Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Biosensor til detektion af antibiotikaresistente Staphylococcus Bakterier

Published: May 8, 2013 doi: 10.3791/50474
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University, 2Clinical Research Laboratory, 81st Medical Group, Keesler Air Force Base

Summary

Lytiske fag biosensorer og antistof perler er i stand til at skelne mellem methicillin resistente (MRSA) og følsomme Staphylococcus bakterier. De fager immobiliseres ved en Langmuir-Blodgett metoden på en overflade af en kvartskrystalmikrovægt sensor og arbejdede som bredspektrede Staphylococcus-prober. Antistof-perler genkende MRSA.

Abstract

Et strukturelt transformeret lytisk bakteriofag med et bredt værtsområde af Staphylococcus aureus-stammer og en penicillin-bindende protein (PBP 2a) antistof konjugerede latexperler er blevet udnyttet til at skabe en biosensor konstrueret til diskrimination af methicillinresistente (MRSA) og følsomme (MSSA) S . aureus arter 1,2. De lytiske fager er blevet omdannet til fag spheroids ved kontakt med vand-chloroform interface. Fag kugleformede monolag er blevet flyttet over på en biosensor overflade ved Langmuir-Blodgett (LB) teknik 3.. De oprettede biosensorer er blevet undersøgt af en kvartskrystalmikrovægt med dissipation sporing (QCM-D) for at evaluere bakterier-fag interaktioner. Bakterier-kugleformede interaktioner førte til reduceret resonansfrekvens og en stigning i dissipation energi til både MRSA og MSSA stammer. Efter bakterielle bindende, er disse sensorer er yderligere udsat for penicillin-bindende protein-antistof latexperles. Sensorer analyseret med MRSA reageret på PBP 2a antistof perler, selvom sensorer inspicerede med MSSA gav ingen svar. Denne eksperimentelle skelnen afgør en entydig forskelsbehandling mellem methicillin resistente og følsomme S. aureus stammer. Lige bundet og ubundne bakteriofager undertrykke bakterievækst på overflader og i vand suspensioner. Når lytiske fager ændres til spheroids, de bevarer deres stærke lytisk aktivitet og vise høj bakteriel capture formåen. Fag og fag sfæroider kan anvendes til afprøvning og sterilisering af antibiotikaresistente mikroorganismer. Andre applikationer kan omfatte brug i bakteriofag terapi og antimikrobielle overflader.

Introduction

Methicillin resistente stammer af Staphylococcus aureus er blevet foreslået som en faktor i væsentlige infektioner og nosokomielle udbrud 4-8. Almindelige måder anerkendelsen af ​​methicillinresistens, såsom disk diffusion oxacillin agar skærmen test, eller bouillon mikrofortyndingsplader, afhængige skræddersyede dyrkningsbetingelser til at forbedre ekspressionen af ​​resistens. Ændringer omfatter udnyttelsen af ​​oxacillin, inkubation ved 30 eller 35 ° C i stedet for 37 ° C, og optagelsen af ​​NaCl til vækstmediet. Desuden er det for korrekt registrering af disse typer af teknikker, en lang inkubationstid på 24 timer i stedet for 16 til 18 år hr er påkrævet. Hurtige teknikker med passende (> 96%) niveau af følsomhed til identifikation af methicillinresistens omfatter automatiserede mikrofortyndingsplader teknikker såsom Vitek GPS-SA-kort, Rapid ATB Staph systemet og Rapid Microscan Panel system, som producerer resultater efter 3-11 hr 9-11. The Crystal MRSA ID systemet er en hurtig metode, baseret på anerkendelse af væksten i S. aureus i nærvær af 2% NaCl og 4 mg oxacillin per liter med en iltfølsomt fluorescens sensor. Reklamerede følsomheder ligge mellem 91 till 100% efter 4 timer inkubation 12-14. Disse fænotypiske metoder er begrænsede i deres nøjagtigheder med virkningen af ​​fremherskende stammer, der udtrykker heterogene modstand. Derfor er den bedste bredt accepteret metoder til anerkendelse af methicillinresistens er PCR eller DNA hybridisering af mecA genet 15.. Men denne teknik kræver oprenset DNA og er yderst følsomt over for forskellige tilsætninger (urenheder), som omfatter celledebris 16..

Desuden er disse teknikker har brug for en lang tid at udføre. Strategier til anerkendelsen af mecA genproduktet, protein PBP 2a, kan bruges til at bestemme modstanden og kan være mere pålidelige i forhold til standard testteknikker 17.

Staphylococcus aureus stammer, herunder dem der methicillinresistens 1,2,18. I dette arbejde har vi foreslået en ny teknik i den specifikke genkendelse og sporing af MRSA, såsom anerkendelse af bakterier sammen med konformation af MRSA i realtid. Til dette specifikke formål a S. aureus bakteriofag med et bredt spektrum af værter (herunder MRSA stammer) kombineret med monoklonalt antistof mod protein (PBP 2a) er blevet anvendt. PBP 2a er en cellevæg-protein, og det er årsagen til antibiotikum resistivitet af MRSA. Men PBP 2a antistof er ikke specifik for S. aureus da nogle andre bakterier har antibiotiske proteiner med sekvenslighed med PBP 2a 19,20. Derfor i dette arbejde, S. aureus bakteriofag og antistoffer mod PBP 2a proteinet er blevet anvendt. At være i stand til at udvikle en biosensor til specifitisk registrere og identificere MRSA en enhed med en to trin er udnyttet. Det første skridt brugte en S. aureus bakteriofag monolag som en sensor probe, mens det andet trin anvendte PBP 2a specifikke antistoffer. Derfor trin man vil genkende S. aureus bakterier, vil som den anden være følsom over for antibiotikummet-bindende protein. Når signaler modtaget fra to trin er positiv, indikerer det specifikke påvisning af MRSA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Indstilling af Stage

  1. Opnå typestamme S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 og Bacillus subtilis ATCC 6051. Methicillin-resistente stammer af S. aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5 MRSA 13, MRSA 26 MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882, Den lytiske fag 12600.
  2. Opnå PBP 2a antistof konjugerede latexperler.
  3. Forbered NZY medium som beskrevet 21.
  4. Opnå phosphatpufret saltopløsning (PBS).
  5. Forbered deioniseret vand som underfase til Langmuir-Blodgett (LB) monolag aflejring.

2.. Bakteriofag Formering og titrering

  1. Inkuber 5 ml natten over kultur af S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 8 kolonidannende enheder (CFU) / ml) med 500 gl af fag (3 x 10 9 </ Sup> PFU / ml) i 500 ml NZY medium i 2 L Flack på rysteinkubator ved 37 ° C natten over.
  2. Centrifugér kultur ved 4.424 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
  3. Re-centrifugeret supernatanten ved 11.325 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
  4. Filter supernatant gennem et 0,22 um Millipore-filter.
  5. Filtratet centrifugeres ved 75.395 xg i 1,5 time.
  6. Opløs pellet i 100 ul destilleret vand.
  7. Forbered 10-folds fortyndinger af fag suspension i NZY medium.
  8. Plade 1 ml natten over (ON) kultur S. aureus ATCC 12600 på hver af 2 plader med NZY agar for at sikre alle flade er dækket. Fjern overskud af kultur og lade overfladen tørre i 30 minutter.
  9. Spot en prøve (10 ul) af passende fag fortynding på overfladen af pladen og inkuberes ved 37 ° C i 18-24 timer.
  10. Undersøg dannelsen af ​​plaques og beregne fag titer. Bakteriofagvektorer titere (T) er estimeret på basis af antallet af pLaques (N) dannet pr 10 gl volumen (v) af fag suspension og fortyndingsfaktoren (F). Titeren blev beregnet ved formlen:. T = N / (VXF) For eksempel, for antallet af plaques 75 ved fortynding 10 -7 og volumen 10 ul (10 x 10 -3 ml), titeren er lig 75 / (10 x 10 -3 x 10 -7) = 7,5 x 10 10 plakdannende enheder (PFU) pr ml suspension.

3.. Guld-immobiliseret Phage

  1. Rene guldbelagte kvarts stykker (60 mm 2) ved plasmaætsning i argon i 10 minutter og derefter sterilisere i 6 timer under UV-lys i en steril kabinet.
  2. Tilføj 50 mikroliter af 1 x 10 9 PFU / ml fag suspensionen til guld overflade af hvert stykke i en steril petriskål, og inkubér derefter natten over i et fugtigt kammer ved stuetemperatur.
  3. Fjern og titrere resterende fag suspensionen.
  4. Vask stykker med bundne fag 5 gange med PBS for at fjerne ubundetfagen.

4.. Afprøvning af immobiliseret Fag Infektivitet på en tør overflade

  1. Spred en O / N-kulturen af S. Aureus ATCC 12600 på en NZY agarplade og tillade tørring.
  2. Læg et guldstykke med immobiliseret fag på pladen nedad.
  3. Observere en zone af lyse efter 12 timers inkubation ved 37 ° C, der angiver infektivitet.
  4. Brug guldbelagte stykker med ingen fag i kontrolforsøg.

5.. Afprøvning af lytisk aktivitet af Free og bundne fag i Liquid

  1. Tilføj en ON kultur S. aureus ATCC 12600 til 10 ml NZY i hver af fire 300 ml sidearm kolber (6 x 10 6 CFU / ml i hver kolbe).
  2. Tilføj I to kolber 2 x 10 6 PFU / ml fri fag.
  3. Brug de to andre kolber som kontrolgruppe.
  4. Overvåg tidsforløbet af S. aureus cellelyse i 570 minutter ved optisk tæthed måling (OD600) ved 30 minutters intervaller for alle kolber.
  5. Træffe en endelig måling på 24 timer.
  6. Gentag trin 5,1-5,5, men brug guldstykker med bundne fager stedet for gratis fager og guld stykker med ingen fag i kontrol kolber.

6.. Tab af Bundet Fager under inkubation

  1. Der tilsættes 50 ul 1 x 10 9 PFU / ml fag på overfladen af sterile guld brik i en petriskål, der er placeret i et fugtigt kammer natten over ved stuetemperatur.
  2. Fjern suspensionen med ubundet fag fra guld overflade og titer.
  3. Guldet stykke med bundne fag 5 gange med PBS og anbring dem i 1 ml NZY opløsning i 15 ml rør i rysteinkubator ved 37 ° C i 8 timer.
  4. Bestem titeren af den fritliggende fag som beskrevet i 2..

7.. Fager Spheroids Forberedelse

  1. Kombinere 400 pi lager fag 12600 suspension (10 11 PFU / ml) blandes med et tilsvarende volumen af spektrofotometrisk kvalitet chloroform i 1 ml hætteglasved stuetemperatur.
  2. Forsigtigt vortex fagen-chloroform suspension 5-6 gange (5 sek intervaller) i løbet af en minutter varighed.
  3. Tilladt suspensionen at stabilisere i 30 sek og derefter pipette af den øverste fase indeholdende spheroids pipetteredes off for enkeltlags forberedelse.
  4. Tag et par mikroliter af sfæroiderne suspension transmission og scanning elektronmikroskopi.
  5. Brug en resterende klumpformet suspension til biosensor produktion.

8.. Biosensor Forberedelse

  1. Clean QCM-D sensorer ved plasmaætsning i argon i 10 minutter PDC-32G Harrick plasma renere.
  2. Skyl sensor med hexan for at fjerne eventuelle organiske urenheder.
  3. Forbered og rengør et trug af filmen balance, som beskrevet i 22..
  4. Fyld LB trug med en underfase løsning, og rengør den med et lavpunkt barriere og stabilisere truget ved 20 ± 0,1 ° C
  5. Spred 300 pi portion af fag 12600 i vandig suspensipå (10 11 PFU / ml) på LB underfase.
  6. Forbered fag monolag på LB underfase opløsning ved at tillade 300 pi portion af fag 12600 vandig suspension (10 11 PFU / ml) til at køre ned ad en skrå befugteligt glasstav, der er delvist nedsænket i underfase 22,23.
  7. Stabilisere forberedte monolag i 10 min, og derefter komprimere den med en hastighed på 30 mm / min (45 cm 2 / min), indtil et konstant tryk 19 N / m er nået.
  8. Udfør en lodret film aflejring på vinkelret positioneret QCM-D sensor med en hastighed på 4,5 mm / min ved successivt dyppe sensoren ind og ud af monolaget syv gange. Elektronmikroskopi af de deponerede fag monolag før udsættelse for bakterielle prøver viste, at lagene var kontinuerlig, homogen, og ensartet (data ikke vist).
  9. Gentag trin 4,5-4,8 med en fag klumpformet suspension, der er udarbejdet i 3..
  10. Brug fabrikerede fag biosensorer for MRSA detektion, elektronmikroskopi, og ellipsometri.

9.. Biosensor Testing, Diskrimination af Methicillin Resistent og følsomme Staphylococcus bakterier

  1. I denne protokol, er biosensorer med umodificeret og modificeret fag og fag spheroids forberedt. En kvartskrystalmikrovægt med fire sensor strømningskamre bruges til at overvåge bindingen af ​​bakterier til fagen immobiliseret på QCM sensoroverfladen. PBP 2a antistof konjugeret latexkugler udnyttes til at skelne mellem methicillin resistente (MRSA) og følsomme Staphylococcus bakterier. Alle målinger er foretaget i flow modus (50 gl / min) ved 5 MHz.
  2. Etablere en basislinie resonansfrekvens QCM sensoren i vand (~ 30 min).
  3. Tegn en suspension af levende methicillin sensitive Staphylococcus bakterieceller i vand (10 9 CFU / ml) gennem testcellen.
  4. Løbende overvåge ændringer i sensorerne resonansfrekvens og energi dissipation for første overtone, USIng Q-Soft software.
  5. Når ændringerne i sensorerne resonansfrekvens og spredning nåede modenhedsniveau, tilføjer suspensionen af PBP antistof konjugeret latexkugler (6,77 x10 10 perler / ml) til strømmen under den løbende overvågning af frekvens og spredning.
  6. Gentag trin 9,2-9,5 for methicillinresistente Staphylococcus bakterieceller (MRSA).
  7. Definer en frekvens forandring gennem massen ændring som følge af bakterier bindende af Sauerbrey ligningen 24,25 bf =-Δm xn / C, hvor C er massen følsomhed konstant (C = 17,7 ng x cm -2 x Hz -1 ved 5 MHz ), m er massen og n er overtone antallet (n = 1).
  8. Definer en energi dissipation ændring (Δ D) fra optagelsen den eksponentielle henfald af oscillation (frekvens og amplitude afdæmpning, som tillod kvantificering af energi, der spredes og lagres i løbet af en periode på svingning,E spredes og E opbevares, henholdsvis: Δ D = E spredes / 2 πE gemt. Δ D måles i dissipation enheder (DU), én DU = 10 -6 relative enheder).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fagen viste lytisk aktivitet mod alle testede stammer af S. aureus, herunder MRSA-stammer, som angivet af fag spottest. Plaque størrelser generelt varierede fra 5 til 15 mm. Ingen aktivitet blev fundet mod andre test-kulturer (tabel 1).

En normal vækst af S. aureus ATCC 12600 i NZY medium på rysteinkubator ved 37 ° C er vist i figur 1A (en kurve mærket ved tomme cirkler). Antallet af bakterier steg fra 3,2 x 10 6-4,0 x 10 8 CFU / ml. 1A (en kurve mærket ved udfyldte cirkler) viser resultaterne af co-dyrkning af 2,0 x 10 6 PFU / ml fri fag tilsat simultant med samme koncentration af S. aureus ATCC 12600. Fager immobiliseret på guld overflade, viste lytiske aktivitet sammenlignes med aktiviteten af fag i suspension (figur 1A, kurve mærket ved top down trekanter). Immobiliserede fager forblev infektiøse når guldet stykke med fag blev først brugt i 24-timers dyrkning eksperiment, derefter blev den vasket 5 gange og opbevaret i PBS i 6 dage ved 4 ° C, og endelig genbruges med en frisk bakteriesuspension. (Figur 1A, kurve mærket af top op trekanter). Det forekommer, at immobiliserede fager injicere deres DNA i bakterier, efterlader tomme capsider, der er i stand til at inficere nye bakterier. Vi hypotesen, at immobiliserede fager på en guld overflade tjente som primære "katalysatorer" for at inficere et par bakterier, som genererer frie fager dem igen inficerer nye bakterier og så videre. Derfor blev de fleste af immobiliserede fager sandsynligvis ikke anvendes i en første 24 timers dyrkning eksperiment, og derfor kan udnyttes endnu en gang. Overfladen tæthed af fager deponeret ved fysisk adsorption var omkring ~ 0,7 fagpartikel / um 2. Denne koncentration er høj, men det kan vokse op til 10 gange 2. Derfor kunne guldpladen inkorporere sogle af de frie levedygtige fager frigivet af inficerede bakterier i den første 24 timers dyrkning eksperiment.

1B viser lysis zone omkring guldstykke, hvilket indikerer, at immobiliserede fager var i stand til at lysere bakterieceller. I kontrolgruppen eksperimenter, har tomme guldplade ikke hæmme bakterievækst. Dermed den faktiske reduktion af bakterievækst findes på co-kultur af bakterier og immobiliseret fag er et resultat af primær vekselvirkning vand suspenderede bakterier og bundne fag som vist i figur 1C. Phag løsrivelse fra guld overflade ved samtidig inkubation af bundne fag og bakterier var lille. For at vurdere, hvor mange fager løsrevet fra guld overflade under inkubationen, blev prøver med bundne fag nedsænket i NZY opløsning, rystet i rysteinkubator ved 37 ° C i 8 timer, og en fri fag koncentration i supernatanten blev vurderet. Vi konstateret, at 4,1 x 10 7 PFU blev bound til en 60 mm 2 guldstykke (~ 0,7 fagpartikel / um 2), hvor kun 3 x 10 4 PFU blev løsrevet (0,007% løsrivelse).

Transmissionen og scanningselektronmikrografer af intakt lytisk fag 12600 om guld substratoverfladen er vist i figur 2A og 2B. Når fag suspensionen blev underkastet til chloroform behandling blev fagen fysiske udseende ændres. Halen indgået i længden og fortykket. Den polygonale hoved blev rundet (figur 2D og 2E). Vi kaldes strukturelt modificeret lytiske fag "klumpformet" ligner navnet på chloroform behandlede filamentøse fag 26.. På trods af de væsentlige strukturelle ændringer resulterede fra chloroform behandling, har den sphæroide lytiske aktivitet målt ved plaque numre ikke ændret (figur 2C og 2F). Den gennemsnitlige lytisk aktivitet af fag og sfæroider var (7,4 ± 1,5 (SD)) x 10 10 (N = 4) og (7,5 ± 1.0 (SD)) x 10 10 (N = 7), PFU / ml. På niveau på 0,05, var aktiviteterne af fag og sfæroider ikke signifikant forskellig (figur 2C og 2F).

QCM-sensorer med immobiliserede lytiske fager viste ingen signifikante ændringer i resonansfrekvensen eller energispredning når de blev udsat for MRSA (figur 3A). Disse data indikerer, at MRSA / fag interaktion resulterede i et nej masseændring ifølge QCM, og alligevel elektronmikrofotografier postkontorernes analyserede biosensorer viste betydelig bakteriel binding på sensorens overflade (figur 3B).

Når MRSA suspensioner blev sprøjtet ind i flowcellen med fag kugleformede biosensorer, en væsentlig reduktion i frekvensen (Δ f ≈ -105 Hz) og en stigning i spredning (af d ≈ 26 DU) blev observeret (figur 3C). Efter fag sfæroid-bakterielle (MRSA) bindingsinteraktioner, SE analyseretnsors blev udsat for PBP2a antistof konjugerede latexperler suspensioner. Disse MRSA analyseret biosensorer reagerede på PBP2a antistof konjugerede latexperler suspensioner, eftersom en yderligere reduktion i frekvensen (Δ f ≈ -45 Hz) og en stigning i spredning (af d ≈ 15 DU) blev observeret (figur 3C). Binding af MRSA fager sonder og PBP2a antistof konjugerede latexperler blev bekræftet ved hjælp af scanning elektronmikroskopi undersøgelser (figur 3D).

Når fag klumpformet biosensor blev udsat for MSSA suspensioner, en væsentlig reduktion i frekvensen (Δ f ≈ -200 Hz) og en stigning i spredning (af d ≈ 55 DU) blev observeret (fig. 3E). Efter fag sfæroid-MSSA bindingsinteraktioner, blev analyseret sensorer udfordret med PBP2a antistof konjugerede latexperler suspensioner. Oprindeligt analyseret MSSA biosensor viste korte transienter afstigning i hyppigheden og falde i spredning. Efter et par minutter af MSSA og PBP2a antistof konjugeret latex perler interaktioner, vendte frekvens for at skrive PBP2a antistof introduktion niveauer, men den dissipative energi steget (figur 3E). Binding af MSSA til fag-prober blev bekræftet med scanning elektronmikroskopi, men ingen binding mellem MSSA og PBP2a antistof konjugerede latexperler blev observeret (figur 3F). Ellipsometric tykkelse profil, 3D tykkelse kort over lytiske fager og Staphylococcus bakterier er vist i supplerende Tal S1 og S2.

Efter kontakt af sensorer med LB immobiliserede fager eller sfæroider til suspension af 10 9 celler / ml af MRSA eller MSSA blev bakterierne observeret at binde fager eller sfæroider ved densitet (ρ) på 9,1 x 10 7 (MRSA / intakte fager) 7,9 x 10 7 (MRSA / sfæroider) og 7,2 x 10 7 (MSSA / sfæroider) celler / cm 2. Itests med 5 forskellige lytiske fager og 2 værtsbakterier 27, forskere udsat fager immobiliseret ved covalent binding metode til 10 9 celler / ml bakterier, og bestemmes fagen capture effektivitet i en række (2,5-8,9) x 10 5 celler / cm 2 . Fag fangsteffektivitet præsenteres i dette arbejde er ~ 100 gange højere.

Host Strain Strain detaljer Methicillin følsomhed Fager følsomhed
S. aureus 12600 ATCC S +
S. aureus 27690 ATCC S +
S. aureus 10292 IA S +
10378 IA S +
S. aureus 10497 IA S +
S. aureus 10686 IA S +
S. aureus MRSA 1 AU R +
S.aureus MRSA 2 AU R +
S. aureus MRSA 5 AU R +
S. aureus MRSA 13 AU R +
S.aureus MRSA 26 AU R +
S. aureus MRSA 34 AU R +
S. aureus MRSA 45 AU R +
B. anthracis Sterne AU NA -
Salmonella typhimurium LT2 AU NA -
Shigella flexneri unknown AU NA -
Yersinia enterocolitica unknown AU NA -
Proteus mirabilis unknown AU NA -
Klebsiella pneumoniae 13882 AU NA -
Bacillus subtilis 6051 ATCC NA -

Tabel 1. Phage 12600 følsomhed af bakteriel stog IA - isoleret fra dyr;. AU - bakteriekultur samling af Auburn University, NA - ikke anvendelig, a - lytisk aktivitet af fag blev defineret af plaques dannelse, +, følsom, -, ikke er følsomme. Overnight kulturer af testede stammer blev udpladet på pladerne med NZY agar. Efter overfladen tørret, blev en prøve (10 ul) af 10 11 PFU fag suspension spottet på overfladen af pladen. Pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 18-24 timer. Lytiske aktivitet af fagerne blev detekteret ved dannelsen af ​​plaques.

Figur 1
Figur 1. Infektive egenskaber af bundet og frit fag. A. bakterievækst i fravær (tomme cirkler) og nærvær (fyldte cirkler) fri fag under tilstedeværelse af fag bundet til guld overflade (top up triangles), og i nærvær af fag bundet til guld overflade efter 6 timer ved 4 ° C (top down trekanter). Indsæt: Linien (1) viser en lineær tilpasning af de ingen fag vækst eksperimentelle data til ligningen (4) (R = -0.99, p <0,0001). Linjen (2) viser et anfald af de eksperimentelle data for bakterievækst på fri fag tilstedeværelse til samme ligning. Bakterievækst konstant (k) i fravær og nærvær af frit fag, er lige 0,88 og 0,64, (-0,048, tilbagegang fase). Repræsentative data fra tre uafhængige eksperimenter er vist i panel A. En gennemsnitlig relativ fejl OD600 målinger ikke overstige 5%. B. Fag immobiliseret til guld overflade er smitsom som indikeret ved lysis zone omkring guldstykke. 1 - fragmentet agarpladen med bakterier, 2 - guldstykke med immobiliseret fag,. 3 - hæmning zone omkring guldstykke C. Skematisk repræsentation af bakterie lysis ved fag bundet til guld overflade. 1 -guld-belagt kvarts stykke 2 - fag bundet til guld overflade, 3 - bakterie forankret ved bundne fager, 4 - gratis fager har udgivet ved sprængning smittet bakterie. Brugt med tilladelse fra: Guntupalli, R., et al 2012.. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Egenskaber af intakt og modificeret fag A og B - Transmission og scanningselektronmikrografer af intakte fag, henholdsvis.. C - fag lytisk aktivitet på en agarplade med MRSA D og E - Transmission og scanningselektronmikrografer af intakte fag spheroids, henholdsvis; F - fag sfæroider lytiske enctivity på en agarplade med MRSA. Den gennemsnitlige aktivitet af fag og sfæroider er (7,4 ± 1,5 (SD)) x 10 10 (N = 4) og (7,5 ± 1,0 (SD)) x 10 10 (N = 7) PFU / ml. T-test: t = 0,15682, p = 0,87851. På 0,05 niveauet, er de aktiviteter af fag-og spheroids ikke signifikant forskellig. Stænger: A, B, D og E: 200 nm. Brugt med tilladelse fra:. Guntupalli, R., et al 2012.

Figur 3


Figur 3. Kombineret QCM-D og EM analyse af fag-bakterier interaktioner. Bakterier blev leveret til sensoren ved en koncentration på 10 9 CFU / ml suspensioner i vand ved en strømningshastighed på 50 ul / min. 1, 2 repræsenterer ændringer i resonansfrekvensen og energi-dissipation, hhv. A. Fag belagt QCM-D sensor respons på MRSA. Pil viser than MRSA leveringstid til sensoroverfladen. B. Scanning elektron mikrograf af post analyseret MRSA bundet til lytisk fag immobiliseret på QCM sensoren. M-MRSA, P-fager på sensoroverfladen. C. Successive reaktioner fag-sfæroider belagt QCM-D sensor for MRSA først og derefter at PBP antistof perler. Pilene angiver MRSA og PBP antistof leveringstid til sensoroverfladen hhv. D. scanningelektronmikrofotografi af post analyseret biosensor med fag sfæroider, MRSA og PBP antistof perler. Tykke og tynde pile viser typiske MRSA celle og antistof perle hhv. E. successive reaktioner fag-sfæroider belagt QCM-D sensor til S. aureus først og derefter PBP antistof perler. Pile angiver S. aureus og PBP antistof leveringstid til sensoroverfladen hhv. F. scanningelektronmikrofotografi af post analyseret biosensor med fag sfæroider, S. aureus, og PBP antistof perler. Tykke og tynde pile viser typiske S. aureus celle og antistof perle, hhv. Brugt med tilladelse fra: Guntupalli, R., et al 2012.. Klik her for at se større figur .

Supplerende Tal

Figur S1
Figur S1. Supplerende fig. 1. (a) og (b) er en ellipsometric tykkelse profil og 3D tykkelse kort for et lytisk fag, henholdsvis (effektive brydningsindeks = 1,05). Tykkelse profiler viser middelværdi, RMS ruhed, minimum, og maksimum tykkelse monolagets. En linje over tykkelsen kortet blev trukket til at generere tykkelsen profil.

50474/50474figs2.jpg "/>
Figur S2. Supplerende Figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er velkendt, at fager kan anvendes som biosensor prober for bakterielle patogener 28. Det er påvist i dette arbejde, fag sammen med PBP 2a antistoffer kan anvendes til at løse det gamle problem: hurtige diskrimination antibiotikaresistente og følsomme stammer.

Det konstateredes imidlertid de normale umodificerede stafylokok fager er ikke egnede til bakterier detektion med QCM enheder, selvom de binder bakterier. Fagen hale er så lang, at akustiske bølger ikke kan "nå" bakterierne bundet til enden af ​​fag haler. Denne betingelse resulterede i en "manglende masse" effekt 29 og manglende evne til at registrere resonansfrekvens og spredning ændring på trods af signifikant binding viste ved EM billeder (fig. 3A og 3B). Dette problem var let løses ved at erstatte det intakte fag med sfæroider fagen modificeret ved chloroform-vandbehandling. Denne behandling resulterede i fuldt funktionel pHage med korte, tykke og ikke-fleksibel hale (figur 2D, 2E og 2F). Når fager blev erstattet med sfæroider i biosensorer, blev MRSA let afsløres ved QCM-D-enhed.

Når fagpartikler blev bundet til guld overflader på en korrekt orientering, deres receptorer var tilgængelige for værtsbakterien. Hvis direkte fysisk kontakt mellem en fast overflade med fager og en tørret bakteriel lag forekomme, de immobiliserede fager kan injicere virale genom i værtsbakterier (figur 1C). Disse resultater stemmer godt med dem, der opnås med lytiske fager immobiliseret til glasskive overflader ved en kovalent binding teknik 27.. Evnen af bundne lytiske fager at fange værtsbakterier blev også demonstreret ved hjælp af et biotinyleret fag immobilisering teknik 30. I modsætning hertil har en meget simpel fysisk adsorption metoden til fastgørelse ordentligt orienterede fager til faste overflader er udnyttet 31. Than højt fag klumpformet capture effektivitet kan anvendes til fremstilling af effektive antimikrobielle overflader. Et samlet tid til svare for den foreslåede assay er ca 16 min per prøve. Denne tid kan dramatisk forkortes ved hjælp af QCM enheder med et stort antal kamre. Den forventede holdbarhed for fag-sensorer er omkring 3-4 måneder ved stuetemperatur. Med en biopolymer beskyttelse det kunne forlænge op til et par år 32.. Detektionsgrænsen for S. aureus blev målt for dette fag ved en overfladeplasmonresonans spektroskopi, og fundet at være 10 4 CFU / ml 18.

En af de vigtigste forudsætninger for at bruge metoder, der beskrives i denne artikel, er at overholde rene og sterile betingelser 33 krav for alle eksperimenter med fager og bakterier.

Almindeligt anvendte metoder til påvisning af MRSA, såsom disk diffusion oxacillin agar skærmen test eller bouillon mikrofortyndingsplader tage normally op til 24 timer at udføre testen. Hurtige teknikker, der omfatter automatiserede teknikker såsom Vitek GPS-SA-kort, Rapid ATB Staph system, Rapid Microscan Panel systemet og Crystal MRSA ID-system også producere resultater efter 3-11 hr 9-14. PCR eller DNA-hybridisering af mecA gen 15 er en forholdsvis hurtig og nøjagtig metode, men kræver oprenset DNA og er yderst følsomme urenheder. I modsætning hertil er fremgangsmåden beskrevet i dette arbejde hurtigt, ikke behøver dna-ekstraktion, og det er ikke følsom over for tilsætningsstoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Arbejdet rapporteret heri blev støttet af tilskud fra Auburn University AUDFS og USAF CRADA 07-277-60MDG-01. Synspunkterne i denne artikel, er dem af forfatterne og ikke afspejler den officielle politik eller position i USA Air Force, Department of Defense, eller den amerikanske regering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P4417
spectrophotometric-grade chloroform Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 154733 (99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 29609-0 (95%)
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT 64-17-5 190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge Beckman Coulter Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden E4
Scanning electron microscope (SEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized Millipore Corporation, Billerica, MA SCGPU05RE 0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish NUNC A/S, Denmark 240835 Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes Gilson, Pipetman, France P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific, CT Classic C24
Gold-coated quartz pieces Auburn University, AL Homemade
Petri dishes Fisher Brand, USA 0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance The Baker Company, ME SG403
Culture Growing Flasks Corning Incorporated, NY 4995 PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. 4001
Plasma Cleaner Harrick Plasma, USA PDC-32G
Millipore water purification system Millipore Direct-Q
Imaging Ellipsometer Accurion, USA nanofilm_ep3se
Software Q-Sense AB, Sweden QSoft, QTools

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes. Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).
  2. Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements. J. Microbiol. Methods. 90, 182-191 (2012).
  3. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Long, R., Olsen, E., Neely, W., Vodyanoy, V. Phage Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films. Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 82, 182-189 (2011).
  4. Barie, P. S. Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice. World. J. Surg. 22, 118-126 (1998).
  5. Byun, D. E., Kim, S. H., Shin, J. H., Suh, S. P., Ryang, D. W. Molecular epidemiologic analysis of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens. J. Korean Med. Sci. 12, 190-198 (1997).
  6. Duan, L., Lei, H., Huang, E., Yi, G., Fan, W. Drug resistance of Staphylococcus aureus from lower respiratory tract. Zhonghua Yiyuanganranxue Zazhi. 21, 1667-1668 (2011).
  7. Giamarellou, H., Papapetropoulou, M., Daikos, G. K. Methicillin resistant' Staphylococcus aureus infections during 1978-79: clinical and bacteriologic observations. J. Antimicrob. Chemother. 7, 649-655 (1981).
  8. Knopf, H. J. Nosocomial infections caused by multiresistant pathogens. Clinical management exemplified by multiresistant Staphylococcus aureus. Urologe A. 36, 248-254 (1997).
  9. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of differential inoculum disk diffusion method and Vitek GPS-SA card for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 433-436 (1994).
  10. Struelens, M. J., Nonhoff, C., Van, D. A., Philippe Mertens, R., Serruys, E. Evaluation of rapid ATB Staph for 5-hour antimicrobial susceptibility testing of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 33, 2395-2399 (1995).
  11. Woods, G. L., LaTemple, D., Cruz, C. Evaluation of MicroScan rapid gram-positive panels for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 1058-1059 (1994).
  12. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of BBL crystal MRSA ID system. J. Clin. Microbiol. 32, 2588-2589 (1994).
  13. Qadri, S. M., Ueno, Y., Imambaccus, H., Almodovar, E. Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Crystal MRSA ID System. J. Clin. Microbiol. 32, 1830-1832 (1994).
  14. Zambardi, G., Fleurette, J., et al. European multicentre evaluation of a commercial system for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 747-749 (1996).
  15. Chambers, H. F. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).
  16. Brown, D. F. J., Edwards, D. I., et al. Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J. Antimicrob. Chemother. 56, 1000-1018 (2005).
  17. Gerberding, J. L., Miick, C., Liu, H. H., Chambers, H. F. Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 35, 2574-2579 (1991).
  18. Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., Simonian, A. L. Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus-A surface plasmon resonance spectroscopic study. Biosens. Bioelectron. 22, 948-955 (2007).
  19. Popham, D. L., Young, K. D. Role of penicillin-binding proteins in bacterial cell morphogenesis. Current Opinion in Microbiology. 6, 594-599 (2003).
  20. Wei, Y., Havasy, T., McPherson, D. C., Popham, D. L. Rod shape determination by the Bacillus subtilis class B penicillin-binding proteins encoded by pbpA and pbpH. J. Bacteriol. 185, 4717-4726 (2003).
  21. Grieco, S. H. H., Lee, S., Dunbar, W. S., MacGillivray, R. T. A., Curtis, S. B. Maximizing filamentous phage yield during computer-controlled fermentation. Bioprocess and Biosystems Engineering. 32, 773-779 (2009).
  22. Olsen, E. V., Pathirana, S. T., Samoylov, A. M., Barbaree, J. M., Chin, B. A., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment. J. Microbiol. Methods. 53, 273-285 (2003).
  23. Pathirana, S. T., Barbaree, J., Chin, B. A., Hartell, M. G., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Rapid and sensitive biosensor for Salmonella. Biosens. Bioelectron. 15, 135-141 (2000).
  24. Sauerbrey, G. The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing. Z. Phys. 155, 206-222 (1959).
  25. Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy Dissipation Kinetics for Protein and Antibody-Antigen Adsorption under Shear Oscillation on a Quartz Crystal Microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
  26. Griffith, J., Manning, M., Dunn, K. Filamentous bacteriophage contract into hollow spherical particles upon exposure to a chloroform-water interface. Cell. 23, 747-753 (1981).
  27. Hosseinidoust, Z., Van de Ven, T. G. M., Tufenkji, N. Bacterial Capture Efficiency and Antimicrobial Activity of Phage-Functionalized Model Surfaces. Langmuir. 27, 5472-5480 (2011).
  28. Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (53), e2740 (2011).
  29. Voinova, M. V., Jonson, M., Kasemo, B. Missing mass" effect in biosensor's QCM applications. Biosens. Bioelectron. 17, 835-841 (2002).
  30. Gervals, L., Gel, M., et al. Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces. Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).
  31. Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption. Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).
  32. Sorokulova, I., Watt, J., et al. Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage. J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).
  33. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).

Tags

Bioteknik Mikrobiologi infektionssygdomme Infektion medicin immunologi cellebiologi molekylærbiologi genetik anatomi fysiologi bakterier farmakologi Staphylococcus bakteriofager fag Binding konkurrencedygtige Biofysik overfladeegenskaber (metalliske materialer) overflade bølge akustiske apparater (elektronisk design) sensorer Lytiske fag sfæroider QCM-D Langmuir-Blodgett (LB) monolag MRSA, Assay
Biosensor til detektion af antibiotikaresistente Staphylococcus Bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guntupalli, R., Sorokulova, I.,… More

Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter