Summary
שיטה פשוטה מתוארת לאינדוקציה של אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) במגוון רחב של סוגי תאים. שיטות לניתוח של תאים במדינות EMT ידי immunocytochemistry כלולים.
Abstract
אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) הוא חיוני להמורפוגנזה הנאותה במהלך פיתוח. ויסות לא תקין של תהליך זה הייתה מעורב כאירוע מפתח בסיסטיק ואת ההתקדמות של קרצינומות למצב גרורתי. הבנת התהליכים שבבסיס EMT היא הכרחית לאבחון המוקדם ובקרה קלינית של מדינות מחלה אלה. אינדוקציה אמינה של EMT במבחנה היא כלי שימושי לגילוי סמים, כמו גם לזהות חתימות ביטוי גנים משותפות למטרות אבחון. כאן אנו מדגימים שיטה פשוטה לאינדוקציה של EMT במגוון רחב של סוגי תאים. שיטות לניתוח של תאים לפני ואינדוקצית ההודעה EMT-ידי immunocytochemistry כלולים גם כן. בנוסף, אנחנו מדגימים את האפקטיביות של שיטה זו דרך ניתוח מערך המבוסס על נוגדן ומבחני הגירה / פלישה.
Introduction
אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) הוא התהליך שבו תאי אפיתל מקוטבים עוברים מגוון רחב של שינויים וכתוצאה מכך תא mesenchymal ניעתי מאוד, כמו פיברובלסטים. תהליך זה מתרחש, בין שאר, באמצעות שינויי ביטוי גנים והשפלה של צמתים adherens, וכתוצאה מכך יכולת מוגברת להגר ולפלוש. מבחינה פיזיולוגית, EMT משחק תפקידים חשובים במהלך התפתחות עוברית וריפוי פצעים. אובדן השליטה נאותה על EMT יכול להוביל לסיסטיק וגרורות של קרצינומה של 1,2.
הירידה של E-cadherin על פני השטח של תאי האפיתל היא שלב קריטי בהתקדמות של תא דרך EMT 3,4. E-cadherin הוא חלבון הטרנסממברני אחת לעבור ישירות אינטראקציה עם חלבוני cadherin על תאים סמוכים. בנוסף לתפקידה בהידבקות תא, תא השפעות E-cadherin איתות באמצעות אינטראקציות בין זנב cytoplasmic של E-cadherinמגוון da של חלבונים רגולטוריים, בעיקר β-catenin. β-catenin משחק תפקיד בייצוב של צמתים adherens. במהלך איתות Wnt הקנונית, β-catenin הוא שוחרר מבית E-cadherin וtranslocated לגרעין שבו היא פועלת כגורם שעתוק במורד הזרם במסלול Wnt 3,4,5. בגרעין, β-catenin הוכח להגדיל את השעתוק של מספר גורמים הקשורים לEMT כולל טוויסט, Slug, פיברונקטין, וכן מגוון של metalloproteases מטריקס 3,6.
בנוסף לWnts, איתות TGF-β הוכח לשחק תפקיד משמעותי באינדוקצית EMT הן במהלך התפתחות נורמלית ובמדינות חולות 7,8,9. TGF-β הוא מעורב בEMT המתרחש במהלך היווצרות חיך ובלב פיתוח 10. הוא גם היה מעורב בסיסטיק ובהתקדמות סרטן לגרורות 7.
ההליך המתואר כאן יחסי הציבורovides אינדוקציה עקבית של EMT במגוון רחב של סוגי תאים ללא הצורך במניפולציה גנטית. הליך זה משתמש בקוקטייל של E-cadherin, sFRP-1, וDKK-1 נוגדני חסימה וWnt-5A וחלבונים רקומביננטיים TGF-β1. קוקטייל זה נועד לחסום מבוסס-cadherin E הידבקות תוך שיפור Wnt ואיתות TGF-β. היכולת לזירוז EMT חזק היא קריטית להבנת הביולוגיה של תהליך זה וכיצד לתפעל אותו למטרות טיפוליות. סמנים נפוצים הנוכחיים של EMT, E-cadherin (downregulated בEMT) וvimentin (שהוגברו בEMT), ניתן למצוא בשיתוף מתבטא בסוגי סרטן ובכך לא מספקים סמני האבחון הטובים ביותר של תאים גרורתי פוטנציאל 12. חשוב מכך, הניתוח של מגוון רחב של סוגי התאים שעברו EMT שימושי לפתח חתימות ביטוי נפוצות גן שיכול לשמש למטרות אבחון בסרטן וסיסטיק 11. בנוסף, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי EMT עשוי לשחק תפקיד בהיווצרות של תאי גזע סרטניים, מה שמרמז שתאים שעברו EMT עשויים להיות שימושיים עבור הקרנת סמים כדי לזהות תרכובות שיכולות למקד תאים אלה 13.
Protocol
1. אינדוקציה של EMT
- מדיה חמה תרבות ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים. תקשורת והתרבות המשמשת אותו כאמצעי התקשורת המשמשת לתרבות סטנדרטית של תאי עניין שלך. לדוגמא, שורת תאי קרצינומה של ריאה האנושית A549 הוא גדל בF12 של Kaighn תוספת 10% בסרום שור העובר וגלוטמין 2 מ"מ.
- קציר תאים של עניין באמצעות פתרון דיסוציאציה (למשל TrypLE Express).
- להשעות את התאים בתקשורת התרבות המחוממת מראש בצינור חרוטי 15 מיליליטר.
- צנטריפוגה ההשעיה תא XG 400 למשך 5 דקות.
- מוציא בזהירות את supernatant על ידי שפיכה לתוך מיכל פסולת.
- להשעות את התא גלולה בתקשורת התרבות המחוממת מראש.
- ספירת תאי קיימא באמצעות Trypan הכחול. הסר מדגם של ההשעיה התא ולדלל ב0.4% פתרון Trypan הכחול. הנח 10 μl של המדגם בדילול מלא על hemocytometer ולספור תאי קיימא (תאים שלא להפוך לכחול). השתמש בספירת תאים כדי לקבוע את ד התאensity בפתרון שלך.
- פלייט תאים על גבי רקמת תרבות מטופלים צלחות או צלוחיות ב0.9-1.0 x 10 4 תאים לכל 2 סנטימטר. לדוגמא, 0.5 x 10 6 תאים מצופים בצלחת 100 מ"מ בתקשורת והתרבות המכילה מוסף 1X EMT התרמת מדיה (6 מיליליטר מדיה לכל 100 צלחת מ"מ).
- תרבות מצופה תאים בC / 5% CO 2 באינקובטור 37 מעלות. לפקח על המורפולוגיה של תאים מדי יום.
- שלושה ימים לאחר ציפוי, להסיר תקשורת ולהחליף עם תקשורת ותרבות מחוממת מראש טריות המכילה מוסף 1X EMT התרמת מדיה. המשך לתרבות בC / 5% CO 2 באינקובטור 37 מעלות.
- חמישה ימים לאחר ציפוי, תאים מוכנים לניתוח. מורפולוגיה של תאים היא מדמיין על ידי מיקרוסקופ אור הפוכה.
2. ניתוח של ביטוי חלבון על ידי Immunocytochemistry
- הכן את coverslips מ"מ 12 סטריליים לצלחת 24 גם על ידי הנחת coverslips בצלחת פטרי שמכילה 95% אתנול. בעדינות להסיר coverslips מאתנולing מחט ומלקחיים מעוקלים ולעקר להבה. מניחים coverslip סטרילי לתוך אחד טוב של צלחת 24 גם. חזור עם coverslips הנותר.
- הכן את ההשעיה התא כפי שתואר בסעיף 1.1-1.7.
- 1.6 x 10 4 תאים / צלחת גם ב0.5 מיליליטר תקשורת התרבות המחוממת מראש המכילה תוסף 1X EMT התרמת מדיה.
- לגדול ולהאכיל את התאים כמתואר בסעיפים 1.9-1.11.
- חמישה ימים לאחר ציפוי, להסיר תקשורת ולתקן את התאים עם 300 μl / טוב של paraformaldehyde 4% בופר פוספט 1X (PBS) עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר.
- הסר מקבע ולשטוף תאי 2x עם 1X PBS, 500 μl / טוב.
- דגירה תאים ב400 μl / טוב של חיץ חסימה (1X PBS המכיל 1% אלבומין בסרום שור (BSA), 10% בסרום חמור נורמלי, ו0.3% טריטון X-100) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
- דגירה בנוגדן ראשוני ביצרנים מומלצים ריכוז ב400 μl / טובה של חיץ חסימה עבור 3 שעות בחדר temperaturדואר או הלילה ב 4 ° C. בעת שימוש בנוגדן ראשוני ישירות מצומדת לfluorochrome, דגירה דגימות בחושך.
- שטוף תאים שלוש פעמים ב500 μl / טוב של 1X PBS המכיל BSA 0.1% במשך 5 דקות כל אחד לשטוף. בעת שימוש בנוגדן ראשוני ישירות מצומדת לfluorochrome, להמשיך ישירות לשלב 2.12.
- דגירה תאים בנוגדנים משני בריכוז המומלץ של היצרן ב400 μl / טוב של 1X PBS המכיל BSA 1% עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר בחושך.
- שטוף תאים שלוש פעמים ב500 μl / טוב של 1X PBS המכיל BSA 0.1% במשך 5 דקות כל אחד לשטוף.
- אם תרצה, counterstain גרעינים עם פתרון DAPI.
- יש לשטוף את התאים במי deionized והר coverslips עם הפנים כלפי מטה בשקופית באמצעות תקשורת הרכבה.
Representative Results
. תנאי תרבות EMT גרימת המתוארים כאן לספק שיטה יציבה לגיוס של EMT במגוון רחב של סוגי תאי איורים 1 ו -2 להדגים את המורפולוגיה של ורמות ביטוי סמן ל4 קווים שונים תא אנושי: תאי גליובלסטומה T98G, HT29 תאי אדנוקרצינומה המעי הגס , קרצינומה של תאי ריאות A549, ותאי אפיתל החלב MCF10A. תאים שטופלו במוסף EMT התרמת מדיה השתנו ממורפולוגיה קלאסית אפיתל (איורים 1 א - 1D) לmesenchymal, מורפולוגיה דמוית כישור (1E דמויות - 1H). תאים מושרה-EMT הופיעו עמוסים פחות צפוף במושבות צפופות בהשוואה לתאי uninduced. דגימות Uninduced MCF10A הכילו אשכולות צפופים מוקפים בתאים עמוסים יותר באופן רופף. אשכולות צפופים אלה היו E-cadherin חיוביים (איור 2 ד) ונעלמו על טיפול עם EMT התרמת מדיה Supplement (איור 2H).
EMT הוערך גם על ידי downregulation של סמנים וגברת ביטוי של סמני mesenchymal אפיתל. Downregulation ביטוי E-cadherin הוא ציין בדרך כלל בעקבות האינדוקציה EMT בסוגי תאים שונים 3,4 איור 2 מדגים ביטוי על פני השטח של E-cadherin ברוב המכריע של תאים שלא טופלו (2A דמויות - 2D; אדום). בהשוואה להיעדרותה לאחר האינדוקציה EMT (2E דמויות - 2H; אדום). קו תאים אחד, T98G, נמצא כי רמת בסיס נמוכה מאוד של E-cadherin לפני גיוס EMT, אשר מנע את הניתוח שלה. גברת ביטוי של סמן mesenchymal, פיברונקטין, הייתה גם גלויה לאחר אינדוקציה עם מוסף EMT התרמת מדיה (2A דמויות - 2D לעומת 2E דמויות - 2H; ירוק).
רמות הביטוי של E-cadherin ופיברונקטין נתפסו על ידי immunocytochemistryאושרו עוד דרך מערבי סופג בסך הכל lysates תא (איור 3). הכתם המערבי אישר downregulation של E-cadherin וגברת ביטוי ביטוי פיברונקטין נתפס על ידי immunocytochemistry. הלהקות ונרשמת באמצעות צפיפות ומנורמלת לGAPDH כדי לקבוע שינוי קיפול יחסי הבאים אינדוקציה EMT. רמות E-cadherin הופחתו 6.4 ו3.4 לקפל בA549 ותאי MCF10A, בהתאמה. רמות פיברונקטין הוגדלו 4.6 4.1, ו2.3 לקפל בT98G, A549, ותאי MCF10A, בהתאמה. למרות הכתם המערבי לא מראה ירידה משמעותית של רמות חלבון E-cadherin בתאי HT29 אינדוקציה הודעה-EMT, תוצאות immunocytochemistry להפגין ירידה בביטוי על פני השטח של E-cadherin (איור 2 לעומת 2F), שאינו מסוגל להבחין ב מערבי סופג בסך הכל lysates תא.
כדי להעריך את מצב EMT, סמן ידוע נוסף נוסףs עבור EMT נותחו לפני ואינדוקצית ההודעה EMT-. עולים בקנה אחד עם תוצאות קודמות, E-cadherin היה downregulated בכל שורות התאים שנבדקו, מצביעה על כך שEMT היה מושרה. בנוסף, סמני mesenchymal, vimentin והחילזון, היו שהוגברו בA549, T98G, ותאי MCF10A לאחר טיפול עם מוסף EMT התרמת מדיה (איור 4). שורת תאי HT29 לא הראתה ביטוי של סמנים אלה mesenchymal עם או בלי האינדוקציה EMT (מידע לא מוצג), אשר עשוי להצביע על כך תאים אלה לנצל מסלולים חלופיים לזירוז EMT.
למרות TGF-β הוא מספיק כדי לגרום EMT בתאים מסוימים הקשרי 7,8,9, סוגי תאים אחרים לא מגיבים אך ורק לתוספת של TGF-β 14. MCF7 תאי שד אנושי הסרטן וPANC-1 קרצינומה של תאי לבלב אנושיים שניהם דיווחו שלא להגיב לTGF-β איתות לבד 14. כדי לקבוע אם שני הקווים יכולים לעבור EMT בvitro, תאים היו בתרבית בנוכחות מוסף EMT התרמת מדיה. תאים היו מגורה עם TGF-β1 רקומביננטי לבד, בריכוז במוסף EMT התרמת מדיה. תאים אלה נשמרים מורפולוגיה האפיתל שלהם, בהיקף של מושבות צפופות של תאים (מידע לא מוצג) ורמות E-cadherin פני השטח היו דומים לאלה שראו בתאי ביקורת (5 ג דמויות ו5D לעומת 5A דמויות ו5 ב). לעומת זאת, תאי מגורה עם מוסף EMT התרמת מדיה הראו ירידה דרסטית ברמות E-cadherin פני השטח (5E דמויות ו5F). תאים אלה גם השיגו מורפולוגיה mesenchymal יותר, כמו תאים הפכו פחות קומפקטיים ויותר כמו ציר (מידע לא מוצג). תוצאות אלו מראות כי שיטת EMT גרימת המתוארת כאן היא מסוגלת לקדם מורפולוגיה EMT וסמן שינויי ביטוי בתאים בדרך כלל עמידים בפני TGF-β-iEMT nduced.
בנוסף לשינויים בביטוי סמן, סימן היכר נוסף של תאי mesenchymal הוא היכולת שלהם להגר ולפלוש. הגירה ופלישה של תאים בתרבית עם או בלי תוספת EMT התרמת מדיה נותחו באמצעות 96 גם נייד BME פלישת Assay על פי הוראות היצרן. בקצרה, תאים היו זורעים על צלחות 96 היטב (50,000 תאים / טוב) המכילים מסנן מוסיף עם 8.0 מיקרומטר נקבוביות. לאחר 48 שעה, הגירה הוערכה על ידי calcein מכתים AM של תאים שנדדו דרך המסנן. כל דגימה נבדקה בשלושה עותקים פעמיים עם תוצאות דומות. נציג תוצאות מניסוי אחד מוצגות באיור 6 א. עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית (P-value <0.003) בנדידת תאים נראו עם שני A549 וPANC-1 התאים הבאים אינדוקציה EMT. כדי להעריך את יכולתם של תאים לפלוש (כלומר להעביר באמצעות מטריצה תאית), אותו assay היההופיע עם מסנן מצופה תמצית קרום במרתף. תאים מושרה-EMT הראו (P-value <0.001) עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית ביכולות פלישה בהשוואה לתאים שלא טופלו כפי שניתן לראות באיור 6.
האינדוקציה החזקה של EMT שימושית לניתוח של שינויים גנטיים ביטוי ואיתות המתרחשים בתאים אלה. ניתוח מערך המבוסס על נוגדן באמצעות lysates מתאי שני מטופלים ואינם מטופלים הוא אחת שיטות לנתח את רמות הביטוי של מגוון רחב של מולקולות בדגימה אחת. כדוגמא, נתחנו את הרמות של בני משפחת MAPK פוספורילציה בlysates מבלתי מושרה וEMT-induced MCF7 ותאי A549 באמצעות ערכת מערך Proteome Profiler האדם phospho-MAPK. המערך נדרס פעמיים מטיפולים עצמאיים EMT-אינדוקציה עם תוצאות דומות. איור 7 מציג נתונים נציג ממערך אחד. שני סוגי התאים הציגו זרחון המוגבר של CREB (S133), ERK1 (T2 02/Y204), וERK2 (T185/Y187) בתאים מושרה-EMT השוואה לקבוצת ביקורת. הבדלים באירועי איתות נצפו בין שני סוגי התאים, כמו גם. תאי A549 הראו עלייה בGSK-3 β זרחון (S9), ואילו תאי MCF7 הראו זירחון p70S6K המוגבר (T421/S424).
איור 1. Mesenchymal אינדוקציה מורפולוגיה לאחר גירוי עם מוסף EMT התרמת מדיה (- ד '). מורפולוגיה אפיתל בארבעת סוגי התאים שצוינה הבאה תרבות במשך 5 ימים בתקשורת התרבות סטנדרטית ללא תוספת EMT התרמת מדיה (ה - ח). מורפולוגיה mesenchymal ב ארבעה סוגי תאים שצוינו תרבותיים עם מוסף EMT התרמת מדיה למשך 5 ימים.
איור 2. Downregulation של ביטוי סמן אפיתל וגברת ביטוי של ביטוי סמן mesenchymal בתאים מושרה-EMT. תאים הוכתמו על ידי immunofluorescence כדי לזהות את הביטוי של סמן אפיתל, E-cadherin (אדום), וסמן mesenchymal, פיברונקטין (ירוק). ( - ד) תאי בקרה בתרבית, ללא תוספת EMT התרמת מדיה במשך 5 ימים (ה -. H) תאים בתרבית עם מוסף EMT התרמת מדיה למשך 5 ימים. כל תאי counterstained עם DAPI (כחול).
איור 3. אישור על ביטוי סמן אפיתל mesenchymal עם כתם מערבי . Alysis כתם המערבי של lysates תא הכולל של ארבעה סוגי התאים שצוין, שטופלו ב( EMT) או בלי (-) מוסף EMT התרמת מדיה למשך 5 ימים. להקות עבור E-cadherin, פיברונקטין, וטעינה מלאה GAPDH הן כפי שצוינו בצד השמאל. סמן הגודל הוא כפי שצוין בצד הימין.
איור 4. גברת ביטוי של סמני mesenchymal, vimentin וחילזון בתאים מושרה-EMT. תאים הוכתמו על ידי immunofluorescence ססגוניות לזהות ביטוי של סמן אפיתל, E-cadherin (האפור), וסמני mesenchymal, vimentin (ירוק) וחילזון (אדום) תאי בקרה בתרבית, ללא תוספת EMT התרמת מדיה עבור 5 ימים. - (C). (ד - ו) תאים בתרבית עם מוסף EMT התרמת מדיה למשך 5 ימים.
איור 5. תאי תאי אינדוקציה של EMT בתאים שאינם מגיב TGF-β1. (A ו-B) בתרבית עם תקשורת לבד במשך 5 ימים. (C ו-D) בתרבית בתקשורת המכילה 10 / מיליליטר ng של TGF-β1 במשך 5 ימים. (E ותאי F) בתרבית במוסף EMT התרמת מדיה למשך 5 ימים. כל התאים הם מוכתמים לביטוי E-cadherin (אדום) וcounterstained עם DAPI (כחול).
איור 6. תאים מושרה-EMT הגדילו יכולות הגירה ופלישה. מספר א הממוצע של תאים שנדדו דרך מסנן נקבובית 8 מיקרומטר לאחר הדגירה של 48 שעות. מספר ב 'הממוצע שלתאים שהיו מסוגל לפלוש דרך מסנן נקבובית 8 מיקרומטר מצופה בתמצית קרום במרתף לאחר הדגירה של 48 שעות. ברים שגיאה מצביעים סטיית התקן מעל 3 בארות.
ניתוח המבוסס על נוגדן איור 7. מערך ביטוי של האינדוקציה EMT. Lysates מA549 (A ו-C) וMCF7 תאים (B ו-D) בתרבית עם או בלי תוספת EMT התרמת מדיה שימשו לניתוח מערך באמצעות ערכת מערך Proteome Profiler האדם phospho-MAPK. נקודות מודגשות בA ו-B אז היו נרשמת באמצעות צפיפות. השוואות של lysates לEMT-induced בלתי מושרה מוצגות בגרף העמודות המתאימות בהמשך (C ו-D). לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה </>.
Discussion
שיטות קודמות לזירוז EMT השתמשו בדרך כלל גירוי TGF-β או הנדסה גנטית. למרות TGF-β לבד הוכח לגרום EMT בכמה סוגי תאים, זה עתה הוכיח כי TGF-β הוא הכרחי לEMT, אבל זה לא מספיק בכל סוגי התאים 6,14. שימוש בהנדסה גנטית לזירוז EMT היא זמן רב ועבודה אינטנסיבית. השיטה המתוארת כאן משתמשת בשילוב של גורמים, לרבות, E-cadherin אנטי אנושי, sFRP-1 אנטי אנושי, DKK-1 אנטי אנושי, Wnt-5A האנושי רקומביננטי, וTGF-β1 אנושיים רקומביננטי לגרום EMT באופן מהימן. זה שילוב של גורמים נועד לחסום הידבקות E-מבוססת cadherin, שלב קריטי לזירוז EMT 4, ולשפר את האיתות של Wnt על ידי הוספת חלבון Wnt-5A, כמו גם באמצעות נוגדני חסימה למעכבי Wnt, sFRP-1 וDKK -1. Wnt ואיתות TGF-β הוכחו לפעול בלולאת autocrine כדי לגרום ולשמור על Stat תא mesenchymalדואר 6. שיטת אינדוקציה זה תמנע מניפולציה גנטית והוא יעיל יותר מאשר השימוש בTGF-β לבד. חשוב מכך, אנו מסוגלים להתבונן אינדוקציה של EMT בסוגי תאים, כולל MCF7 וPANC-1 תאים, שהוכח בעבר שלא להגיב אך ורק לגירוי TGF-β (איור 5) 14.
תאים שטופלו עם מופע מוסף EMT התרמת מדיה מורפולוגיה ציר בצורת פחות קומפקטית ומוגברת (איור 1). בנוסף, יש ירידה במקביל ביטוי E-cadherin משטח עם עלייה בביטוי פיברונקטין, שהם מסימני ההיכר של EMT (איורים 2 ו -3). סמני mesenchymal נוספים כגון vimentin וחילזון גם הוגברו בתאים המושרה EMT בהשוואה לקבוצת ביקורת uninduced (איור 4). יכולות הגירה ופלישה מוגברות הם המאפיינים הפונקציונליים העיקריים של תאי mesenchymal. במבחנה (איור 6).
זו שיטה פשוטה לזירוז EMT שימושית ללימוד איתות EMT כפי שהודגם באמצעות נתונים ביטוי מערך נוגדנים שמוצגים באיור 7. ניתן להשוות סוגי תאים שונים לפני ואינדוקצית ההודעה EMT-להשיג חתימות נפוצות ביטוי הקשורים EMT, כגון העלייה בCREB פוספורילציה וERK1 / 2 ראו בשני MCF7 ותאים מושרה-EMT A549. זירחון S133 של CREB מגרה DNA המחייב והוכח לפעול במורד הזרם של TGF-מושרה β1 EMT 15. ERK1 / 2 זירחון כן הוכח לפעול במורד הזרם של TGF-מושרה β1 EMT 16. הבדלים במסלולי איתות בין סוגי תאים יכולים גם להיות הובהר כפי שניתן לראות עם העלייה בזירחון GSK-3β בתאי A549 לעומת p70S6זירחון K בMCF7. זירחון GSK-3β בסרין 9 מקטין אותו לתפקד, וGSK-3β הוכח לעכב את גורם השעתוק פרו-EMT, חילזון 17. לעומת זאת, p70S6K גורם פעילות החילזון וזירחון שלו קשור בהפעלתו של חלבון זה 18.
בסך הכל, אינדוקציה פשוטה ואמינה של EMT, במיוחד בתאים הראו בעבר שלא להגיב אך ורק לTGF-β, היא שימושית להבנת הביולוגיה של EMT, זיהוי חתימות ביטוי נפוצות לשימוש כסמנים פרוגנוסטיים, ובפיתוח והערכה של תרופות חדשניות לסרטן ומחלה fibrotic.
Disclosures
מערכות מו"פ, Inc היא חברה למטרת רווח, ציבורית.
ההפקה והגישה חופשית למאמר זה היא בחסות מו"פ Systems, Inc
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר ג'וליה Hatler ומרטין צוקים (R & D מערכות) לדיון מועיל וביקורת כתב יד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epithelial cells of interest | We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1 | ||
| EMT Inducing Media Supplement | R&D Systems | CCM017 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | R&D Systems | 240-B | Used at 10ng/ml |
| Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody | R&D Systems | NL648R | Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry |
| Anti-E-Cadherin | R&D Systems | MAB1838 | Used at 0.1 μg/ml for western blotting |
| Anti-Fibronectin | R&D Systems | MAB1918 | Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting |
| Anti-GAPDH | R&D Systems | AF5718 | Used at 0.2 μg/ml for western blotting |
| Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody | R&D Systems | NL009 | Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry |
| Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody | R&D Systems | HAF109 | Used at 1:2000 for western blotting |
| Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody | R&D Systems | HAF007 | Used at 1:2000 for western blotting |
| EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit | R&D Systems | SC026 | Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail. |
| 96 Well BME Cell Invasion Assay | R&D Systems | 3455-096-K | This kit was used according to the manufacturer's recommendations. |
| Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit | R&D Systems | ARY002B | This kit was used according to the manufacturer's recommendations19. |
| Mounting Media | R&D Systems | CTS011 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15350-061 | |
| 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| 95% Ethanol | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Triton-X-100 | Roche Molecular Biochemicals | 789-704 | Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration. |
| DAPI Solution | Sigma | D9542 | Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS. |
| Fine pointed curved forceps | Thermo-Fisher Scientific | 08-875 | |
| 12 mm coverslips | Carolina Biological | 633009 | |
| Nonfat dry milk | Used at 5% in TBST for blocking in western blotting | ||
| TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20] | For western blotting blocking and washing | ||
| PVDF Membrane | For western blotting | ||
| 4-20% SDS-page gel | For western blotting | ||
| ECL substrate | For western blotting | ||
| 15 ml conical tubes | |||
| Plates/flasks, tissue culture treated | |||
| 24-well plates, tissue culture treated | |||
| Pipettes / pipette tips | |||
| Pipet Aid / pipets | |||
| Hemocytometer | |||
| 37 °C Water Bath | |||
| 37 °C/5%CO2 Incubator | |||
| Centrifuge | |||
| Inverted light microscope | |||
| Fluorescence microscope |
References
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Thiery, J. P. Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).
- Heuberger, J., Birchmeier, W. Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).
- Onder, T. T. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Research. 68, 3645-3654 (2008).
- Tian, X. E-cadherin/β-catenin complex and the epithelial barrier. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-6 (2011).
- Scheel, C. Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast. Cell. 145, 926-940 (2011).
- Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Research. 19, 156-172 (2009).
- Kasai, H. TGF-β1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition. EMT). Respiratory Research. 6, 56-70 (2005).
- Miettinen, P. J., et al. TGF-β induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors. Journal of Cell Biology. 127, 2021-2036 (1994).
- Pelton, R. W., et al. Differential expression of genes encoding TGFs β1, β2, and β3 during murine palate formation. Dev. Biol. 141, 456-460 (1990).
- Taube, J. H. Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes. PNAS. 107, 15449-15454 (2010).
- Roussos, E. T., et al. AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment. Cancer Research. 70, 7360-7364 (2010).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).
- Brown, K. A. Induction by transforming growth factor-β1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro. Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).
- De Falco, V., et al. CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells. Cancer Research. 72, 1449-1458 (2012).
- Xie, L. Activation of the Erk pathway is required for TGF-β1-induced EMT in vitro. Neoplasia. 6, 603-610 (2004).
- Bachelder, R. E., et al. Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).
- Pon, Y. L. p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells. Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).
- Wegner, G. J., et al. Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays. J. Vis. Exp. , (2012).
