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Bioengineering

Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos

doi: 10.3791/50474 Published: May 8, 2013

Summary

Biossensores fagos líticos e contas de anticorpos são capazes de discriminar entre resistente à meticilina (MRSA) e bactérias estafilococos sensíveis. Os fagos foram imobilizadas por um método de Langmuir-Blodgett sobre uma superfície de um sensor de microbalança de cristal de quartzo e trabalhado como de largo espectro de estafilococos sondas. Contas de anticorpos reconhecer MRSA.

Abstract

Um bacteriófago lítico estruturalmente transformadas tendo uma ampla gama de hospedeiros de estirpes de Staphylococcus aureus e uma proteína de ligação à penicilina (PBP 2A) contas de látex de anticorpos conjugados têm sido utilizados para criar um biossensor para a discriminação concebido resistente à meticilina (MRSA) e sensível (MSSA) S . espécies aureus 1,2. Os fagos foram convertidos em esferóides fago pelo contato com a interface água-clorofórmio. Fago monocamadas esferóides foram movidos para uma superfície de biosensor por Langmuir-Blodgett (LB) técnica 3. Os biossensores criados foram examinados por uma microbalança de cristal de quartzo com dissipação de rastreamento (QCM-D) para avaliar as interações bactéria-fago. Interações bactéria-esferóides levou a freqüência de ressonância reduzida e um aumento na dissipação de energia, tanto para MRSA e MSSA isolados. Após a ligação de bactérias, esses sensores têm sido ainda mais exposto ao anticorpo a proteína de ligação à penicilina esférula de látexs. Sensores analisados ​​com MRSA respondeu a PBP 2a contas de anticorpos, embora sensores inspecionados com MSSA não deu nenhuma resposta. Esta distinção experimental determina uma discriminação clara entre resistente à meticilina e S. sensível aureus. Igualmente vinculados e bacteriófagos não ligados suprimir o crescimento de bactérias nas superfícies e em suspensões de água. Uma vez fagos são transformados em esferóides, eles mantêm a sua atividade lítica forte e mostram alta capacidade de captação bacteriana. O fago e o fago esferóides pode ser utilizado para teste e de esterilização de microorganismos resistentes aos antibióticos. Outras aplicações podem incluir a utilização em terapia de bacteriófago e superfícies antimicrobianas.

Introduction

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Cepas resistentes de Staphylococcus aureus meticilina têm sido apontados como um fator essencial nas infecções e surtos nosocomiais 4-8. Formas comuns de reconhecimento de resistência à meticilina, tais como o ensaio de difusão em disco de agar oxacilina tela ou de microdiluição em caldo, dependem das condições de cultivo adaptadas para aumentar a expressão da resistência. As alterações incluem a utilização de oxacilina, incubação a 30 ou 35 ° C em vez de 37 ° C, e a inclusão de NaCl ao meio de crescimento. Além disso, para a detecção correcta por estes tipos de técnicas, um longo período de incubação de 24 horas em vez de 16 a 18 horas é necessário. Técnicas rápidos com o nível adequado (> 96%) de sensibilidade para a identificação da resistência à meticilina incluem técnicas de microdiluição automatizados tais como o GPS Vitek-SA cartão, o sistema rápido de ATB estafilococo, e o sistema de painel Microscan rápida que produzem resultados após 3-11 hr 9-11. The Crystal MA RSA é um sistema de identificação de método rápido baseado no reconhecimento de crescimento de S. aureus na presença de 2% de NaCl e 4 mg de oxacilina por litro, com um sensor de fluorescência sensíveis ao oxigénio. Sensibilidades reivindicados variam entre 91 a 100% após 4 horas de incubação 12-14. Estes métodos fenotípicos estão limitados nas suas precisões pelo impacto de estirpes prevalentes que expressam resistência heterogénea. Portanto, os métodos mais amplamente aceito para o reconhecimento da resistência à meticilina é PCR ou hibridização DNA do gene mecA 15. No entanto, esta técnica requer que o ADN purificado e é extremamente sensível a vários aditivos (impurezas), que incluem fragmentos de células 16.

Além disso, estas técnicas de precisar de um tempo para executar. Estratégias para o reconhecimento do produto do gene mecA, a proteína PBP 2a, pode ser utilizado para determinar a resistência e podem ser mais fiáveis ​​em comparação com as técnicas de ensaio padrão 17.

de Staphylococcus aureus, incluindo aqueles que têm resistência à meticilina 1,2,18. Neste trabalho, proposta uma nova técnica para o reconhecimento específico e detecção de MRSA, tais como o reconhecimento de bactéria juntamente com a conformação de MRSA em tempo real. Para este fim específico a S. bacteriófago aureus com um amplo espectro de hospedeiros (incluindo MRSA), combinada com o anticorpo monoclonal contra a proteína (PBP 2as) têm sido utilizados. PBP 2a é uma proteína de parede celular, e é a causa de resistividade antibiótico de MRSA. No entanto anticorpo PBP 2a não é específico para S. aureus, uma vez que algumas bactérias possuem outras proteínas de ligação aos antibióticos com similaridade de sequência com o PBP 2a 19,20. Por conseguinte, neste trabalho, S. bacteriófago aureus e anticorpos contra a proteína PBP 2a têm sido utilizados. Para ser capaz de desenvolver um biossensor para especificamente detectar e identificar SARM um dispositivo com uma acção em dois passos foi utilizado. O passo inicial usou um S. aureus bacteriófago monocamada como uma sonda de sensor, enquanto que o segundo passo de PBP 2a empregues anticorpos específicos. Portanto, o primeiro passo será reconhecer S. bactéria Staphylococcus, como o outro irá ser sensível à proteína de ligação ao antibiótico. Quando os sinais recebidos a partir de dois passos são positivas, isso indica a detecção específica de MRSA.

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Protocol

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1. Ajustando o estágio

  1. Obter estirpe S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 e Bacillus subtilis ATCC 6051. Cepas resistentes à meticilina de S. aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13 de MRSA 26 de MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13.882, o fago lítico 12600.
  2. Obter anticorpos de PBP 2a de pérolas de látex conjugadas.
  3. Prepara NZY meio como descrito 21.
  4. Obter uma solução salina tamponada com fosfato (PBS).
  5. Prepare água deionizada como subfase de Langmuir-Blodgett (LB) deposição monocamada.

2. Propagação bacteriófago e Titulação

  1. Incubar 5 ml de cultura de uma noite de S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 8 unidades formadoras de colónias (CFU) / ml) com 500 ul de fagos (3 x 10 9 </ Sup> UFP / ml) em 500 ml de meio NZY em 2 L em agitador Flack-incubadora a 37 ° C durante a noite.
  2. Centrifugar cultura em 4424 xg durante 10 min a 4 ° C.
  3. Sobrenadante re-centrifugado a 11.325 xg durante 10 min a 4 ° C.
  4. Filtrar o sobrenadante através de um filtro Millipore de 0,22.
  5. Centrifugar o filtrado a 75.395 g durante 1,5 horas.
  6. Dissolve-se o pellet em 100 ul de água destilada.
  7. Preparar diluições de 10 vezes de suspensão de fagos em meio NZY.
  8. Placa 1 ml de cultura overnight (ON) de S. aureus ATCC 12600 em cada uma das duas placas com agar NZY para certificar-se toda a superfície é coberta. Remover o excesso de cultura e deixe seca a superfície durante 30 minutos.
  9. Manchar uma amostra (10 ul) da diluição de fago apropriado sobre a superfície da placa e incubar a 37 ° C durante 18-24 horas.
  10. Examinar a formação de placas e calcular o título do fago. Os títulos de bacteriófagos (t) são calculadas na base da quantidade de pLaques (N) formada por 10 mL de volume (v), da suspensão de fagos e o factor de diluição (F). O título foi calculado pela fórmula:. T = N / (VXF) Por exemplo, para o número de placas de diluição de 75 a 10 -7 e o volume de 10 ul (10 -3 x 10 ml), a titulação é igual 75 / (10 x 10 x 10 -3 -7) = 7,5 x 10 10 unidades formadoras de placas (PFU) por ml de suspensão.

3. O fago imobilizado e ouro

  1. Limpeza peças de quartzo revestidos com ouro (60 mm 2) no plasma por gravura em atmosfera de árgon durante 10 min e, em seguida esterilizar por 6 horas sob luz UV num armário estéril.
  2. Adicionar 50 microlitros de 1 x 10 9 UFP / ml de suspensão de fago com a superfície de ouro de cada peça numa placa de Petri estéril e incubar durante a noite numa câmara húmida à temperatura ambiente.
  3. Remover e titule a suspensão de fagos restantes.
  4. Lave as peças com fago ligado 5 vezes com PBS para remover desacopladofago.

4. Ensaio de infecciosidade do fago imobilizado sobre uma superfície seca

  1. Espalhe uma cultura de O / N de S. Aureus ATCC 12600 em uma placa de ágar NZY e permitir secagem.
  2. Coloque um pedaço de ouro com fago imobilizada sobre a face da placa para baixo.
  3. Observar uma zona de lise após 12 horas de incubação a 37 ° C que indica a infectividade.
  4. Use peças cobertas de ouro sem fago em experimentos de controle.

5. Testes de atividade lítica de Phage livre e ligada em líquido

  1. Adicionar uma cultura ON da S. aureus ATCC 12600-10 ml de NZY em cada dos quatro balões de 300 ml sidearm (6 x 10 6 CFU / mL em cada frasco).
  2. Adicionar Em dois frascos de 2 x 10 6 PFU / ml de fago livre.
  3. Use os outros dois frascos como controles.
  4. Monitorizar a evoluo no tempo de S. lise celular aureus para 570 min por medição da densidade óptica (DO 600) em intervalos de 30 min para todos os frascos.
  5. Dê uma medição final às 24 horas.
  6. Repita os passos de 5,1-5,5, mas usar peças de ouro com fagos ligados ao invés de fagos livres, e peças de ouro sem fago em frascos de controle.

6. Perda de fagos ligados durante a incubação

  1. Adicionar 50 ul de 1 x 10 9 UFP / ml de fago na superfície do pedaço de ouro estéril numa placa de Petri que está colocado numa câmara húmida durante a noite à temperatura ambiente.
  2. Retirar a suspensão de fagos não ligados com a superfície de ouro e titulação.
  3. Lava-se a peça de ouro com os fagos ligados cinco vezes com PBS e coloque em 1 ml de solução de NZY em tubo de 15 ml, agitador em incubadora a 37 ° C durante 8 horas.
  4. Determinar o título do fago isolada como descrito em 2.

7. Fago Spheroids Preparação

  1. Combinando 400 ul de estoque de fago 12600 suspensão (10 11 UFP / ml) com um volume igual de clorofórmio espectrofotométrica grau em 1 ml frascoà temperatura ambiente.
  2. Gentilmente vórtice a suspensão de fagos-clorofórmio 5-6 vezes (intervalos de 5 seg) ao longo de um minuto de duração.
  3. Permitiu a suspensão para estabilizar por 30 segundos e, em seguida, pipeta da fase superior contendo esferóides foi pipetado off para a preparação monocamada.
  4. Dedique alguns microlitros da suspensão esferóides para a transmissão e microscopia eletrônica de varredura.
  5. Use uma suspensão esferóide restante para a fabricação de biossensores.

8. Preparação Biosensor

  1. Limpe os sensores QCM-D por plasma de gravura em argônio por 10 min PDC-32G Harrick limpo plasma.
  2. Lavar o sensor com hexano para remover as impurezas orgânicas.
  3. Preparar e limpar a calha do saldo filme conforme descrito em 22.
  4. Preencha através LB com uma solução subfase e limpá-lo com uma barreira de cocho e estabilizar a calha a 20 ± 0,1 ° C
  5. Espalhe aliquota de 300 ul de fago 12600 em suspensi aquosoem (10 11 PFU / ml) na subfase LB.
  6. Prepare monocamada fago para solução subfase LB, permitindo que 300 mL alíquota de fago suspensão aquosa 12.600 (10 11 PFU / ml) de atropelar um bastão de vidro wettable inclinado que está parcialmente submerso na subfase 22,23.
  7. Estabilizar a monocamada preparada durante 10 minutos e, em seguida comprimi-lo a uma velocidade de 30 mm / min (45 cm 2 / min), a uma pressão constante até que 19 N / m é atingido.
  8. Executar uma película de deposição vertical sobre o sensor posicionado perpendicular QCM-D a uma velocidade de 4,5 mm / min por meio de imersão do sensor sucessivamente dentro e fora da monocamada de sete vezes. A microscopia electrónica de depositadas monocamadas de fagos antes da exposição a bactérias amostras mostrou que as camadas eram contínuos, homogéneo e uniforme (dados não mostrados).
  9. Repita os passos de 4,5-4,8 com uma suspensão de esferóide fago que é preparada em 3.
  10. Use biossensores fago fabricados para detecção de MRSA, o elétronA microscopia e elipsometria.

9. Teste Biosensor, Discriminação de resistente à meticilina e bactérias Staphylococcus sensíveis

  1. Neste protocolo, biossensores com fago não modificada e modificada e esferóides fago estão preparados. Um microbalança de cristal de quartzo, com quatro câmaras de fluxo do sensor é usado para monitorar a ligação de bactérias para o fago imobilizados na superfície do sensor de QCM. PBP 2a de pérolas de látex de anticorpos conjugados são utilizados para discriminar entre resistente à meticilina (MRSA), estafilococos e bactérias sensíveis. Todas as medições são realizadas em modo de fluxo (50 ul / min) a 5 MHz.
  2. Estabelecer uma freqüência de ressonância linha de base do sensor QCM em água (~ 30 min).
  3. Desenhar uma suspensão das células vivas de estafilococos sensíveis à meticilina bacterianas em água (10 9 CFU / ml) através da célula de teste.
  4. Monitorar continuamente as mudanças na freqüência de ressonância sensores e dissipação de energia para o primeiro harmônico, using o software Q-Soft.
  5. Quando as mudanças na freqüência de ressonância sensores e dissipação atingiu níveis de saturação, adicionar a suspensão de esferas de látex PBP anticorpos conjugados (6,77 x10 10 contas / ml) para o fluxo durante o monitoramento contínuo da freqüência e dissipação.
  6. Repita os passos de 9,2-9,5 para células de bactérias estafilococos resistentes à meticilina (MRSA).
  7. Definir uma mudança de frequência através da variação da massa, devido à ligação de pelo Sauerbrey 24,25 equação Af =-Dm xn / C, onde C é a sensibilidade de uma massa constante (C = 17,7 ng x cm x Hz -2 -1 de 5 MHz, bactérias ), m é a massa e o símbolo n representa o número harmónico (n = 1).
  8. Definir uma mudança de dissipação de energia (Δ D) a partir da gravação do decaimento exponencial de oscilação (frequência e amplitude de amortecimento, que permitiu a quantificação da energia dissipada e armazenadas durante um período de oscilação,E e E dissipada armazenados, respectivamente: D = E Δ dissipada / 2 πE armazenado. Δ D é medido em unidades de dissipação (DU), um DU = 10 -6 unidades relativas).

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Representative Results

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O fago demonstrou atividade lítica contra todas as cepas testadas de S. aureus, incluindo as estirpes MRSA, como indicado pelo teste de mancha de fago. Tamanhos de placas geralmente variou de 5 a 15 mm. Sem atividade foi encontrada contra outras culturas-teste (Tabela 1).

Um crescimento normal de S. aureus ATCC 12600 em meio NZY em agitador-incubadora a 37 ° C é mostrada na Figura 1A (uma curva marcados por círculos vazios). O número de bactérias aumentaram de 3,2 x 10 6 a 4,0 × 10 8 CFU / mL. Figura 1A (uma curva marcados por círculos a cheio) mostra os resultados da co-cultura de 2,0 x 10 6 PFU / ml de fago livre adicionados simultaneamente com o mesma concentração de S. aureus ATCC 12600. Fago, imobilizada sobre a superfície do ouro, demonstrou a actividade lítica comparável com a actividade dos fagos em suspensão (Figura 1A, a curva marcada com triângulos topo para baixo). Fago imobilizado permaneceu infecciosa, quando a peça de ouro com o fago foi utilizado pela primeira vez em 24 h de crescimento experiência, em seguida, foi lavada cinco vezes em PBS e armazenada durante 6 dias a 4 ° C, e, finalmente, reutilizadas com uma suspensão bacteriana fresca. (Figura 1A, a curva marcada por grandes triângulos para cima). Parece que os fagos imobilizados injeta seu DNA em que as bactérias, deixando cápsides vazias, que são incapazes de infectar novas bactérias. Nós supomos que os fagos imobilizados sobre uma superfície de ouro serviu como "catalisadores" primários para infectar algumas bactérias, que geram os fagos livres, por sua vez infectar novas bactérias e assim por diante. Portanto, a maioria dos fagos imobilizados provavelmente não foram utilizados numa primeira experiência 24 horas de crescimento e, por conseguinte, pode ser utilizado uma segunda vez. A densidade de superfície de fagos depositados por adsorção física foi de cerca de ~ 0,7 fago partícula / 2 mM. Esta concentração é alta, mas pode crescer até 10 vezes 2. Portanto, a placa de ouro poderia incorporar some dos fagos viáveis ​​livres liberados por bactérias infectados nas primeiras 24 horas experiência crescente.

A Figura 1B mostra a lise da zona em torno da peça de ouro, o que indica que os fagos imobilizados foram capazes de lisar as células bacterianas. Nas experiências de controlo, a placa de ouro vazio não inibiu o crescimento bacteriano. Assim, a redução efectiva do crescimento bacteriano encontrado na co-cultura de bactérias e de fagos imobilizada é um resultado de interacção primário de bactérias em suspensão de água e os fagos ligados como mostrado na Figura 1C. O desprendimento do fago a partir da superfície de ouro durante a co-incubação de bactérias e fagos ligados foi pequena. A fim de calcular quantos os fagos foram descoladas a partir da superfície de ouro durante a incubação, as amostras com os fagos ligados foram imersos em solução de NZY, agitada com o agitador-incubadora a 37 ° C durante 8 horas, e uma concentração de fago livre no sobrenadante foi determinada. Nós determinamos que 4,1 x 10 7 PFU foram bound a um mm 2 peça de ouro 60 (~ 0,7 fago partícula / mM 2), quando apenas 3 x 10 4 UFP foram destacadas (0,007% desapego).

A transmissão e digitalização micrografias electrónicas de intacta fago litico 12600 sobre a superfície do substrato de ouro é mostrado nas Figuras 2A e 2B. Quando a suspensão de fagos foi submetido a tratamento clorofórmio, a aparência física do fago foi alterada. A cauda contraída em comprimento e engrossar. A cabeça poligonal ficou arredondado (Figuras 2D e 2E). Nós denominado fago litico estruturalmente modificado "esferoidal" semelhante ao nome do clorofórmio tratado fago filamentoso 26. Apesar de as alterações estruturais significativas resultantes de tratamento clorofórmio, a actividade lítica esferóide medido pelos números de placa não foi alterada (figuras 2C e 2F). A actividade lítica significativo do fago e esferóides foram (7,4 ± 1,5 (DP)) 10 x 10 (N = 4) e (7,5 ± 1.0 (DP)) 10 x 10 (N = 7), UFP / ml. Ao nível de 0,05, as actividades do fago e esferóides não foram significativamente diferentes (Figura 2C e 2F).

Os sensores QCM com fagos imobilizados não apresentaram alterações significativas na freqüência de ressonância ou de dissipação de energia quando eles foram expostos a MRSA (Figura 3A). Estes dados indicam que o MRSA / fago interacção não resultou numa alteração de massa de acordo com a QCM, e ainda as micrografias electrónicas de pós biossensores ensaiadas revelaram ligação bacteriana significativa a superfície do sensor (Figura 3B).

Quando as suspensões de MRSA foram injectados para dentro da célula de fluxo com fagos biossensores esferóides, uma diminuição substancial na frequência (f Δ ≈ -105 Hz) foram observadas e um aumento da dissipação (ΔD ≈ 26 DU) (Figura 3C). Após fago esferóide-bacterianas (MRSA) interações de ligação, se analisadasnsors foram expostos a anticorpos conjugados PBP2a suspensões de pérolas de látex. Estes MRSA ensaiadas biossensores respondeu aos PBP2a anticorpos conjugados suspensões de pérolas de látex, uma vez que uma diminuição adicional da frequência (f Δ ≈ -45 Hz) e um aumento da dissipação (ΔD ≈ 15 DU) foram observados (Figura 3C). A ligação do MRSA aos fagos sondas e PBP2a anticorpos esferas de látex conjugadas foi confirmado usando microscopia eletrônica de varredura investigações (Figura 3D).

Quando o fago esferóide biossensor foi exposto a suspensões MSSA, uma diminuição substancial na frequência (f Δ ≈ -200 Hz) e foi observado um aumento da dissipação (ΔD ≈ DU 55) (Figura 3E). Após fago interações de ligação esferóide-MSSA, sensores ensaiadas foram desafiados com PBP2a anticorpos conjugados látex contas suspensões. Inicialmente, o biossensor MSSA ensaiada mostrou picos curtos deaumentar em frequência e em diminuir a dissipação. Depois de alguns minutos de MSSA e PBP2a anticorpos conjugados látex contas interações, a freqüência voltou a postar PBP2a níveis introdução de anticorpos, mas a dissipação de energia aumentou (Figura 3E). A ligação da MSSA para sondas de fagos foi confirmada com microscopia eletrônica de varredura, mas não há ligação entre MSSA e PBP2a anticorpos esferas de látex conjugadas foi observado (Figura 3F). Ellipsometric perfil de espessura, a espessura mapa 3D de fagos e bactérias estafilococos são mostrados nas Figuras complementares S1 e S2.

Após o contacto com os sensores de LB fagos ou esferóides imobilizadas para a suspensão de 10 células / ml 9 de MRSA ou MSSA, as bactérias foram observadas para se ligar os fagos ou esferóides com uma densidade (ρ) de 9,1 x 10 7 (MRSA / fagos intactas), 7,9 x 10 7 (MRSA / esferóides), e 7,2 x 10 7 (MSSA / esferóides) células / cm 2. Emtestes utilizando diferentes fagos 5 e 2 27 de bactérias hospedeiras, os investigadores submetido fagos imobilizados pelo método de ligação covalente a 9 10 células / ml de bactérias, e determinada a eficiência de captura de fago numa gama de (2,5-8,9) 5 x 10 células / cm 2 . A eficiência de captura de fago apresentado neste trabalho é aproximadamente 100 vezes maior.

Hospedeiro Tensão Detalhes Strain Sensibilidade à meticilina Sensibilidade fago
S. aureus 12600 ATCC S +
S. aureus 27690 ATCC S +
S. aureus 10292 IA S +
10378 IA S +
S. aureus 10497 IA S +
S. aureus 10686 IA S +
S. aureus MRSA 1 AU R +
S.aureus MRSA 2 AU R +
S. aureus MRSA 5 AU R +
S. aureus MRSA 13 AU R +
S.aureus MRSA 26 AU R +
S. aureus MRSA 34 AU R +
S. aureus MRSA 45 AU R +
B. anthracis Sterne AU NA -
Salmonella typhimurium LT2 AU NA -
Shigella flexneri desconhecido AU NA -
Yersinia enterocolitica desconhecido AU NA -
Proteus mirabilis desconhecido AU NA -
Klebsiella pneumoniae 13882 AU NA -
Bacillus subtilis 6051 ATCC NA -

Tabela 1. Fago 12600 sensibilidade bacteriana strens IA - isoladas de animais,. AU - coleta de cultura bacteriana, da Universidade de Auburn, NA - não aplicável; uma - atividade lítica de fagos foi definida pela formação de placas, +, sensível -, não é sensível. Culturas durante a noite de estirpes testadas foram colocadas sobre as placas com ágar NZY. Depois secou-se a superfície de uma amostra (10 ul) de 10 de 11 PFU de suspensão de fagos foi manchada sobre a superfície da placa. As placas foram incubadas a 37 ° C durante 18-24 horas. Actividade lítica dos fagos foi detectada pela formação de placas.

Figura 1
Figura 1. Propriedades infecciosas de fagos ligados e livre. A. crescimento bacteriano na ausência (círculos vazios) e presença (círculos preenchidos) de fagos livre, na presença de fagos obrigado a superfície de ouro (top up triangles), e na presença de fago ligado à superfície de ouro, após 6 horas, a 4 ° C (triângulos de cima para baixo). Inserção: A linha (1) mostra um ajuste não linear dos dados experimentais de crescimento de fagos para a equação (4) (r = -0,99, p <0,0001). A linha (2), mostra um ajuste dos dados experimentais de crescimento bacteriano na presença de fago livre para a mesma equação. Constante crescimento bacteriano (k) na ausência e na presença de fagos livres, são iguais 0,88 e 0,64, (-0,048, fase de declínio). Os dados representativos de três experiências independentes são apresentados no painel A. A média de erro relativas OD 600 medições não excedam 5%. B. Fago imobilizado à superfície do ouro é infeccioso, tal como indicado pela lise da zona em torno da peça de ouro. 1 - o fragmento da placa de ágar com a bactéria, 2 - a peça de ouro com fago imobilizado;. 3 - a zona de inibição em torno da peça de ouro C. Representação esquemática de bactéria lise por fagos ligados à superfície do ouro. 1 -peça de ouro revestido de quartzo, 2 - fago ligado à superfície de ouro, 3 - bactéria ancorado por fagos ligados, 4 - fagos livres têm lançado pelo rebentamento bactéria infectou. Usado com permissão de: Guntupalli, R., et al 2012.. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 2
Figura 2. Propriedades de fago intacta e modificado A e B - Transmissão e microscopia eletrônica de varredura de fago intacto, respectivamente.;. C - atividade lítica de fagos em uma placa de ágar com MRSA D e E - transmissão e microscopia eletrônica de varredura de esferóides fago intactas, respectivamente; esferóides fagos líticos a - Fctividades sobre uma placa de ágar com MRSA. A actividade média de fagos e são esferóides (7,4 ± 1,5 (DP)) 10 x 10 (N = 4) e de (7,5 ± 1,0 (DP)) 10 x 10 (N = 7) UFP / ml. T-teste: t = 0,15682, p = 0,87851. Ao nível de 0,05, as atividades de fagos e esferóides não são significativamente diferentes. Barras: A, B, D e E: 200 nm. Usado com permissão de:. Guntupalli, R., et al 2012.

Figura 3


Figura 3. Combinados QCM-D e análise EM de interacções fagos bactérias. Bactérias foram entregues ao sensor a uma concentração de 10 9 CFU / ml em suspensões de água com um caudal de 50 l / min. 1, 2 representam mudanças na freqüência de ressonância e da dissipação de energia, respectivamente. A. Phage revestido de resposta do sensor QCM-D para MRSA. Seta mostra tele MRSA tempo de entrega à superfície do sensor. B. Micrografia de varrimento electrónico de pós ensaiadas MRSA ligado ao fago litico imobilizado no sensor QCM. C. respostas M-MRSA, P-fago na superfície do sensor. Sucessiva dos esferóides revestidos fagos sensores QCM-D para MRSA primeiro e, em seguida, para PLP grânulos de anticorpos. As setas indicam a MRSA e PBP tempo de entrega do anticorpo à superfície do sensor, respectivamente. D. micrografia electrónica por varrimento de pós ensaiadas biossensor com esferóides de fagos, MRSA, e os grânulos de anticorpos PBP. Setas grossas e finas mostra célula típica MRSA e anticorpo talão, respectivamente. E. respostas sucessivas dos esferóides fago revestido sensor de QCM-D para S. aureus, em primeiro lugar e, em seguida, para PLP grânulos de anticorpos. As setas indicam S. aureus e PBP tempo de entrega do anticorpo à superfície do sensor, respectivamente. F. micrografia electrónica por varrimento de pós ensaiadas biossensor com esferóides de fagos, S. aureus, e PBP grânulos de anticorpos. Setas grossas e finas mostra típico S. célula aureus e anticorpo grânulo, respectivamente. Usado com permissão de: Guntupalli, R., et al 2012.. Clique aqui para ver a figura maior .

Figuras suplementares

Figura S1
Figura S1. Suplementar Figura 1. (A) e (b) são um perfil de espessura e ellipsometric mapa 3D espessura de um fago litico, respectivamente (índice de refracção efectivo = 1,05). Perfis de espessura mostrar, rugosidade RMS, mínimo e máximo espessura média da monocamada. A linha através do mapa da espessura foi elaborado para gerar o perfil da espessura.

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Figura S2. Suplementar Figura 2.

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Discussion

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É bem sabido que os fagos podem ser usados ​​como sondas de biossensor para 28 agentes patogénicos bacterianos. Foi demonstrado neste trabalho que, juntamente com os anticorpos de fago PBP 2a podem ser utilizadas para resolver o problema antigo: discriminação estirpes resistentes e sensíveis a antibióticos rápidos.

Verificou-se no entanto os fagos não modificados estafilocócicas normais não são adequados para a detecção de bactérias com dispositivos QCM, embora elas se ligam as bactérias. A cauda do fago é tão longa que as ondas acústicas não pode "atingir" as bactérias ligadas à extremidade da cauda de fagos. Esta condição resulta numa "massa ausente" efeito 29 e incapacidade de se registar frequência de ressonância e da mudança de dissipação, apesar da ligação significativa mostrou por EM imagens (Figuras 3A e 3B). Este problema foi resolvido facilmente substituindo o fago intacto com esferóides, o fago modificado por tratamento de clorofórmio-água. Este tratamento resultou em p totalmente funcionalhage com cauda curta, grossa e não-flexível (Figuras 2D, 2E e 2F). Quando os fagos foram substituídos por esferóides em biossensores, o MRSA foram facilmente detectados pelo dispositivo QCM-D.

Quando as partículas de fagos foram obrigados a superfícies de ouro em uma orientação adequada, seus receptores eram acessíveis às bactérias hospedeiras. Se ocorrer o contacto físico directo entre uma superfície sólida, com os fagos e uma camada bacteriana secos, os fagos imobilizados são capazes de injectar genoma viral em bactérias hospedeiras (Figura 1C). Esses resultados concordam bem com aqueles obtidos com fagos imobilizadas em superfícies de disco de vidro por uma técnica de ligação covalente 27. A capacidade dos fagos ligados para capturar as bactérias hospedeiras foram também demonstradas através de uma técnica de imobilização do fago biotinilada 30. Em contraste, um método de adsorção física muito simples para prender adequadamente fagos orientados para superfícies sólidas tem sido utilizado 31. Tele elevada eficiência de captura de esferóide fago pode ser usado para fazer superfícies antimicrobianas eficazes. Um tempo de resposta total para o ensaio proposto é de cerca de 16 min por amostra. Este tempo pode ser reduzido drasticamente, usando dispositivos QCM com um grande número de câmaras. A vida útil esperada para os sensores de fago é de cerca de 3-4 meses à temperatura ambiente. Com um biopolímero de protecção poderia ser prolongar até alguns 32 anos. O limite de detecção de S. aureus foi medido para este fago por espectroscopia de ressonância de plasmon de superfície, e que se verificou ser de 10 4 UFC / ml de 18.

Uma das condições mais importantes para a utilização de métodos descritos neste artigo é o de respeitar as condições limpas e estéril 33 requisitos para todos os experimentos com fagos e bactérias.

Métodos comumente utilizados para a detecção de MRSA, como o teste de tela agar disco difusão oxacilina, ou microdiluição ter normally até 24 horas para realizar o ensaio. Técnicas rápidas que incluem técnicas automatizadas como o GPS Vitek-SA cartão, o sistema rápido de ATB Staph, o sistema do painel Microscan rápida, e o sistema de cristal MRSA ID também produzir resultados após 3-11 9-14 hr. PCR ou hibridização de DNA do gene mecA 15 é um método relativamente rápido e preciso, mas requer o DNA purificado e impurezas é extremamente sensíveis. Em contraste, o método descrito neste trabalho é rápida, não necessita de extracção do ADN, e não é sensível às misturas.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

O trabalho aqui relatado foi apoiada por doações da Auburn University AUDFS e USAF CRADA 07-277-60MDG-01. As opiniões expressas neste artigo são de responsabilidade dos autores e não refletem a política oficial ou a posição da Força Aérea dos EUA, Departamento de Defesa, ou do Governo dos EUA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P4417
spectrophotometric-grade chloroform Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 154733 (99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 29609-0 (95%)
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT 64-17-5 190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge Beckman Coulter Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden E4
Scanning electron microscope (SEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized Millipore Corporation, Billerica, MA SCGPU05RE 0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish NUNC A/S, Denmark 240835 Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes Gilson, Pipetman, France P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific, CT Classic C24
Gold-coated quartz pieces Auburn University, AL Homemade
Petri dishes Fisher Brand, USA 0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance The Baker Company, ME SG403
Culture Growing Flasks Corning Incorporated, NY 4995 PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. 4001
Plasma Cleaner Harrick Plasma, USA PDC-32G
Millipore water purification system Millipore Direct-Q
Imaging Ellipsometer Accurion, USA nanofilm_ep3se
Software Q-Sense AB, Sweden QSoft, QTools

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Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos
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Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).More

Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).

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