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Bioengineering

Biosensor zum Nachweis von Antibiotika-resistenten Staphylococcus Bakterien

doi: 10.3791/50474 Published: May 8, 2013

Summary

Lytic Phagen Biosensoren und Antikörper Perlen sind in der Lage, zwischen Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindliche Staphylokokken Bakterien unterscheiden. Die Phagen wurden durch ein Langmuir-Blodgett-Technik auf einer Oberfläche einer Quarzkristall-Mikrowaage Sensor immobilisiert und arbeitete als breites Staphylococcus Sonden. Antikörper erkennen Perlen MRSA.

Abstract

Eine konstruktiv transformiert lytischen Bakteriophagen mit einem breiten Wirtsbereich von Staphylococcus aureus und Penicillin-Bindungsprotein (PBP 2a)-Antikörper, konjugiert Latex-Kügelchen wurden verwendet, um einen Biosensor zur Diskriminierung von Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindlich (MSSA) S ausgelegt zu erstellen . aureus Arten 1,2. Die lytische Phagen in Phagen Sphäroide wurde durch Kontakt mit Wasser-Chloroform-Schnittstelle umgewandelt. Phagen Sphäroid Monoschichten haben auf einem Biosensor Oberfläche wurde durch Langmuir-Blodgett (LB)-Technik 3 bewegt. Die angelegten Biosensoren nach einem Quarzkristall mit Dissipationsmessung Verfolgung (QCM-D), um Bakterien-Phagen-Wechselwirkungen auswerten untersucht. Bakterien-Sphäroid Wechselwirkungen zu reduzierten Resonanzfrequenz und einem Anstieg in Dissipationsenergie sowohl für MRSA und MSSA Stämmen führte. Nach der bakteriellen Bindung haben diese Sensoren wurde weiter auf die Penicillin-bindende Protein Antikörper Latexperle ausgesetzts. Sensoren mit MRSA untersucht reagierte auf 2a Antikörper Perlen PBP, obwohl Sensoren mit MSSA inspiziert gab keine Antwort. Diese experimentelle Unterscheidung bestimmt eine eindeutige Unterscheidung zwischen Methicillin-resistenten und sensiblen S. aureus-Stämme. Ebenso gebundenen und ungebundenen Bakteriophagen unterdrücken das Wachstum von Bakterien auf Oberflächen und in Wasser-Suspensionen. Sobald lytischen Phagen in Sphäroide geändert werden, behalten sie ihre starke lytische Aktivität und zeigen eine hohe bakterielle Capture-Funktion. Die Phagen und Phagen Sphäroide können für die Prüfung und Sterilisation von Antibiotika-resistenten Mikroorganismen verwendet werden. Andere Anwendungen können die Verwendung in Bakteriophagen-Therapie und antimikrobielle Oberflächen.

Introduction

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Methicillin-resistente Stämme von Staphylococcus aureus haben als ein Faktor in wesentlichen Infektionen und nosokomiale Ausbrüche 4-8 vorgeschlagen worden. Gemeinsame Wege der Anerkennung von Methicillin-Resistenz, wie die Scheibe Diffusion Oxacillin Agar Probeaufnahmen oder Bouillonmikrodilutions auf maßgeschneiderte Kulturbedingungen verlassen, um den Ausdruck des Widerstands zu verbessern. Änderungen umfassen die Verwendung von Oxacillin, Inkubation bei 30 oder 35 ° C statt 37 ° C, und die Aufnahme von NaCl zu dem Wachstumsmedium. Weiterhin für korrekte Erkennung durch diese Art von Techniken, eine lange Inkubationszeit von 24 h statt 16 bis 18 h erforderlich. Schnelle Techniken mit entsprechenden (> 96%) Empfindlichkeit für die Identifizierung von Methicillin-Resistenz sind automatisierte microdilution Techniken wie die Vitek GPS-SA-Karte, die Rapid-ATB Staph-System und Rapid Microscan Systemsteuerung System, Ergebnisse zu produzieren nach 3-11 h 9-11. The Crystal MRSA ID-System ist ein schnelles Verfahren auf Anerkennung des Wachstums von S. basierend aureus in Gegenwart von 2% NaCl und 4 mg Oxacillin pro Liter mit einem Sauerstoff-sensitive Fluoreszenz-Sensor. Beansprucht Empfindlichkeiten im Bereich zwischen 91 bis 100% nach 4 h Inkubation 12-14. Diese phänotypische Methoden sind in ihrer Genauigkeit durch die Auswirkungen der herrschenden Stämme, die heterogene Widerstand auszudrücken begrenzt. Daher ist die beste weithin akzeptierte Verfahren für die Anerkennung von Methicillin-Resistenz PCR oder DNA-Hybridisierung des mecA Gens 15. Allerdings erfordert diese Technik gereinigt DNA und ist äußerst empfindlich gegenüber verschiedenen Beimischungen (Verunreinigungen), die Zelltrümmer 16 umfassen.

Darüber hinaus müssen diese Verfahren eine lange Zeit durchzuführen. Strategien, um die Anerkennung des mecA Genprodukt Protein PBP 2a, könnte genutzt werden, um den Widerstand zu bestimmen und kann zuverlässiger im Vergleich zu Standard-Test-Techniken 17.

Staphylococcus aureus-Stämme, einschließlich solche, die Methicillin-Resistenz 1,2,18 verwendet werden. In dieser Arbeit haben wir vorgeschlagen, eine neue Technik in der spezifischen Erkennung und Erkennung von MRSA, wie die Anerkennung von Bakterien zusammen mit Konformation von MRSA in Echtzeit. Für diesen speziellen Zweck ein S. aureus Bakteriophagen mit einem breiten Wirtsspektrum (einschließlich MRSA) mit einem monoklonalen Antikörper gegen Protein kombiniert (PBP 2a) verwendet wurden. PBP 2a eine Zellwandprotein und ist die Ursache von antibiotischen Widerstand von MRSA. Allerdings PBP 2a Antikörper ist nicht spezifisch für S. aureus seit einigen anderen Bakterien Antibiotika-bindende Proteine ​​mit Sequenzähnlichkeit zu PBP 2a 19,20. Folglich in dieser Arbeit, S. aureus Bakteriophagen und Antikörper gegen PBP 2a Protein verwendet wurden. Um einen Biosensor zu entwickeln spezielltisch erkennen und zu identifizieren MRSA Ein Gerät mit einem zwei Schritten genutzt wurde. Der erste Schritt verwendet ein S. aureus Bakteriophagen Monoschicht als Sensor-Sonde, während der zweite Schritt PBP 2a spezifischen Antikörpern verwendet. Daher Schritt wird man erkennen, S. aureus Bakterien, als der andere empfindlich gegen das Antibiotikum-Bindungsprotein. Wenn Signale von zwei Schritten erhalten positiv sind, gibt es den spezifischen Nachweis von MRSA.

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Protocol

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1. Einstellen der Stage

  1. Erhalten Typstamm S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 und Bacillus subtilis ATCC 6051. Methicillin-resistente Stämme von S. aureus - MRSA1, MRSA 2, 5 MRSA, MRSA 13, 26 MRSA, MRSA 34, 45 MRSA, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Das lytische Phagen 12600.
  2. Erhalten PBP 2a Antikörper, konjugiert Latexkügelchen.
  3. Bereiten NZY Medium wie beschrieben 21.
  4. Erhalten Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  5. Bereiten VE-Wasser als Subphase für Langmuir-Blodgett (LB)-Monoschicht Abscheidung.

2. Bakteriophagen Vermehrung und Titration

  1. Inkubieren 5 ml Übernachtkultur von S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 8 Kolonie bildenden Einheiten (KBE) / ml) mit 500 ul Phagen (3 x 10 9 </ Sup> PFU / ml) in 500 ml Medium in NZY 2 L Flack auf Schüttler-Inkubator bei 37 ° C über Nacht.
  2. Zentrifuge bei 4.424 xg Kultur für 10 min bei 4 ° C.
  3. Re zentrifugierten Überstand bei 11.325 × g für 10 min bei 4 ° C.
  4. Filter Überstand durch ein 0,22 um Millipore-Filter.
  5. Das Filtrat bei 75.395 xg für 1,5 Stunden.
  6. Anschließend das Pellet in 100 ul destilliertem Wasser.
  7. Bereiten 10fache Verdünnungen von Phagensuspension in NZY Medium.
  8. Plate 1 ml über Nacht (ON) Kultur von S. aureus ATCC 12600 auf je 2 Platten mit NZY Agar sicherstellen, dass alle Oberfläche bedeckt ist. Entfernen Sie den Überschuss an Kultur und lassen die Oberfläche trocken für 30 min.
  9. Spot eine Probe (10 ul) geeigneter Phagenverdünnung auf die Oberfläche der Platte und Inkubation bei 37 ° C für 18-24 Std.
  10. Untersuchen Sie die Bildung von Plaques und die Berechnung der Phagentiter. Bakteriophagen-Titer (T) auf der Grundlage der Anzahl von p geschätztLaques (N) je 10 ul Volumen (V) des Phagen Suspension und der Verdünnungsfaktor (F) gebildet ist. . T = N / (vxf) Beispiel für die Anzahl der Plaques 75 bei der Verdünnung 10 -7 und das Volumen 10 ul (10 x 10 -3 ml), ist der Titer gleich 75 /: Der Titer wurde durch Formel (10 x 10 -3 x 10 -7) = 7,5 x 10 10 Plaque-bildende Einheiten (PFU) pro ml Suspension.

3. Gold-immobilisierten Phagen

  1. Saubere goldbeschichteten Quarz Stück (60 mm 2) durch Plasma-Ätzen in Argon für 10 min und dann für 6 Stunden sterilisieren unter UV-Licht in einem sterilen Gehäuse.
  2. In 50 Mikroliter von 1 x 10 9 PFU / ml Phagensuspension an die Goldoberfläche jedes Stückes in eine sterile Petrischale, und dann Inkubation über Nacht in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur.
  3. Entfernen und die restlichen titrieren Phagensuspension.
  4. Waschen Stücke mit gebundenen Phagen 5 mal mit PBS, um ungebundene entfernenPhagen.

4. Testen von immobilisiertem Phageninfektiosität auf eine trockene Oberfläche

  1. Verbreiten Sie eine O / N-Kultur von S. Aureus ATCC 12600 auf eine NZY Agarplatte und trocknen lassen.
  2. Legen Sie ein Goldstück mit immobilisierten Phagen auf die Platte nach unten.
  3. Beobachten einer Zone der Lyse nach 12-stündiger Inkubation bei 37 ° C, die angibt Infektiosität.
  4. Mit Gold bedeckt Stücke ohne Phagen in Kontrollversuche.

5. Prüfung der lytischen Aktivität der freien und gebundenen Phagen in Liquid

  1. Hinzufügen eines ON Kultur von S. aureus ATCC 12600 bis 10 ml NZY in jeder von vier 300 ml-Kolben Seitenarm (6 x 10 6 CFU / ml in jeden Kolben).
  2. Hinzufügen In zwei Kolben 2 x 10 6 PFU / ml des freien Phagen.
  3. Mit den beiden anderen Kolben als Kontrollen.
  4. Überwachen Sie den zeitlichen Verlauf der S. aureus Zelllyse für 570 min durch Messung der optischen Dichte (OD 600) bei 30 min-Takt für alle Flaschen.
  5. Nehmen Sie eine abschließende Messung nach 24 Stunden.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.5, sondern verwenden Sie Goldstücke mit gebundenen Phagen anstelle des freien Phagen und Goldstücke ohne Phagen in Kontrolle Kolben.

6. Der Verlust der gebundenen Phagen während der Inkubation

  1. In 50 ul 1 x 10 9 PFU / ml Phagen auf der Oberfläche von sterilen Goldstück in einer Petrischale, die in einer feuchten Kammer über Nacht bei Raumtemperatur gelegt wird.
  2. Entfernen Sie die Suspension mit ungebundenen Phagen aus der Goldoberfläche und Titer.
  3. Waschen Sie das Goldstück mit gebundenen Phagen 5 mal mit PBS und in 1 ml NZY Lösung in 15 ml Tube im Shaker-Inkubator bei 37 ° C für 8 Stunden.
  4. Bestimmen Sie den Titer der abgelösten Phagen wie in 2 beschrieben.

7. Phagen Spheroids Vorbereitung

  1. Die Kombination 400 ul stock Phagen 12600 Suspension (10 11 PFU / ml) mit einem gleichen Volumen Chloroform spektrophotometrische Grad in 1 ml Fläschchenbei Raumtemperatur.
  2. Vortexen die Phagen-Chloroform Suspension 5-6 mal (5 Sekunden-Intervallen) über eine Minute Dauer.
  3. Erlaubt die Suspension für 30 sec stabilisieren und dann Pipettieren der oberen Phase, die Sphäroide off wurde Monolayer pipettiert.
  4. Nehmen Sie ein paar Mikroliter der Sphäroide Suspension für die Übertragung und der Rasterelektronenmikroskopie.
  5. Verwenden Sie einen verbleibenden Sphäroid Aufhängung für Biosensor Fertigung.

8. Biosensor Vorbereitung

  1. Saubere QCM-D-Sensoren durch Plasma-Ätzen in Argon für 10 min PDC-32G Harrick Plasma cleaner.
  2. Spülen Sensor mit Hexan keine organischen Verunreinigungen zu entfernen.
  3. Vorbereiten und reinigen einen Trog des Films Gleichgewicht wie in 22 beschrieben.
  4. Füllen LB Trog mit einer Subphase Lösung und reinigen Sie ihn mit einem Trog Barriere und stabilisieren die Mulde bei 20 ± 0,1 ° C
  5. Verbreiten Sie 300 ul Aliquot des Phagen 12600 in wässrigen Susauf (10 11 PFU / ml) auf LB Subphase.
  6. Bereiten Phagen Monoschicht auf LB Subphase Lösung, indem 300 ul Aliquots des Phagen 12600 wässrigen Suspension (10 11 PFU / ml) abzulaufen eine geneigte benetzbaren Glasstab, der teilweise in die Subphase 22,23 eingetaucht ist.
  7. Stabilisieren Sie die vorbereiteten Monoschicht für 10 min und dann komprimieren mit einer Geschwindigkeit von 30 mm / min (45 cm 2 / min), bis ein konstanter Druck 19 N / m erreicht wird.
  8. Führen einer vertikalen Schichtabscheidung auf senkrecht positioniert QCM-D-Sensor mit einer Geschwindigkeit von 4,5 mm / min durch aufeinanderfolgendes Eintauchen Sensor in die und aus der Monoschicht siebenmal. Elektronenmikroskopie abgeschieden Phagen Monoschichten vor der Exposition gegenüber bakteriellen Proben zeigten, daß die Schichten kontinuierliche, homogene und einheitliche (Daten nicht gezeigt) waren.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 4,5-4,8 mit einem Phagen Sphäroid Suspension in 3 hergestellt wird.
  10. Verwenden hergestellt Phagen Biosensoren für die MRSA-Erkennung, ElektronenMikroskopie und Ellipsometrie.

9. Biosensor Testing, Diskriminierung von Methicillin-resistenten Staphylococcus Bakterien und Sensitive

  1. In diesem Protokoll werden Biosensoren mit unmodifizierten und modifizierten Phagen und Phagen-Kügelchen hergestellt. Quarzkristall-Mikrowaage mit vier Sensor Strömungskammern dient zur Überwachung Bindung von Bakterien an die Phagen auf QCM Sensoroberfläche immobilisiert. PBP 2a Antikörper, konjugiert Latexkügelchen werden verwendet, um zwischen Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindliche Staphylokokken Bakterien unterscheiden. Alle Messungen werden in der Flow-Modus (50 ml / min) bei 5 MHz durchgeführt.
  2. Stellen Sie eine Basislinie Resonanzfrequenz der QCM Sensor in Wasser (~ 30 min).
  3. Zeichnen einer Suspension lebender Methicillin sensitive Staphylococcus Bakterienzellen in Wasser (10 9 CFU / ml) durch die Testzelle.
  4. Kontinuierliche Überwachung Änderungen in der Resonanzfrequenz und Sensoren Energiedissipation zum ersten Oberton, using der Q-Soft Software.
  5. Wenn die Änderungen in der Resonanzfrequenz Sensoren und Dissipation Sättigung erreicht, fügen Sie die Aussetzung der PBP-Antikörper, konjugiert Latexkügelchen (6,77 x10 10 Perlen / ml) auf die Strömung während der kontinuierlichen Überwachung von Frequenz und Verlustleistung.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 9,2-9,5 für Methicillin-resistenten Staphylococcus Bakterienzellen (MRSA).
  7. Definieren Sie einen Frequenzwechsel durch die Masse Änderung durch Bakterien-Bindung durch die Sauerbrey-Gleichung Af = 24,25-Dm xn / C, wobei C die Masse Empfindlichkeit konstant (C = 17,7 ng x cm -2 x Hz -1 bei 5 MHz ) m Masse und n die Anzahl Oberton (n = 1).
  8. Definieren einer Energiedissipation Änderung (Δ D) von der Aufnahme der exponentiellen Abklingen der Schwingung (Frequenz und Amplitude dämpft, welche erlaubt die Quantifizierung der Energie abgeführt und während einer Periode der Oszillation gespeichert,E abgeführt und E jeweils gespeichert: Δ D = E abgeführt / 2 πE gespeichert. Δ D ist in Verlustleistung Einheiten (DU), eine DU = 10 -6 relative Einheiten) gemessen.

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Representative Results

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Die Phagen zeigte lytische Aktivität gegen alle getesteten Stämme von S. aureus, einschließlich MRSA-Stämme, wie die Phagen-Spot-Test angegeben. Plaque Größen Regel reichten von 5 bis 15 mm. Wurde keine Aktivität gegen andere Test-Kulturen (Tabelle 1).

Ein normales Wachstum von S. aureus ATCC 12600 in NZY Mediums auf Schüttler-Inkubator bei 37 ° C ist in Abbildung 1A (eine Kurve durch leere Kreise gekennzeichnet) gezeigt. Die Anzahl der Bakterien von 3,2 x 10 6 bis 4,0 x 10 8 erhöht CFU / ml. 1A (eine Kurve durch gefüllte Kreise markiert) zeigt die Ergebnisse der Co-Kultivierung von 2,0 x 10 6 PFU / ml frei Phagen gleichzeitig zugegeben mit dem gleiche Konzentration an S. aureus ATCC 12600. Phagen, auf der Goldoberfläche immobilisiert, demonstrierte die lytische Aktivität vergleichbar mit der Aktivität des Phagen in Suspension (Abbildung 1A, Kurve von oben nach unten Dreiecke markiert). Immobilisierten Phagen blieb infektiös wenn das Gold Stück mit dem Phagen wurde in 24 h verwendet wachsenden Experiment, dann wurde 5 mal gewaschen und in PBS für 6 Tage bei 4 ° C, und schließlich mit einer frischen Bakteriensuspension wiederverwendet. (Abbildung 1A, Kurve von oben bis Dreiecken markiert). Es scheint, dass immobilisierten Phagen ihre DNA in den Bakterien injizieren, so nichtig Kapside, die unfähig sind neue Bakterien infizieren. Wir vermuten, dass immobilisierten Phagen auf einer Goldoberfläche als primäre "Katalysatoren", um ein paar Bakterien infizieren, die frei Phagen denen wiederum neue Bakterien infizieren und so weiter erzeugen serviert. Daher wurden die von immobilisierten Phagen wahrscheinlich nicht in der ersten 24 Stunden wachsen Experiment verwendet, und daher kann ein zweites Mal verwendet werden kann. Die Flächendichte der Phagen durch physikalische Adsorption abgeschieden war etwa ~ 0,7 Phagenpartikels / &mgr; m 2. Diese Konzentration ist hoch, aber es kann bis zu 10-mal 2. Daher könnte die Gold-Platte aufzunehmen some der freien lebensfähigen Phagen durch infizierte Bakterien in den ersten 24 Stunden wachsen Experiment veröffentlicht.

1B zeigt die Lyse Zone um das Geldstück, das anzeigt, dass immobilisierten Phagen Lage Lyse bakterieller Zellen. In der Kontrollgruppe Experimente hat die goldenen Teller leer nicht hemmen das Bakterienwachstum. Daher ist die effektive Verringerung des Bakterienwachstums an der Co-Kultur von Bakterien und immobilisierten Phagen vorhanden ist ein Ergebnis der primären Wechselwirkung Wasser suspendiert und Bakterien gebundenen Phagen wie in 1C gezeigt. Die Phagen Loslösung von der Goldoberfläche während Co-Inkubation von gebundenen Phagen und Bakterien war klein. Um abzuschätzen, wie viele Phagen wurden von der Goldoberfläche abgelöst während der Inkubation wurden die Proben mit gebundenen Phagen in NZY Lösung, im Shaker-Inkubator bei 37 ° C geschüttelt 8 Stunden eingetaucht, und eine freie Phagen-Konzentration im Überstand wurde beurteilt. Wir haben festgestellt, dass 4,1 x 10 7 PFU boun warend zu einer 60 mm 2 Goldstück (~ 0,7 Phagenpartikels / &mgr; m 2), wenn nur 3 x 10 4 PFU abgelöst wurden (0,007% Ablösung).

Die Sende-und REM-Aufnahmen von intakten lytischen Phagen 12600 auf dem Gold Substratoberfläche in den 2A und 2B gezeigt. Wenn der Phagensuspension wurde einer Behandlung Chloroform wurde die Phagen Aussehen verändert. Der Schwanz schrumpfte in der Länge und verdickt. Der polygonale Kopf wurde abgerundet (Abb. 2D und 2E). Wir bezeichnen die strukturell modifizierte lytischen Phagen "Sphäroid" ähnlich wie der Name des Chloroform behandelt filamentösen Phagen 26. Trotz der erheblichen strukturellen Veränderungen aus Chloroform-Behandlung führte, hat das Sphäroid lytische Aktivität durch Plaque-Zahlen gemessen nicht verändert werden (2C und 2F). Die mittlere lytische Aktivität von Phagen und Sphäroide waren (7.4 ± 1,5 (SD)) x 10 10 (N = 4) und (7,5 ± 1.0 (SD)) x 10 10 (N = 7), PFU / ml. Auf dem Niveau 0,05, waren die Aktivitäten von Phagen und Sphäroide nicht signifikant unterschiedlich (2C und 2F).

Die QCM-Sensoren mit immobilisierten lytischen Phagen zeigten keine signifikanten Änderungen in der Resonanzfrequenz oder Energieverlust, wenn sie MRSA (3A) ausgesetzt waren. Diese Daten zeigen, dass MRSA / Phagen-Interaktion in einer Masse ohne Veränderung resultiert nach dem QCM, und doch sind die elektronenmikroskopischen Aufnahmen der Beitrag untersucht Biosensoren zeigte signifikante bakterielle Bindung an der Sensoroberfläche (3B).

Wenn MRSA Suspensionen in die Durchflusszelle wurden mit dem Phagen Sphäroid Biosensoren, eine deutliche Abnahme der Häufigkeit injiziert (Δ f ≈ -105 Hz) und ein Anstieg der Verlustleistung (&Dgr; D ≈ 26 DU) beobachtet (Fig. 3C). Nach Phagen Sphäroid-Bakterien (MRSA) Bindungswechselwirkungen, getestet sensors wurden PBP2a Antikörper, konjugiert Latexkügelchen Suspensionen ausgesetzt. Diese MRSA getestet Biosensoren reagierte auf die PBP2a Antikörper, konjugiert Latexkügelchen Suspensionen, da eine weitere Abnahme in der Frequenz (Δ f ≈ -45 Hz) und eine Erhöhung der Verlustleistung (&Dgr; D ≈ 15 DU) beobachtet wurden (Abbildung 3C). Die Bindung von MRSA zu Sonden und Antikörper, konjugiert PBP2a Latexkügelchen Phagen bestätigt wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie Untersuchungen (3D).

Wenn die Phagen Sphäroid Biosensor wurde MSSA Suspensionen, eine deutliche Senkung der Frequenz ausgesetzt (Δ f ≈ -200 Hz) und ein Anstieg der Verlustleistung (&Dgr; D ≈ 55 DU) beobachtet (Fig. 3E). Nach Phagen Sphäroid-MSSA Bindungswechselwirkungen wurden getestet Sensoren mit PBP2a Antikörper, konjugiert Latexkügelchen Suspensionen herausgefordert. Zunächst untersucht die MSSA Biosensor zeigte kurze TransientenErhöhung der Frequenz und Abnahme der Verlustleistung. Nach ein paar Minuten von MSSA und PBP2a Antikörper, konjugiert Latexkügelchen Wechselwirkungen kehrte Frequenz PBP2a Antikörper Einführung Ebenen posten, aber die dissipative Energie (3E). Die Bindung von MSSA um Phagen-Sonden wurde mit Rasterelektronenmikroskopie bestätigt, aber keine Bindung zwischen MSSA und PBP2a Antikörper, konjugiert Latexkügelchen beobachtet (3F). Ellipsometrische Dickenprofils, 3D-Karte Dicke von lytischen Phagen und Staphylokokken Bakterien sind in Ergänzende Zahlen S1 und S2 gezeigt.

Nach dem Kontakt der Sensoren mit LB immobilisierten Phagen oder Sphäroide zu der Suspension von 10 9 Zellen / ml von MRSA oder MSSA wurden die Bakterien beobachtet Phagen oder Sphäroide bei einer Dichte (ρ) von 9,1 x 10 7 (MRSA / intakten Phagen) zu binden, 7,9 x 10 7 (MRSA / Sphäroide) und 7,2 x 10 7 (MSSA / Sphäroide) Zellen / cm 2. InTests unter Verwendung von 5 verschiedenen lytischen Phagen und 2 Wirtsbakterien 27, Forscher Phagen durch kovalente Bindung Verfahren bis 10 9 Zellen / ml Bakterien immobilisiert unterzogen und bestimmt den Phagen Abscheidegrad in einem Bereich von (2,5 bis 8,9) x 10 5 Zellen / cm 2 . Die Phagen Einfangeffizienz in dieser Arbeit vorgestellten ist ~ 100 mal höher.

Moderator Stamm Stamm Details Methicillin-Empfindlichkeit Phagen-Empfindlichkeit
S. aureus 12600 ATCC S +
S. aureus 27690 ATCC S +
S. aureus 10292 IA S +
10378 IA S +
S. aureus 10497 IA S +
S. aureus 10686 IA S +
S. aureus MRSA 1 AU R +
S. aureus MRSA 2 AU R +
S. aureus MRSA 5 AU R +
S. aureus MRSA 13 AU R +
S. aureus MRSA 26 AU R +
S. aureus MRSA 34 AU R +
S. aureus MRSA 45 AU R +
B. anthracis Sterne AU NA -
Salmonella typhimurium LT2 AU NA -
Shigella flexneri unbekannt AU NA -
Yersinia enterocolitica unbekannt AU NA -
Proteus mirabilis unbekannt AU NA -
Klebsiella pneumoniae 13882 AU NA -
Bacillus subtilis 6051 ATCC NA -

Tabelle 1. Phagen 12600 Empfindlichkeit der bakteriellen sZüge IA - isoliert von Tieren;. AU - Bakterienkultur Sammlung von Auburn University; na - nicht anwendbar, ein - lytische Aktivität des Phagen wurde von Plaques Bildung, +, einfühlsam, definiert -, nicht empfindlich. Übernacht-Kulturen der getesteten Stämme wurden auf die Platten mit NZY Agar. Nachdem die Oberfläche getrocknet war, wurde eine Probe (10 ul) 10 11 PFU Phagensuspension auf der Oberfläche der Platte gesichtet. Die Platten wurden bei 37 ° C für 18-24 Stunden inkubiert. Lytische Aktivität der Phagen wurde durch Bildung von Plaques nachgewiesen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Infektiöse Eigenschaften der gebundenen und freien Phagen. A. Bakterienwachstum in Abwesenheit (leere Kreise) und in Gegenwart (gefüllte Kreise) der freien Phagen, in Anwesenheit von Phagen an Goldoberfläche gebunden (top up triangles), und in Gegenwart des Phagen gebunden Goldoberfläche nach 6 Stunden bei 4 ° C (von oben nach unten Dreiecke). Insert: Die Leitung (1) zeigt eine lineare Anpassung der Phagen ohne Wachstum experimentellen Daten der Gleichung (4) (R = -0.99, p <0,0001). Die Leitung (2) eine Anpassung an die experimentellen Daten des Bakterienwachstums am freien Phagen Gegenwart der gleichen Gleichung. Bakterienwachstum Konstante (k) in Abwesenheit und Anwesenheit von freien Phagen, gleich 0,88 und 0,64, (-0.048, Rückgang Phase). Repräsentative Daten von drei unabhängigen Experimenten sind in Panel A. gezeigt eine mittlere relative Fehler OD 600 Messungen nicht mehr als 5%. B. Phagen immobilisiert an die Goldoberfläche ist infektiöser als durch die Lyse Zone rund um das Goldstück angegeben. 1 - das Fragment der Agarplatte mit Bakterien, 2 - das Gold Stück mit immobilisierten Phagen;. 3 - der Hemmzone um das Geldstück C. Schematische Darstellung Bakterium Lyse von Phagen, die an der Goldoberfläche. 1 -gold-beschichteten Quarz Stück, 2 - Phagen gebunden an die Goldoberfläche, 3 - Bakterium durch gebundenen Phagen, 4 verankert - kostenlos Phagen durch Platzen infiziert Bakterium freigesetzt. Mit freundlicher Genehmigung von: Guntupalli, R., et al 2012.. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 2
Abbildung 2. Eigenschaften von intakten und modifizierten Phagen A und B - Getriebe und Rasterelektronenmikrobilder intakten Phagen sind;.. C - Phagen lytische Aktivität auf einer Agar-Platte mit MRSA D und E - Getriebe und Rasterelektronenmikrobilder intakten Phagen Sphäroide sind; F - Phagen Sphäroide lytischen einctivity auf einer Agar-Platte mit MRSA. Die mittlere Aktivität des Phagen und Sphäroide (7,4 ± 1,5 (SD)) x 10 10 (N = 4) und (7,5 ± 1,0 (SD)) x 10 10 (N = 7) PFU / ml. T-Test: t = 0,15682, p = 0,87851. Auf dem Niveau 0,05, sind die Aktivitäten von Phagen und Sphäroide nicht signifikant unterschiedlich. Bars: A, B, D und E: 200 nm. Mit freundlicher Genehmigung von:. Guntupalli, R., et al 2012.

Abbildung 3


Abbildung 3. Kombinierte QCM-D und EM-Analyse von Phagen-Bakterien-Interaktionen. Bakterien wurden auf den Sensor in einer Konzentration von 10 9 CFU / ml Suspension in Wasser bei einer Fließgeschwindigkeit von 50 ml / min zugeführt. 1, 2 stellen Änderungen in der Resonanzfrequenz und der Energieverlust auf. A. Phage beschichteten QCM-D-Sensor als Reaktion auf MRSA. Pfeil zeigt ter MRSA Lieferzeit auf der Sensoroberfläche. B. Rasterelektronenmikrographie Beitrag untersucht MRSA zu lytischen Phagen auf dem QCM Sensor immobilisiert gebunden. M-MRSA, P-Phagen auf der Sensoroberfläche. C. Nachfolgende Reaktionen der Phagen Sphäroide beschichteten QCM-D Sensor MRSA und dann an Antikörper Perlen PBP. Die Pfeile zeigen die MRSA und PBP Antikörper Lieferzeit zur Sensoroberfläche, beziehungsweise. D. Rasterelektronenmikrographie Beitrag untersucht Biosensor mit Phagen Sphäroide, MRSA, und PBP Antikörper Perlen. Dicke und dünne Pfeile zeigt typische MRSA Zelle und Antikörper Wulst auf. E. Sukzessive Antworten der Phagen Sphäroide beschichteten QCM-D Sensor S. aureus und dann auf Antikörper Perlen PBP. Die Pfeile zeigen S. aureus und PBP Antikörper Lieferzeit zur Sensoroberfläche, beziehungsweise. F. Rasterelektronenmikrographie Beitrag untersucht Biosensor mit Phagen Sphäroide, S. aureus, und PBP Antikörper Perlen. Dicke und dünne Pfeile zeigt typische S. aureus Zellen und Antikörper-Kügelchen sind. Mit freundlicher Genehmigung von: Guntupalli, R., et al 2012.. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Ergänzende Zahlen

Abbildung S1
Abbildung S1. Ergänzende 1. (A) und (b) sind Ellipsometrisches Dickenprofil und 3D Dickenkarte eines lytischen Phagen, bzw. (effektive Brechungsindex = 1,05). Dicke Profile zeigen Mittelwert, RMS-Rauhigkeit, minimale und maximale Dicke der Monoschicht. Eine Linie über die Dicke der Karte gezogen wurde, um die Dicke zu generieren.

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Abbildung S2. Ergänzende Abbildung 2.

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Discussion

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Es ist bekannt, dass Phagen als Biosensor Sonden für bakterielle Erreger 28 verwendet werden. Es wird in dieser Arbeit gezeigt, dass Phagen zusammen mit PBP 2a Antikörper genutzt werden, um das alte Problem zu lösen: schnelle Diskriminierung antibiotikaresistenten und empfindliche Stämme.

Es wurde gefunden, jedoch diese normale unveränderte Staphylokokken Phagen nicht geeignet sind für Bakterien Detektion mit QCM Geräte, obwohl sie Bakterien binden. Die Phagen-Schwanz ist so lang, dass akustische Wellen nicht "greifen" die Bakterien gebunden an das Ende der Phagen Schwänze. Dieser Zustand führte zu einem "missing mass" Effekt 29 und die Unfähigkeit, Resonanzfrequenz und Verlustleistung Änderung trotz der erheblichen Bindung von EM registrieren zeigte Bilder (3A und 3B). Dieses Problem einfach durch Ersetzen des intakten Phagen mit Sphäroide gelöst, die durch Phagen-Chloroform-Wasser-Behandlung nicht verändert. Diese Behandlung führte zu voll funktionsfähig pHage mit kurzen, dicken und nicht-flexiblen Schwanz (Figuren 2D, 2E, 2F und). Wenn Phagen mit Sphäroide in Biosensoren ersetzt wurden, wurden die MRSA leicht durch QCM-D-Gerät erkannt.

Wenn Phagenpartikeln an Goldoberflächen wurden bei einer richtigen Orientierung gebunden, waren ihre Rezeptoren zugänglich für die Host-Bakterien. Wenn direkten physischen Kontakt zwischen einer festen Oberfläche mit Phagen und einem getrockneten Bakterien-Schicht auftreten, sind die immobilisierten Phagen einspritzen kann viralen Genoms in Wirtsbakterien (Abbildung 1C). Diese Ergebnisse stimmen gut mit denen mit lytischen Phagen immobilisiert Glasscheibe Oberflächen durch eine kovalente Bindung Technik 27 erhalten. Die Fähigkeit von gebundenem lytischen Phagen Wirtsbakterien erfassen wurden auch unter Verwendung eines biotinylierten Phagen Immobilisierungstechnik 30 gezeigt. Im Gegensatz dazu hat eine sehr einfache physikalische Adsorption Verfahren zum Anbringen richtig ausgerichtet Phagen an feste Oberflächen wurde 31 verwendet. Ter hohe Phagen Sphäroid Einfangeffizienz kann zur Herstellung von wirksamen antimikrobiellen Oberflächen verwendet werden. Insgesamt Zeit bis zur Rufannahme für das vorgeschlagene Test ist etwa 16 min pro Probe. Diese Zeit lässt sich durch die Verwendung QCM Geräte mit einer Vielzahl von Kammern verkürzt werden. Die erwartete Haltbarkeit für den Phagen Sensoren etwa 3-4 Monate bei Raumtemperatur. Mit einem Biopolymer Schutz könnte man zu verlängern bis zu 32 Jahren. Die Nachweisgrenze von S. aureus wurde dieser Phagen durch eine Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Spektroskopie gemessen und betrug 10 4 KBE / ml 18 sein.

Eine der wichtigsten Voraussetzungen für die Verwendung von Methoden in diesem Artikel beschrieben ist, mit sauberen und sterilen Bedingungen 33 Anforderungen für alle Experimente mit Phagen und Bakterien entsprechen.

Häufig verwendete Methoden zum Nachweis von MRSA, wie die Scheibe Diffusion Oxacillin Agar Probeaufnahmen oder Bouillonmikrodilutions nehmen normally bis zu 24 Stunden, um den Test durchzuführen. Schnelle Techniken, die automatisierte Techniken wie die Vitek GPS-SA-Karte, Rapid ATB Staph-System, das Schnellwarnsystem Microscan Systemsteuerung System und der Crystal MRSA-ID-System gehören auch zu Ergebnissen führen, nach 3-11 h 9-14. PCR oder DNA-Hybridisierung des mecA Gens 15 ist eine relativ schnelle und genaue Methode erfordert jedoch gereinigte DNA und ist extrem empfindlich Verunreinigungen. Im Gegensatz dazu ist das Verfahren in dieser Arbeit beschriebenen schnellen, braucht nicht die DNA-Extraktion, und es ist nicht empfindlich auf Zusätze.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Die Arbeit hier berichtet wird, wurde durch Zuschüsse von der Auburn University und AUDFS USAF CRADA 07-277-60MDG-01 unterstützt. Die in diesem Artikel sind die der Autoren und spiegeln nicht die offizielle Politik oder Position der United States Air Force, Department of Defense, oder die US-Regierung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P4417
spectrophotometric-grade chloroform Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 154733 (99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 29609-0 (95%)
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT 64-17-5 190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge Beckman Coulter Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden E4
Scanning electron microscope (SEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized Millipore Corporation, Billerica, MA SCGPU05RE 0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish NUNC A/S, Denmark 240835 Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes Gilson, Pipetman, France P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific, CT Classic C24
Gold-coated quartz pieces Auburn University, AL Homemade
Petri dishes Fisher Brand, USA 0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance The Baker Company, ME SG403
Culture Growing Flasks Corning Incorporated, NY 4995 PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. 4001
Plasma Cleaner Harrick Plasma, USA PDC-32G
Millipore water purification system Millipore Direct-Q
Imaging Ellipsometer Accurion, USA nanofilm_ep3se
Software Q-Sense AB, Sweden QSoft, QTools

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Biosensor zum Nachweis von Antibiotika-resistenten Staphylococcus Bakterien
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Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).More

Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).

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