Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Биосенсоров для обнаружения устойчивых к антибиотикам бактерий Staphylococcus

doi: 10.3791/50474 Published: May 8, 2013

Summary

Литические биосенсоров фага и антител шариков, способных различать устойчивые к метициллину (MRSA) и чувствительных бактерий стафилококка. Фаги обездвижен Ленгмюра-Блоджетт на поверхность кварцевых датчиков микровесах кристалла и работала широкая зонды стафилококком диапазоне. Антитела бисера признать MRSA.

Abstract

Структурно преобразован литических бактериофагов, имеющего широкий круг хозяев штаммов золотистого стафилококка и пенициллин-связывающих белков (ПСБ 2а) антитела, конъюгированного латексных были использованы для создания биосенсоров предназначен для дискриминации устойчивые к метициллину (MRSA) и чувствительные (MSSA) S . 1,2 золотистый вид. Литические фаги были преобразованы в фаг сфероидов при контакте с водой и хлороформом интерфейс. Фаговые сфероидом монослоя были перемещены на поверхности биосенсора Ленгмюра-Блоджетт (ЛБ) техника 3. Созданный биосенсоров, были рассмотрены кварцевых микровесов с диссипацией слежения (QCM-D), чтобы оценить бактерий-фаг взаимодействий. Бактерии-сфероида взаимодействий привело к снижению резонансной частоты и увеличение диссипации энергии для MRSA и MSSA штаммов. После того, как бактериальный связывания, эти датчики были дополнительно подвергают пенициллин-связывающего белка антител латексный шарикс. Датчики проанализированы с MRSA ответил на PBP бисера 2а антител, хотя датчики проверены с MSSA не дал никакого ответа. Этот экспериментальный различие определяет однозначную дискриминации между метициллин устойчивый и чувствительный S. стафилококк штаммов. Не менее связанными и несвязанными бактериофаги подавляют рост бактерий на поверхностях и в воде суспензии. После литические фаги превратился сфероидами, они сохраняют свою сильную литической активностью и показывают высокую бактериальную возможности захвата. Фага и фаг сфероиды могут быть использованы для тестирования и стерилизации устойчивых к антибиотикам микроорганизмов. Другие приложения могут включать в себя использование в терапии бактериофаг и противомикробные поверхностей.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Устойчивые к метициллину штаммы золотистого стафилококка были предложены в качестве фактора в необходимых инфекций и внутрибольничных вспышках 4-8. Обычные способы признания устойчивость к метициллину, такие как диск диффузии оксациллином кинопробы агар или бульон микроразведений, рассчитывать на индивидуальные условия культивирования для усиления экспрессии сопротивления. Изменения включают использование оксациллин, инкубация при 30 или 35 ° C, чем 37 ° С, и включение NaCl в среде роста. Кроме того, для правильного определения этих видов техники, длительный период инкубации 24 ч вместо 16 до 18 часов не требуется. Быстрое методы с соответствующим (> 96%) уровень чувствительности для идентификации устойчивость к метициллину включать автоматизированных методов микроразбавления такие как Vitek GPS-SA карты, Быстрое ATB Staph системы и быстрой панели Microscan системы, которые производят результаты после 3-11 часов 9-11. Кристалл MRSA ID системы является быстрое метод, основанный на признании роста S. стафилококк в присутствии 2% NaCl и 4 мг на литр оксациллин с чувствительных к кислороду флуоресценции датчика. Заявленное чувствительностью в диапазоне от 91 до 100% через 4 часа инкубации 12-14. Эти фенотипические методы ограничены в своей точности под воздействием распространенных штаммов, которые выражают гетерогенных сопротивления. Поэтому лучший широко принятыми методами для признания устойчивость к метициллину является ПЦР или гибридизации ДНК гена MÉCA 15. Однако этот метод требует очищенной ДНК и чрезвычайно чувствительны к различным примесей (примеси), которые включают 16 клеточного дебриса.

Кроме того, эти методы требуют длительного времени для выполнения. Стратегии, направленные на признание продукта Мека ген, белок PBP 2a, могут быть использованы для определения сопротивления и может быть более надежным по сравнению со стандартными методами тесте 17.

золотистого стафилококка штаммы том числе те, метициллин сопротивление 1,2,18. В данной работе предложен новый метод в специфическое распознавание и обнаружение MRSA, такие как признание бактерии вместе с конформацией MRSA в реальном времени. Для этой цели С. стафилококк бактериофаг с широким спектром хозяев (включая штаммы MRSA) в сочетании с моноклональными антителами против белка (PBP 2a), были использованы. PBP 2a является белком клеточной стенки, и это является причиной сопротивления антибиотикам MRSA. Однако PBP 2a антитело не является специфичным для S. стафилококка, так как некоторые другие бактерии антибиотиками связывающих белков с последовательностью сходство с PBP 2a 19,20. Следовательно, в данной работе С. бактериофаг стафилококк и антитела против белка 2а PBP были использованы. Для того, чтобы разработать для биосенсора спецификациически обнаружения и идентификации MRSA устройство с двухступенчатым действием была использована. Первым шагом использованы С. стафилококк бактериофаг монослой как выходной сигнал с датчика, а на втором этапе используют PBP 2a специфических антител. Таким образом, первый этап будет признать С. стафилококк бактерии, а другая будет чувствителен к антибиотику-связывающий белок. Когда сигналы, получаемые от двух шагов положительны, указывает конкретный обнаружения MRSA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Создание основы

  1. Получение штамма S. стафилококк АТСС 12600, С. стафилококк АТСС 27690 и Сенная палочка АТСС 6051. Метициллин-резистентных штаммов S. стафилококк - MRSA1, MRSA 2, 5 MRSA, MRSA 13, 26 MRSA, MRSA 34, 45 MRSA, Б. сибирской язвы Sterne, Salmonella Typhimurium LT2, шигеллы Флекснера, Yersinia enterocolotica, Proteus Mirabilis, клебсиелла пневмонии 13882; литических фагов 12600.
  2. Получить PBP 2a антитела, конъюгированного латексных.
  3. Подготовка NZY среде, как описано 21.
  4. Получение забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS).
  5. Подготовьте деионизированной воды как для субфазы Ленгмюра-Блоджетт (ЛБ) монослоя осаждения.

2. Распространение и титрование бактериофага

  1. Выдержите 5 мл ночной культуры С. стафилококк АТСС 12600 (3.6 х 10 8 колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл), 500 мкл фага (3 × 10 9 </ Вир> PFU / мл) в 500 мл NZY среды в 2 л Флэк на шейкере-инкубаторе при 37 ° С в течение ночи.
  2. Центрифуга культуры в 4424 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  3. Повторное супернатант центрифугировали при 11325 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  4. Фильтр супернатанта через 0,22 мкм фильтр Millipore.
  5. Центрифуга фильтрата при 75 395 мкг в течение 1,5 часов.
  6. Растворить осадок в 100 мкл дистиллированной воды.
  7. Подготовка 10-кратного разведения фага суспензии в NZY среды.
  8. Пластина 1 мл на ночь (ON) культуры С. стафилококк АТСС 12600 на каждую из 2 пластин с NZY агар убедиться, что все поверхности покрыта. Удаления избытка культуры и дать поверхности высохнуть в течение 30 мин.
  9. Определить образец (10 мкл) из соответствующего разведения фага на поверхность пластины и инкубировать при 37 ° С в течение 18-24 часов.
  10. Изучите образованию бляшек и рассчитать титр фага. Бактериофаг титры (Т), оцениваются на основе количества рLaques (N), образованный в 10 мкл объема (объем) суспензии фага и коэффициент разбавления (F). Титр рассчитывали по формуле:. Т = N / (VXF) Например, для количества бляшек 75 при разведении 10 -7 и объемом 10 мкл (10 × 10 -3 мл) Титр равна 75 / (10 × 10 -3 × 10 -7) = 7,5 · 10 10 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл суспензии.

3. Gold-иммобилизованных Фаговые

  1. Чистый золотым покрытием кварцевым части (60 мм 2), плазменного травления в атмосфере аргона в течение 10 мин и затем стерилизуют в течение 6 часов под УФ-светом в стерильной камере.
  2. Добавьте 50 мкл 1 × 10 9 БОЕ / мл фагового подвески с поверхностью золота каждой части в стерильную чашку Петри, а затем инкубировать в течение ночи во влажной камере при комнатной температуре.
  3. Удалите и титровать оставшиеся подвески фага.
  4. Вымойте части со связанными фага в 5 раз с PBS для удаления несвязанныхфага.

4. Тестирование Иммобилизованный Фаговые Инфекционность на сухой поверхности

  1. Распространение O / N культуры с. Золотистый АТСС 12600 на NZY пластины агара и дать высохнуть.
  2. Поместите золотую монету с иммобилизованными фага на тарелку лицом вниз.
  3. Заметим зону лизиса после 12 ч инкубации при 37 ° С, что указывает на инфекционность.
  4. Использование золота покрыты части, не фага в контрольных экспериментах.

5. Тестирование литической активности свободных и связанных Фаговые в жидком

  1. Добавить по культуре С. стафилококк АТСС 12600 в 10 мл NZY в каждом из четырех 300-мл колбы пистолет (6 × 10 6 КОЕ / мл в каждую колбу).
  2. Добавить В двух колбах 2 х 10 6 PFU / мл свободного фага.
  3. Использование других двух колбах в качестве контроля.
  4. Следить за ходом времени С. стафилококк лизис клеток на 570 минут на измерение оптической плотности (ОП 600) на 30 минутные интервалы для всех колбах.
  5. Принять окончательное измерение в 24 часов.
  6. Повторите шаги 5.1-5.5, но и использовать золотые монеты со связанными фагов вместо свободного фагов, и золотых монет, не фага в контрольных колбах.

6. Потери связанные фаги во время инкубации

  1. Добавьте 50 мкл 1 × 10 9 БОЕ / мл фага на поверхности стерильный кусок золота в чашке Петри, который помещен в влажной камере в течение ночи при комнатной температуре.
  2. Снимите подвеску с несвязанными фага с поверхности золота и титр.
  3. Промыть золото кусок со связанными фаг 5 раз PBS и место в 1 мл NZY раствора в 15 мл пробирку в шейкере-инкубаторе при 37 ° С в течение 8 часов.
  4. Определить титр фага отдельно, как описано в пункте 2.

7. Подготовка Фаговые Сфероиды

  1. Сочетание 400 мкл запас фага 12600 суспензии (10 11 PFU / мл) с равным объемом хлороформа спектрофотометрического класса в 1 мл флаконепри комнатной температуре.
  2. Аккуратно вихрь фаг-хлороформ подвески 5-6 раз (5 сек интервалами) в течение одной минуты продолжительности.
  3. Допускается подвеска стабилизироваться в течение 30 секунд, после чего пипеткой верхней фазы, содержащей сфероидами был пипеткой для монослоя подготовки.
  4. Потратьте несколько мкл сфероидами подвески для передачи и сканирующей электронной микроскопии.
  5. Используйте оставшиеся сфероидом суспензия для биосенсоров производства.

8. Подготовка биосенсоров

  1. Чистый QCM-D датчикам плазменного травления в среде аргона в течение 10 мин PDC-32G чистых Harrick плазмы.
  2. Промыть датчик с гексаном, чтобы удалить любые органические примеси.
  3. Подготовьте и очистите корыто фильма баланса, как описано в 22.
  4. Заполните ЛБ-ванной с субфазы раствором и протрите его через барьер и стабилизации корыта при температуре 20 ± 0,1 ° C
  5. Распространение 300 мкл аликвоты фага 12600 в водных suspensiна (10 11 PFU / мл) на LB субфазы.
  6. Подготовьте фага монослоя на LB субфазы решение, позволив 300 мкл аликвоты фага 12600 водной суспензии (10 11 PFU / мл), чтобы запустить по наклонной смачивающийся стеклянную палочку, которая частично погружают в субфазы 22,23.
  7. Стабилизация подготовленную монослое в течение 10 мин, а затем сжать его со скоростью 30 мм / мин (45 см 2 / мин), для достижения постоянного давления 19 Н / м, не будет достигнута.
  8. Выполнение вертикального осаждения пленки на перпендикулярную расположены QCM-D датчик со скоростью 4,5 мм / мин путем последовательного погружения датчика в и из монослой семь раз. Электронно-микроскопическое исследование хранение фага монослоев перед воздействием бактериальных образцов показал, что слои были непрерывными, однородный и равномерный (данные не показаны).
  9. Повторите шаги 4.5-4.8 с фагом сфероид суспензии, которую получают 3.
  10. Используйте сфабрикованы фага биосенсоров для обнаружения MRSA, электронмикроскопии и эллипсометрии.

9. Тестирование биосенсоров, Дискриминация метициллин устойчивый и чувствительных бактерий Staphylococcus

  1. В этом протоколе биосенсоров с немодифицированных и модифицированных фагов и фаг сфероиды подготовлены. Кварцевых микровесов на основе кристалла с четырех камер датчика потока используется для контроля связывание бактерий фагом иммобилизованного на поверхности QCM датчика. PBP 2a антитела, конъюгированного латексных используются различать устойчивые к метициллину (MRSA) и чувствительных бактерий стафилококка. Все измерения проводятся в режиме потока (50 мкл / мин) на частоте 5 МГц.
  2. Создание базовой линии резонанса частота QCM датчик в воде (~ 30 мин).
  3. Нарисовать суспензии живых чувствительные к метициллину стафилококками бактериальных клеток в воде (10 9 КОЕ / мл) через испытательную камеру.
  4. Непрерывный мониторинг изменений в частоте резонанса и датчики диссипации энергии для первого обертона, УЗИнг Q-Soft программного обеспечения.
  5. Когда изменения в частоте резонанса датчиков и диссипации достиг точки насыщения, добавьте приостановлении PBP антитела, конъюгированного латексных (6,77 x10 10 бисер / мл) в потоке во время непрерывного мониторинга частоты и тепла.
  6. Повторите шаги 9,2-9,5 для метициллин устойчивый золотистый бактериальных клеток (MRSA).
  7. Определить изменение частоты через изменение массы из-за бактерий обязательным уравнением Sauerbrey 24,25 Δf = Ат-хп / C, где С-постоянная чувствительность масс (C = 17,7 нг х х см -2 -1 Гц на частоте 5 МГц ), М-масса и N является обертона числа (N = 1).
  8. Определить изменение рассеяния энергии (Δ D) от записи экспоненциальное затухание колебаний (частоты и амплитуды увлажнения, что позволило количественно энергии, рассеянной и хранятся в течение одного периода колебаний,E рассеивается и Е сохраняются соответственно: D = Δ E рассеивается / 2 πE сохранены. Δ D измеряется в единицах диссипации (DU), один Ду = 10 -6 относительных единицах).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Фага продемонстрировали литическую активность в отношении всех протестированных штаммов S. стафилококка, включая MRSA штаммов, о чем свидетельствуют капельного теста фага. Зубной налет размеров обычно составлял от 5 до 15 мм. Нет активность была обнаружена в отношении других тест-культур (табл. 1).

Нормальный рост S. стафилококк АТСС 12600 в NZY среды на шейкере-инкубаторе при температуре 37 ° C показана на рисунке 1А (кривой помечены пустые кружки). Количество бактерий увеличилось с 3,2 × 10 6 до 4,0 × 10 8 КОЕ / мл. (кривой помечены закрашенные кружки) показывает результаты совместного культивирования 2,0 × 10 6 БОЕ / мл свободный фага одновременно с добавлением той же концентрации С. стафилококк АТСС 12600. Фага иммобилизованных на поверхности золота, продемонстрировал литическую активность, сравнимую с активностью фага в виде суспензии (рис. 1а, кривая помечены сверху вниз треугольники). Иммобилизованные фага остается инфекционный когда золото часть с фаг был впервые использован в 24-часовой растущий эксперимент, а затем его промывали 5 раз и хранится в PBS в течение 6 дней при 4 ° С и, наконец, повторно с новой бактериальной суспензии. (Рис. 1а, кривая помечены верхнего треугольника вверх). Кажется, что иммобилизованные фагов вводят свою ДНК в бактерии, оставляя пустоту капсид, которые не способны инфицировать новые бактерии. Мы предполагаем, что иммобилизованные фагов на золотой поверхности выступала в роли главного "катализаторов", чтобы заразить несколько бактерий, которые образуют свободные фаги те в свою очередь заражают новые бактерии и так далее. Таким образом, наиболее иммобилизованных фаги, вероятно, не используется в первые 24 часов эксперимента растущий и, следовательно, могут быть использованы во второй раз. Поверхностная плотность фагов, сданный на хранение физической адсорбции составляла около ~ 0,7 фаговой частицы / мкм 2. Эта концентрация высока, но она может вырасти до 10 раз 2. Таким образом, золотые пластины могли бы включить сОме свободного жизнеспособных фагов, выпущенный инфицированных бактерий в течение первых 24 часов растущий эксперимента.

Фиг.1В показывает лизис зоны вокруг золота кусок, указывая, что иммобилизованные фаги были способны к лизису бактериальных клеток. В контрольных экспериментах, пустые пластины золото не ингибирует рост бактерий. Таким образом, эффективное снижение роста бактерий найден в совместной культуре бактерий и иммобилизованных фаг результате первичного взаимодействия воды взвешенных бактерий и связанного фага, как показано на рисунке 1C. Фаг отрыва от поверхности золота при совместной инкубации связанного фага и бактерии, было небольшим. Для того чтобы оценить, сколько фаги были отделены от поверхности золота во время инкубации образцы со связанными фага были погружены в NZY раствор встряхивали в шейкере-инкубаторе при 37 ° С в течение 8 ч и концентрацию свободной фага в надосадочной жидкости оценивали. Мы решили, что 4,1 х 10 7 PFU были Bounд до 60 мм 2 золотую монету (~ 0,7 частицы фага / мкм 2), когда только 3 х 10 4 PFU были отделены (0,007% отряд).

Просвечивающей и сканирующей электронной микрофотографии интактных литического фага 12600 на золотой поверхности подложки показано на фиг.2А и 2В. Когда фаг суспензию подвергали обработке хлороформом, фаг внешний вид был изменен. Хвост контракту в длину и загустеет. Многоугольной голова стала округлой (рис. 2D и 2Е). Мы называют структурно модифицированных литический фаг "сфероид", похожие на имя хлороформа обрабатывают нитевидного фага 26. Несмотря на значительные структурные изменения, в результате лечения хлороформ, сфероид литическую активность измеряется Число розеток не изменилась (рис. 2С и 2F). Среднее литическую активность фага и сфероиды были (7,4 ± 1,5 (SD)) х 10 10 (N = 4) и (7,5 ± 1.0 (SD)) х 10 10 (N = 7), БОЕ / мл. На уровне 0,05, деятельность фагов и сфероидами существенно не различались (рис. 2С и 2F).

QCM датчиков с иммобилизованными литических фагов, не показали значительных изменений резонансной частоты или диссипации энергии, когда они подвергались воздействию MRSA (фиг. 3А). Эти данные показывают, что MRSA / фага взаимодействие привело к массе нет изменений в соответствии с ПКМ, и все же электронные микрофотографии сообщению анализировали биосенсоров выявлены значительные бактериального связывания на поверхности датчика (рис. 3В).

Когда MRSA суспензии вводили в проточной кювете с фагом сфероид биосенсоров, существенное снижение частоты (Δ е ≈ -105 Гц) и увеличение диссипации (ΔD ≈ 26 DU) наблюдались (фиг.3С). После фага сфероид-бактериальной (MRSA) связывающие взаимодействия, анализировали SEnsors подвергались PBP2a антитела, конъюгированного латексных шариков суспензий. Эти MRSA анализировали биосенсоров ответ на антитело, конъюгированное PBP2a латексных шариков суспензий, так как дальнейшее снижение частоты (Δ е ≈ -45 Гц) и увеличение диссипации (ΔD ≈ 15 DU) наблюдались (фиг.3С). Связывание MRSA фага зондов и PBP2a антитела, конъюгированного латексных была подтверждена с помощью сканирующей электронной микроскопии исследования (рис. 3D).

Когда биосенсора фага сфероид подвергалась MSSA суспензий, существенное снижение частоты (Δ е ≈ -200 Гц) и увеличение диссипации (ΔD ≈ 55 DU) наблюдались (рис. 3Е). После фага Сфероид MSSA связывающие взаимодействия, анализировали датчики заражали PBP2a антитела, конъюгированного латексных шариков суспензий. Первоначально MSSA анализировали биосенсоров показали короткий переходные процессыувеличение частоты и снижения рассеивания. Через несколько минут из устойчивых и чувствительных к PBP2a антитела, конъюгированного латексных шариков взаимодействий, частоту вернулся на сообщение PBP2a уровни антител введение, но диссипативной энергии увеличилась (рис. 3Е). Связывание MSSA к фага зондов не было подтверждено с помощью сканирующего электронного микроскопа, но не связывание между устойчивых и чувствительных к PBP2a антитела, конъюгированного латексных наблюдалось (рис. 3F). Эллипсометрическое толщина профиля, 3D-карты толщины литических фагов и бактерий стафилококка приведены в дополнительном Цифры S1 и S2.

После контакта с датчиками LB иммобилизованных фагов или сфероидами к суспензии 10 9 клеток / мл MRSA или MSSA, бактерии были обнаружены связывать фагов или сфероидами на плотность (ρ) 9,1 х 10 7 (MRSA / нетронутыми фаги), 7,9 х 10 7 (MRSA / сфероидами) и 7,2 х 10 7 (MSSA / сфероидами) клеток / см 2. ВТесты с использованием 5 различных литических фагов и 2 хозяина бактерии 27, исследователи подвергали фагов иммобилизованных путем ковалентного связывания метод до 10 9 клеток / мл бактерий и определяют эффективность фага захвата в диапазоне (2.5-8.9) × 10 5 клеток / см 2 . Эффективность захвата фаг, представленные в этой работе ~ 100 раз выше.

Хозяин Напрягаться Штамм подробнее Метициллин чувствительности Фаговые чувствительности
Золотистого стафилококка 12600 АТСС S +
Золотистого стафилококка 27690 АТСС S +
Золотистого стафилококка 10292 Айова S +
10378 Айова S +
Золотистого стафилококка 10497 Айова S +
Золотистого стафилококка 10686 Айова S +
Золотистого стафилококка MRSA 1 AU R +
S.aureus MRSA 2 AU R +
Золотистого стафилококка MRSA 5 AU R +
Золотистого стафилококка MRSA 13 AU R +
S.aureus MRSA 26 AU R +
Золотистого стафилококка MRSA 34 AU R +
Золотистого стафилококка MRSA 45 AU R +
B. сибирской язвы Sterne AU Не Доступно -
Salmonella Typhimurium LT2 AU Не Доступно -
Шигеллы Флекснера неизвестный AU Не Доступно -
Yersinia Enterocolitica неизвестный AU Не Доступно -
Proteus Mirabilis неизвестный AU Не Доступно -
Клебсиелла пневмонии 13882 AU Не Доступно -
Сенная палочка 6051 АТСС Не Доступно -

Таблица 1. Фаговые 12600 чувствительности бактериальных споезда И.А. - изолированные от животных;. AU - бактериальная культура коллекции Auburn University; NA - не применяется; - литическую активность фагов определяется бляшек, +, чувствительный, -, не чувствительна. Ночные культуры протестированных штаммов высевают на пластины с NZY агара. После того как поверхность сушат, образец (10 мкл) 10 11 подвески PFU фаг был замечен на поверхности пластины. Планшеты инкубировали при 37 ° С в течение 18-24 часов. Литическую активность фагов было обнаружено образованию бляшек.

Рисунок 1
Рисунок 1. Инфекционные свойства связанного и свободного фага. А. бактериального роста в отсутствие (пустые кружки) и присутствие (темные кружки) свободного фага, в присутствии фагов связаны с поверхностью золота (пополнить TRiangles) и в присутствии фага связаны с поверхностью золота после 6 часов при 4 ° С (сверху вниз треугольники). Вставка: линия (1) показывает линейной подгонки не фаг роста экспериментальных данных в уравнении (4) (R = -0,99, р <0,0001). Линии (2) показывает, подгонка экспериментальных данных бактериального роста на свободном присутствие фага с тем же уравнением. Бактериальные постоянный рост (К) в отсутствие и в присутствии свободного фага, равны 0,88 и 0,64, (-0,048, фаза спада). Репрезентативные данные из трех независимых экспериментов показаны на панель A. средней относительной ошибки OD 600 измерения не превышает 5%. B. Фаг иммобилизован на поверхности золота является инфекционный как указано лизис зоны вокруг золотой часть. 1 - фрагмент чашки с агаром с бактериями, 2 - золото кусок с иммобилизованными фага;. 3 - ингибирование зоны вокруг золота кусок C. Схематическое представление бактерии лизис фагом прикреплены к поверхности золота. 1 -Покрытый золотом образец кварца, 2 - фаг связаны с поверхностью золота, 3 - бактерия якорь связанные фаги, 4 - свободный фаги выпущенный разрыва инфицированных бактерией. Используется с разрешения: Guntupalli Р., и др. 2012.. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2
Рисунок 2. Свойства неповрежденными и модифицированный фага А и В - Коробка передач и сканирующем электронном микроскопе интактных фагов, соответственно.. С - фаг литической активности на агаровой пластине с MRSA, D и E - Коробка передач и сканирующем электронном микроскопе интактных сфероидов фага соответственно; F - фага сфероидами литическомуctivity на агаровой пластине с MRSA. Средняя активность фага и сфероиды (7,4 ± 1,5 (SD)) х 10 10 (N = 4) и (7,5 ± 1,0 (SD)) х 10 10 (n = 7) БОЕ / мл. T-тест: Т = 0,15682, р = 0,87851. На уровне 0,05, деятельность фагов и сфероидами существенно не отличаются. Бары: A, B, D, и E: 200 нм. Используется с разрешения:. Guntupalli Р., и др. 2012.

Рисунок 3


Рисунок 3. Комбинированное QCM-D и Е. Анализ фага бактерии взаимодействий. Бактерии были доставлены на датчик в концентрации 10 9 КОЕ / мл суспензии в воде при скорости потока 50 мкл / мин. 1, 2 представляют изменения в частоте резонанса и рассеяние энергии, соответственно. А. Фаговые покрытием QCM-D датчик ответ на MRSA. Стрелка показывает TОн MRSA Срок поставки к поверхности датчика. B. сканирующего электронного микроскопа сообщению анализировали MRSA обязаны литических фагов иммобилизованных на QCM датчика. M-MRSA, P-фагов на поверхности датчика. С. Последовательные ответы фага сфероидов покрытием QCM-D датчик для MRSA, а затем в PBP антитело шариков. Стрелки указывают MRSA и PBP антител Срок поставки к поверхности датчика, соответственно. D. сканирующего электронного микроскопа сообщению анализировали биосенсоров фага сфероидами, MRSA, и PBP бисера антитела. Толстый и тонкий стрелками показаны типичные клетки MRSA и антител шарик, соответственно. Е. Последовательные ответы фага сфероидами покрытием QCM-D датчик С. стафилококка, а затем в PBP антитело шариков. Стрелки указывают С. стафилококка и PBP антител Срок поставки к поверхности датчика, соответственно. F. сканирующего электронного микроскопа сообщению анализировали биосенсоров фага сфероидами, С. стафилококк, и PBP антител бисером. Толстый и тонкий стрелками показаны типичные С. клетки стафилококка и антител шарик, соответственно. Используется с разрешения: Guntupalli Р., и др. 2012.. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Дополнительные показатели

Рисунок S1
Рисунок S1. Дополнительное рисунке 1. (А) и (б) эллипсометрические профиль толщины и 3D-карты толщины литического фага соответственно (эффективный показатель преломления = 1,05). Толщина профилей показывают средние, RMS шероховатость, минимальная и максимальная толщина монослоя. Линии по толщине была составлена ​​карта для создания профиля толщины.

50474/50474figs2.jpg "/>
Рис. S2. Дополнительное рисунке 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Хорошо известно, что фаги могут быть использованы в качестве зондов для биосенсора бактериальных патогенов 28. Как показано в этой работе, что фаг вместе с антителами PBP 2a может быть использован для решения старой проблемы: быстрое дискриминации устойчивых к антибиотикам и чувствительными штаммами.

Было обнаружено, однако те нормальные неизмененные фагов стафилококковый не пригодны для обнаружения бактерий с устройствами QCM, хотя они связывают бактерий. Фаг хвоста так долго, что акустические волны не может "достичь" бактерии, присоединенный к концу фага хвосты. Это условие привело к "недостающую массу" эффект 29 и невозможность зарегистрировать резонансную частоту и диссипации изменений, несмотря на значительное связывание показал Е. М. изображения (рис. 3А и 3В). Эта проблема была легко решена заменой нетронутыми фага с сфероиды фага модифицированы хлороформ вод. Результатом обработки полнофункциональную PХадж с короткими, толстыми и не гибкий хвост (рис. 2D, 2E, и 2F). Когда фаги были заменены сфероидов в биосенсоры, MRSA было легко обнаружить QCM-D устройства.

Когда частицы фага были связаны с золотой поверхности в правильной ориентации, их рецепторы были доступны для принимающей бактерий. Если прямой физический контакт между твердой поверхности фагов и бактериальной высушенного слоя происходят, иммобилизованных фаги способны инъекционных вирусного генома в бактерии-хозяина (рис. 1в). Эти результаты хорошо согласуются с данными, полученными с литические фаги иммобилизованных на поверхности стеклянный диск ковалентной технике вязания 27. Способность связанного литических фагов для захвата хост бактерии были продемонстрированы с использованием биотинилированного метод иммобилизации фага 30. С другой стороны, очень простым физическим методом адсорбции для крепления правильной ориентации фагов твердых поверхностей были использованы 31. Tон высоко фага сфероид эффективность захвата может быть использован для изготовления эффективным антимикробным поверхностей. Общее время до ответа для предлагаемого анализа составляет около 16 мин на образец. Это время может быть значительно сокращено при использовании QCM устройства с большим количеством камер. Ожидаемый срок хранения фага датчиков составляет около 3-4 месяцев при комнатной температуре. С биополимер защиты ее можно продлить до нескольких лет 32. Предел обнаружения С. стафилококк измеряли для этого фага спектроскопии поверхности плазмонного резонанса, и обнаружено, что 10 4 КОЕ / мл 18.

Одним из наиболее важных условий для использования методов, описанных в этой статье, в соответствии с чистыми и стерильных условиях 33 требования для всех экспериментов с фагов и бактерий.

Часто используемые методы обнаружения MRSA, такие как диск диффузии оксациллином тест экрана агар или бульон микроразведений принять нормативныйLLY до 24 часов для проведения теста. Быстрые методы, которые включают в себя автоматизированные методы, такие как Vitek GPS-SA карты, быстрый ATB стафилококка системы, панели быстрого Microscan системы, и кристалл MRSA ID системы также производят результаты после 3-11 часов 9-14. ПЦР или гибридизации ДНК гена МЕСА 15 является относительно быстрым и точным методом, но требует очищенной ДНК и чрезвычайно чувствителен примесей. В противоположность этому, способ, описанный в данной работе является быстрым, не требует экстракции ДНК, и он не чувствителен к примесям.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Описываемой работе была поддержана грантами от Auburn University AUDFS и ВВС США CRADA 07-277-01-60MDG. Взгляды, выраженные в этой статье, принадлежат авторам и не отражают официальную политику или положения ВВС США, министерства обороны или американского правительства.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P4417
spectrophotometric-grade chloroform Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 154733 (99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 29609-0 (95%)
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT 64-17-5 190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge Beckman Coulter Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden E4
Scanning electron microscope (SEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized Millipore Corporation, Billerica, MA SCGPU05RE 0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish NUNC A/S, Denmark 240835 Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes Gilson, Pipetman, France P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific, CT Classic C24
Gold-coated quartz pieces Auburn University, AL Homemade
Petri dishes Fisher Brand, USA 0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance The Baker Company, ME SG403
Culture Growing Flasks Corning Incorporated, NY 4995 PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. 4001
Plasma Cleaner Harrick Plasma, USA PDC-32G
Millipore water purification system Millipore Direct-Q
Imaging Ellipsometer Accurion, USA nanofilm_ep3se
Software Q-Sense AB, Sweden QSoft, QTools

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes. Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).
  2. Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements. J. Microbiol. Methods. 90, 182-191 (2012).
  3. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Long, R., Olsen, E., Neely, W., Vodyanoy, V. Phage Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films. Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 82, 182-189 (2011).
  4. Barie, P. S. Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice. World. J. Surg. 22, 118-126 (1998).
  5. Byun, D. E., Kim, S. H., Shin, J. H., Suh, S. P., Ryang, D. W. Molecular epidemiologic analysis of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens. J. Korean Med. Sci. 12, 190-198 (1997).
  6. Duan, L., Lei, H., Huang, E., Yi, G., Fan, W. Drug resistance of Staphylococcus aureus from lower respiratory tract. Zhonghua Yiyuanganranxue Zazhi. 21, 1667-1668 (2011).
  7. Giamarellou, H., Papapetropoulou, M., Daikos, G. K. Methicillin resistant' Staphylococcus aureus infections during 1978-79: clinical and bacteriologic observations. J. Antimicrob. Chemother. 7, 649-655 (1981).
  8. Knopf, H. J. Nosocomial infections caused by multiresistant pathogens. Clinical management exemplified by multiresistant Staphylococcus aureus. Urologe A. 36, 248-254 (1997).
  9. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of differential inoculum disk diffusion method and Vitek GPS-SA card for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 433-436 (1994).
  10. Struelens, M. J., Nonhoff, C., Van, D. A., Philippe Mertens, R., Serruys, E. Evaluation of rapid ATB Staph for 5-hour antimicrobial susceptibility testing of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 33, 2395-2399 (1995).
  11. Woods, G. L., LaTemple, D., Cruz, C. Evaluation of MicroScan rapid gram-positive panels for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 1058-1059 (1994).
  12. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of BBL crystal MRSA ID system. J. Clin. Microbiol. 32, 2588-2589 (1994).
  13. Qadri, S. M., Ueno, Y., Imambaccus, H., Almodovar, E. Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Crystal MRSA ID System. J. Clin. Microbiol. 32, 1830-1832 (1994).
  14. Zambardi, G., Fleurette, J., et al. European multicentre evaluation of a commercial system for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 747-749 (1996).
  15. Chambers, H. F. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).
  16. Brown, D. F. J., Edwards, D. I., et al. Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J. Antimicrob. Chemother. 56, 1000-1018 (2005).
  17. Gerberding, J. L., Miick, C., Liu, H. H., Chambers, H. F. Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 35, 2574-2579 (1991).
  18. Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., Simonian, A. L. Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus-A surface plasmon resonance spectroscopic study. Biosens. Bioelectron. 22, 948-955 (2007).
  19. Popham, D. L., Young, K. D. Role of penicillin-binding proteins in bacterial cell morphogenesis. Current Opinion in Microbiology. 6, 594-599 (2003).
  20. Wei, Y., Havasy, T., McPherson, D. C., Popham, D. L. Rod shape determination by the Bacillus subtilis class B penicillin-binding proteins encoded by pbpA and pbpH. J. Bacteriol. 185, 4717-4726 (2003).
  21. Grieco, S. H. H., Lee, S., Dunbar, W. S., MacGillivray, R. T. A., Curtis, S. B. Maximizing filamentous phage yield during computer-controlled fermentation. Bioprocess and Biosystems Engineering. 32, 773-779 (2009).
  22. Olsen, E. V., Pathirana, S. T., Samoylov, A. M., Barbaree, J. M., Chin, B. A., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment. J. Microbiol. Methods. 53, 273-285 (2003).
  23. Pathirana, S. T., Barbaree, J., Chin, B. A., Hartell, M. G., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Rapid and sensitive biosensor for Salmonella. Biosens. Bioelectron. 15, 135-141 (2000).
  24. Sauerbrey, G. The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing. Z. Phys. 155, 206-222 (1959).
  25. Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy Dissipation Kinetics for Protein and Antibody-Antigen Adsorption under Shear Oscillation on a Quartz Crystal Microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
  26. Griffith, J., Manning, M., Dunn, K. Filamentous bacteriophage contract into hollow spherical particles upon exposure to a chloroform-water interface. Cell. 23, 747-753 (1981).
  27. Hosseinidoust, Z., Van de Ven, T. G. M., Tufenkji, N. Bacterial Capture Efficiency and Antimicrobial Activity of Phage-Functionalized Model Surfaces. Langmuir. 27, 5472-5480 (2011).
  28. Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (53), e2740 (2011).
  29. Voinova, M. V., Jonson, M., Kasemo, B. Missing mass" effect in biosensor's QCM applications. Biosens. Bioelectron. 17, 835-841 (2002).
  30. Gervals, L., Gel, M., et al. Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces. Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).
  31. Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption. Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).
  32. Sorokulova, I., Watt, J., et al. Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage. J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).
  33. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
Биосенсоров для обнаружения устойчивых к антибиотикам бактерий Staphylococcus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).More

Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter