Summary
يوصف طريقة واضحة لتحريض الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. وترد وسائل لتحليل الخلايا في الدول EMT بواسطة كيمياء سيتولوجية مناعية.
Abstract
الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) أمر ضروري لالتشكل السليم خلال التنمية. Misregulation من هذه العملية وقد تورط كحدث رئيسي في تليف وسرطان تطور إلى حالة النقيلي. فهم العمليات التي تكمن وراء EMT يتحتم على التشخيص المبكر والسيطرة السريرية لهذه الحالات المرضية. الحث موثوقة من EMT في المختبر هو أداة مفيدة لاكتشاف المخدرات وكذلك لتحديد التوقيعات التعبير الجيني المشترك لأغراض التشخيص. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة واضحة لتحريض EMT في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. وترد أيضا أساليب لتحليل الخلايا ما قبل وما بعد EMT-تحريض من قبل كيمياء سيتولوجية مناعية. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر مدى فعالية هذه الطريقة من خلال تحليل مجموعة القائم على الأجسام المضادة والمقايسات الهجرة / الغزو.
Introduction
الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) هو العملية التي الخلايا الظهارية الاستقطاب يخضع لمجموعة متنوعة من التغيرات الناتجة في زنزانة الوسيطة متحركة عالية مثل الخلايا الليفية. تحدث هذه العملية، في جزء منه، من خلال التغيرات في التعبير الجيني وتدهور تقاطعات الملتصقة، مما أدى إلى زيادة القدرة على الهجرة وغزو. من الناحية الفسيولوجية، EMT تلعب أدوارا هامة أثناء التطور الجنيني والتئام الجروح. فقدان السيطرة المناسبة على EMT يمكن أن يؤدي إلى تليف وورم خبيث من سرطان 1،2.
الحد من E-كادهيرين على سطح الخلايا الظهارية هو خطوة حاسمة في تطور خلية من خلال EMT 3،4. E-كادهيرين هو بروتين الغشاء تمرير واحد التي تتفاعل مباشرة مع البروتينات على الخلايا المجاورة كادهيرين. بالإضافة إلى دورها في التصاق الخلية، E-كادهيرين خلية التأثيرات إشارة عبر التفاعلات بين الذيل حشوية من E-كادهيرين ودا متنوعة من البروتينات التنظيمية، ولا سيما β-catenin. β-catenin يلعب دورا في تحقيق الاستقرار في تقاطعات الملتصقة. خلال إشارات Wnt الكنسي، ويتم تحريرها β-catenin من E-كادهيرين وtranslocated إلى النواة حيث انها بمثابة عامل النسخ المصب في مسار 3،4،5 WNT. في النواة، وقد تبين β-catenin لزيادة النسخ لعدة عوامل ذات الصلة بما في ذلك EMT تويست، سبيكة، فيبرونكتين]، ومجموعة متنوعة من metalloproteases مصفوفة 3،6.
بالإضافة إلى WNTS، وقد تبين TGF-β إشارات للعب دورا هاما في EMT الحث على حد سواء خلال التطور الطبيعي في الدول المريضة و7،8،9. وتشارك TGF-β في EMT التي تحدث أثناء تشكيل الحنك وفي قلب النامية 10. كما تم المتورطين في تليف وسرطان في التقدم إلى ورم خبيث 7.
الإجراء الموضح هنا العلاقات العامةovides الاستقراء ثابت من EMT في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا دون الحاجة للتلاعب الجيني. يستخدم هذا الإجراء مزيج من E-كادهيرين، sFRP-1، وDKK-1 منع الأجسام المضادة وWNT-5A والبروتينات المؤتلف TGF-β1. تم تصميم هذا الكوكتيل لمنع E-المستندة إلى كادهيرين التصاق مع تعزيز WNT وTGF-β الإشارة. القدرة على الاستقراء EMT قوية هو أمر حاسم لفهم بيولوجيا هذه العملية وكيفية التعامل مع ذلك لأغراض علاجية. علامات الموحد الحالي للEMT، E-كادهيرين (downregulated في EMT) وVimentin (upregulated في EMT)، ويمكن الاطلاع أعرب المشارك في أمراض السرطان وبالتالي لا توفر أفضل علامات التشخيص من الخلايا المتنقل المحتملة 12. الأهم من ذلك أن تحليل مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا التي خضعت EMT هو مفيد لتطوير التوقيعات التعبير الجيني الشائعة التي يمكن أن تستخدم لأغراض التشخيص في السرطان والتليف 11. بالإضافة إلى ذلك، وقد أثبتت الدراسات الحديثة أن EMT قد تلعب دورا في تشكيل الخلايا الجذعية السرطانية، مما يشير إلى أن الخلايا التي خضعت EMT قد تكون مفيدة لفحص المخدرات لتحديد المركبات التي يمكن أن تستهدف هذه الخلايا 13.
Protocol
1. تحريض EMT
- الدافئة سائل الإعلام والثقافة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. وسائل الإعلام والثقافة المستخدمة هي نفس وسائل الإعلام المستخدمة للثقافة القياسية من الخلايا الخاصة بك من الفائدة. على سبيل المثال، يزرع خط خلية سرطان الرئة A549 الإنسان في Kaighn F12 لتستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني والجلوتامين 2mm و.
- خلايا الحصاد الاهتمام باستخدام محلول التفكك (على سبيل المثال TrypLE اكسبرس).
- تعليق الخلايا في وسائل الإعلام ثقافة قبل حرارة في أنبوب 15 مل المخروطية.
- الطرد المركزي تعليق خلية في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة بعناية طاف بصب في حاوية النفايات.
- تعليق بيليه خلية في وسائل الإعلام ثقافة قبل حرارة.
- عد خلايا قابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق. إزالة عينة من تعليق الخلية وتمييع في 0.4٪ حل التريبان الأزرق. وضع 10 ميكرولتر من العينة المخففة على عدادة الكريات وعدد خلايا قابلة للحياة (الخلايا التي لا تتحول الأزرق). استخدام عدد الخلايا لتحديد الخلية دensity في الحل.
- خلايا لوحة على زراعة الأنسجة المعالجة لوحات أو القوارير في 0.9-1.0 × 10 4 خلايا لكل سم 2. على سبيل المثال، 0.5 × 10 6 خلايا مطلي في لوحة 100 ملم في وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على الملحق 1X EMT الإقناع وسائل الاعلام (6 مل لكل 100 ملم وسائل الاعلام لوحة).
- ثقافة الخلايا مطلي في 37 ° C / 5٪ CO 2 الحاضنة. رصد مورفولوجيا الخلايا اليومية.
- بعد ثلاثة أيام من الطلاء، وإزالة واستبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام ثقافة جديدة قبل حرارة التي تحتوي على الملحق 1X EMT الإقناع وسائل الإعلام. تواصل الثقافة في 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 الحاضنة.
- بعد خمسة أيام والطلاء، والخلايا جاهزة للتحليل. هو تصور مورفولوجيا الخلايا بواسطة المجهر الضوئي المقلوب.
2. تحليل التعبير البروتين بواسطة كيمياء سيتولوجية مناعية
- إعداد العقيمة coverslips 12 ملم ل24 لوحة جيدا قبل وضع coverslips في طبق بتري تحتوي على 95٪ من الإيثانول. بلطف إزالة coverslips من الإيثانول بناجي إبرة وملقط المنحني واللهب تعقيم. وضع ساترة العقيمة في بئر واحدة من 24 لوحة جيدا. كرر مع coverslips المتبقية.
- إعداد تعليق خلية كما هو موضح في القسم 1،1-1،7.
- لوحة 1.6 × 10 4 خلايا / جيد في 0.5 مل سائل الإعلام والثقافة قبل حرارة التي تحتوي على الملحق 1X EMT الإقناع وسائل الإعلام.
- تنمو وتتغذى الخلايا كما هو موضح في الأقسام 1،9-1،11.
- بعد خمسة أيام والطلاء، وإزالة وسائل الإعلام وإصلاح الخلايا مع 300 ميكرولتر / جيد من بارافورمالدهيد 4٪ في الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة تثبيتي، وشطف الخلايا 2X مع 1X PBS، 500 ميكرولتر / جيد.
- احتضان الخلايا في 400 ميكرولتر / جيد من عرقلة العازلة (1X PBS تحتوي على 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، و 10٪ مصل حمار عادي، و 0.3٪ تريتون X-100) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان في الأجسام المضادة الأولية في مصنعين أوصت التركيز في 400 ميكرولتر / جيد من عرقلة العازلة لمدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفةه أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. عند استخدام الأجسام المضادة الأولية مترافق مباشرة إلى تألقي، واحتضان العينات في الظلام.
- غسل الخلايا ثلاث مرات في 500 ميكرولتر / جيد من 1X PBS تحتوي على 0.1٪ BSA لمدة 5 دقائق كل غسل. عند استخدام الأجسام المضادة الأولية مترافق مباشرة إلى تألقي، انتقل مباشرة إلى الخطوة 2.12.
- احتضان الخلايا في الأجسام المضادة الثانوية في أوصت تركيز الشركة المصنعة في 400 ميكرولتر / جيد من 1X PBS تحتوي على 1٪ BSA لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- غسل الخلايا ثلاث مرات في 500 ميكرولتر / جيد من 1X PBS تحتوي على 0.1٪ BSA لمدة 5 دقائق كل غسل.
- إذا رغبت في ذلك، نوى مع حل دابي ملون مباين.
- شطف الخلايا في الماء منزوع الأيونات وجبل coverslips وجهه لأسفل على شريحة باستخدام وسائل الإعلام في تصاعد مستمر.
Representative Results
. وحمل EMT الظروف الثقافة الموصوفة هنا توفر وسيلة قوية للتحريض EMT في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا أرقام 1 و 2 إظهار مورفولوجية ومستويات التعبير علامة لمدة 4 مختلف خطوط الخلايا البشرية: الخلايا ورم أرومي دبقي T98G، HT29 خلايا غدية القولون ، وخلايا سرطان الرئة A549، وMCF10A الخلايا الظهارية الثديية. تغير الخلايا التي تم التعامل معها في الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام من مورفولوجيا الكلاسيكية الظهارية (أرقام 1A - 1D) إلى الوسيطة، المغزل على شكل التشكل (أرقام 1E - 1H). ظهرت الخلايا التي يسببها EMT معبأة أقل كثافة في المستعمرات ضيق مقارنة مع الخلايا uninduced. عينات الواردة Uninduced MCF10A مجموعات معبأة بإحكام وتحيط بها خلايا معبأة أكثر فضفاضة. وكانت هذه المجموعات معبأة بإحكام E-كادهيرين إيجابية (الشكل 2D) واختفى على العلاج مع EMT الإقناع الإعلامي ملحقement (الشكل 2H).
تم تقييم EMT أيضا downregulation من علامات الظهارية وupregulation من علامات الوسيطة. وعادة ما لاحظ downregulation من E-كادهيرين التعبير التالي EMT الاستقراء في أنواع مختلفة من الخلايا 3،4 الشكل 2 يوضح التعبير سطح E-كادهيرين في غالبية الخلايا غير المعالجة (أرقام 2A - 2D؛ الحمراء). بالمقارنة مع غيابها بعد الحث EMT (أرقام 2E - 2H، أحمر). خط خلية واحدة، T98G وجد، أن يكون هناك مستوى منخفض للغاية من القاعدية E-كادهيرين قبل EMT الاستقراء، والتي حالت دون تحليله. Upregulation من علامة الوسيطة، فيبرونكتين]، وكان أيضا مرئية بعد الاستقراء مع الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام (أرقام 2A - 2D مقابل أرقام 2E - 2H؛ الأخضر).
مستويات التعبير عن E-كادهيرين وفيبرونكتين] ينظر إليه من قبل كيمياء سيتولوجية مناعيةوأكد كذلك من خلال النشاف الغربي من مجموع لست] الخلية (الشكل 3). أكدت طخة غربية downregulation من E-كادهيرين وupregulation فبرونيكتين التعبير يراها مناعية. تم quantitated العصابات باستخدام كثافة وتطبيع GAPDH لتحديد التغير النسبي أضعاف التالية EMT الاستقراء. تم تخفيض مستويات كادهيرين E 6.4 و 3.4 أضعاف في A549 والخلايا MCF10A، على التوالي. وزادت مستويات فبرونيكتين 4.6، 4.1، و 2.3 أضعاف في T98G، A549، والخلايا MCF10A، على التوالي. على الرغم من أن لطخة غربية لا تظهر انخفاض كبير في مستويات البروتين E-كادهيرين في الخلايا HT29 الحث بعد EMT، والنتائج كيمياء سيتولوجية مناعية يبرهن على وجود انخفاض في التعبير سطح E-كادهيرين (الشكل 2B مقابل 2F)، والذي هو غير قادر على تمييزها في النشاف الغربي من مجموع لست] الخلية.
لمزيد من تقييم الوضع EMT، علامة معروفة إضافيةوقد تم تحليل و لEMT قبل وبعد EMT-الاستقراء. يتفق مع النتائج السابقة، تم downregulated E-كادهيرين في جميع خطوط الخلايا فحصها، مشيرا إلى أن EMT كان المستحث. بالإضافة إلى ذلك، علامات الوسيطة، Vimentin والحلزون، وupregulated في A549، T98G، والخلايا MCF10A بعد العلاج مع الملحق EMT الإقناع وسائل الاعلام (الشكل 4). لم خط الخلية HT29 لا تظهر علامات التعبير عن هذه الوسيطة إما مع أو بدون تحريض EMT (لا تظهر البيانات)، والتي قد تشير إلى أن هذه الخلايا تستخدم مسارات بديلة لEMT الاستقراء.
على الرغم من TGF-β كافية لإحداث EMT في الخلية بعض سياقات 7،8،9، أنواع الخلايا الأخرى لا تستجيب فقط لإضافة TGF-β 14. MCF7 الثدي البشرية الخلايا السرطانية وPANC-1 خلايا سرطان البنكرياس الإنسان أفادت بعدم الرد على TGF-β يشير حده 14 على حد سواء. لتحديد ما إذا كان أي من الخطين يمكن الخضوع EMT في vitrس، ومثقف الخلايا في وجود الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام. وقد حفز الخلايا مع المؤتلف TGF-β1 وحدها، في تركيز داخل الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام. هذه الخلايا الظهارية الاحتفاظ التشكل، تتكون من مستعمرات الخلايا معبأة بإحكام (لا تظهر البيانات) ومستويات سطح كادهيرين E كانت مشابهة لتلك التي ظهرت في خلايا التحكم (أرقام 5C و 5D مقابل أرقام 5A و 5B). في المقابل، أظهرت الخلايا حفز مع الملحق EMT الإقناع الإعلامي انخفاض حاد في مستويات سطح E-كادهيرين (أرقام 5E و5F). أيضا الحصول على هذه الخلايا أكثر التشكل الوسيطة، حيث أصبحت الخلايا أقل إحكاما وأكثر مثل المغزل (لا تظهر البيانات). تثبت هذه النتائج أن طريقة EMT حمل الموصوفة هنا هو قادرة على تعزيز التشكل EMT والتغيرات التعبير علامة في الخلايا عادة مقاومة للTGF-β-IEMT nduced.
بالإضافة إلى التغييرات في علامة التعبير، السمة المميزة أخرى من خلايا اللحمة المتوسطة هي قدرتها على الهجرة وغزو. الهجرة وغزو الخلايا المستزرعة مع أو بدون الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام وتحليلها باستخدام 96 خلية جيدا BME الغزو الفحص وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. لفترة وجيزة، وكانت المصنفة الخلايا على لوحات 96 جيدا (50،000 خلية / أيضا) التي تحتوي على إدراج مرشح مع 8.0 ميكرومتر المسام. بعد 48 ساعة، وجرى تقييم هجرة calcein AM تلطيخ الخلايا التي هاجروا من خلال مرشح. تم اختبار كل عينة في ثلاث نسخ مرتين مع نتائج مماثلة. وتظهر نتائج ممثلة من تجربة واحدة في الشكل 6A. وشوهدت زيادات ذات دلالة إحصائية (P-قيمة <0.003) في الهجرة الخلية مع كل من وA549-1 PANC الخلايا التالية EMT الاستقراء. لتقييم قدرة هذه الخلايا على غزو (أي الهجرة من خلال المصفوفة خارج الخلية)، وكان نفس الاختبارأجريت مع الغشاء القاعدي المغلفة استخراج التصفية. وأظهرت الخلايا التي يسببها EMT يعتد به إحصائيا (P-قيمة <0.001) الزيادة في قدرات الغزو مقارنة مع الخلايا غير المعالجة كما رأينا في الشكل 6B.
تحريض قوية من EMT مفيد لتحليل التغيرات في التعبير الجيني والإشارات التي تجري في هذه الخلايا. تحليل مجموعة القائم على الأجسام المضادة باستخدام لست] من خلايا كل من المعالجة وغير المعالجة هو أسلوب واحد لتحليل مستويات التعبير عن مجموعة متنوعة من الجزيئات في عينة واحدة. على سبيل المثال، قمنا بتحليل مستويات فسفرته أفراد الأسرة في MAPK لست] من الامم المتحدة والتي يسببها وEMT التي يسببها MCF7 والخلايا A549 باستخدام صفيف كيت بروتيوم التعريف البشرية الفوسفات-MAPK. تم تشغيل مجموعة من العلاجات مرتين EMT-تحريض مستقلة مع نتائج مماثلة. الشكل 7 يظهر بيانات تمثيلية من مجموعة واحدة. كلا النوعين الخلية أظهرت زيادة الفسفرة من CREB (S133)، ERK1 (T2 02/Y204)، وERK2 (T185/Y187) في الخلايا التي يسببها EMT مقارنة مع الضوابط. وقد لوحظت اختلافات في إشارة الأحداث بين أنواع الخلايا اثنين أيضا. أظهرت خلايا A549 زيادة في GSK-3 β (S9) الفسفرة، في حين أظهرت خلايا MCF7 زيادة p70S6K (T421/S424) الفسفرة.
الشكل 1. وأشار مورفولوجيا الظهارية في أنواع الخلايا الأربعة التالية الثقافة لمدة 5 أيام في وسائل الإعلام ثقافة القياسية دون الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام (E - H) - الوسيطة التشكل الحث بعد التحفيز مع الملحق EMT الإقناع وسائل الاعلام (D A). مورفولوجيا الوسيطة في وأشار أربعة أنواع الخلايا المستزرعة مع الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام لمدة 5 أيام.
الشكل 2. Downregulation من الظهارية التعبير علامة وupregulation من التعبير علامة الوسيطة في الخلايا التي يسببها EMT. تم صبغ الخلايا بواسطة المناعي للكشف عن التعبير عن علامة الظهارية، E-كادهيرين (أحمر)، وعلامة الوسيطة، فيبرونكتين] (الخضراء). (A - D) الخلايا تحكم مثقف دون الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام لمدة 5 أيام (E - H) الخلايا المستزرعة مع الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام لمدة 5 أيام. وcounterstained جميع الخلايا مع دابي (الأزرق).
الرقم 3. تأكيد الظهارية والوسيطة التعبير علامة مع الغربية وصمة عار على . alysis طخة غربية من إجمالي لست] خلية من أربعة أنواع الخلايا المشار إليها، وتعامل مع (EMT) أو بدون (-) في الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام لمدة 5 أيام. العصابات لE-كادهيرين، فيبرونكتين]، والسيطرة GAPDH التحميل هي كما هو مبين على اليسار. علامة حجم كما هو مبين على الحق.
الشكل 4. Upregulation من علامات الوسيطة، Vimentin والحلزون في الخلايا التي يسببها EMT. تم صبغ الخلايا بواسطة المناعي متعدد الألوان للكشف عن التعبير عن علامة الظهارية، E-كادهيرين (الرمادي)، وعلامات الوسيطة، Vimentin (الخضراء) والحلزون (الأحمر) الخلايا تحكم مثقف دون تكملة EMT الإقناع وسائل الإعلام لمدة 5 أيام - (C A) (D - F) الخلايا المستزرعة مع الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام لمدة 5 أيام.
الرقم 5. تحريض EMT في الخلايا غير مستجيبة للTGF β1. (A و B) خلايا مثقف مع وسائل الاعلام وحدها لمدة 5 أيام. (C و D) الخلايا المستزرعة في وسائل الإعلام التي تحتوي على 10 نانوغرام / مل من TGF-β1 لمدة 5 أيام. (E وF) الخلايا المستزرعة في الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام لمدة 5 أيام. هي ملطخة جميع الخلايا للتعبير E-كادهيرين (أحمر) و counterstained مع دابي (الأزرق).
الرقم 6. وزادت الخلايا التي يسببها EMT القدرات الهجرة والغزو. A. متوسط عدد الخلايا التي هاجرت من خلال تصفية المسام 8 ميكرون بعد الحضانة لمدة 48 ساعة. B. متوسط عددالخلايا التي كانت قادرة على غزو من خلال تصفية المسام 8 ميكرون المغلفة مع استخراج الغشاء القاعدي بعد الحضانة لمدة 48 ساعة. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري أكثر من 3 آبار.
استنادا الأجسام المضادة الرقم 7. مجموعة تحليل التعبير عن EMT الاستقراء. واستخدمت لست] من A549 (A و C) وMCF7 (B و D) الخلايا المستزرعة مع أو بدون الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام لتحليل مجموعة باستخدام صفيف كيت بروتيوم التعريف البشرية الفوسفات-MAPK. أبرز النقاط في ألف وباء ثم تم quantitated باستخدام كثافة. وتظهر مقارنات من الامم المتحدة والتي يسببها لست] يسببها EMT لفي المقابلة الرسوم البيانية أدناه (C و D). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية </ أ>.
Discussion
الأساليب السابقة لEMT الحث والتحفيز تستخدم عادة TGF-β أو التعديل الوراثي. على الرغم من TGF-β وحدها وقد تبين للحث على EMT في بعض أنواع الخلايا، وقد تم الآن ثبت أن TGF-β ضروري لEMT، ولكنها ليست كافية في جميع أنواع الخلايا 6،14. باستخدام التعديل الوراثي للEMT الاستقراء هو مضيعة للوقت وكثيفة العمالة. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم مزيجا من العوامل من بينها، ومكافحة الإنسان E كادهيرين، sFRP-1 مكافحة الإنسان، ومكافحة الإنسان DKK-1، المؤتلف الإنسان WNT-5A، والمؤتلف الإنسان TGF-β1 للحث موثوق EMT. تم تصميم هذا المزيج من العوامل لمنع التصاق القائم E كادهيرين، خطوة حاسمة للتحريض EMT 4، وتعزيز الإشارات WNT بإضافة البروتين WNT-5A وكذلك باستخدام الأجسام المضادة ومنع لمثبطات WNT، sFRP-1 وDKK -1. وقد ثبت WNT وTGF-β إشارات التصرف في حلقة autocrine للحث والحفاظ على القانون الأساسي الخلية الوسيطةه 6. هذه الطريقة الحث يتجنب التلاعب الجيني وأكثر فعالية من استخدام TGF-β وحدها. الأهم من ذلك، نحن قادرون على مراقبة تحريض EMT في أنواع الخلايا، بما في ذلك MCF7 وPANC-1 الخلايا، التي ثبت سابقا عدم الرد فقط لتحفيز-TGF β (الشكل 5) 14.
الخلايا المعالجة مع الملحق المعرض EMT الإقناع وسائل الإعلام التشكل على شكل مغزل أقل إحكاما وزيادة (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، هناك انخفاض في سطح كادهيرين E التعبير المتزامنة مع زيادة في فبرونيكتين التعبير، والتي هي السمات المميزة لEMT (الشكلين 2 و 3). وupregulated علامات الوسيطة إضافية مثل Vimentin والحلزون أيضا في الخلايا التي يسببها EMT بالمقارنة مع الضوابط uninduced (الشكل 4). زيادة الهجرة والغزو قدرات هي الخصائص الفنية الرئيسية لخلايا اللحمة المتوسطة. في في المختبر (الشكل 6).
هذه طريقة بسيطة لEMT الاستقراء هو مفيد لدراسة EMT الإشارات كما هو موضح باستخدام بيانات التعبير مجموعة الضد هو مبين في الشكل 7. أنواع مختلفة من الخلايا يمكن مقارنة قبل وبعد EMT-التعريفي للحصول على التوقيعات التعبير الشائعة المرتبطة EMT، مثل الزيادة في CREB فسفرته وERK1 / 2 ينظر في كل من MCF7 والخلايا التي يسببها EMT A549. S133 الفسفرة من CREB يحفز الحمض النووي ملزمة، ولقد ثبت أن يتصرف المصب من TGF-β1 التي يسببها EMT 15. وقد تبين أيضا ERK1 / 2 الفسفرة للعمل المصب TGF-β1 التي يسببها EMT 16. كما يمكن توضيح الاختلافات في مسارات الإشارات بين الخلايا أنواع كما رأينا مع الزيادة في GSK-3β الفسفرة في خلايا A549 مقابل p70S6K الفسفرة في MCF7. الفسفرة GSK-3β في 9 سيرين أنه يقلل وظيفة، ولقد ثبت GSK-3β لمنع عامل النسخ المؤيدة للEMT، الحلزون 17. في المقابل، يدفع p70S6K النشاط الحلزون ويرتبط الفسفرة مع تفعيل هذا البروتين 18.
عموما، تحريض واضحة وموثوق بها من EMT، لا سيما في الخلايا هو موضح سابقا عدم الرد فقط لTGF-β، مفيد لفهم بيولوجيا EMT، وتحديد التوقيعات التعبير الشائع لاستخدامها بوصفها علامات النذير، وتطوير وتقييم علاجات جديدة للسرطان والمرض متليفة.
Disclosures
أنظمة R & D، هي شركة، والشركة العامة للربح.
وترعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المقالة عن طريق R & D سيستمز
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أنوه جوليا Hatler ومارتن رامسدن (R & D أنظمة) للمناقشة مفيدة ومراجعة مخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epithelial cells of interest | We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1 | ||
| EMT Inducing Media Supplement | R&D Systems | CCM017 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | R&D Systems | 240-B | Used at 10ng/ml |
| Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody | R&D Systems | NL648R | Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry |
| Anti-E-Cadherin | R&D Systems | MAB1838 | Used at 0.1 μg/ml for western blotting |
| Anti-Fibronectin | R&D Systems | MAB1918 | Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting |
| Anti-GAPDH | R&D Systems | AF5718 | Used at 0.2 μg/ml for western blotting |
| Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody | R&D Systems | NL009 | Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry |
| Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody | R&D Systems | HAF109 | Used at 1:2000 for western blotting |
| Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody | R&D Systems | HAF007 | Used at 1:2000 for western blotting |
| EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit | R&D Systems | SC026 | Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail. |
| 96 Well BME Cell Invasion Assay | R&D Systems | 3455-096-K | This kit was used according to the manufacturer's recommendations. |
| Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit | R&D Systems | ARY002B | This kit was used according to the manufacturer's recommendations19. |
| Mounting Media | R&D Systems | CTS011 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15350-061 | |
| 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| 95% Ethanol | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Triton-X-100 | Roche Molecular Biochemicals | 789-704 | Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration. |
| DAPI Solution | Sigma | D9542 | Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS. |
| Fine pointed curved forceps | Thermo-Fisher Scientific | 08-875 | |
| 12 mm coverslips | Carolina Biological | 633009 | |
| Nonfat dry milk | Used at 5% in TBST for blocking in western blotting | ||
| TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20] | For western blotting blocking and washing | ||
| PVDF Membrane | For western blotting | ||
| 4-20% SDS-page gel | For western blotting | ||
| ECL substrate | For western blotting | ||
| 15 ml conical tubes | |||
| Plates/flasks, tissue culture treated | |||
| 24-well plates, tissue culture treated | |||
| Pipettes / pipette tips | |||
| Pipet Aid / pipets | |||
| Hemocytometer | |||
| 37 °C Water Bath | |||
| 37 °C/5%CO2 Incubator | |||
| Centrifuge | |||
| Inverted light microscope | |||
| Fluorescence microscope |
References
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Thiery, J. P. Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).
- Heuberger, J., Birchmeier, W. Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).
- Onder, T. T. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Research. 68, 3645-3654 (2008).
- Tian, X. E-cadherin/β-catenin complex and the epithelial barrier. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-6 (2011).
- Scheel, C. Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast. Cell. 145, 926-940 (2011).
- Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Research. 19, 156-172 (2009).
- Kasai, H. TGF-β1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition. EMT). Respiratory Research. 6, 56-70 (2005).
- Miettinen, P. J., et al. TGF-β induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors. Journal of Cell Biology. 127, 2021-2036 (1994).
- Pelton, R. W., et al. Differential expression of genes encoding TGFs β1, β2, and β3 during murine palate formation. Dev. Biol. 141, 456-460 (1990).
- Taube, J. H. Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes. PNAS. 107, 15449-15454 (2010).
- Roussos, E. T., et al. AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment. Cancer Research. 70, 7360-7364 (2010).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).
- Brown, K. A. Induction by transforming growth factor-β1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro. Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).
- De Falco, V., et al. CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells. Cancer Research. 72, 1449-1458 (2012).
- Xie, L. Activation of the Erk pathway is required for TGF-β1-induced EMT in vitro. Neoplasia. 6, 603-610 (2004).
- Bachelder, R. E., et al. Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).
- Pon, Y. L. p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells. Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).
- Wegner, G. J., et al. Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays. J. Vis. Exp. , (2012).
