菌 ATCC 12600(3.6×10 8菌落形成单位(CFU)/毫升)与500μl的噬菌体(3×10 9 </ SUP> PFU /毫升)500毫升的NZY介质在2升长颈瓶摇床培养箱中37℃过夜。
  2. 离心文化在4,424 XG 10分钟,在4°C。
  3. 再离心上清在4℃下11,325 xg离心10分钟
  4. 通过0.22μm微孔过滤器过滤上清液。
  5. 离心滤液在75395×g离心1.5小时。
  6. 沉淀溶解于100μl蒸馏水中。
  7. 准备的噬菌体悬浮液的10倍稀释液,在NZY培养基中。
  8. 板1毫升过夜(ON)的S.文化金黄色葡萄球菌 ATCC 12600到每个2板NZY琼脂,以确保所有的表面被水覆盖。取出多余的文化和30分钟,让表面干燥。
  9. 现货板表面上适当的噬菌体稀释样品(10微升),并在37℃孵育18-24小时。
  10. 检查斑块的形成,并计算噬菌体滴度。噬菌体滴度(T)的p的数目的基础上估计的噬菌体悬浮液和稀释倍数(F)的10微升体积(v)条形成的laques(N)的数目。滴度计算公式计算:T = N /(VXF),例如,对于空斑数75在稀释10 -7和10微升的体积(10×10 -3毫升),滴定度等于75 / (10×10 -3×10 -7)= 7.5×10 10噬斑形成单位(PFU)每ml悬液。

3。黄金固定噬菌体的

  1. 清洁金涂层的石英片(60毫米2)通过等离子蚀刻10分钟,然后在氩气中的灭菌6小时,在UV光下在无菌柜。
  2. 加入50μl的1×10 9 PFU / ml的噬菌体悬浮液在无菌培养皿中的每一块在金表面,然后在室温下在潮湿的腔室中孵育过夜。
  3. 删除及滴度剩下的噬菌体悬液。
  4. 结合的噬菌体件,5倍,用PBS洗涤除去未结合的噬菌体。

4。在干燥的表面固定化噬菌体侵染测试

  1. 金黄色葡萄球菌 ATCC 12600 O / N的文化传播到NZY琼脂平板上,并让干燥。
  2. 将黄金固定噬菌体到的板面。
  3. 观察一个区域的温育12小时后溶解在37℃下,该值指示传染性。
  4. 使用黄金覆盖件在对照实验中,没有噬菌体。

5。结合的噬菌体液体催化活性测试

  1. 添加ON文化S.黄色葡萄球菌 ATCC 12600到10毫升的NZY在每一个四个300毫升侧臂的烧瓶中(6×10 6 CFU / ml的每个烧瓶中)。
  2. 加在两个烧瓶2×10 6 PFU / ml的游离噬菌体。
  3. 使用作为对照组的另外两个烧瓶。
  4. 监控到的时间过程中,S。 570分钟由金黄色葡萄球菌细胞裂解测量光密度(OD 600)在30分钟的时间间隔为所有烧瓶。
  5. 以最终在24小时测量。
  6. 重复步骤5.1-5.5,但与对照烧瓶没有噬菌体结合的噬菌体,而不是免费的噬菌体,使用金币和金币。

6。孵化过程中结合的噬菌体亏损

  1. 添加50μl的1×10 9 PFU / ml的噬菌体无菌金片的表面上,在培养皿中,置于潮湿的腔,在室温下过夜。
  2. 取下悬挂与未结合的噬菌体的黄金表面和滴度。
  3. 洗涤5次,用PBS,地点在1毫升的NZY溶液摇床培养箱中在15毫升管结​​合的噬菌体金片在37℃下8小时。
  4. 确定如2所述的分离的噬菌体的滴度。

7。噬菌体球体准备

  1. 用1毫升的小瓶分光级的氯仿的等体积的结合库存噬菌体12600悬浮液(10 11 PFU /毫升)的400微升在室温下。
  2. 轻轻涡旋噬菌体氯仿暂停一分钟持续时间超过5-6次(间隔5秒)。
  3. 宠物的悬浮液稳定,持续30秒,然后移液管顶端相,含有单层制备吸球粒。
  4. 径的球状体的悬浮液,用于传输和扫描电子显微镜几微升。
  5. 使用剩余的球体悬浮生物传感器制造业。

8。生物传感器的制备

  1. 清洁QCM-D传感器在氩气等离子体刻蚀10分钟哈里克PDC-32G等离子清洗机。
  2. 用己烷冲洗传感器,以消除任何有机杂质。
  3. 准备和清理的电影中所描述的22平衡低谷。
  4. 填写LB槽,一个副相解决方案和清洁槽屏障和稳定的低谷,在20±0.1°C
  5. 传播300微升等分的噬菌体12600在水suspensi(10 PFU / 11毫升)到LB副相。
  6. 准备噬菌体单层到LB副相溶液通过允许300微升噬菌体12600水悬浮液(10 PFU / 11毫升),运行等分可湿性玻璃棒部分浸没入亚相22,23倾斜。
  7. 稳定10分钟后,制备的单分子层,然后将压缩的速度为30毫米/分钟(45厘米/分),直到一个恒定的压力达到19牛顿/米。
  8. 执行垂直的膜沉积于垂直定位的QCM-D传感器的速率为4.5毫米/分钟,,依次浸渍传感器中的单层七次。电子显微镜观察沉积的噬菌体单层前暴露于细菌样本显示层是连续的,均匀的和均匀的(数据未示出)。
  9. 重复步骤4.5-4.8噬菌体球体悬浮准备3。
  10. MRSA的检测,电子制造噬菌体生物传感器显微镜和椭圆。

9。生物传感器的测试,歧视耐甲氧西林敏感的葡萄球菌

  1. 在这个协议中,生物传感器与未改性和改性的噬菌体和噬菌体球体的准备。采用石英晶体微有四个传感器流量室是用来监测结合的细菌的噬菌体固定在QCM传感器表面。 PBP 2a的抗体乳胶珠利用区分耐甲氧西林(MRSA)和敏感的葡萄球菌。在流模式(50微升/分钟)进行所有的测量都在5 MHz。
  2. 建立一个基线水(〜30分钟)的QCM传感器的共振频率。
  3. 绘制活甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌的细菌细胞在水(10 9 CFU / ml)的通过测试细胞的悬浮液中。
  4. 不断监测变化的传感器共振频率和耗能第一泛音,USI使用Q-Soft软件。
  5. 当传感器的谐振频率和耗散的变化达到饱和电平,加到PBP抗体共轭乳胶珠(6.77×10 10珠/毫升)的悬浮液的流动过程中连续监测频率和耗散。
  6. 重复步骤9.2-9.5耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的细菌细胞。
  7. 通过大规模的变化,由于细菌结合Sauerbrey方程24,25ΔF=ΔMXN / C,其中C是质量灵敏度常数(C = 17.7纳克为x cm -2 X赫兹-1在5 MHz定义的频率变化) 中,m是质量,n是谐波数(n = 1时)。
  8. 定义了一个能量耗散的变化(ΔD)从记录的指数衰减振荡(频率和振幅衰减,这使得定量消耗的能量和存储在一个周期内的振荡ê 消散 电子存储 ,分别为:ΔD =Ë 消散 / 2 存储 πE。 ΔD是测量消散单元(DU),DU = 10 -6相对单位)。

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Representative Results

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对所有测试菌株噬菌体展示催化活性金黄色葡萄球菌 ,MRSA菌株,所指示的噬菌体斑点试验。斑块的大小一般从5毫米到15毫米不等。没有对其他测试( 表1)文化活动被发现。

一个正常的生长影响ATCC 12600 金黄色葡萄球菌在37℃摇床培养箱在的NZY介质上显示如图1A(曲线标记的空圈)。细菌的数量增加至3.2×10 6〜4.0×10 8 CFU /毫升(实心圆标记的曲线图1A)示出结果的共培养2.0×10 6 PFU / ml的免费噬菌体同时添加有相同浓度的S.金黄色葡萄球菌 ATCC 12600。噬菌体,固定在金表面上,表现出的催化活性与噬菌体悬浮液中的活性( 图1A,曲线由自上而下三角形标记)。保持固定化的噬菌体感染金片与噬菌体时,最初是用在生长24小时的实验,然后它被洗涤5次,并存储在PBS中6天,在4℃,最后重复使用新鲜的细菌悬浮液。 ( 图1A,曲线由顶起来三角形标记)。它似乎是固定的噬菌体的DNA注入细菌,留下空衣壳,这是不能胜任新的细菌感染。我们推测,在金表面上的固定化的噬菌体作为主要的加氢催化剂的“几个细菌感染,产生游离的噬菌体反过来的感染新的细菌等。因此,大部分的固定化的噬菌体可能不使用在第一个24小时的实验,因此,可利用第二次。沉积通过物理吸附的噬菌体的表面密度为约0.7〜噬菌体颗粒/μm2以下。此浓度高,但它可以长到10倍2。因此,黄金板块可以纳入小号青梅免费可行的噬菌体感染的细菌释放在第一个24小时的实验。

图1B示出的裂解区周围的金片,表明固定化的噬菌体裂解细菌细胞。在对照实验中,没有空黄金板块抑制细菌的生长。因此,发现在细菌和固定化的噬菌体的共培养物的细菌生长的有效减少水悬浮细菌和图1C中所示的结合的噬菌体的主要相互作用的结果。噬菌体支队在金表面结合的噬菌体和细菌共同培养过程中是很小的。为了估计有多少噬菌体金表面脱离孵化过程中,结合的噬菌体的样品浸泡8小时的的NZY解决方案,在37℃摇床培养箱动摇,一个免费的噬菌体培养上清中浓度评估。我们确定,4.1×10 7 PFU奔d到60毫米的金片(〜0.7噬菌体颗粒/ 2微米)时,只有3×10 4 PFU分离(0.007%支队)。

图2A和2B中所示的传输和扫描电子显微镜照片上的金衬底表面的完整的裂解的噬菌体12600。当噬菌体悬浮液进行氯仿处理,噬菌体的物理外观被改变了。的尾部收缩的长度和增厚。多边形头变圆( 图2D和2E)。我们称之为氯仿处理的丝状噬菌体26的名称类似的“旋转椭圆体”结构改性的裂解的噬菌体。尽管从氯仿处理导致的显着的结构变化,通过噬菌斑数测量的旋转椭球体的溶解活性并没有改变( 图2C和2F)。噬菌体和球粒的平均溶解活性分别为(7.4±1.5(SD))×10 10(N = 4)和(7.5±1。0(SD))×10 10(N = 7),PFU /毫升。在0.05的水平上,对噬菌体与球体的活动没有显着性差异( 图2C和2F)。

QCM传感器固定裂解噬菌体没有表现出显着的共振频率的改变或能量耗散,当他们接触到MRSA( 图3A)。这些数据表明,MRSA /噬菌体相互作用导致在无质量变化,根据石英晶体微天平,但后测定的生物传感器的电子显微照片显示了显着的细菌结合在所述传感器表面( 图3B)。

当MRSA的悬浮液注射到流动池与噬菌体的旋转椭球体的生物传感器,大幅减少的频率(fΔ≈-105赫兹),观察到增加的耗散(ΔD≈26 DU)( 图3C)。球体细菌(MRSA)的噬菌体结合的相互作用,检测本身PBP2a的抗体乳胶颗粒悬浮液暴露nsors。这些MRSA检测PBP2a的抗体乳胶珠悬浮液的生物传感器,由于在频率进一步下降(ΔF≈-45赫兹)和耗散的增加(ΔD≈15 DU)进行观察( 图3C)。约束力的MRSA的噬菌体探针和PBP2a的抗体乳胶珠被证实使用扫描电子显微镜调查( 图3D)。

当噬菌体旋转椭球体的生物传感器暴露MSSA的悬浮液,在频率大幅下降(Δf≈-200赫兹)和耗散的增加(ΔD≈55 DU)进行观察( 图3E)。继噬菌体的MSSA球体结合的相互作用,传感器检测PBP2a的抗体乳胶颗粒悬浮液的挑战。最初,MSSA的生物传感器测定表明短的瞬态的频率增加,并减少损耗。经过几分钟的MSSA和PBP2a的抗体乳胶珠相互作用,频率返回到发布的PBP2a的抗体引入水平,但耗散的能量增加( 图3E)。用扫描电子显微镜证实的MSSA到噬菌体探针的结合,但没有观察到( 图3F)之间MSSA和PBP2a的抗体乳胶珠结合。椭偏厚的个人主页上,3D厚度地图裂解噬菌体和葡萄球菌补充图S1和S2。

继接触传感器的LB固定化的噬菌体或球粒为10 9个细胞/ ml的MRSA或MSSA该悬浮液中,观察到的细菌结合的噬菌体或球粒的密度(ρ)为9.1×10 7个(MRSA /完好无损噬菌体), 7.9×10 7(MRSA /球粒),和7.2×10 7(MSSA /球粒)细胞/ cm 2。在使用5个不同的裂解的噬菌体和2宿主菌27的测试中,研究人员受到固定的共价结合的方法,以10 9细胞/ ml的细菌的噬菌体,并确定的噬菌体捕获效率(2.5-8.9)×10 5个细胞/ cm 2的范围内。在这项工作中的噬菌体捕获效率是高〜100次。

主持人 应变 应变详情 耐甲氧西林敏感性 噬菌体的敏感性
金黄色葡萄球菌 12600 ATCC Ş +
金黄色葡萄球菌 27690 ATCC Ş +
金黄色葡萄球菌 10292 IA Ş +
10378 IA Ş +
金黄色葡萄球菌 10497 IA Ş +
金黄色葡萄球菌 10686 IA Ş +
金黄色葡萄球菌 MRSA 1 AU ŗ +
金黄色葡萄球菌 MRSA 2 AU ŗ +
金黄色葡萄球菌 MRSA 5 AU ŗ +
金黄色葡萄球菌 MRSA 13 AU ŗ +
金黄色葡萄球菌 MRSA 26 AU ŗ +
金黄色葡萄球菌 MRSA 34 AU ŗ +
金黄色葡萄球菌 议员SA 45 AU ŗ +
炭疽 斯特恩 AU NA -
鼠伤寒沙门氏菌 LT2 AU NA -
痢疾杆菌 未知 AU NA -
小肠结肠炎耶尔森氏菌 未知 AU NA -
奇异变形杆菌 未知 AU NA -
肺炎克雷伯氏菌 13882 AU NA -
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 6051 ATCC NA -

表1中。噬菌体的细菌S 12600的感光度列车。IA -从动物中提取的; AU -奥本大学的细菌培养收集NA -不适用; A -噬菌体裂解活性斑块形成,+,敏感,定义-不敏感。试菌株接种到NZY琼脂板过夜培养。表面干燥后,将样品(10微升)10 11 PFU噬菌体悬浮液被察觉的板材的表面上。在37℃下孵育18-24小时。的噬菌体的裂解活性检测斑块的形成。

图1
图1。绑定到金表面的结合和游离的噬菌体感染特性A.细菌生长在没有(空圈)和存在(实心圆)的免费噬菌体,噬菌体的存在下(补足风帆iangles),并在噬菌体的存在下,在4到6小时后的金表面绑定℃下(自上而下三角形)。插入:该生产线(1)示出没有噬菌体生长的等式(4)(R = -0.99,P <0.0001)的实验数据的线性拟合。该生产线(2)示出了适合细菌生长的实验数据,在其自由的噬菌体存在相同的方程。细菌生长的常数(k)在缺乏和存在的游离噬菌体,等于0.88和0.64(-0.048,衰退期)。面板A.代表三个独立的实验数据显示,平均相对误差外径600次测量不超过5%。B.噬菌体固定在金表面感染裂解区周围的金片。 1 - C.示意图黄金表面的细菌噬菌体裂解片段与细菌的琼脂板,2 -金片固定噬菌体; 3 -金片的抑菌圈周围。 1 -镀金石英片,2 - 噬菌体结合到金表面,3 - 挂靠结合的噬菌体,4 - 免费噬菌体的细菌已发布通过爆破感染细菌。许可:,R.,Guntupalli的使用等。2012点击这里查看大图

图2
图2。 A和 B 的属性的完好和修改噬菌体。 -传输和扫描电子显微镜完整的噬菌体,分别为C -噬菌体裂解活性琼脂平板上的MRSA。D和 E -变速箱和完好的的噬菌体球体,分别扫描电子显微照片; F -噬菌体裂解一个球体ctivity琼脂平板上的MRSA。噬菌体和球粒的平均活性为(7.4±1.5(SD))×10 10(N = 4)和(7.5±1.0(SD))×10 10(N = 7)PFU /毫升。 T-测试:t = 0.15682,P = 0.87851。在0.05的水平,噬菌体与球体的活动都没有显着差异。酒吧:A,B,D,E:200纳米。使用许可:Guntupalli,R. 等2012。

图3


图3。 QCM-D和EM分析噬菌体-细菌相互作用结合细菌被传递到传感器10 9 CFU / ml的悬浮液在水中的浓度为50μl/分钟的流速。 1,2表示在谐振频率和能量耗散的变化,A.噬菌体涂层QCM-D传感器响应的MRSA。箭头显示t他MRSA的交货时间到传感器表面。后B.扫描型电子显微镜照片测定MRSA的方向固定在QCM传感器裂解的噬菌体。 M-MRSA,在传感器表面上的P-噬菌体。C.逐次反应中的噬菌体球体涂覆QCM-D传感器MRSA第一然后PBP抗体有孔玻璃珠。箭头表示MRSA和PBP抗体的交货时间到传感器表面,D.扫描后的电子显微镜照片测定的生物传感器与噬菌体球体,MRSA,PBP抗体珠。厚和薄箭头显示了典型的MRSA细胞和抗体的磁珠,分别E.连续反应噬菌体球体涂层的QCM-D传感器S.金黄色葡萄球菌 ,然后再PBP抗体的有孔玻璃珠。箭头表示S.到传感器表面的金黄色葡萄球菌和PBP抗体送货时间。F.扫描后的电子显微镜照片测定的生物传感器噬菌体球体,S.葡萄球菌和 PBP抗体珠子。厚和薄箭头显示了典型的S。金黄色葡萄球菌细胞和抗体的珠。许可:,R.,Guntupalli的使用等。2012点击这里查看大图

补充数据

图S1
图S1。补充图1(a)(b)是椭圆的厚度分布曲线和3D厚度地图裂解噬菌体,分别为(有效折射率= 1.05)。厚度剖面显示,均方根粗糙度,最小和最大的单层厚度。被吸引到A线的厚度上图生成厚度分布。

50474/50474figs2.jpg“/>
图S2。补充图2。

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Discussion

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这是众所周知的,细菌病原体的生物传感器探针28可以用作噬菌体。这是表明在这项工作中,可以被用来解决的老问题:快速鉴别抗生素抗性及敏感菌株的噬菌体一起与PBP 2a的抗体。

发现,但那些正常的未改性的金黄色葡萄球菌噬菌体细菌检测与QCM装置​​是不适合的,尽管它们绑定细菌。噬菌体尾部是如此之长,声波不能“达到”约束的细菌噬菌体尾结束。这种情况会导致在“质量缺失”的效果29和无力注册共振频率和耗散的变化表明EM在尽管显著结合的图像( 图3A和3B)。这个问题很容易解决与球体更换完整的噬菌体,噬菌体氯仿水处理修改。这种治疗导致全功能p哈格与短,粗和非柔性的尾巴( 图2D,2E,2F)。当噬菌体换成生物传感器中的球体,很容易被检测到MRSA的QCM-D设备。

当噬菌体金表面粒子被束缚在一个正确的方向,及其受体访问主机菌。如果噬菌体的固体表面和干燥的细菌层之间的直接物理接触时,固定化的噬菌体能够注射到宿主细菌( 图1C)的病毒基因组。这些结果同意以及与裂解噬菌体获得固定玻璃盘表面通过共价结合技术27。捕捉宿主菌裂解噬菌体结合的能力,也证明了利用生物素标记的噬菌体固定化技术30。与此相反,一个非常简单的方向正确噬菌体附着到固体表面的物理吸附法已动用31。 Ť高噬菌体的旋转椭球体的捕获效率,可用于有效的抗菌表面。的总时间回答建议检测每个样品约16分钟。腔室具有大量使用QCM装置​​,该时间可以显着缩短。为噬菌体传感器的预期的保质期在室温下约3-4个月。使用的生物聚合物的保护,它可以延长到几年32。 S.的检出限黄色葡萄球菌该噬菌体的由表面等离激元共振谱测定,结果为10 4 CFU / ml的18。

使用本文中描述的方法的最重要的条件之一是符合清洁和无菌条件下33要求的所有实验用噬菌体和细菌。

常用的方法检测MRSA,如苯唑西林琼脂纸片扩散屏幕测试,或肉汤稀释诺玛LLY长达24小时进行测试。快速的技术,包括维特克GPS-SA卡,快速ATB金黄色葡萄球菌系统,快速迈思肯面板系统,水晶MRSA ID系统自动化技术,如9-14 3-11小时后产生的结果。 PCR或DNA杂交的mecA基因15是一种相对快速和准确的方法,但需要纯化的DNA,是极为敏感的杂质。与此相反,在这项工作中所描述的方法是快速的,并不需要DNA的提取,并且它不是敏感的外加剂。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争经济利益。

Acknowledgments

本文报道的工作的支持补助金奥本大学AUDFS的和美国空军CRADA 07-277-60MDG-01。作者在这篇文章中所表达的意见,不反映美国的空军,国防部,或美国政府的官方政策或立场。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P4417
spectrophotometric-grade chloroform Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 154733 (99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 29609-0 (95%)
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT 64-17-5 190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge Beckman Coulter Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden E4
Scanning electron microscope (SEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized Millipore Corporation, Billerica, MA SCGPU05RE 0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish NUNC A/S, Denmark 240835 Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes Gilson, Pipetman, France P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific, CT Classic C24
Gold-coated quartz pieces Auburn University, AL Homemade
Petri dishes Fisher Brand, USA 0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance The Baker Company, ME SG403
Culture Growing Flasks Corning Incorporated, NY 4995 PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. 4001
Plasma Cleaner Harrick Plasma, USA PDC-32G
Millipore water purification system Millipore Direct-Q
Imaging Ellipsometer Accurion, USA nanofilm_ep3se
Software Q-Sense AB, Sweden QSoft, QTools

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References

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生物传感器检测抗生素耐药金黄色葡萄球菌细菌
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Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).More

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