Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Biosensor för detektion av antibiotikaresistenta stafylokocker

doi: 10.3791/50474 Published: May 8, 2013

Summary

Lytiska fag biosensorer och pärlor antikroppar kan diskriminera mellan meticillinresistenta (MRSA) och känsliga bakterier Staphylococcus. De fager orörlig med en Langmuir-Blodgettmetod på en yta av en kvartskristallmikrovåg sensor och arbetade som breda sonder utbud stafylokocker. Antikropp pärlor erkänner MRSA.

Abstract

En strukturellt transformerad lytisk bakteriofag som har ett brett värdområde av Staphylococcus aureus-stammar och ett penicillin-bindande protein (PBP 2a) antikroppar konjugerade latexpärlor har använts för att skapa en biosensor utformad för diskriminering av meticillinresistent (MRSA) och känsliga (MSSA) S . aureus arter 1,2. De lytiska fager har omvandlats till fag spheroids genom kontakt med vatten-kloroform gränssnitt. Fag sfäroida monolager har flyttats till en biosensoryta genom Langmuir-Blodgett (LB) teknik 3. De skapade biosensorer har granskats av en kvartskristallmikrovåg med dissipation tracking (QCM-D) för att utvärdera bakterier-fag interaktioner. Bakterier-sfäroida interaktioner lett till minskad resonansfrekvens och en ökning av försvinnande energi för både MRSA och MSSA stammar. Efter bakteriell bindning, har dessa sensorer varit ytterligare utsatt för penicillin-bindande protein antikropp latexpärlas. Sensorer analyserade med MRSA svarade på PBP pärlor 2a antikroppar, även sensorer inspekterats med MSSA gav inget svar. Denna experimentella distinktion bestämmer en otvetydig diskriminering mellan meticillinresistenta och känsliga S. aureus-stammar. Lika bundna och obundna bakteriofager undertrycka bakterietillväxt på ytor och i vatten upphävanden. När lytiska fager ändras i spheroids, behåller de sin starka lytisk aktivitet och visar hög bakteriell capture kapacitet. Fag och fag sfäroider kan utnyttjas för testning och sterilisering av antibiotikaresistenta mikroorganismer. Andra program kan omfatta användning i bakteriofag terapi och antimikrobiella ytor.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Meticillin resistenta stammar av Staphylococcus aureus har föreslagits som en faktor på essentiella infektioner och nosokomiala utbrott 4-8. Vanliga sätt att erkänna meticillinresistens, såsom disk diffusion oxacillin agar provfilma, eller buljong microdilution, förlita sig på skräddarsydda odlingsbetingelser för att öka uttrycket av motstånd. Förändringar inkluderar utnyttjandet av oxacillin, inkubering vid 30 eller 35 ° C i stället för 37 ° C, och införlivandet av NaCl till tillväxtmediet. Dessutom, för korrekt detektering av dessa typer av tekniker, i stället för 16 och 18 år hr en lång inkubationstid 24 timmar krävs. Snabba metoder med lämplig (> 96%) grad av känslighet för identifiering av meticillinresistens omfattar automatiserade microdilution tekniker såsom Vitek GPS-SA-kortet, Rapid ATB Staph systemet, och Rapid Microscan Panel system som ger resultat efter 3-11 tim 9-11. The Crystal MRSA ID-system är en snabb metod baserad på erkännande av tillväxt av S. aureus i närvaro av 2% NaCl och 4 mg oxacillin per liter med en syre-känslig fluorescenssensor. Påstådda känslighet varierar mellan 91 till 100% efter 4 h inkubation 12-14. Dessa fenotypiska metoder är begränsade i sin noggrannhet genom inverkan av vanliga stammar som uttrycker heterogena motstånd. Därför är det bäst allmänt accepterade metoder för erkännande av meticillinresistens PCR eller DNA hybridisering av mecA gen 15. Men denna teknik kräver renat DNA och är extremt känslig för olika blandningar (föroreningar), som omfattar 16 cell skräp.

Dessutom är dessa tekniker behöver en lång tid att utföra. Strategier för erkännande av mecA genprodukten, protein PBP 2a, kan utnyttjas för att bestämma resistans, och kan vara mer tillförlitlig jämfört med vanliga testtekniker 17.

Staphylococcus aureus-stammar, inklusive de som har meticillinresistens 1,2,18. I detta arbete har vi föreslagit en ny teknik inom specifika Igenkännande och upptäckt av MRSA, såsom erkännande av bakterier tillsammans med konformation av MRSA i realtid. För detta specifika ändamål ett S. aureus bakteriofag med ett brett spektrum av värdar (inklusive MRSA-stammar) kombinerat med monoklonal antikropp mot protein (PBP 2a) har använts. PBP 2a är en cellvägg protein, och det är orsaken till antibiotikum resistivitet av MRSA. Men PBP 2a-antikroppen är inte specifik för S. aureus eftersom vissa andra bakterier har antibiotiska bindande proteiner med sekvenslikhet PBP 2a 19,20. Därför i detta arbete, S. aureus bakteriofag och antikroppar mot PBP 2a-protein har använts. För att kunna utveckla en biosensor till specifimatiskt upptäcka och identifiera MRSA en enhet med en tvåstegs åtgärder har utnyttjats. Det första steget används en S. aureus bakteriofag monoskikt som en sensor sond, medan det andra steget användes PBP 2a specifika antikroppar. Därför steg ett kommer att känna igen S. aureus bakterier, kommer som den andra en vara känslig för antibiotikumet-bindande proteinet. När signaler från två stegen är positivt, betyder det att specifikt påvisande av MRSA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ett. Inställning av scenen

  1. Skaffa S. typstam aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 och Bacillus subtilis ATCC 6051. Meticillinresistenta stammar av S. aureus - MRSA1, 2 MRSA, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882, Den lytiska fag 12600.
  2. Skaffa PBP 2a konjugerad latexpärlor.
  3. Förbered NZY medium som beskrivits 21.
  4. Erhåll fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  5. Förbered avjoniserat vatten som subfasen för Langmuir-Blodgett (LB) monoskikt nedfall.

2. Bacteriophage Spridning och titrering

  1. Inkubera 5 ml natten kultur av S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 8 kolonibildande enheter (CFU) / ml) med 500 | il av fag (3 x 10 9 </ Sup> PFU / ml) i 500 ml NZY medium i 2 L flack på skak-inkubator vid 37 ° C över natten.
  2. Centrifugera kultur vid 4424 xg under 10 min vid 4 ° C.
  3. Re-centrifugerade supernatanten vid 11.325 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
  4. Filtrera supernatanten genom ett 0,22 | im Millipore-filter.
  5. Centrifugera filtratet vid 75.395 xg under 1,5 timmar.
  6. Lös pelleten i 100 l destillerat vatten.
  7. Bered 10-faldiga spädningar av fagsuspension i NZY medium.
  8. Platta 1 ml över natten (ON) kultur av S. aureus ATCC 12600 på vardera 2 plattor med NZY agar för att se till att all yta är täckt. Avlägsna överskott av kulturen och låt torka i 30 min.
  9. Spot ett prov (10 ^ il) av lämplig fag utspädning på ytan av plattan och inkubera vid 37 ° C under 18-24 timmar.
  10. Undersök bildandet av plack och beräkna fag titer. Bakteriofag titer (T) beräknas på grundval av antalet plaques (N) som bildas per 10 pl volym (v) av fag suspensionen och den utspädningsfaktor (F). Titern beräknades med formeln:. T = N / (VXF) Till exempel för antalet plack 75 vid utspädning 10 -7 och volym 10 l (10 x 10 -3 ml), är titer motsvarar 75 / (10 x 10 -3 x 10 -7) = 7,5 x 10 10 plackbildande enheter (PFU) per ml suspension.

Tre. Guld-immobiliserade Fag

  1. Rena guldbelagda kvarts stycken (60 mm 2) genom plasmaetsning i argon under 10 min och sedan sterilisera under 6 timmar under UV-ljus i ett sterilt skåp.
  2. Lägg 50 mikroliter av 1 x 10 9 pfu / ml fagsuspension till guldytan på varje bit i en steril petriskål och sedan inkubera över natten i en fuktig kammare vid rumstemperatur.
  3. Ta och titrera återstående fagsuspensionen.
  4. Tvätta bitar med bunden fag 5 gånger med PBS för avlägsnande av obundetfag.

4. Testning av immobiliserade Fag Smittsamhet på en torr yta

  1. Sprid en O / N-kulturen i S. Aureus ATCC 12600 på en NZY agarplatta och låt torka.
  2. Placera ett guldmynt med immobiliserade fager på plattan nedåt.
  3. Beakta en zon av lys efter 12 h inkubation vid 37 ° C som indikerar infektivitet.
  4. Använd guld omfattas bitar med ingen fag i kontroll experiment.

Fem. Provning av lytisk aktivitet av fri och bunden fag i Liquid

  1. Lägg till ett ON kultur av S. aureus ATCC 12.600 till 10 ml NZY i varje av fyra 300 ml sidearm kolvar (6 x 10 6 CFU / ml i varje kolv).
  2. Lägg in två flaskor 2 x 10 6 PFU / ml fri fag.
  3. Använd de andra två kolvarna som kontroller.
  4. Övervaka tidsförloppet för S. aureus cellysering för 570 min med optisk densitet mätning (OD 600) med 30 minuters intervaller för alla kolvar.
  5. Ta en slutlig mätning vid 24 tim.
  6. Upprepa steg 5.1-5.5, men använd guldmynt med bundna fager istället för fria fager, och bitar guld med ingen fag i kontroll kolvar.

6. Förlust av bundna fager under inkubation

  1. Lägg 50 pl av 1 x 10 9 pfu / ml fag på ytan av steril guld bit i en petriskål som placeras i en fuktig kammare över natten vid rumstemperatur.
  2. Ta suspensionen med obunden fag från guldet ytan och titer.
  3. Tvätta guld stycke med bunden fag 5 gånger med PBS och plats i en ml NZY lösning i 15 ml rör i skak-inkubator vid 37 ° C under 8 timmar.
  4. Bestäm titern av fristående fag som beskrivs i 2.

7. Fag Sfäroider Framställning

  1. Kombinera 400 | il lager fag 12600 suspension (10 11 PFU / ml) med en lika stor volym spektrofotometriska grad kloroform i en ml injektionsflaskavid rumstemperatur.
  2. Försiktigt virvel fag-kloroform fjädring 5-6 gånger (5 sek intervall) under en minut varaktighet.
  3. Tillåten suspensionen stabiliseras under 30 sekunder och sedan pipettera den övre fasen innehållande spheroids pipetterades av för monoskikt beredning.
  4. Ta några mikroliter av spheroids suspension för överföring och svepelektronmikroskop.
  5. Använd en återstående spheroid suspension för Biosensor tillverkning.

8. Biosensor Framställning

  1. Rena QCM-D sensorer från plasma etsning i argon under 10 min PDC-32G Harrick plasma renare.
  2. Skölj sensorn med hexan för att avlägsna eventuella organiska föroreningar.
  3. Förbered och rengör ett tråg av filmen balans som beskrivs i 22.
  4. Fyll LB tråg med en subfasen lösning och rengör den med ett tråg barriär och stabiliserar rännan vid 20 ± 0,1 ° C
  5. Sprid 300 pl alikvot av fag 12600 i vattenhaltig upphängningpå (10 11 PFU / ml) på LB subfasen.
  6. Förbered fag monolager på LB subfasen lösning genom att låta 300 pl alikvot av fag 12600 vattenbaserad suspension (10 11 PFU / ml) för att köra ner en lutande vätbart glasstav som delvis är nedsänkt i subfasen 22,23.
  7. Stabilisera förberedda monoskiktet under 10 min, och sedan komprimera den med en hastighet av 30 mm / min (45 cm 2 / min), till dess att ett konstant tryck 19 N / m uppnås.
  8. Utför en vertikal filmavsättning på vinkelrätt placerad QCM-D-sensor med en hastighet av 4,5 mm / min genom att successivt doppning sensor in och ut av monoskiktet sju gånger. Elektronmikroskopi av avsatt fag monoskikt före exponering för bakteriella prov visade att skikten var kontinuerliga, homogena och enhetliga (data visas ej).
  9. Upprepa steg 4,5-4,8 med en fag sfäroid suspension som bereds i 3.
  10. Använd fabricerade fag biosensorer för MRSA upptäckt, elektronmikroskopi, och ellipsometri.

9. Biosensor Testing, Diskriminering av meticillinresistenta och känsliga bakterier Staphylococcus

  1. I detta protokoll är biosensorer med omodifierade och modifierade fag och spheroids fag förberedd. En mikrobalans för kvartskristall med fyra kamrar sensor flöde används för att övervaka bindning av bakterier till fagen immobiliserad på QCM sensorytan. PBP 2a antikropp konjugerad latexpärlor utnyttjas för att diskriminera mellan meticillinresistenta (MRSA) och känsliga bakterier Staphylococcus. Alla mätningar utförs i flödet läge (50 ul / min) vid 5 MHz.
  2. Upprätta en bas frekvens linje resonans av QCM sensorn i vatten (~ 30 min).
  3. Rita en suspension av levande meticillin känsliga stafylokocker bakterieceller i vatten (10 9 CFU / ml) genom provrummet.
  4. Kontinuerligt övervaka förändringar i sensorer resonansfrekvensen och energiupptagning för den första övertonen, USIng Q-Soft programvara.
  5. När förändringarna i sensorerna resonansfrekvensen och försvinnande nådde mättnad, lägga upphävandet av PBP konjugerad latexpärlor (6.77 x10 10 pärlor / ml) till flödet under kontinuerlig övervakning av frekvens och försvinnande.
  6. Upprepa steg 9,2-9,5 för meticillinresistenta Staphylococcus bakterieceller (MRSA).
  7. Definiera en frekvens förändring genom massan förändras på grund av bakterier bindande genom Sauerbrey ekvationen 24,25 Af =-Δm xn / C, där C är massan känsligheten konstant (C = 17,7 ng x cm -2 x Hz -1 vid 5 MHz ), m är massan och n är övertons antal (n = 1).
  8. Definiera en förändring energiavledningsresistor (Δ D) från inspelningen den exponentiella sönderfallet av oscillation (frekvens och amplitud dämpning, vilket tillät kvantifiering av den energi som förbrukas och lagras under en period av pendling,E skingras och E lagras, respektive: Δ D = E skingras / 2 πE lagras. Δ D mäts i försvinnandestudier enheter (DU), en DU = 10 -6 relativa enheter).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fagen demonstrerade lytisk aktivitet mot alla testade stammar av S. aureus, inklusive MRSA-stammar, såsom indikeras av fagen spot test. Plack storlekar varierade i allmänhet från 5 till 15 mm. Ingen aktivitet återfanns mot andra test-kulturer (Tabell 1).

En normal tillväxt av S. aureus ATCC 12600 i NZY medium på skak-inkubator vid 37 ° C visas i figur 1 A (en kurva märkt genom tomma cirklar). Antalet bakterier ökat från 3,2 x 10 6-4,0 x 10 8 CFU / ml. Figur 1A (en kurva märkt med fyllda cirklar) visar resultaten av samodling av 2,0 x 10 6 PFU / ml fri fag tillsattes samtidigt med samma koncentration av S. aureus ATCC 12600. Fag, immobiliserad på guldytan, demonstrerade den lytiska aktiviteten jämförbar med aktiviteten av fag i suspension (Figur 1A, kurva märkt genom Top Down trianglar). Immobiliserad fag förblev smittsamt när guldmyntet med fag användes först i 24-hr växande experiment, därefter tvättades 5 gånger och lagras i PBS under 6 dagar vid 4 ° C, och slutligen återanvändas med en ny bakteriell suspension. (Figur 1A, kurva märkt av top up trianglar). Det verkar som immobiliserade fager injicera sitt DNA i bakterier, lämnar tomma kapsider, som är oförmögna att infektera nya bakterier. Vår hypotes är att immobiliserade fager på ett guld yta tjänade som primära "katalysatorer" för att infektera några bakterier, vilka genererar fria fager som i sin tur infektera nya bakterier och så vidare. Därför var det mesta av immobiliserade fager förmodligen inte används i en första 24 tim växande experiment och därför kan användas en andra gång. Den ytors fager deponerats av fysikalisk adsorption var ca ~ 0,7 fagpartikeln / im 2. Denna koncentration är hög, men det kan bli upp till 10 gånger 2. Därför kunde guldplätering införliva some av de fria livsdugliga fager släpptes av infekterade bakterier i första 24 hr växande experiment.

Figur 1B visar lys zonen runt guldmynt, vilket indikerar att immobiliserade fager kan lysera bakterieceller. I kontrollexperiment, gjorde den tomma guldplätering hämmar inte bakterietillväxt. Därmed den faktiska minskningen av bakterietillväxt finns längst samodling av bakterier och immobiliserad fag är ett resultat av primär interaktion av vatten suspenderade bakterier och bunden fag såsom visas i figur 1C. Den fag avskildhet från guldet ytan vid samtidig inkubation av bunden fag och bakterier var liten. För att uppskatta hur många fager loss från guldet ytan under inkubation, togs prover med bunden fag nedsänkt i NZY lösning, skakas i shakern-inkubator vid 37 ° C under 8 h, och en fri fag koncentrationen i supernatanten bedömdes. Vi bestämde att 4,1 x 10 7 PFU var bound till en 60 mm 2 guldmynt (~ 0,7 fagpartikeln / im 2), då endast 3 x 10 4 PFU lossades (0,007% lossnar).

Transmissionen och svepelektronmikrofotografier av intakt lytisk fag 12600 på guldet substratytan visas i figurerna 2A och 2B. När fagsuspensionen underkastades kloroform behandling blev den fag utseende förändrats. Svansen minskade i längd och förtjockad. Den polygonalhuvudet blev rundad (figurerna 2D och 2E). Vi benämnde strukturellt modifierade lytisk fag "sfäroid" liknar namnet på kloroform behandlade filamentfag 26. Trots de betydande strukturella förändringar som resulterade från kloroform behandling, har sfäroiden lytiska aktiviteten mätt med plack siffror ändras inte (figur 2C och 2F). Medelvärdet lytiska aktiviteten hos fag och sfäroider var (7,4 ± 1,5 (SD)) x 10 10 (N = 4) och (7,5 ± 1.0 (SD)) x 10 10 (N = 7), PFU / ml. På nivån 0,05, var verksamheten i fag och spheroids inte signifikant (figur 2C och 2F).

QCM sensorer med immobiliserade lytiska fager visade inga signifikanta förändringar i resonansfrekvensen eller energiförlust när de utsattes för MRSA (Figur 3A). Dessa data indikerar att MRSA / fag interaktionen resulterade i ett nej massa förändring enligt QCM, och ändå elektronmikrofotografier av inlägget analyserade biosensorer avslöjade betydande bakteriell bindning på sensorytan (Figur 3B).

När MRSA suspensioner injicerades i flödet cellen med fag sfäroida biosensorer, en avsevärd minskning i frekvensen (Δ f ≈ -105 Hz) och en ökning av avledning (AD ≈ 26 DU) observerades (figur 3C). Efter fag spheroid-bakterie (MRSA) bindningsväxelverkningar, analyserades SEnsors exponerades för PBP2a konjugerad latexpärlor suspensioner. Dessa MRSA analyserades biosensorer svarade på PBP2a konjugerad latexpärlor suspensioner, eftersom en ytterligare minskning i frekvensen (Δ f ≈ -45 Hz) och en ökning av avledning (AD ≈ 15 DU) observerades (figur 3C). Bindning av MRSA till fag sonder och PBP2a konjugerad latexpärlor bekräftades med hjälp av scanning utredningar elektronmikroskopi (Figur 3D).

När fag sfäroiden biosensor utsattes för MSSA suspensioner, en avsevärd minskning i frekvensen (Δ f ≈ -200 Hz) och en ökning av avledning (AD ≈ 55 DU) observerades (figur 3E). Efter fag spheroid-MSSA bindningsinteraktioner, analyserades sensorer utmanades med PBP2a konjugerad latexpärlor suspensioner. Inledningsvis analyseras den MSSA biosensor visade korta transientaöka i frekvens och minska i försvinnande. Efter några minuter av MSSA och PBP2a konjugerad pärlor latex interaktioner, återvände frekvens att posta PBP2a nivåer antikroppar introduktion, men den avledande energi ökade (figur 3E). Bindning av MSSA till fag-prober bekräftades med svepelektronmikroskopi, men ingen bindning mellan MSSA och PBP2a antikroppar konjugerade pärlor latex observerades (Fig. 3F). Ellipsometrisk tjocklek profil, 3D tjocklek karta över lytiska fager och bakterier Staphylococcus visas i Kompletterande Siffror S1 och S2.

Efter kontakt med sensorer med LB immobiliserade fager eller sfäroider till suspension av 10 9 celler / ml av MRSA eller MSSA, har bakterierna observerades att binda fager eller sfäroider vid densitet (ρ) på 9,1 x 10 7 (MRSA / intakta fager), 7,9 x 10 7 (MRSA / sfäroider), och 7,2 x 10 7 (MSSA / sfäroider) celler / cm 2. Itester med användning av fem olika lytiska fager och två bakterier värd 27, forskare utsattes fager immobiliserade genom kovalent bindningsmetod till 10 9 celler / ml bakterier, och bestämdes effektiviteten fag infångning i ett intervall av (2,5-8,9) x 10 5 celler / cm 2 . Fag infångningseffektivitet som presenteras i detta arbete är ~ 100 gånger högre.

Värd Stam Strain detaljer Meticillin känslighet Fag känslighet
S. aureus 12600 ATCC S +
S. aureus 27690 ATCC S +
S. aureus 10292 IA S +
10378 IA S +
S. aureus 10497 IA S +
S. aureus 10686 IA S +
S. aureus MRSA en AU R +
S.aureus MRSA 2 AU R +
S. aureus MRSA 5 AU R +
S. aureus MRSA 13 AU R +
S.aureus MRSA 26 AU R +
S. aureus MRSA 34 AU R +
S. aureus MRSA 45 AU R +
B. anthracis Sterne AU NA -
Salmonella typhimurium LT2 AU NA -
Shigella flexneri okänt AU NA -
Yersinia enterocolitica okänt AU NA -
Proteus mirabilis okänt AU NA -
Klebsiella pneumoniae 13882 AU NA -
Bacillus subtilis 6051 ATCC NA -

Tabell 1. Fag 12600 känslighet bakteriell ståg IA - isolerade ur djur,. AU - bakteriekultur samling Auburn University, NA - ej tillämpligt, a - lytisk aktivitet av fag definierades av plack bildas, +, känslig, -, inte känslig. Övernattning kulturer av testade stammar ströks ut på plattorna med NZY agar. Efter det att ytan torkat togs ett prov (10 fil) av 10 11 PFU fagsuspension fläckvis på ytan av plattan. Plattorna inkuberades vid 37 ° C under 18-24 timmar. Lytisk aktivitet av fagerna detekterades genom bildning av plack.

Figur 1
Figur 1. Smittsamma egenskaper bunden och fri fag. A. bakterietillväxt i frånvaro (tomma cirklar) och närvaro (fyllda cirklar) av fri fag, i närvaro av fag bundet till guld yta (fyll triangles), och i närvaro av fag bundet till guld ytan efter 6 h vid 4 ° C (uppifrån och ned trianglar). Insert: linjen (1) visar en linjär anpassning av de inga experimentella fag tillväxt uppgifter till ekvationen (4) (R = -0,99, p <0,0001). Linjen (2) visar en passning av de experimentella data för bakterietillväxt på fri fag närvaro till samma ekvation. Bakterietillväxt konstant (k) i frånvaro och närvaro av fri fag, är lika 0,88 och 0,64, (-0,048, nedgång fas). Representativa data från tre oberoende experiment visas i panel A. En genomsnittlig relativt fel OD 600 mätningar inte överstiga 5%. B. Fag immobiliseras till guldet ytan är smittsamt som indikeras av lys zonen runt guldmynt. 1 - fragmentet agarplattan med bakterier, 2 - guldet bit med immobiliserade fag,. 3 - hämningszonen runt guldmynt C. Schematisk representation av bakterien lys genom fag bunden till guldet ytan. 1 -guldbelagda kvarts bit, 2 - fag bunden till guldet ytan, 3 - bakterie förankrad med bundna fager, 4 - fria fager har släppt genom sprängning infekterad bakterie. Används med tillåtelse från: Guntupalli, R., et al 2012.. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. Egenskaper hos intakt och modifierad fag A och B - Transmission och svepelektronmikrofotografier av intakt fag, respektive;.. C - fag lytisk aktivitet på en agarplatta med MRSA D och E - Transmission och svepelektronmikrofotografier av intakta fag spheroids, respektive; F - fag spheroids lytiska enctivity på en agarplatta med MRSA. Den genomsnittliga aktiviteten för fag och sfäroider är (7,4 ± 1,5 (SD)) x 10 10 (N = 4) och (7,5 ± 1,0 (SD)) x 10 10 (N = 7) PFU / ml. T-test: t = 0,15682, p = 0,87851. På nivån 0,05, verksamhet fag och spheroids är inte signifikant. Bars: A, B, D och E: 200 nm. Används med tillstånd från:. Guntupalli, R., et al 2012.

Figur 3


Figur 3. Kombinerade QCM-D och EM-analys av fag-bakterier interaktioner. Bakterier levererades till sensorn i en koncentration av 10 9 CFU / ml suspension i vatten vid en flödeshastighet av 50 ml / min. 1, 2 representerar förändringar i resonansfrekvensen och energiförlust, resp. A. Fag belagd QCM-D sensor svar på MRSA. Pilen visar than MRSA leveranstiden till sensorytan. B. svepelektronmikrofotografi av inlägget analyserades MRSA bundet till lytisk fag immobiliserad på QCM sensorn. M-MRSA, P-fager på sensorytan. C. Successiva svar av fagen spheroids belagda QCM-D sensor till MRSA först och sedan till PBP antikropp pärlor. Pilar indikerar MRSA och PBP antikropp leveranstiden till sensorytan, respektive. D. svepelektronmikrofotografi av inlägget analyserades biosensor med fag-sfäroider, MRSA och PBP pärlor antikroppar. Tjocka och tunna pilar visar typisk MRSA cell och antikropp pärla, respektive. E. Successiva svar av fagen spheroids belagda QCM-D sensor till S. aureus först och sedan till PBP antikroppar pärlor. Pilar indikerar S. aureus och PBP antikropp leveranstiden till sensorytan, respektive. F. svepelektronmikrofotografi av inlägget analyserades biosensor med fag-sfäroider, S. aureus, och PBP antikroppar pärlor. Tjocka och tunna pilar visar typiska S. aureus cell och antikropp pärla, respektive. Används med tillåtelse från: Guntupalli, R., et al 2012.. Klicka här för att visa en större bild .

Kompletterande Siffror

Figur S1
Figur S1. Kompletterande Figur 1. (A) och (b) är en ellipsometrisk tjockleksprofil och 3D-tjocklek karta av en lytisk fag, respektive (effektiva brytningsindex = 1,05). Tjocklek profiler visar medelvärdet, RMS strävhet, minimum och maximal tjocklek av monoskiktet. En linje över tjockleken kartan drogs att generera tjockleken profilen.

50474/50474figs2.jpg "/>
Figur S2. Kompletterande Figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det är väl känt att fager kan användas som biosensordata prober för bakteriella patogener 28. Det framgår i detta arbete som fag tillsammans med PBP 2a-antikroppar kan användas för att lösa gamla problem: snabba diskriminering antibiotikaresistenta och känsliga stammar.

Man fann emellertid de normala omodifierade stafylokock fager är inte lämpliga för bakterier detektion med QCM-enheter, även om de binder bakterier. Fag-svans är så lång att akustiska vågor inte kan "reach" bakterierna bundna till slutet av fag-svansar. Detta tillstånd resulterade i en "felande massa" effekt 29 och oförmåga att registrera resonansfrekvens och försvinnande förändring trots den signifikant bindning visade av EM bilder (figurerna 3A och 3B). Detta problem var lätt löst genom att ersätta den intakta fag med spheroids, fag modifieras genom kloroform-vattenbehandling. Denna behandling resulterade i fullt fungerande pHage med korta, tjocka och icke-flexibel svans (Fig. 2D, 2E och 2F). När fager ersattes med spheroids i biosensorer, var MRSA lätt upptäcks av QCM-D-enheten.

När fagpartiklarna bundna till guldytor på en riktig orientering, var deras receptorer tillgängliga värdbakterierna. Om direkt fysisk kontakt mellan en fast yta med fager och en torkad bakterie skikt förekomma, de immobiliserade fager är kapabla att injicera virala genomet i värdbakterier (Figur 1C). Dessa resultat stämmer väl överens med de som erhållits med lytiska fager immobiliserade på ytor glasskiva med en kovalent bindning teknik 27. Möjligheten av bundna lytiska fager att fånga värdbakterier visades också genom att använda en biotinylerad teknik fag immobilisering 30. Däremot har en mycket enkel fysikalisk adsorption metod för att fästa ordentligt orienterade fager till fasta ytor använts 31. Than hög fag sfäroid infångningseffektivitet kan användas för framställning av effektiva antimikrobiella ytor. En total tid-till-svara för den föreslagna analysen är ca 16 min per prov. Den här gången kan drastiskt förkortas med QCM enheter med ett stort antal kammare. Den förväntade hållbarhetstiden för fag-sensorerna är ungefär av 3-4 månader vid rumstemperatur. Med en biopolymer skydd det kan förlänga upp till några år 32. Detektionsgränsen för S. aureus mättes för denna fag genom en ytplasmonresonans-spektroskopi, och befanns vara 10 4 CFU / ml 18.

En av de viktigaste förutsättningarna för att använda metoder som beskrivs i den här artikeln är att följa med rena och sterila förhållanden 33 krav för alla experiment med fager och bakterier.

Vanligt använda metoder för detektion av MRSA, såsom disk diffusion oxacillin agar skärmtest eller buljong microdilution ta Normally upp till 24 h för att utföra testet. Snabba metoder som inkluderar automatiserade tekniker såsom Vitek GPS-SA-kortet, Rapid ATB Staph systemet, Rapid Microscan Panel systemet, och Crystal MRSA-ID-system ger också resultat efter 3-11 tim 9-14. PCR eller DNA-hybridisering av mecA-gen 15 är en relativt snabb och noggrann metod men kräver renat DNA och är extremt känsliga föroreningar. I motsats härtill är den metod som beskrivs i detta arbete snabbt, behöver inte DNA-extraktion, och det är inte känslig för tillsatser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Arbetet rapporteras häri har finansierats med bidrag från Auburn University AUDFS och USAF CRADA 07-277-60MDG-01. De åsikter som uttrycks i artikeln är de av författarna, och återspeglar inte den officiella politiken eller ställning i United States Air Force, försvarsdepartementet, eller den amerikanska regeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P4417
spectrophotometric-grade chloroform Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 154733 (99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 29609-0 (95%)
Ethyl Alcohol Pharmco products Inc. Brookfield, CT 64-17-5 190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge Beckman Coulter Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden E4
Scanning electron microscope (SEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM) JEOL USA Inc., Peabody, MA JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized Millipore Corporation, Billerica, MA SCGPU05RE 0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish NUNC A/S, Denmark 240835 Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes Gilson, Pipetman, France P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific, CT Classic C24
Gold-coated quartz pieces Auburn University, AL Homemade
Petri dishes Fisher Brand, USA 0875713 100 mmX15 mm
SterilGard III Advance The Baker Company, ME SG403
Culture Growing Flasks Corning Incorporated, NY 4995 PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. 4001
Plasma Cleaner Harrick Plasma, USA PDC-32G
Millipore water purification system Millipore Direct-Q
Imaging Ellipsometer Accurion, USA nanofilm_ep3se
Software Q-Sense AB, Sweden QSoft, QTools

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes. Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).
  2. Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements. J. Microbiol. Methods. 90, 182-191 (2012).
  3. Guntupalli, R., Sorokulova, I., Long, R., Olsen, E., Neely, W., Vodyanoy, V. Phage Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films. Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 82, 182-189 (2011).
  4. Barie, P. S. Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice. World. J. Surg. 22, 118-126 (1998).
  5. Byun, D. E., Kim, S. H., Shin, J. H., Suh, S. P., Ryang, D. W. Molecular epidemiologic analysis of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens. J. Korean Med. Sci. 12, 190-198 (1997).
  6. Duan, L., Lei, H., Huang, E., Yi, G., Fan, W. Drug resistance of Staphylococcus aureus from lower respiratory tract. Zhonghua Yiyuanganranxue Zazhi. 21, 1667-1668 (2011).
  7. Giamarellou, H., Papapetropoulou, M., Daikos, G. K. Methicillin resistant' Staphylococcus aureus infections during 1978-79: clinical and bacteriologic observations. J. Antimicrob. Chemother. 7, 649-655 (1981).
  8. Knopf, H. J. Nosocomial infections caused by multiresistant pathogens. Clinical management exemplified by multiresistant Staphylococcus aureus. Urologe A. 36, 248-254 (1997).
  9. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of differential inoculum disk diffusion method and Vitek GPS-SA card for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 433-436 (1994).
  10. Struelens, M. J., Nonhoff, C., Van, D. A., Philippe Mertens, R., Serruys, E. Evaluation of rapid ATB Staph for 5-hour antimicrobial susceptibility testing of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 33, 2395-2399 (1995).
  11. Woods, G. L., LaTemple, D., Cruz, C. Evaluation of MicroScan rapid gram-positive panels for detection of oxacillin-resistant staphylococci. J. Clin. Microbiol. 32, 1058-1059 (1994).
  12. Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. Evaluation of BBL crystal MRSA ID system. J. Clin. Microbiol. 32, 2588-2589 (1994).
  13. Qadri, S. M., Ueno, Y., Imambaccus, H., Almodovar, E. Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Crystal MRSA ID System. J. Clin. Microbiol. 32, 1830-1832 (1994).
  14. Zambardi, G., Fleurette, J., et al. European multicentre evaluation of a commercial system for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 747-749 (1996).
  15. Chambers, H. F. Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).
  16. Brown, D. F. J., Edwards, D. I., et al. Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J. Antimicrob. Chemother. 56, 1000-1018 (2005).
  17. Gerberding, J. L., Miick, C., Liu, H. H., Chambers, H. F. Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 35, 2574-2579 (1991).
  18. Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., Simonian, A. L. Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus-A surface plasmon resonance spectroscopic study. Biosens. Bioelectron. 22, 948-955 (2007).
  19. Popham, D. L., Young, K. D. Role of penicillin-binding proteins in bacterial cell morphogenesis. Current Opinion in Microbiology. 6, 594-599 (2003).
  20. Wei, Y., Havasy, T., McPherson, D. C., Popham, D. L. Rod shape determination by the Bacillus subtilis class B penicillin-binding proteins encoded by pbpA and pbpH. J. Bacteriol. 185, 4717-4726 (2003).
  21. Grieco, S. H. H., Lee, S., Dunbar, W. S., MacGillivray, R. T. A., Curtis, S. B. Maximizing filamentous phage yield during computer-controlled fermentation. Bioprocess and Biosystems Engineering. 32, 773-779 (2009).
  22. Olsen, E. V., Pathirana, S. T., Samoylov, A. M., Barbaree, J. M., Chin, B. A., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment. J. Microbiol. Methods. 53, 273-285 (2003).
  23. Pathirana, S. T., Barbaree, J., Chin, B. A., Hartell, M. G., Neely, W. C., Vodyanoy, V. Rapid and sensitive biosensor for Salmonella. Biosens. Bioelectron. 15, 135-141 (2000).
  24. Sauerbrey, G. The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing. Z. Phys. 155, 206-222 (1959).
  25. Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy Dissipation Kinetics for Protein and Antibody-Antigen Adsorption under Shear Oscillation on a Quartz Crystal Microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
  26. Griffith, J., Manning, M., Dunn, K. Filamentous bacteriophage contract into hollow spherical particles upon exposure to a chloroform-water interface. Cell. 23, 747-753 (1981).
  27. Hosseinidoust, Z., Van de Ven, T. G. M., Tufenkji, N. Bacterial Capture Efficiency and Antimicrobial Activity of Phage-Functionalized Model Surfaces. Langmuir. 27, 5472-5480 (2011).
  28. Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (53), e2740 (2011).
  29. Voinova, M. V., Jonson, M., Kasemo, B. Missing mass" effect in biosensor's QCM applications. Biosens. Bioelectron. 17, 835-841 (2002).
  30. Gervals, L., Gel, M., et al. Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces. Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).
  31. Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption. Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).
  32. Sorokulova, I., Watt, J., et al. Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage. J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).
  33. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
Biosensor för detektion av antibiotikaresistenta stafylokocker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).More

Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter