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Bioengineering

抗生物質耐性ブドウ球菌の細菌の検出のためのバイオセンサー

doi: 10.3791/50474 Published: May 8, 2013

Summary

溶菌ファージバイオセンサーと抗体ビーズメチシリン耐性(MRSA)と敏感ブドウ球菌の細菌を区別することができます。ファージを水晶振動子マイクロバランスセンサーの表面上にラングミュア·ブロジェット法で固定し、広範囲のブドウ球菌プローブとして働いていた。抗体ビーズはMRSAを認識しています。

Abstract

黄色ブドウ球菌広い宿主範囲およびペニシリン結合タンパク質(PBP 2a)の抗体共役ラテックスビーズは、メチシリン耐性(MRSA)および感受性(MSSA)Sの識別用に設計されたバイオセンサーを作成するために利用されているを有する構造的に形質転換された溶菌バクテリオファージ。ブドウ種 1,2。溶菌ファージは、水 - クロロホルムインタフェースとの接触によりファージスフェロイドに変換されている。ファージスフェロイド単層をラングミュア·ブロジェット(LB)法3でバイオセンサー表面上に移動されました。作成されたバイオセンサーは、細菌ファージの相互作用を評価するための放熱追跡と水晶振動子マイクロバランス(QCM-D)によって検討されている。細菌スフェロイド相互作用が減少し、共振周波数とMRSAとMSSA株の両方の消費エネルギーの上昇につながった。細菌結合した後、これらのセンサは、さらにペニシリン結合タンパク質抗体ラテックスビーズにさらされているS。 MRSAで分析センサーは2A抗体ビーズをPBPに応え、MSSAで検査センサーが応答を与えませんが。この実験的な区別は、メチシリン耐性と敏感S.間に明確な区別を決定黄色ブドウ球菌株 。同じようにバインドされ、バインドされていないバクテリオファージは、表面上、水懸濁液中の細菌の増殖を抑制する。溶菌ファージをスフェロイドに変更されると、彼らは強力な溶解活性を保持し、高い細菌の捕獲能力を示しています。ファージとファージスフェロイドは、抗生物質耐性微生物のテストおよび滅菌のために利用することができる。他のアプリケーションは、バクテリオファージ療法および抗菌面での使用を含むことができる。

Introduction

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黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性株は、本質的な感染症や院内アウトブレイク4-8の要因として示唆されている。このようなディスク拡散オキサシリン寒天スクリーンテスト、または微量液体希釈としてメチシリン耐性の認識の一般的な方法は、耐性の発現量を高めるために合わせた培養条件に依存している。変化は、成長培地に30または35でオキサシリン、インキュベーションの活用°Cではなく37℃以上、およびNaClのインクルージョンが含まれています。さらに、これらの種類の技法が正しい検出のため、24時間の代わりに16〜18時間の長い潜伏期間が必要である。メチシリン耐性を同定するための感度の適切な(> 96%)レベルの急速な技術は、バイテックGPS-SAカード、ラピッドATB黄色ブドウ球菌システム、及び3-11時間後に結果を生成する高速マイクロスキャンパネルシステムのような自動化された微量希釈法を含む9-11。クリスタルMRSA IDシステムは、Sの成長の認識に基づいて迅速な方法である2%NaClおよび酸素感受性蛍光センサー付リットルあたりオキサシリン4mgの存在下での黄色ブドウ球菌 。 91から100パーセントの間で感度の範囲は、インキュベーション12-14の4時間後に主張した。これらの表現型の方法は、異種の抵抗を発現普及している菌株の影響によりその精度が制限されている。したがって、メチシリン耐性の認識のための最高の広く受け入れられている方法はmecAの遺伝子15のPCRまたはDNAハイブリダイゼーションである。しかしこの手法は、精製されたDNAを必要とし、細胞の破片16を含む様々な混和剤(不純物)に非常に敏感です。

さらに、これらの技術は実行するのに長い時間を必要とする。 mecAの遺伝子産物、蛋白質PBP 2aとの認識戦略は抵抗を決定するために利用することができ、標準試験法17に比べて信頼性があってもよい。

1,2,18を有するものを含む黄色ブドウ球菌株の認識プローブとして利用することができることが示された。本研究ではこのようなリアルタイムでMRSAのコンフォメーションと一緒に細菌の認識などのMRSAの特異的認識と検出における新規手法を提案した。この特定の目的のためのS.タンパク質に対するモノクローナル抗体と組み合わせたホストの広いスペクトル(MRSA株を含む)と黄色ブドウ球菌バクテリオファージは、(PBP 2a)が使用されている。 PBP 2aは、細胞壁タンパク質であり、それはMRSAの抗生物質抵抗性の原因である。しかしPBP 2aの抗体は、S.のために固有のものではありませんいくつかの他の細菌から黄色ブドウ球菌は、PBP 2A 19,20に配列類似性と抗生物質結合タンパク質を持っている。そこで本研究では、S. PBP 2aの蛋白質に対する黄色ブドウ球菌バクテリオファージおよび抗体が使用されている。納入仕様にバイオセンサーを開発することができるようにする的に二段階のアクションが利用されていると、デバイスを検出し、MRSAを識別します。最初のステップは、Sを使用センサプローブとして球菌バクテリオファージ単層、2番目のステップはPBP 2A特異的な抗体を用いている。したがって、人はS.を認識し、手順黄色ブドウ球菌の細菌は、他の一人としての抗生物質結合タンパク質に敏感になります。二つのステップから受信された信号が正である場合には、MRSAの特異的検出を示す。

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Protocol

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1。ステージの設定

  1. 型株S.を得る球菌 ATCC 12600、S.球菌 ATCC 27690及び枯草菌 ATCC 6051。 S.のメチシリン耐性株黄色ブドウ球菌 - MRSA1、MRSA 2、MRSA 5、MRSA 13、MRSA 26、MRSA 34、MRSA 45、B.炭疽スターン、 ネズミチフス菌 LT2、 赤痢菌、エルシニアenterocolotica、プロテウス·ミラビリス、肺炎桿菌 13882;溶菌ファージ12600。
  2. PBP 2aは抗体共役ラテックスビーズを入手します。
  3. 21に記載されいるようNZY培地を準備します。
  4. 食塩水(PBS)をリン酸緩衝を得る。
  5. ラングミュア·ブロジェット(LB)単分子層堆積のためのサブフェーズとして脱イオン水を準備します。

2。バクテリオファージの伝播と滴定

  1. Sの一晩培養を5mlをインキュベート球菌 ATCC 12600ファージを500μl(3×10 9 <と(3.6×10 8コロニー形成単位(CFU)/ ml)を/ 37℃で一晩振盪インキュベーターで2 Lフラック500ミリリットルNZY培地で)> PFU / mlの(商標)。
  2. 4℃で10分のために4,424 xgで文化を遠心
  3. 4℃で10分間、11,325×gで再遠心上清℃で
  4. 0.22μmのミリポアフィルターを通してフィルター上澄み。
  5. 1.5時間75395 xgでろ液を遠心分離します。
  6. 蒸留水100μlのペレットを溶解する。
  7. NZY培地でファージ懸濁液の10倍希釈液を調製する。
  8. Sの(ON)一晩培養のプレート1ミリリットルすべての表面が覆われていることを確認するためNZY寒天と2プレートの各々の上に黄色ブドウ球菌 ATCC 12600を。文化の過剰を削除し、30分間、表面が乾燥してみましょう。
  9. プレートの表面に適当なファージ希釈のサンプル(10μL)を発見し、18から24時間、37°C ​​のでインキュベート。
  10. プラークの形成を調べ、ファージ力価を計算します。バクテリオファージ力価(T)は、ウェブ数に基づいて推定されるファージサスペンションと希釈係数(F)10μlの体積(V)ごとに形成laques(N)。 。Tは= N /(VXF)たとえば、希釈10 -7でのプラーク数75と体積10μlの(10×10 -3 ml)のために、力価が75 /等しいです:力価は、次の式により算出した(10×10 -3×10 -7)= 7.5×10 10プラーク形成単位(PFU)あたりのmlの懸濁液。

3。ゴールド固定化ファージ

  1. 10分間アルゴンのプラズマエッチングによってクリーンゴールドコーティングされた水晶片(60ミリメートル2)した後、滅菌キャビネットにUV光の下で6時間殺菌する。
  2. 滅菌シャーレ内の各部分の金表面に1×10 9 PFU / mlのファージ懸濁液の50マイクロリットルを追加し、室温で湿潤チャンバー内で一晩インキュベートする。
  3. 残りファージ懸濁液を取り出して、滴定。
  4. アンバウンドを除去するためにPBSで結合したファージと片5回洗浄ファージ。

4。乾燥した表面上に固定化されたファージ感染のテスト

  1. NZY寒天プレート上にS。球菌 ATCC 12600のO / N文化を広げ、乾燥させることができます。
  2. 板面上に固定化したファージとゴールドピースを下に置きます。
  3. 感染性を示している℃で37℃で12時間インキュベートした後溶解のゾーンを守ってください。
  4. 対照実験のないファージを金覆わ片を使用してください。

5。液体中の遊離と結合したファージの溶解活性のテスト

  1. S.のON文化を追加4 300ミリリットルサイドアームフラスコ(各フラスコに6×10 6 CFU / ml)を毎におけるNZYのブドウ球菌 ATCC 12600〜10ミリリットル。
  2. 2フラスコ2×10 6 PFU /遊離ファージmlのアドイン。
  3. コントロールとして他の二つのフラスコを使用してください。
  4. S.の経時変化を監視するすべてのフラスコを30分間隔で光学密度測定(OD 600)により、570分間球菌細胞溶解。
  5. 24時間での最終的な測定を行います。
  6. 手順5.1から5.5を繰り返しますが、コントロールフラスコのないファージを金結合したファージの代わりに自由にファージと片、金の部分を使用しています。

6。インキュベーション中に結合したファージの損失

  1. 室温で一晩湿気のチャンバー内に配置されたペトリ皿中の滅菌金片の表面に1×10 9 PFU / mlのファージ50μlのを追加します。
  2. 金表面と力価から非結合ファージとサスペンションを取り外します。
  3. 8時間37℃で5 PBSで倍と場所シェーカー·インキュベーター、15 mlチューブに、1mlのNZY溶液中の結合したファージとの金の部分を洗う。
  4. 2で説明したように切 ​​り離されたファージの力価を決定します。

7。ファージスフェロイドの準備

  1. 1ミリリットルバイアルで分光等級のクロロホルム等量と在庫ファージ12600懸濁液400μlの(10 11 PFU / ml)を組み合わせる室温で加えた。
  2. 優しくボルテックス1分持続オーバーファージ - クロロホルムサスペンション5-6回(5秒間隔)。
  3. 懸濁液を30秒間安定化させ、次いでスフェロイドを含む上相をピペットで単層の準備のためにオフにピペッティングした。
  4. 伝送および走査型電子顕微鏡用スフェロイドサスペンション数マイクロリットルを取る。
  5. バイオセンサー製造の残りの回転楕円体サスペンションを使用してください。

8。バイオセンサーの準備

  1. 10分PDC-32G Harrickプラズマクリーナー、アルゴンのプラズマエッチングによってクリーンQCM-Dセンサー。
  2. 任意の有機不純物を除去するためにヘキサンでセンサーを洗浄します。
  3. 22で説明したように、フィルムバランスのトラフを準備し、清掃してください。
  4. 副相溶液とLBトラフを記入し、20℃±0.1℃をトラフ障壁とそれをきれいにし、トラフを安定
  5. 水性suspensiにおけるファージ12600300μlのアリコートを広げLBサブフェーズへ(10 11 PFU / ml)を上に。
  6. 部分的に副相22,23に浸漬する傾斜水和ガラス棒を下に実行するためにファージ12600水性懸濁液(10 11 PFU / ml)を300μlのアリコートを可能にすることにより、LBサブフェーズ·ソリューションにファージ単層を準備します。
  7. 10分間準備された単層を安定化した後、定圧19 N / mのが達成されるまで30 50mm /分(44 cm 2で/分)の速度でそれを圧縮する。
  8. 連続して単層のうちに7回センサーを浸漬することにより4.5ミリメートル/分の速度で垂直に配置QCM-Dセンサに垂直成膜を実行します。細菌試料への曝露の前に堆積ファージ単層の電子顕微鏡は、層が均質で連続であることを示し、均一(データは示さず)。
  9. 繰り返し3で調製されたファージ回転楕円体懸濁液を用いて4.5から4.8を繰り返します。
  10. MRSA検出、電子のために製造されたファージのバイオセンサーを使用して、顕微鏡、およびエリプソメトリ。

9。バイオセンサーテスト、メチシリン耐性および感受性黄色細菌の識別

  1. このプロトコルでは、未変性および変性ファージとファージスフェロイドを有するバイオセンサが用意されている。 4つのセンサ流室を有する水晶振動子マイクロバランスがQCMセンサー表面に固定化ファージを細菌の結合を監視するために使用される。 PBP 2aは抗体共役ラテックスビーズは、メチシリン耐性(MRSA)および感受性黄色ブドウ菌を区別するために利用される。すべての測定は5 MHzでフローモード(50μL/分)で行われる。
  2. 水中でQCMセンサ(〜30分)のベースラインの共振周波数を確立する。
  3. テストセルを通る水でのライブメチシリン感受性黄色細菌細胞(10 9 CFU / ml)の懸濁液を描画します。
  4. 連続的に第一の倍音、USIのためのセンサの共振周波数とエネルギー散逸の変化を監視ngのQ-ソフトソフトウェア。
  5. センサの共振周波数及び損失の変化が飽和レベルに達したときに、周波数及び損失の連続監視中に流れるようにPBP抗体共役ラテックスビーズの懸濁液(6.77×10 10粒子/ ml)を加える。
  6. 繰り返しメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の細菌細胞(MRSA)が9.2から9.5を繰り返します。
  7. Cは質量感度が一定である(5 MHzでC = 17.7 ngのX cm -2のX Hzで-1 Sauerbrey方程式24,25 量Δf=-ΔmをXN / C、による結合細菌に起因する質量変化を通じて、周波数変化を定義)、mは質量であり、nは倍音の数(n = 1)である。
  8. 記録からのエネルギー散逸変化(ΔD)を定義する振動の指数関数的減衰(周波数および振幅は振動の一周期の間に消費されると、蓄積されたエネルギーの定量化を可能にする、減衰、それぞれ、Eは 散逸、Eが 格納されている :ΔD = E 消散 / 2πEを 格納 ΔDは放熱ユニット(DU)は1 DU = 10 -6相対単位)で測定される。

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Representative Results

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ファージは、Sのすべてのテストされた株に対して溶菌活性を示しとしてファージスポット試験によって示さMRSA株、 黄色ブドウ球菌を含む、。プラークサイズは、通常5〜15 mmの範囲であった。活動は、他の試験培養物( 表1)に対して、見つかりませんでした。

S.の正常な成長球菌 ATCC 12600は37℃シェーカー·インキュベーターでNZY培地で°Cは、 図1A(白丸でラベル曲線)で示されている。細菌の数が×10 8 CFU / mlの。 図1A(黒丸によってラベル曲線が)同時にで追加された2.0×10 6 PFU / mlの無料ファージの共培養の結果を示している4.0から3.2×10 6から増加S.同じ濃度球菌 ATCC 12600。金表面上に固定化されたファージは、懸濁液中のファージの活動( 図1A、トップダウンの三角形によって標識カーブに匹敵溶菌活性を示した)。固定化されたファージ感染残ったファージの金片は第24時間成長実験に使用した場合、それは5回洗浄し、PBSに格納されて6日間4℃では、最終的には新鮮な細菌懸濁液を再利用した。 ( 図1A、トップアップ三角形によって標識曲線)。これは、固定化されたファージは、新しい細菌を感染させることができないボイドキャプシドを、残して、細菌で自分のDNAを注入すると思われます。私たちは、金表面上に固定化されたファージは、順番にそれらは新しい細菌に感染し、その上で無料ファージを生成するいくつかの細菌に感染する主な "触媒コンバーター"を務めたと仮定。従って、固定化されたファージのほとんどは、おそらく最初の24時間の成長実験で使用されておらず、従って、二度目に利用することができる。物理吸着によって堆積ファージの表面密度は、約0.7〜ファージ粒子/μm2であった。この濃度は高いですが、それは10倍の2まで成長することができます。したがって、金板をsを組み込むことができ最初の24時間の成長実験で感染した細菌によって放出された遊離実行可能なファージの青梅。

図1Bは、固定化されたファージは、細菌細胞を溶解することができたことを示す、金片の周りに溶解ゾーンを示している。対照実験では、空の金プレートは、細菌増殖を阻害しなかった。したがって、細菌や固定化されたファージの共培養で発見細菌の増殖を効果的に減少は水浮遊細菌や図1Cに示すように結合したファージの主要な相互作用の結果である。バインドされたファージや細菌の共同インキュベーション中金表面からのファージ剥離は小さかった。インキュベーションの間、金表面から剥離された何ファージ推定するために、結合したファージを有するサンプルは、8時間、37℃で振盪インキュベーター中で振盪NZY溶液°Cに浸漬し、上清中の遊離ファージ濃度を評価した。私たちは、4.1×10 7 PFUは準備するあったと判断のみ3×10 4 PFUが切り離された60ミリメートル2ゴールドピース(〜0.7ファージ粒子個/μm2)、(0.007パーセントの剥離)にD。

送信及び金基板表面上に無傷の溶菌ファージ12600の走査電子顕微鏡写真は、 図2Aおよび図2Bに示されている。ファージ懸濁液を処理しクロロホルムを行ったときに、ファージ物理的な外観を変化させた。尾の長さが縮小し、厚く。多角ヘッド( 図2Dおよび2E)丸めた。私たちは、繊維状ファージ26をあしらったクロロホルムの名前に似た"回転楕円体"構造的に変更された溶菌ファージと呼ばれる。クロロホルム処理に起因する重要な構造変化にもかかわらず、プラーク番号によって測定されたスフェロイド溶解活性は、( 図2Cおよび2F)変更されていない。ファージとスフェロイドの平均溶解活性であった(7.4±1.5(SD))×10 10(N = 4)と(7.5±1。0(SD))×10 10(N = 7)、PFU / mlであった。 0.05レベルでは、ファージとスフェロイドの活動は、( 図2Cおよび2F)有意差は認められなかった。

それらはMRSA( 図3A)に曝露したときに固定化された溶解性を有するファージQCMセンサは、共振周波数またはエネルギー消費に有意な変化を示さなかった。これらのデータは、MRSA /ファージの相互作用がQCMによると質量変化なしをもたらしたことを示しているが、まだポスト検定バイオセンサーの電子顕微鏡写真は、センサー表面( 図3B)で有意細菌の結合を明らかにした。

MRSAファージ懸濁液をスフェロイドバイオセンサー、周波数が大幅に減少してフローセル中に注入されたとき(Δfは ≈-105ヘルツ)と損失の増加(ΔD≈26 DU)が観察された( 図3C)。ファージスフェロイド-細菌(MRSA)の結合相互作用に続いて、SEを検定nsorsはPBP2a抗体共役ラテックスビーズ懸濁液にさらされた。これらのMRSAは、バイオセンサーは、周波数の一層の減少があるため、PBP2a抗体共役ラテックスビーズ懸濁液に反応(ΔF≈-45ヘルツ)と消費の増加が(ΔD≈15 DU)が観察された( 図3C)をアッセイした。プローブおよびPBP2a抗体共役ラテックスビーズ、ファージするMRSAの結合は、走査型電子顕微鏡調査( 図3D)を用いて確認した。

ファージ回転楕円体のバイオセンサーがMSSA懸濁液、周波数の大幅な減少にさらされたときに(Δfは ≈-200ヘルツ)と散逸の増加(ΔD≈55 DU)が観察された( 図3E)。ファージスフェロイド-MSSA結合相互作用の後、検定センサはPBP2a抗体共役ラテックスビーズ懸濁液でチャレンジした。当初、MSSAはバイオセンサーがの短いトランジェントを示した検定周波数の増加や損失の減少。 MSSAとPBP2a抗体共役ラテックスビーズ相互作用の数分後、周波数がPBP2a抗体導入レベルを投稿するには戻ったが、散逸エネルギーが( 図3E)に増加した。ファージプローブとMSSAの結合は、走査型電子顕微鏡で確認しませんが、MSSAとPBP2a抗体共役ラテックスビーズ( 図3F)が観察された間には、結合された。溶菌ファージ及びブドウ球菌細菌の偏光解析厚さプロファイルは、3D厚さマップは、S1とS2補足図に示されている

10 9細胞/ MRSAまたはMSSA mlの懸濁液にLB固定化ファージまたはスフェロイドとセンサーの接触の後、細菌は、9.1×10 7(MRSA /無傷ファージ)の密度(ρ)で、ファージまたはスフェロイドをバインドすることが観察された7.9×10 7(MRSA /スフェロイド)、および7.2×10 7(MSSA /スフェロイド)細胞/ cm 2である。で5つの異なる溶解性ファージ及び2宿主細菌27を用いた試験では、研究者らは10 9細胞/ mlの細菌への共有結合法により固定ファージを行い、(2.5から8.9)×10 5細胞/ cm 2の範囲でファージ捕捉効率を決定する。この研究で提示ファージの捕獲効率は、約100倍高い。

ホスト 歪み ひずみの詳細 メチシリン感受性 ファージ感受性
黄色ブドウ球菌 12600 ATCC S +
黄色ブドウ球菌 27690 ATCC S +
黄色ブドウ球菌 10292 IA S +
10378 IA S +
黄色ブドウ球菌 10497 IA S +
黄色ブドウ球菌 10686 IA S +
黄色ブドウ球菌 MRSA 1 AU R +
黄色ブドウ球菌 MRSA 2 AU R +
黄色ブドウ球菌 MRSA 5 AU R +
黄色ブドウ球菌 MRSA 13 AU R +
黄色ブドウ球菌 MRSA 26 AU R +
黄色ブドウ球菌 MRSA 34 AU R +
黄色ブドウ球菌 MRSA 45 AU R +
炭疽菌 スターン AU NA -
ネズミチフス菌 LT2 AU NA -
赤痢菌 不明 AU NA -
腸炎エルシニア 不明 AU NA -
ミラビリス変形菌 不明 AU NA -
肺炎桿菌 13882 AU NA -
枯草菌 6051 ATCC NA -

表1。ファージ細菌秒の12600感度列車IA -動物から単離し; AU -オーバーン大学の細菌培養コレクション; NA -適用されません。A -ファージの溶解活性が敏感なプラークの形成、+、、によって定義されていた- 、小文字の区別はありません。テストした菌株の一晩培養物NZY寒天とプレートに播種した。表面が乾燥した後、10 11 PFUのファージ懸濁液の試料(10μl)をプレートの表面上にスポットした。プレートを18〜24時間37℃でインキュベートした。ファージの溶解活性は、プラークの形成によって検出した。

図1
図1。結合および遊離ファージの感染特性。金表面(TRまでトップにバインドファージの存在下で遊離ファージのA.細菌不在下で成長(白丸)と存在(黒丸)、iangles)、および4で6時間後に、金表面に結合したファージの存在下で°C(三角形トップダウン)。インサート:行(1)は式(4)(R = -0.99、P <0.0001)にファージ成長実験データなしの線形近似を示しています。行(2)は、同じ方程式への無料ファージ存在における細菌の増殖の実験データの適合度を示しています。遊離ファージの不在と存在下で細菌の増殖定数(k)は、0.88と0.64、(-0.048、衰退期)等しい。 3つの独立した実験の代表的なデータは、パネルAに示されている金片の周りに溶解ゾーンによって示されるように、金表面に固定化された相対誤差OD 600の測定値が5%を超えないことを意味する。B.ファージに感染性である。 1 -細菌と断片寒天プレート、2 -固定化したファージとゴールドピース、3 -ゴールドピースの周りに阻害ゾーン金表面に付着したファージによって細菌溶解のC.模式図。 1 -ゴールドコーティングされた水晶片、2 - 金表面に結合したファージ、3 - 結合したファージによって固定細菌、4 - 無料のファージは、感染した細菌を破裂でリリースしている。から許可を得て使用:Guntupalli、R. ら2012。 大きい図を表示するには、ここをクリックしてください

図2
図2。そのまま、変更ファージの特性およびB -トランスミッションそれぞれ無傷ファージの電子顕微鏡写真、スキャン、。C - MRSA DEと寒天プレート上のファージ溶解活性-トランスミッションをそれぞれ無傷ファージスフェロイドの走査電子顕微鏡写真; F -溶菌ファージスフェロイドMRSAと寒天プレート上にctivity。ファージおよびスフェロイドの平均活性は(7.4±1.5(SD))×10 10(N = 4)および(7.5±1.0(SD))×10 10(N = 7)PFU / mlである。 T-検定:T = 0.15682、P = 0.87851。 0.05レベルでは、ファージとスフェロイドの活動が大幅に違いはありません。バー:A、B、D、およびE:200nmである。から許可を得て使用:。Guntupalli、R.ら 2012。

図3


図3。 QCM-Dおよびファージ-細菌相互作用のEM解析組み合わせる。細菌を50μl/分の流速で、水中で10 9 CFU / mlの懸濁液の濃度でセンサに送達した。 1,2は、それぞれ、共振周波数及びエネルギー消費の変化を表す。MRSAへA.ファージ被覆QCM-Dセンサ応答。矢印は、Tを示しています彼は、センサ表面へのMRSA納期。ポストのB.走査型電子顕微鏡写真では、MRSAがQCMセンサー上に固定化された溶菌ファージにバインドされてアッセイした。その後、M-MRSA、センサー表面上のP-ファージ。MRSA最初にファージスフェロイドコーティングQCM-DセンサーのC.連続応答は、抗体ビーズをPBPする。矢印はそれぞれ、センサー表面にMRSAおよびPBP抗体納期を示しています。記事のD.走査型電子顕微鏡写真は、ファージスフェロイド、MRSA、およびPBP抗体ビーズでバイオセンサーアッセイした。厚いと薄い矢印はそれぞれ典型的なMRSAの細胞と抗体ビーズを、示しています。ファージスフェロイドのE.連続応答はSにコーティングされたQCM-Dセンサー抗体ビーズをPBPする最初にしてブドウ球菌 。矢印はS.を示すポストのそれぞれセンサ表面に黄色ブドウ球菌やPBP抗体納期、。F.走査型電子顕微鏡写真は、ファージスフェロイド、S.とバイオセンサー検定黄色ブドウ球菌 、および抗体ビーズをPBP。厚いと薄い矢印は、典型的なSを示しています黄色ブドウ球菌細胞と抗体ビーズ、それぞれ。から許可を得て使用:Guntupalli、R. ら2012。 大きい図を表示するには、ここをクリックしてください

補足図

図S1
S1を示しています。補足図1(a)、(b)は偏光解析厚さプロファイルとそれぞれ溶菌ファージの3D厚さマップ(有効屈折率= 1.05)である。厚さプロファイルは、単層の平均値、RMS粗さ、最小値、最大厚さを示しています。厚さマップを横切る線は厚さプロファイルを生成するために描かれた。

50474/50474figs2.jpg "/>
S2図。補足図2。

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Discussion

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それはよくファージを細菌性病原体28バイオセンサープローブとして使用できることが知られている。急速な差別抗生物質耐性および感受性株:これは、PBP 2aの抗体と一緒にファージは、古い問題を解決するために利用できることは、この研究で実証されている。

しかしながら、それらの正常な未変性ブドウ球菌ファージは、彼らが細菌に結合するにもかかわらず、QCM装置​​との細菌検出には適していないが判明した。ファージ尾部は、音響波がファージ尾の末端に結合したバクテリアを "到達"ことができないほど長い。この状態は、( 図3Aおよび図3B)EM画像によって示された"欠けているマス"効果29と有意な結合にもかかわらず、共振周波数と放熱変更を登録することができないことをもたらした。この問題は簡単にスフェロイドと無傷ファージ、クロロホルム - 水処理によって変更されたファージを交換することで解決しました。この治療法は、完全に機能するPをもたらし、短く太く、非柔軟尾( 図2E 2D、および2F)とヘイグ。ファージをバイオセンサーにおけるスフェロイドに置き換えられたときに、MRSAを容易にQCM-D装置により検出した。

ファージ粒子は正しい向きで金表面に結合していたとき、それらの受容体は、宿主細菌にしかアクセスできませんでした。ファージと固体表面と乾燥菌層発生の間の直接的な物理的に接触した場合は、固定化されたファージは、宿主細菌( 図1C)にウイルスゲノムを注入することが可能である。これらの結果は、共有結合技術27によってガラスディスクの表面に固定化された溶菌ファージで得られたものとよく一致。宿主細菌をキャプチャするために結合したファージの溶解能力はまた、ビオチン化されたファージの固定化法30を用いて実証された。対照的に、固体表面に正しく配向したファージを取り付けるための非常に単純な物理的吸着法は、31利用されている。 T彼の高いファージスフェロイド捕捉効率が有効な抗菌表面を作るために使用することができる。提案されたアッセイのための合計時間ツー答えはサンプルあたり約16分です。この時間は劇的にチャンバ多数のQCM装置​​を使用することによって短縮することができる。ファージセンサの予想される貯蔵寿命は、室温で3〜4ヶ月程度である。生体高分子の保護を使って、それは数年32まで延長することができます。 S.の検出限界黄色ブドウ球菌は、表面プラズモン共鳴分光法によりこのファージを測定し、そして10 4 CFU / mlと18であることが判明した。

この資料に記載された方法を使用するための最も重要な条件の一つは、清潔で無菌条件下ファージと細菌と全ての実験の33要件に準拠することである。

このようなディスク拡散オキサシリン寒天スクリーンテスト、または微量液体希釈がノーマを取るようにMRSAの検出のために一般的に使用されるメソッド、LLYまでの24時間は、テストを実施する。などビテックGPS-SAカード、迅速ATB黄色ブドウ球菌システム、迅速なマイクロスキャンパネルシステム、およびクリスタルMRSA IDシステムとして自動化技術を含む急速な技術も3-11時間9-14後に結果を出す。 mecA遺伝子遺伝子15のPCRやDNAハイブリダイゼーションは、比較的迅速かつ正確な方法であるが、DNAを精製し、不純物が極めて敏感である必要があります。対照的に、この研究で記載された方法は、迅速でDNA抽出を必要としない、それは混和剤に敏感ではない。

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Disclosures

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

Acknowledgments

ここに報告された作品は、オーバーン大学AUDFSとUSAF CRADA 07から277-60MDG-01からの補助金によって支えられて。この記事の見解は著者のものであり、アメリカ空軍、国防総省、または米国政府の公式政策や立場を反映するものではありません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P4417
spectrophotometric-grade chloroform Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 154733 (99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 29609-0 (95%)
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT 64-17-5 190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge Beckman Coulter Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden E4
Scanning electron microscope (SEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized Millipore Corporation, Billerica, MA SCGPU05RE 0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish NUNC A/S, Denmark 240835 Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes Gilson, Pipetman, France P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific, CT Classic C24
Gold-coated quartz pieces Auburn University, AL Homemade
Petri dishes Fisher Brand, USA 0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance The Baker Company, ME SG403
Culture Growing Flasks Corning Incorporated, NY 4995 PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. 4001
Plasma Cleaner Harrick Plasma, USA PDC-32G
Millipore water purification system Millipore Direct-Q
Imaging Ellipsometer Accurion, USA nanofilm_ep3se
Software Q-Sense AB, Sweden QSoft, QTools

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References

  1. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes. Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).
  2. Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements. J. Microbiol. Methods. 90, 182-191 (2012).
  3. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Long, R., Olsen, E., Neely, W., Vodyanoy, V. Phage Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films. Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 82, 182-189 (2011).
  4. Barie, P. S. Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice. World. J. Surg. 22, 118-126 (1998).
  5. Byun, D. E., Kim, S. H., Shin, J. H., Suh, S. P., Ryang, D. W. Molecular epidemiologic analysis of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens. J. Korean Med. Sci. 12, 190-198 (1997).
  6. Duan, L., Lei, H., Huang, E., Yi, G., Fan, W. Drug resistance of Staphylococcus aureus from lower respiratory tract. Zhonghua Yiyuanganranxue Zazhi. 21, 1667-1668 (2011).
  7. Giamarellou, H., Papapetropoulou, M., Daikos, G. K. Methicillin resistant' Staphylococcus aureus infections during 1978-79: clinical and bacteriologic observations. J. Antimicrob. Chemother. 7, 649-655 (1981).
  8. Knopf, H. J. Nosocomial infections caused by multiresistant pathogens. Clinical management exemplified by multiresistant Staphylococcus aureus. Urologe A. 36, 248-254 (1997).
  9. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of differential inoculum disk diffusion method and Vitek GPS-SA card for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 433-436 (1994).
  10. Struelens, M. J., Nonhoff, C., Van, D. A., Philippe Mertens, R., Serruys, E. Evaluation of rapid ATB Staph for 5-hour antimicrobial susceptibility testing of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 33, 2395-2399 (1995).
  11. Woods, G. L., LaTemple, D., Cruz, C. Evaluation of MicroScan rapid gram-positive panels for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 1058-1059 (1994).
  12. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of BBL crystal MRSA ID system. J. Clin. Microbiol. 32, 2588-2589 (1994).
  13. Qadri, S. M., Ueno, Y., Imambaccus, H., Almodovar, E. Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Crystal MRSA ID System. J. Clin. Microbiol. 32, 1830-1832 (1994).
  14. Zambardi, G., Fleurette, J., et al. European multicentre evaluation of a commercial system for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 747-749 (1996).
  15. Chambers, H. F. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).
  16. Brown, D. F. J., Edwards, D. I., et al. Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J. Antimicrob. Chemother. 56, 1000-1018 (2005).
  17. Gerberding, J. L., Miick, C., Liu, H. H., Chambers, H. F. Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 35, 2574-2579 (1991).
  18. Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., Simonian, A. L. Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus-A surface plasmon resonance spectroscopic study. Biosens. Bioelectron. 22, 948-955 (2007).
  19. Popham, D. L., Young, K. D. Role of penicillin-binding proteins in bacterial cell morphogenesis. Current Opinion in Microbiology. 6, 594-599 (2003).
  20. Wei, Y., Havasy, T., McPherson, D. C., Popham, D. L. Rod shape determination by the Bacillus subtilis class B penicillin-binding proteins encoded by pbpA and pbpH. J. Bacteriol. 185, 4717-4726 (2003).
  21. Grieco, S. H. H., Lee, S., Dunbar, W. S., MacGillivray, R. T. A., Curtis, S. B. Maximizing filamentous phage yield during computer-controlled fermentation. Bioprocess and Biosystems Engineering. 32, 773-779 (2009).
  22. Olsen, E. V., Pathirana, S. T., Samoylov, A. M., Barbaree, J. M., Chin, B. A., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment. J. Microbiol. Methods. 53, 273-285 (2003).
  23. Pathirana, S. T., Barbaree, J., Chin, B. A., Hartell, M. G., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Rapid and sensitive biosensor for Salmonella. Biosens. Bioelectron. 15, 135-141 (2000).
  24. Sauerbrey, G. The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing. Z. Phys. 155, 206-222 (1959).
  25. Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy Dissipation Kinetics for Protein and Antibody-Antigen Adsorption under Shear Oscillation on a Quartz Crystal Microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
  26. Griffith, J., Manning, M., Dunn, K. Filamentous bacteriophage contract into hollow spherical particles upon exposure to a chloroform-water interface. Cell. 23, 747-753 (1981).
  27. Hosseinidoust, Z., Van de Ven, T. G. M., Tufenkji, N. Bacterial Capture Efficiency and Antimicrobial Activity of Phage-Functionalized Model Surfaces. Langmuir. 27, 5472-5480 (2011).
  28. Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (53), e2740 (2011).
  29. Voinova, M. V., Jonson, M., Kasemo, B. Missing mass" effect in biosensor's QCM applications. Biosens. Bioelectron. 17, 835-841 (2002).
  30. Gervals, L., Gel, M., et al. Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces. Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).
  31. Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption. Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).
  32. Sorokulova, I., Watt, J., et al. Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage. J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).
  33. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
抗生物質耐性ブドウ球菌の細菌の検出のためのバイオセンサー
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Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).More

Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).

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