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Bioengineering

항생제 내성 황색 포도상 구균 박테리아의 검출을위한 바이오 센서

doi: 10.3791/50474 Published: May 8, 2013

Summary

용해성 파지 바이오 센서 및 항체 비즈 메티 실린 내성 (MRSA) 및 민감한 황색 포도상 구균 박테리아를 구별 할 수 있습니다. 파지는 석영 크리스탈 마이크로 센서의 표면에 랭 뮤어 - 블로 젯 방식으로 고정 넓은 범위 포도상 구균 프로브로 근무 하였다. 항체 비즈 MRSA를 인식하고 있습니다.

Abstract

황색 포도상 구균 균주의 광범위한 호스트 범위와 페니실린 결합 단백질 (PBP 2a에) 항체 결합 라텍스 구슬이 메티 실린 내성 (MRSA)에 민감 (MSSA) S의 차별을 위해 디자인 된 바이오 센서를 만드는 데 활용 된 데 구조적 변화 용해성 살균 . 구균 종 1,2. 용해성 파지는 물에 클로로포름 인터페이스와의 접촉에 의해 파지 상체로 변환되었습니다. 파지 회전 타원체 단층은 랭 뮤어 - 블로 젯 (LB) 기법에 의하여 바이오 센서의 표면에 이동되었습니다. 생성 된 바이오 센서는 박테리아 파지 상호 작용을 평가하기 위해 분산 추적을 가진 석영 크리스탈 마이크로 (QCM-D)로 조사되었다. 박테리아 회전 타원체 상호 작용은 감소 공진 주파수와 MRSA와 MSSA 균주 모두에 대한 분산 에너지 상승했다. 세균 바인딩 한 후,이 센서는 또한 페니실린 결합 단백질 항체 라텍스 비드에 노출 된의. MRSA로 분석 센서는 2A 항체 비즈 PBP에 응답, MSSA에 검사 센서는 응답을 준 없지만. 이 실험 구별은 메티 실린 저항하고 민감한 S. 사이에 명확한 차별을 결정 구균의 변종. 마찬가지로 바운드 및 언 바운드 살균은 표면에 물 현탁액에있는 박테리아의 성장을 억제합니다. 용해성 파지가 상체로 변경되면, 그들은 그들의 강한 용해성 활동을 유지하고 높은 세균 캡처 기능을 보여줍니다. 파지와 파지 상체는 항생제 내성 미생물의 테스트 및 살균을 위해 이용 될 수있다. 다른 응용 프로그램은 박테리오파지 요법과 항균 표면에서의 사용을 포함 할 수 있습니다.

Introduction

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황색 포도상 구균의 메티 실린 내성은 필수 감염과 원내 발생 4-8에 영향을 미치는 요인으로 제시되었다. 이러한 디스크를 확산 oxacillin 한천 스크린 테스트, 또는 국물 microdilution으로 메티 실린 저항의 인식의 일반적인 방법은, 저항의 표현을 향상시키기 위해 맞춤형 배양 조건에 의존한다. 변경은 oxacillin의 활용, ° C보다는 37 ° C 이상 30 35 배양 및 성장 매체의 NaCl의 포함이 (가) 있습니다. 또한, 기술의 이러한 유형으로 정확한 탐지를 위해, 24 시간의 긴 잠복기 대신에 16-18 시간의 필요합니다. 메티 실린 저항의 식별을위한 감도 적절한 (> 96 %) 수준의 빠른 기술은 3-11 시간 후 결과를 같은 VITEK GPS-SA 카드, 신속한 ATB 포도상 구균 시스템 및 신속한 Microscan은 패널 시스템으로 자동 microdilution 기술을 포함 9-11. 크리스탈 MRSA ID 시스템은 S.의 성장 인식에 따라 빠른 방법입니다 2 % 염화나트륨과 산소에 민감한 형광 센서 리터 당 oxacillin 4 MG의 존재 구균. 주장 감도는 배양 12-14 4 시간 후에 100-91 % 사이가 다양합니다. 이러한 표현형 방법은 서로 다른 저항을 표현하는 유행 균주의 영향으로 자신의 정확도에 제한됩니다. 따라서 메티 실린 저항의 인식을위한 가장 널리 사용되는 방법은 메카 유전자 15의 PCR 또는 DNA 혼성화입니다. 그러나이 기술은 정제 된 DNA가 필요하며 세포 파편 16 등 각종 혼화제 (불순물)에 매우 민감합니다.

또한, 이러한 기술을 수행하는 데 오랜 시간이 필요합니다. 메카 유전자 제품, 단백질 PBP 2a에의 인식 전략은 저항을 결정하기 위해 활용 될 수 있으며 표준 시험 방법 17에 비해 더 신뢰할 수 있습니다.

1,2,18을 갖는 포함 황색 포도상 구균의 변종에 대한 인식 조사로 활용 될 수 있음을 표시했다. 이 작품에서 우리는 실시간으로 MRSA의 형태와 함께 박테리아의 인식과 같은 MRSA의 특정 인식 및 탐지에있는 새로운 기술을 제안 하였다. 이 특정한 목적 S.에 대한 단백질에 대한 단클론 항체와 결합 된 호스트의 다양한 스펙트럼 (MRSA 균주 포함) 구균 살균은 (PBP 2a에) 사용되었습니다. PBP 2a에는 세포벽 단백질이며 MRSA의 항생제 저항의 원인입니다. 그러나 PBP 2a에 항체는 S.에 대한 구체적인 없습니다 다른 박테리아 이후 구균 PBP 2a에 19,20에 서열의 유사성과 항생제 결합 단백질이 있습니다. 따라서 본 연구에서는 S. PBP 2a에 단백질에 대한 구균 살균 및 항체가 사용되었습니다. specifi에 바이오 센서를 개발 할 수 있으려면,으로 두 단계 동작을 활용 한로 장치를 인식하고 MRSA를 식별합니다. 초기 단계는 S.를 사용 센서 프로브와 같은 구균 살균의 단층, 두 번째 단계는 PBP 2a에 특정 항체를 고용하면서. 따라서 하나 S를 인식 단계 구균 박테리아, 다른 하나 항생제 결합 단백질에 민감 할 것입니다. 두 단계에서 수신 신호가 긍정적 인 경우는 MRSA의 특정 감지를 나타냅니다.

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Protocol

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1. 스테이지 설정

  1. 형 균주 S.를 얻을 구균 ATCC 12600, S. 구균 ATCC의 27690과 바실러스 서브 틸리 스 ATCC는 6051입니다. S.의 메티 실린 내성 구균 - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis의 Sterne 다음, 살모넬라 티피 뮤 리움 LT2, 시겔 flexneri, 예 르시 니아 enterocolotica, 프로 테우스 mirabilis의, 폐렴 간균 13882, 용해성 파지 12600.
  2. PBP 2a에 항체 결합 라텍스 구슬을 구하십시오.
  3. 21 설명 된대로 NZY 매체를 준비합니다.
  4. 인산를 얻기는 생리 식염수 (PBS)를 버퍼.
  5. 랭 뮤어 - 블로 젯 (LB) 단층 증착 subphase로 증류수를 준비합니다.

2. 박테리오파지 전파 및 적정

  1. S.의 하룻밤 문화 5 mL를 품다 파지의 500 μL (3 구균 ATCC 12600 (3.6 × 10 8 콜로니 형성 단위 (CFU) / ㎖) × 10 9 </ 37 ° C에서 하룻밤 쉐이커 인큐베이터에 2 L 플랙 500 ML의 NZY 매체에)> PFU / ㎖을 먹다.
  2. 4시 10 분 4,424 XG에 문화를 원심 분리기 ° C.
  3. 4 10 분 11,325 XG에서 다시 원심 분리 상층 ° C.
  4. 0.22 μm의 밀리 포아 필터를 통해 필터 상층 액.
  5. 1.5 시간 동안 75,395 XG에서 여과 액을 원심 분리기.
  6. 증류수 100 μL에 펠렛을 녹인다.
  7. NZY 매체에 파지 현탁액의 10 배 희석을 준비합니다.
  8. S.의 하룻밤 (ON) 문화 판 1 ML 모든 표면이 포함되어 있는지 확인하는 NZY 한천 2 플레이트의 각 상 구균 ATCC 12600을. 문화의 과잉을 제거하고 30 분 동안 표면을 건조 할 수 있습니다.
  9. 판의 표면에 적절한 파지 희석 시료 (10 μL)을 발견하고 18-24 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
  10. 플라크의 형성을 검토하고 파지 역가를 계산합니다. 살균 역가 (T)가 P의 수에 기초하여 추정laques (N)는 파지 서스펜션과 희석 계수 (F) 10 μL 부피 (V) 당 형성했다. . T는 = N / (VXF) 예를 들어, 희석 10-7에서 플라크의 수를 75 부피 10 μL (10 × 10 -3 ML)의 경우, 역가가 75 / 같습니다 : 역가가 공식으로 계산 하였다 (10 × 10 -3 × 10 -7) = 7.5 × 10 10 플라크 형성 단위 (PFU) 당 ML 정지.

3. 금 고정 파지

  1. 다음 10 분 동안 아르곤 에칭 플라즈마에 의한 깨끗한 골드 코팅 된 석영 조각 (60mm 2) 살균 캐비닛에 UV 빛의 밑에 6 시간 동안 살균.
  2. 멸균 페트리 접시에있는 각 조각의 금 표면에 1 × 10 9 PFU / ㎖ 파지 현탁액의 50 μl를 추가하고 실온에서 습기 챔버에서 하룻밤 배양한다.
  3. 나머지 파지 현탁액을 제거하고 역가.
  4. 언 바운드를 제거하는 PBS로 파지와 조각 5 번 씻으십시오파지.

4. 건조한 표면에 고정 파지 감염성 테스트

  1. NZY 한천 배지에 S. 구균 ATCC 12600의 O / N 문화를 확산하고 건조 할 수 있습니다.
  2. 플레이트 얼굴에 고정 파지와 금 조각을 아래로 놓습니다.
  3. 37 12 시간 배양 한 후 용해의 영역을 관찰 ° C 그 감염을 나타냅니다.
  4. 제어 실험없이 파지와 골드 커버 조각을 사용합니다.

5. 액체의 무료와 바인딩 파지의 용해성 활동의 테스트

  1. S.의 ON 문화 추가 네 300 ML 사이드 암 플라스크의 모든 (6 × 10 6 CFU / 각 플라스크에 ml)에 NZY의 구균 ATCC 12600-10 ML.
  2. 두 개의 플라스크 2 × 10 6 PFU / 무료 파지의 ML에 추가합니다.
  3. 컨트롤과 같은 다른 두 플라스크를 사용합니다.
  4. S.의 시간 경과를 모니터링 모든 플라스크 30 분 간격으로 광학 밀도 측정 (OD 600)의 570 분 구균 세포 용해.
  5. 24 시간에서 최종 측정을 가져 가라.
  6. 단계 5.1-5.5를 반복하지만, 제어 플라스크 없음 파지 골드 바운드 파지 대신 무료로 파지와 조각, 골드 조각을 사용합니다.

6. 부화하는 동안 바인딩 파지 손실

  1. 실온에서 하룻밤 습도 챔버에 배치됩니다 페트리 접시에 무균 금 조각의 표면에 1 × 10 9 PFU / ㎖ 파지의 50 μl를 추가합니다.
  2. 금 표면과 역가에서 언 바운드 파지와 서스펜션을 제거합니다.
  3. 8 시간 동안 37 ° C에서 5 PBS로 시간과 장소 쉐이커 배양기에서 15 ML 튜브 1 ML의 NZY 솔루션 바운드 파지와 금 조각을 씻으십시오.
  4. 2에 설명 된대로 분리 된 파지의 역가를 결정합니다.

7. 파지 상체 준비

  1. 1 ML 유리 병의 분광 등급 클로로포름의 동일한 볼륨 스톡 파지 12600 서스펜션 (10 11 PFU / ㎖)의 400 μl를 결합실온에서.
  2. 부드럽게 소용돌이 5-6 시간 (5 초 간격) 일분 기간 동안 파지 - 클로로포름 서스펜션.
  3. 30 초 동안 안정하고 상체는 단층 준비를 위해 전원 피펫되었다가 포함 된 상위 단계의 피펫 현탁액을 허용했다.
  4. 전송 및 주사 전자 현미경 상체 현탁액의 몇 마이크로 리터를 가져 가라.
  5. 바이오 센서의 제조에 남아있는 회전 타원체 현탁액을 사용합니다.

8. 바이오 센서 제조

  1. 10 분 PDC-32G Harrick 플라즈마 클리너 아르곤 플라즈마 에칭에 의한 청소 QCM-D 센서.
  2. 모든 유기 불순물을 제거하는 헥산으로 센서를 씻어.
  3. 준비하고 22에 설명 된 필름의 균형 구유를 청소하십시오.
  4. subphase 솔루션 LB 트로프를 입력하고 여물통 장벽을 청소하고 20 통을 안정화 ± 0.1 ° C
  5. 수성 suspensi에있는 파지 12600 300 μL 나누어지는 확산LB의 subphase 상 (10 11 PFU / ㎖)에.
  6. 부분적으로 subphase 22,23으로 침수되는 경사 적실 유리 막대를 실행하는 파지 12600 현탁액 300 μL 나누어지는 (10 11 PFU / ㎖)함으로써 LB의 subphase 솔루션에 파지 단층을 준비합니다.
  7. 10 분 동안 준비된 단일 층을 안정화하고 일정한 압력까지 19 N / m를 달성되어, 30mm / 분 (45cm 2 / 분)의 비율로 압축합니다.
  8. 연속적으로 단층의 일곱 번 센서에서 찍기에 의해 밖으로 4.5 mm / min의 속도로 수직으로 QCM-D 센서에 수직 증착을 수행합니다. 박테리아 샘플에 노출 레이어 (데이터 표시되지 않음), 연속 균질하고 균일 한 것으로 나타났다 전에 전자 현미경으로는 파지 단일 층을 증착.
  9. 반복 3 준비 파지 구형 서스펜션 4.5-4.8 단계를 반복합니다.
  10. MRSA 검출, 전자에 대한 제작 파지 바이오 센서를 사용하여현미경, 및 타원.

9. 바이오 센서 테스트, 메티 실린 저항의 차별과 민감한 황색 포도상 구균 박테리아

  1. 이 프로토콜에서는 수정되지 않은 수정 된 파지 및 파지 상체와 바이오 센서는 준비가되어 있습니다. 네 개의 센서 유량 용기를 가진 석영 크리스탈 마이크로는 QCM 센서의 표면에 고정 파지에 박테리아의 바인딩을 모니터링하는 데 사용됩니다. PBP 2a에 항체 결합 라텍스 구슬 메티 실린 내성 (MRSA) 및 민감한 황색 포도상 구균 박테리아를 구별하기 위하여 이용된다. 모든 측정은 5 MHz에서 유동 모드 (50 μL / 분)에서 실시하고 있습니다.
  2. 물 (~ 30 분)에 QCM 센서의 기본 라인 공진 주파수를 설정합니다.
  3. 테스트 셀을 통해 물에 살고있는 메티 실린 민감 황색 포도상 구균 박테리아 세포 (10 9 CFU / ㎖)의 현탁액을 그립니다.
  4. 지속적으로 최초의 배음, USI에 대한 센서의 공진 주파수와 에너지 소모의 변화를 모니터링NG는 Q-소프트 소프트웨어입니다.
  5. 센서의 공진 주파수와 손실의 변화가 포화 수준에 도달 할 때, 주파수와 소비의 지속적인 모니터링 중에 흐름 PBP 항체 결합 라텍스 구슬 (6.77 배 10 비즈 / ML)의 정지를 추가합니다.
  6. 반복 메티 실린 내성 포도상 구균 박테리아 세포 (MRSA)에 대한 9.2-9.5 단계를 반복합니다.
  7. C는 상수 (C = 17.7 NG X cm -2 X Hz에서 -1 5 MHz의 질량 감도 Sauerbrey 식 24,25 Δf에 =-ΔM XN / C에 의해 바인딩 세균에 의한 질량 변화를 통해 주파수 변화를 정의 ), M은 질량 n은 배음의 수 (N = 1)입니다.
  8. 기록에서 에너지 소비의 변화 (Δ D)를 정의 진동의 지수 감쇠 (주파수와 진폭 진동의 한주기 동안 소비 및 저장 에너지의 정량화를 허용하는 완충,각각 E는 소비와 E가 저장 : Δ D = E 소산 / 2 πE가 저장됩니다. Δ D는 분산 단위 (DU), 하나의 DU = 10 -6 상대 단위)로 측정됩니다.

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Representative Results

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파지는 S.의 시험 균주에 대한 용해성 활동을 보여 로 파지 현장 시험에 의해 표시 MRSA 균주를 포함 구균. 플라크의 크기는 일반적으로 5 ~ 15 mm까지였다. 활동은 다른 테스트 배양 (표 1)에 대해 찾을 수없는 경우.

S.의 정상적인 성장 37 쉐이커 인큐베이터에 NZY 매체 구균 ATCC 12600는 ° C는 그림 1A (빈 원으로 표시된 곡선)에 표시됩니다. 세균의 수는 4.0으로 X 10 6 3.2로 증가 × 10 8 CFU / ㎖. 그림 1A는 (채워진 원으로 표시된 곡선) 2.0 × 10의 공동 재배의 결과를 보여줍니다 6 PFU / ㎖ 무료 파지 동시에로 추가 S.의 동일한 농도 구균 ATCC 12600. 금 표면에 고정 파지, 서스펜션 파지의 활동 (그림 1A, 하향식 삼각형으로 표시된 곡선을 비교 용해성 활동을 보여). 파지와 금 조각이 첫 번째 실험 성장을 24 시간에서 사용했을 때 고정 된 파지 감염 남아, 그때는 4의 6 일 동안 5 회 세척하고 PBS에 저장된 ° C, 그리고 마지막으로 신선한 세균 현탁액으로 다시. (그림 1A, 최고 최대의 삼각형 표시 곡선). 그것은 고정 된 파지 새로운 박테리아를 감염시킬 능력이 있습니다 무효 캡시드를 떠나, 박테리아에 자신의 DNA를 주입 것 같다. 우리는 금 표면에 고정 파지 차례로 그 새로운 세균 등 감염 무료 파지를 생성하는 몇 가지 박테리아를 감염 기본 "촉매제"역할을한다는 가설. 따라서, 고정 된 파지의 대부분은 아마 처음 24 시간 성장 실험에 사용되지 않은, 따라서 두 번째 시간을 활용할 수 있습니다. 물리적 흡착에 의해 증착 된 파지의 표면 밀도는 약 ~ 0.7 파지 입자 / μm의 2입니다. 이 농도가 높은이지만, 10 배 2까지 증가 할 수 있습니다. 따라서, 골드 플레이트의를 통합 할 수최초의 24 시간 성장 실험에 감염된 박테리아에 의해 발표 무료로 가능한 파지 오메.

그림 1B는 고정 파지가 세균 세포를 lysing 할 수 있다고 나타내는 금 조각 주위에 용해 영역을 보여줍니다. 제어 실험에서, 빈 골드 플레이트는 박테리아의 성장을 억제하지 않았다. 따라서 박테리아와 고정 된 파지의 공동 문화에서 발견 박테리아의 성장을 효과적으로 감소는 물에 부유 세균과 그림 1C 같이 파지의 기본 상호 작용의 결과이다. 파지와 세균의 공동 배양시 금 표면에서 파지 분리가 작았 다. 배양 중에 금 표면에서 분리 한 얼마나 많은 파지 추정하기 위해 파지와 샘플은 8 시간 동안 37 통 - 인큐베이터에 동요 NZY 솔루션 ° C에 몰두하였고, 상층 액에서 무료 파지 농도를 측정 하였다. 우리는 4.1 × 10 7 PFU는 보운 있다고 판단단지 3 × 10 4 PFU가 분리 된 60mm 2 금 조각 (~ 0.7 파지 입자 / μm의 2), (0.007 %의 분리)에 라.

전송 및 금 기판 표면에 그대로 용해성 파지 12600의 전자 현미경 스캐닝는 그림의 2A 및 2B에 표시됩니다. 파지 현탁액 치료를 클로로포름의 대상이되었을 때, 파지 신체적 인 외모가 변경되었습니다. 꼬리의 길이는 수축 두꺼워. 다각형 머리 (그림 2D 및 2E) 반올림되었다. 우리는 사상 파지 26 처리 클로로포름의 이름으로 "회전 타원체"구조적으로 수정 용해성 파지 유사한라고합니다. 클로로포름 치료의 결과 중대한 구조적 변화에도 불구하고, 플라크 번호에 의해 측정 된 회전 타원체 용해성 활동 (그림 2C와 2 층) 변경되지 않았습니다. 파지와 상체의 평균 용해성 활동 하였다 (7.4 ± 1.5 (SD)) × 10 10 (N = 4)과 (7.5 ± 1.0 (SD)) × 10 10 (N = 7), PFU / ㎖. 0.05 수준에서 파지와 상체의 활동 (그림 2C와 2 층) 유의 한 차이가 없었다.

그들은 MRSA (그림 3A)에 노출되었을 때 고정 용해성 파지와 QCM 센서는 공진 주파수 나 에너지 소비에 큰 변화가 없었다. 이러한 데이터는 MRSA / 파지 상호 작용 QCM에 따른 질량 변화없이 귀착되었다는 것을 표시하고 아직 포스트 assayed 바이오 센서의 전자 현미경 사진은 센서 표면 (그림 3B)에서 유의 박테리아 바인딩을 밝혔다.

MRSA 현탁액은 파지 회전 타원체 바이오 센서, 주파수에 상당한 감소와 흐름 세포에 주입했을 때 (Δ F ≈ -105 Hz에서)과 분산의 증가 (ΔD ≈ 26 DU)가 관찰되었다 (그림 3C). 파지 구형 박테리아 (MRSA) 바인딩의 상호 작용에 따라 자체를 assayednsors은 PBP2a 항체 결합 라텍스 구슬 현탁액에 노출되었다. 이 MRSA는 바이오 센서의 주파수에서 더 감소 때문에, PBP2a 항체 결합 라텍스 구슬 현탁액에 응답 (Δ F ≈ -45 Hz에서)과 분산의 증가는 (ΔD ≈ 15 DU) 관찰되었다 (그림 3C)를 assayed. 프로브 및 PBP2a 항체 결합 라텍스 구슬을 파지 할 MRSA의 바인딩은 주사 전자 현미경 조사 (그림 3D)를 사용하여 확인 하였다.

파지 회전 타원체 바이오 센서는 MSSA 현탁액, 주파수에 상당한 감소에 노출되었을 때 (Δ F ≈ -200 Hz에서)과 분산의 증가 (ΔD ≈ 55 DU)가 관찰되었다 (그림 3E). 파지 회전 타원체-MSSA 바인딩의 상호 작용에 따라 assayed 센서는 PBP2a 항체 결합 라텍스 구슬 현탁액에 도전했다. 처음 MSSA가 assayed 바이오 센서의 짧은 과도을 보여 주었다주파수 증가와 소비 감소. MSSA와 PBP2a 항체 결합 라텍스 구슬 상호 작용의 몇 분 후, 주파수 PBP2a 항체 소개 수준을 게시 할 반환하지만 소산 에너지는 (그림 3E) 증가했다. 파지 프로브 MSSA의 바인딩은 주사 전자 현미경으로 확인되지 않지만 MSSA와 PBP2a 항체 결합 라텍스 구슬 (그림 3 층) 관찰 사이의 결합되었다. Ellipsometric 두께 프로파일, 용해성 파지 및 황색 포도상 구균 박테리아의 3D 두께지도는 S1과 S2 보충 그림에 표시됩니다.

10 9 셀 / MRSA 또는 MSSA의 ML의 정지에 LB 고정 파지 또는 상체와 센서의 접촉을 이어, 박테리아, 9.1 × 10 7 (MRSA / 그대로 파지)의 밀도 (ρ)에서 파지 또는 구형 체를 바인딩 관찰되었다 7.9 × 10 7 (MRSA / 상체), 7.2 × 10 7 (MSSA / 상체) 세포 / cm 2. 에5 가지 용해성 파지 및 2 호스트 세균 27를 사용하여 테스트, 연구자들은 10 9 셀 / ML 세균에 공유 결합 방법에 의해 고정 된 파지를 실시하고, (2.5-8.9) × 10 5 세포 / cm 2의 범위에서 파지 포집 효율을 결정 . 이 연구에서 제시 파지 포집 효율은 ~ 100 배 높다.

주인 변형 스트레인 세부 정보 메티 실린 감도 파지 감도
황색 포도상 구균 12600 ATCC 에스 +
황색 포도상 구균 27690 ATCC 에스 +
황색 포도상 구균 10292 IA 에스 +
10378 IA 에스 +
황색 포도상 구균 10497 IA 에스 +
황색 포도상 구균 10686 IA 에스 +
황색 포도상 구균 MRSA 1 AU R +
S.aureus MRSA 2 AU R +
황색 포도상 구균 MRSA 5 AU R +
황색 포도상 구균 MRSA 13 AU R +
S.aureus MRSA 26 AU R +
황색 포도상 구균 MRSA 34 AU R +
황색 포도상 구균 MRSA 45 AU R +
B. anthracis의 Sterne 다음 AU NA -
살모넬라 티피 뮤 리움 LT2 AU NA -
시겔 flexneri 알 수없는 AU NA -
예 르시 니아 enterocolitica 알 수없는 AU NA -
프로 테우스 mirabilis의 알 수없는 AU NA -
폐렴 간균 13882 AU NA -
바실러스 서브 틸리 스 6051 ATCC NA -

표 1. 세균의의 파지 12600 민감도기차 IA - 동물로부터 격리;. AU - 오번 대학의 세균 배양 수집, NA - 적용 할 수 없습니다; - 파지의 용해성 활동이 중요한 플라크 형성, +,,에 의해 정의 된 -를 구분하지 않습니다. 시험 균주의 하룻밤 배양 NZY 한천 플레이트에 도금되었다. 표면은 건조 후, 10 11 PFU 파지 서스펜션의 샘플 (10 μL)는 판의 표면에 발견되었다. 플레이트는 18-24 시간 동안 37 ° C에서 배양 하였다. 파지의 용해성 활동은 플라크의 형성에 의해 발견되었습니다.

그림 1
그림 1. 바운드 무료 파지의 감염 특성. 무료 파지의 A. 세균없는 성장 (빈 원)와 존재 (채워진 원), 파지의 존재는 (TR까지 최고 금 표면에 바인딩iangles), 4에서 6 시간 후 금 표면에 결합 파지의 존재 ° C (삼각형 위에서 아래로). 삽입 : 선 (1) 식 (4) (R = -0.99, p <0.0001)로 파지의 성장 실험 데이터 없음의 선형 적합을 보여줍니다. 라인 (2) 같은 식에 무료로 파지 존재감 세균의 성장 실험 데이터의 적합을 보여줍니다. 무료 파지의 부재와 존재의 박테리아의 성장 상수 (K)는 동일한 0.88 및 0.64 (-0.048, 쇠퇴 단계)입니다. 세 개의 독립적 인 실험의 대표적인 데이터는 평균 상대 오차 OD 600 측정이 5 %를 초과하지 않았다 패널 A.에 표시됩니다. B. 파지는 금 표면에 고정 금 조각 주위에 용해 영역에서 표시된대로 감염이다. 1 - 단편 박테리아 한천 플레이트, 2 - 고정 파지와 금 조각, 3. - 금 조각 주변의 억제 영역 금 표면에 부착 파지하여 박테리아 용해의 C. 도식 표현. 1 -금 코팅 된 석영 조각, 2 - 파지 금 표면 3에 바인딩 - 바인딩 파지, 4에 의해 고정 세균 - 무료 파지 감염 세균 파열에 의해 발표했다. 의 허가와 함께 사용 : Guntupalli, R., 그 외 2012.. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
그림 2. 손상 및 수정 된 파지의 특성B - 변속기 및 각각 그대로 파지의 전자 현미경, 스캔,.. C - MRSA DE와 한천 플레이트에 파지 용해성 활동 - 변속기를 각각 그대로 파지 상체의 전자 현미경 스캐닝; F - 파지 상체 용해성MRSA와 한천 플레이트에 ctivity. 파지와 상체의 평균 활동은 (7.4 ± 1.5 (SD)) × 10 10 (N = 4)과 (7.5 ± 1.0 (SD)) × 10 10 (N = 7) PFU / ㎖.에게 T-검정 : t = 0.15682, p = 0.87851. 0.05 수준에서 파지와 상체의 활동은 크게 다르지 않다. 바 : A, B, D, 그리고 E : 200 nm의. 의 허가와 함께 사용 :. Guntupalli, R., 그 외 여러분 2012 년입니다.

그림 3


그림 3. QCM-D와 파지 박테리아의 상호 작용 EM 분석을 결합했다. 박테리아는 50 μL / min의 유량 10 9 CFU / 물에 ML 현탁액의 농도 센서에 전달했다. 1, 2는 각각 공진 주파수와 에너지 소모의 변화를 나타냅니다. MRSA에 A. 살균 코팅 QCM-D 센서 반응. 화살표 t를 보여줍니다그는 센서 표면에 MRSA 배달 시간. 게시물의 B. 스캐닝 전자 현미경은 MRSA는 QCM 센서에 고정 용해성 파지에 바인딩 assayed. 파지 상체의 M-MRSA, 센서 표면에 P-파지. C. 연속 반응 항체 비즈 PBP 그런 다음 MRSA 먼저에 코팅 QCM-D 센서. 화살표는 각각 MRSA와 센서 표면에 PBP 항체 배달 시간을 나타냅니다. 게시물의 D. 스캐닝 전자 현미경은 파지 상체, MRSA 및 PBP 항체 구슬 바이오 센서 assayed. 두껍고 얇은 화살표는 각각 일반 MRSA 세포와 항체 비드를 보여줍니다. 파지 상체의 E. 연속 반응은 S.에 코팅 QCM-D 센서 항체 비즈 PBP 그런 다음 구균 먼저. 화살표는 S.를 나타냅니다 게시물의 각각 센서 표면 구균 PBP 항체 배달 시간. F. 스캐닝 전자 현미경은 파지 상체, S.와 바이오 센서 assayed 구균과 항체 구슬 PBP. 두껍고 얇은 화살표는 일반적인 S.를 보여줍니다 구균 세포와 항체 구슬, 각각. 의 허가와 함께 사용 : Guntupalli, R., 그 외 2012.. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

보충 그림

그림 S1
그림 S1. 보충 그림 1. (a)와 (b) ellipsometric 두께 프로파일과 각각 용해성 파지의 3D 두께지도 (유효 굴절률 = 1.05)입니다. 두께 프로파일은 단층의 평균, RMS 거칠기, 최소 및 최대 두께를 보여줍니다. 두께지도를 통해 선은 두께 프로파일을 생성하기 위해 그려졌다.

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S2줍니다. 보충 그림 2.

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Discussion

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그것은 잘 파지는 세균 병원체 28 바이오 센서 프로브로 사용할 수있는 것으로 알려져 있습니다. 빠른 차별 항생제 내성 민감한 균주 : 그것은 PBP 2a에 항체과 함께 파지 이전 문제를 해결하기 위해 활용 될 수있는이 작품에서 보여줍니다.

그것은 그러나 이러한 일반적인 수정되지 않은 포도상 구균 파지들이 박테리아를 바인딩에도 불구하고, QCM 장치와 세균 검출에 적합하지 않습니다 발견되었다. 파지의 꼬리는 음향 파도 파지 꼬리의 끝 부분에 바인딩 박테리아 "에 도달 할 수 없습니다"너무 깁니다. 이 조건은 (그림 3A 및 3B) EM에 의해 이미지를 보여 상당한 바인딩에도 불구하고 공진 주파수 및 분산 변경 사항을 등록하는 "누락 매스"효과 29 무능력의 결과. 이 문제는 쉽게 상체에 그대로 파지를 교체하여 해결되었다, 파지는 클로로포름 물 처리에 의해 수정. 이 치료는 완전한 기능 P의 결과짧은 두꺼운 비 유연한 꼬리 (그림, 2D 2E 및 2 층)와 hage. 파지는 바이오 센서의 상체로 대체되었을 때, MRSA는 쉽게 QCM-D 장치에 의해 발견되었다.

파지 입자가 올바른 방향으로 금 표면에 결합되었을 때, 자신의 수용체는 호스트 박테리아에 액세스 할 수있었습니다. 파지와 고체 표면 건조 세균 층 사이 직접적인 신체 접촉이 발생하면, 고정 된 파지는 숙주 박테리아 (그림 1C)에 바이러스 게놈을 주입 할 수있다. 이러한 결과는 공유 결합 기술을 27으로 유리 디스크 표면에 고정화 된 세포 용해 파지 얻은 사람들과 잘 일치. 호스트 박테리아를 캡처하는 바인딩 용해성 파지의 능력은 바이오틴 파지 고정화 기술 30을 사용하여 증명 하였다. 대조적으로, 고체 표면에 제대로 방향 파지를 연결하는 매우 간단한 물리적 흡착 방법은 31 활용하고있다. 티그는 높은 파지 회전 타원체의 포집 효율은 효과적인 항균 표면을 만들기 위해 사용할 수 있습니다. 총 시간 - 대답하기 위해 제안 된 분석 용 시료 당 약 16 분이다. 이 시간은 크게 챔버의 큰 번호와 QCM 장치를 사용하여 단축 할 수 있습니다. 파지 센서의 예상 수명은 실내 온도 3 ~ 4 개월 정도입니다. 생체 고분자 보호는 몇 년 최대 32 개까지 연장 할 수 있습니다. S.의 검출 한계 구균은 표면 플라즈몬 공명 분광법하여 파지을 측정, 10 4 CFU / ㎖ 18 것으로 나타났다.

이 문서에서 설명하는 방법을 사용하기위한 가장 중요한 조건 중 하나는 깨끗하고 무균 조건 파지와 세균 모든 실험 33 요구 사항을 준수하는 것입니다.

일반적으로 사용되는 등 디스크 확산 oxacillin 한천 스크린 테스트로 MRSA를 검출하기위한 방법, 또는 국물 microdilution는 노마을베드로 최대 24 시간의 시험을 수행한다. 같은 VITEK GPS-SA 카드, 신속한 ATB 포도상 구균 시스템, 신속한 Microscan은 패널 시스템 및 크리스탈 MRSA ID 시스템과 자동화 기술을 포함 빠른 방법은 3-11 시간 9-14 후 결과를 생성합니다. 메카 유전자 15의 PCR 또는 DNA 교잡은 상대적으로 신속하고 정확한 방법이지만 정제 된 DNA가 필요하며 매우 민감한 불순물이다. 대조적으로,이 작품에 설명 된 방법은 급속 DNA 추출이 필요하지 않습니다, 그리고 혼화제로 구분하지 않습니다.

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Disclosures

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

여기에보고 된 연구는 오번 대학교 AUDFS 및 USAF CRADA 07-277 - 60MDG-01에서 교부금에 의해 지원되었다. 이 문서에 표현 된 뷰는 저자의 사람이며, 공식적인 정책이나 미국 공군, 국방부, 또는 미국 정부의 입장을 반영하지 않습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P4417
spectrophotometric-grade chloroform Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 154733 (99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 29609-0 (95%)
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT 64-17-5 190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge Beckman Coulter Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden E4
Scanning electron microscope (SEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized Millipore Corporation, Billerica, MA SCGPU05RE 0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish NUNC A/S, Denmark 240835 Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes Gilson, Pipetman, France P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific, CT Classic C24
Gold-coated quartz pieces Auburn University, AL Homemade
Petri dishes Fisher Brand, USA 0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance The Baker Company, ME SG403
Culture Growing Flasks Corning Incorporated, NY 4995 PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. 4001
Plasma Cleaner Harrick Plasma, USA PDC-32G
Millipore water purification system Millipore Direct-Q
Imaging Ellipsometer Accurion, USA nanofilm_ep3se
Software Q-Sense AB, Sweden QSoft, QTools

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References

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항생제 내성 황색 포도상 구균 박테리아의 검출을위한 바이오 센서
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Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).More

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