Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Induktion og analyse af Epithelial til Mesenchymale Transition

Published: August 27, 2013 doi: 10.3791/50478

Summary

En enkel fremgangsmåde er beskrevet til induktion af epitelial til mesenkymale overgang (EMT) i en række celletyper. Metoder til analyse af celler i EMT tilstande ved immuncytokemi er inkluderet.

Abstract

Epitelial til mesenkymale overgang (EMT), er afgørende for korrekt morfogenese under udviklingen. Misregulation af denne proces har været impliceret som en vigtig begivenhed i fibrose og progression af carcinomer til et metastatisk tilstand. Forståelse af de processer, der ligger til grund for EMT er bydende nødvendigt for tidlig diagnosticering og klinisk kontrol af disse sygdomstilstande. Pålidelig induktion af EMT in vitro er et nyttigt redskab for lægemiddelforskning, samt at identificere fælles genekspression underskrifter til diagnostiske formål. Her vi demonstrere en enkel metode til induktion af EMT i en række forskellige celletyper. Metoder til analyse af celler præ-og post-EMT induktion med immuncytokemi er også inkluderet. Desuden har vi demonstrere effektiviteten af ​​denne metode gennem antistof-baserede array analyse og migration / invasion assays.

Introduction

Epitelial til mesenkymale overgang (EMT) er den proces, hvorved en polariseret epitelcelle undergår en række forandringer, som resulterer i en meget bevægelige, fibroblast-lignende mesenchymal celle. Denne proces sker dels via genekspression ændringer og nedbrydningen af ​​adherens vejkryds, hvilket resulterer i en øget evne til at migrere og invadere. Fysiologisk EMT spiller vigtige roller under fosterudviklingen og sårheling. Tab af en ordentlig kontrol over EMT kan føre til fibrose og metastasering af karcinomer 1,2.

Reduktionen af E-cadherin på overfladen af epitelceller er et kritisk trin i udviklingen af en celle gennem EMT 3,4. E-cadherin er en single-pass transmembrane protein, der interagerer direkte med cadherin proteiner på tilstødende celler. Ud over dets rolle i celleadhæsion, E-cadherin påvirkninger cellesignalerende via interaktioner mellem den cytoplasmatiske hale af E-cadherin enda forskellige regulatoriske proteiner, især β-catenin. β-catenin spiller en rolle i stabiliseringen af ​​adherens vejkryds. Under kanoniske Wnt signalering, er β-catenin frigivet fra E-cadherin og translokeres til kernen, hvor det virker som en nedstrøms transkriptionsfaktor i Wnt pathway 3,4,5. I kernen, har β-catenin vist sig at øge transkriptionen af flere EMT-relaterede faktorer, herunder Twist, Slug, fibronectin, og en række af matrixmetalloproteaser 3,6.

Ud over Wnts har TGF-β-signalering vist sig at spille en væsentlig rolle i EMT induktion både under normal udvikling og i sygdomstilstande 7,8,9. TGF-β er involveret i EMT, der opstår under ganen dannelse og i udviklingslandene hjerte 10. Det har også været impliceret i fibrose og cancer progression til metastase 7.

Den her beskrevne PR-procedureovides ensartet induktion af EMT i en række forskellige celletyper uden behov for genetisk manipulation. Denne procedure bruger en cocktail af E-cadherin, sFRP-1, og DKK 1 blokerende antistoffer og Wnt-5a og TGF-β1 rekombinante proteiner. Denne cocktail er designet til at blokere E-cadherin-baserede vedhæftning samtidig fremme Wnt og TGF-β-signalering. Muligheden for robust EMT induktion er afgørende for at forstå biologi denne proces, og hvordan man kan manipulere det til terapeutiske formål. Nuværende fælles markører for EMT, E-cadherin (nedreguleret i EMT) og Vimentin (opreguleret i EMT), kan findes co-udtrykt i kræft, og dermed ikke giver den bedste diagnostiske markører af potentielle metastatiske celler 12. Vigtigere er det, at analysen af en række celletyper, der har gennemgået EMT er nyttigt at udvikle fælles genekspression signaturer, der kan anvendes til diagnostiske formål i kræft og fibrose 11. Derudover har de seneste undersøgelser vist, at EMT kan spille en rolle i dannelsen af kræft stamceller, hvilket tyder på, at celler, der har undergået EMT kan være nyttige for lægemiddel-screening til at identificere forbindelser, der kan målrette disse celler 13.

Protocol

1.. Induktion af EMT

  1. Varm dyrkningsmedier til 37 ° C i et vandbad. Kulturen medier, der anvendes, er de samme som de medier, der anvendes til standard kultur af dine celler af interesse. For eksempel er A549 human lungecarcinom-cellelinje dyrket i Kaighn F12 suppleret med 10% kalvefosterserum og 2 mM glutamin.
  2. Harvest celler af interesse ved hjælp af en dissociation løsning (f.eks TrypLE Express).
  3. Suspendere cellerne i foropvarmede dyrkningsmedier i en 15 ml konisk rør.
  4. Centrifugeres cellesuspensionen ved 400 xg i 5 min.
  5. Fjern forsigtigt supernatanten ved at hælde ned i en affaldsbeholder.
  6. Suspender cellepelleten i foropvarmede dyrkningsmediet.
  7. Tæl levedygtige celler ved hjælp af trypanblåt. Fjerne en prøve af cellesuspensionen og fortyndes i 0,4% trypanblåt-opløsning. Placer 10 ul af den fortyndede prøve på et hæmocytometer og tælle levedygtige celler (celler, der ikke skifter til blå). Brug celletal at bestemme celle density i din løsning.
  8. Plate celler på vævskultur behandlede plader eller kolber ved 0,9-1,0 x 10 4 celler pr cm2. For eksempel, 0,5 x 10 6 celler udpladet i en 100 mm plade i dyrkningsmedier indeholdende 1X EMT Inducing Media Supplement (6 ml medier per 100 mm plade).
  9. Kultur belagte celler i en 37 ° C / 5% CO 2-inkubator. Monitor cellemorfologi dagligt.
  10. Tre dage efter plating, fjerne medier og erstatte med frisk forvarmet dyrkningsmedier indeholdende 1X EMT Inducerende Media Supplement. Fortsæt til kulturen i et 37 ° C / 5% CO2-inkubator.
  11. Fem dage efter udpladning celler er klar til analyse. Cellemorfologi visualiseres ved omvendt lysmikroskopi.

2. Analyse af Protein Expression ved Immuncytokemi

  1. Fremstille sterile 12 mm dækglas i en 24-brønds plade ved at placere dækglas i en petriskål indeholdende 95% ethanol. Fjern forsigtigt dækglas fra ethanol osning en nål og buede pincet og flamme steriliseres. Anbring steril dækglas i en brønd i en 24-brønds plade. Gentag med de resterende dækglas.
  2. Forbered celle suspension som beskrevet i afsnit 1,1 - 1,7.
  3. Plate 1,6 x 10 4 celler / brønd i 0,5 ml forvarmet dyrkningsmedier indeholdende 1X EMT Inducing Media Supplement.
  4. Vokse og foder-celler som beskrevet i afsnit 1,9-1,11.
  5. Fem dage efter udpladning, fjern medier og lave cellerne med 300 ul / brønd af 4% paraformaldehyd i 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS) i 20 minutter ved stuetemperatur.
  6. Fjern fiksativ og skyl celler 2x med 1X PBS, 500 ul / brønd.
  7. Cellerne inkuberes i 400 ul / brønd blokeringsbuffer (1X PBS indeholdende 1% bovint serumalbumin (BSA), 10% normal donkey serum, og 0,3% Triton X-100) i 1 time ved stuetemperatur.
  8. Inkuber i den primære antistof ved fabrikanterne anbefalede koncentration i 400 ul / brønd blokeringsbuffer i 3 timer ved rumtemperature eller natten over ved 4 ° C. Ved brug af et primært antistof direkte konjugeret til et fluorokrom, inkuber prøverne i mørke.
  9. Vask cellerne tre gange i 500 ul / brønd af 1X PBS indeholdende 0,1% BSA i 5 minutter hver vask. Når du bruger et primært antistof direkte konjugeret til et fluorokrom, gå direkte til trin 2.12.
  10. Cellerne inkuberes i sekundært antistof ved producentens anbefalede koncentration i 400 ul / brønd af 1X PBS indeholdende 1% BSA i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
  11. Vask cellerne tre gange i 500 ul / brønd af 1X PBS indeholdende 0,1% BSA i 5 minutter hver vask.
  12. Hvis det ønskes, kontrastfarve kerner med DAPI-opløsning.
  13. Skyl celler i deioniseret vand og montere dækglas med forsiden nedad på et dias ved hjælp af montering medier.

Representative Results

. EMT inducerende dyrkningsbetingelser beskrevet her tilvejebringe en robust metode til induktion af EMT i en række forskellige celletyper figur 1 og 2 demonstrere morfologi og markør ekspressionsniveauer for 4 forskellige humane cellelinjer: T98G glioblastoma-celler, HT29 colon-adenocarcinom-celler , A549 lungecarcinomceller og MCF10A brystepitelceller celler. Celler, der blev behandlet med EMT Inducing Media Supplement ændret fra en klassisk epitelial morfologi (figur 1A - 1D) til en mesenchymale, spindelformet morfologi (figur 1E - 1 H). EMT-inducerede celler synes mindre tæt pakket ind i snævre kolonier i forhold til ikke-inducerede celler. Uinduceret MCF10A prøver indeholdt tætpakkede klynger omgivet af mere løst pakkede celler. Disse tætpakkede klynger var E-cadherin positiv (Figur 2D) og forsvandt efter behandling med EMT Inducerende Media Supplement (figur 2H).

EMT blev også vurderet ved nedregulering af epitel-markører og opregulering af mesenchymale markører. Nedreguleringen af E-cadherin ekspression typisk observeres efter EMT induktion i forskellige celletyper 3,4 Figur 2 viser overflade ekspression af E-cadherin i størstedelen af ubehandlede celler (figur 2A - 2D, rød). I forhold til dens fravær efter EMT induktion (figur 2E - 2H; rød). En cellelinie T98G, blev fundet at have et ekstremt lavt basisniveau af E-cadherin før EMT induktion, som udelukker dens analyse. Opregulering af mesenkymale markør, Fibronektin, var også synlig efter induktion med EMT Inducerende Media Supplement (figur 2A - 2D versus figur 2E - 2H, grøn).

Ekspressionsniveauerne af E-cadherin og Fibronektin set med immuncytokemiblev bekræftet ved western-blotting af den samlede cellelysater (figur 3). Den western blot bekræftet nedregulering af E-cadherin og opregulering af Fibronektin udtryk set med immuncytokemi. Båndene blev kvantificeret ved hjælp af densitometri og normaliseret til GAPDH at bestemme relative fold ændring efter EMT induktion. E-cadherin niveauet blev nedsat 6,4 og 3,4 gange i A549 og MCF10A celler. Fibronectin-niveauer blev forøget 4,6, 4,1 og 2,3 gange i T98G, A549 og MCF10A celler. Selv western blot ikke viser signifikant reduktion af E-cadherin protein niveauer i HT29-celler efter EMT induktion, immuncytokemi resultater viser en reduktion i overfladen ekspression af E-cadherin (figur 2B versus 2F), der er i stand til at skelne i Western-blotting af de samlede cellelysater.

For yderligere at evaluere EMT status, yderligere kendt markørs for EMT blev analyseret før og efter-EMT induktion. I overensstemmelse med tidligere resultater blev E-cadherin nedreguleret i alle cellelinjer undersøgt, hvilket indikerer, at EMT blev induceret. Desuden mesenchymale markører, vimentin og sneglen blev opreguleret i A549, T98G og MCF10A-celler efter behandling med EMT Inducing Media Supplement (figur 4). HT29-cellelinien ikke vise ekspression af disse mesenchymale markører, enten med eller uden EMT induktion (data ikke vist), som kan indikere, at disse celler udnytte alternative veje for EMT induktion.

Skønt TGF-β er tilstrækkelig til at inducere EMT i visse celle sammenhænge 7,8,9, behøver andre celletyper ikke reagerer udelukkende tilsætning af TGF-β 14. MCF7 humane brystkræftceller og PANC-1-humane pancreascarcinom celler er begge rapporteret ikke at reagere på TGF-β signalering alene 14. At afgøre, om begge linjer kan undergå EMT i vi troo Cellerne blev dyrket i nærvær af EMT Inducing Media Supplement. Celler blev stimuleret med rekombinant TGF-β1 alene ved fusion i EMT Inducerende Media Supplement. Disse celler beholdt deres epitelial morfologi, der består af tætpakkede kolonier af celler (data ikke vist) og overflade E-cadherin niveauer blev magen til dem, der ses i kontrol-celler (figur 5C og 5D versus 5A og 5B). I modsætning hertil celler stimuleret med EMT Inducing Media Supplement viste et drastisk fald i overflade E-cadherin-niveauer (figur 5E og 5F). Disse celler opnås også en mere mesenchymale morfologi, som cellerne blev mindre kompakt og mere spindel-lignende (data ikke vist). Disse resultater viser, EMT inducerende metoden beskrevet her er i stand til at fremme EMT morfologi og markørekspression ændringer i celler typisk resistente over for TGF-β-induced EMT.

Ud over ændringer i markør ekspression, et andet kendetegn af mesenchymal-celler er deres evne til at migrere og invadere. Migration og invasion af celler dyrket med eller uden EMT Inducing Media Supplement blev analyseret under anvendelse af 96-brønds BME Cell Invasion Assay ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev celler podet på plader med 96 brønde (50.000 celler / brønd) indeholdende filterindsatse med 8,0 um porer. Efter 48 timer blev migration vurderet ved calcein AM-farvning af celler, som var migreret gennem filteret. Hver prøve blev testet tredobbelt to gange med lignende resultater. Repræsentative resultater fra et eksperiment er vist i figur 6A. Statistisk signifikante stigninger (p-værdi <0,003) i celle migration blev set med både A549 og PANC-1-celler efter EMT induktion. For at vurdere evnen af disse celler til at invadere (dvs. migrere gennem ekstracellulær matrix), det samme assay varudføres med en basalmembran ekstrakt-coated filter. EMT-inducerede celler viste en statistisk signifikant (p-værdi <0,001) stigning i invasions kapacitet sammenlignet med ubehandlede celler som set i figur 6B.

Den robuste induktion af EMT er nyttigt til analyse af genekspression ændringer og signalering, der finder sted i disse celler. Antistof-baserede array analyse under anvendelse af lysater fra både behandlede og ubehandlede celler er en metode til at analysere ekspressionsniveauerne af forskellige molekyler i en enkelt prøve. Som et eksempel, analyserede vi niveauerne af phosphorylerede MAPK familiemedlemmer i lysater fra ikke-inducerede og EMT-induceret MCF7-og A549-celler ved hjælp af Proteome Profiler Humant Phospho-MAPK Array Kit. 7 viser repræsentative data fra ét array array blev kørt to gange fra uafhængige EMT-induktion behandlinger med lignende resultater. Figur. Begge celletyper udviste øget phosphorylering af CREB (S133), ERK1 (T2 02/Y204), og ERK2 (T185/Y187) i EMT-inducerede celler sammenlignet med kontrolgruppen. Forskelle i signalering hændelser blev observeret mellem de to celletyper så godt. A549-celler viste en stigning i GSK-3 β (S9) fosforylering, mens MCF7 celler viste øget p70S6k (T421/S424) phosphorylering.

Figur 1
Figur 1. Mesenchymale morfologi induktion efter stimulering med EMT Inducing Media Supplement (A - D). Epithelial morfologi i de fire celletyper angivet efter dyrkning i 5 dage i standard dyrkningsmedier uden EMT Inducing Media Supplement (E - H). Mesenchymale morfologi i fire celletyper angivet dyrket med EMT Inducing Media Supplement i 5 dage.

nt "fo: keep-together.within-side =" altid "> Figur 2
Figur 2. Nedregulering af epitelial markør ekspression og opregulering af mesenchymale markør ekspression i EMT-inducerede celler. Celler blev farvet med immunofluorescens til påvisning af ekspression af epitel markering, E-cadherin (rød), og mesenchymale markering, fibronectin (grøn). (A - D) Kontrol celler dyrket uden EMT Inducing Media Supplement 5 dage (E -. H) Celler dyrket med EMT Inducing Media Supplement i 5 dage. Alle celler er modfarvet med DAPI (blå).

Figur 3
Figur 3. Bekræftelse af epitel-og mesenchymale markør udtryk med western blot en . alysis Western blot af totale cellelysater af de fire celletyper angivet, behandlet med (EMT) eller uden (-) EMT Inducing Media Supplement i 5 dage. Bands til E-cadherin, Fibronektin og GAPDH lastning kontrol er som angivet til venstre. Størrelsen markør er som angivet til højre.

Figur 4
Figur 4.. Opregulering af mesenchymale markører, vimentin og sneglen i EMT-inducerede celler. Celler blev farvet ved flerfarvet immunofluorescens til påvisning af ekspression af epitel markering, E-cadherin (grå) og mesenchymale markører, vimentin (grøn) og sneglen (rød) . (A - C) Kontrol celler dyrket uden EMT Inducing Media tillæg for 5 dage. (D - F) Celler dyrket med EMT Inducing Media Supplement i 5 dage.

lways "> Figur 5
Figur 5. Induktion af EMT i TGF-β1 ikke-responsive celler. (A og B) Celler dyrket med medier alene i 5 dage. (C og D) Celler dyrket i medier indeholdende 10 ng / ml TGF-β1 i 5 dage. (E og F) Celler dyrket i EMT Inducing Media Supplement i 5 dage. Alle celler er farvet for E-cadherin ekspression (rød) og modfarvet med DAPI (blå).

Figur 6
Figur 6. EMT-inducerede celler har øget migration og invasion kapacitet. A. Gennemsnitligt antal celler, der migrerede gennem en 8 um porefilter efter inkubation i 48 timer. B. Gennemsnitligt antalceller, der var i stand til at invadere gennem en 8 um porefilter overtrukket med basalmembran ekstrakt efter inkubation i 48 timer. Fejllinjer angiver standardafvigelsen over 3 brønde.

Figur 7
Fig. 7. Antistofbaseret vifte ekspressionsanalyse EMT induktion. Lysater fra A549 (A og C) og MCF7 (B og D)-celler dyrket med eller uden EMT Inducing Media Supplement blev anvendt til array analyse vha. Proteome Profiler Humant Phospho-MAPK Array Kit. Steder fremhævet i A og B blev derefter kvantificeret under anvendelse af densitometri. Sammenligninger af un-induceret til EMT-inducerede lysater er vist i de tilsvarende søjlegrafer nedenfor (C og D). Klik her for at se større figur </ A>.

Discussion

Tidligere metoder til EMT induktion har generelt anvendt TGF-β stimulering eller gensplejsning. Skønt TGF-β alene har vist sig at inducere EMT i nogle celletyper, er det nu blevet vist, at TGF-β er nødvendig for EMT, men det er ikke tilstrækkeligt i alle celletyper 6,14. Brug genetisk modifikation for EMT induktion er tidskrævende og arbejdskrævende. Den her beskrevne metode anvender en kombination af faktorer, herunder, anti-human E-cadherin, anti-human sFRP-1, anti-human Dkk-1, rekombinant humant Wnt-5a og rekombinant human TGF-β1 til pålideligt fremkalde EMT. Denne kombination af faktorer er designet til at blokere e-cadherin-baserede friktion, et afgørende skridt for EMT induktion 4 og forbedre Wnt signalering ved at tilføje Wnt-5a protein samt bruge blokerende antistoffer til Wnt-hæmmere, sFRP-1 og Dkk -1. Wnt og TGF-β-signalering har vist sig at virke i en autokrin sløjfe til at inducere og vedligeholde mesenchymale celler state 6. Denne induktion metode undgår genmanipulation og er mere effektiv end anvendelse af TGF-β alene. Vigtigere er det, vi er i stand til at observere induktion af EMT i celletyper, herunder MCF7 og PANC-1-celler, som tidligere har vist sig ikke alene at reagere på TGF-β stimulation (figur 5) 14.

Celler behandlet med EMT Inducing Media Supplement show mindre kompakt og øget spindelformet morfologi (figur 1). Derudover er der et fald i overfladen E-cadherinekspression samtidig med en stigning i fibronectin udtryk, som er kendetegnende for EMT (fig. 2 og 3). Yderligere mesenchymale markører, såsom vimentin og sneglen er også opreguleret i EMT inducerede celler sammenlignet med ikke-inducerede kontroller (figur 4). Øget migration og invasion evner er de vigtigste funktionelle egenskaber mesenchymalceller. I in vitro (figur 6).

Denne simple metode til EMT induktion er nyttig til undersøgelse af EMT signalering som påvist ved hjælp af antistof-array expression i figur 7 viste. Forskellige celletyper kan sammenlignes præ-og post-EMT induktion at opnå fælles udtryk signaturer forbundet med EMT, såsom en stigning i phosphoryleret CREB og ERK1 / 2 ses i både MCF7-og A549 EMT-inducerede celler. S133 phosphorylering af CREB stimulerer DNA-binding og er blevet vist at virke nedstrøms for TGF-β1-inducerede EMT 15. ERK1 / 2 phosphorylering er også blevet vist at virke nedstrøms for TGF-β1-inducerede EMT 16. Forskelle i signalveje blandt celletyper kan også blive belyst som set med stigningen i GSK-3β fosforylering i A549 celler versus p70S6K phosphorylering i MCF7. GSK-3β phosphorylering ved serin 9 reducerer den funktion, og GSK-3β er blevet vist at inhibere pro-EMT transkriptionsfaktor sneglen 17. I modsætning hertil p70S6k inducerer sneglen aktivitet og phosphorylering er forbundet med aktivering af dette protein 18.

Samlet set ligetil og pålidelig induktion af EMT, især i cellerne tidligere har vist ikke at reagere alene på TGF-β, er nyttigt for forståelsen af ​​biologi EMT, identificere fælles udtryk signaturer til brug som prognostiske markører, samt udvikling og evaluering af nye lægemidler til behandling af kræft og fibrotisk sygdom.

Disclosures

R & D Systems, Inc. er en for-profit, offentlig virksomhed.
Produktion og fri adgang til denne artikel er sponsoreret af R & D Systems, Inc.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende Julia Hatler og Martin Ramsden (R & D Systems) for nyttige drøftelser og manuskript gennemgang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Epithelial cells of interest We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1
EMT Inducing Media Supplement R&D Systems CCM017
Recombinant Human TGF-β1 R&D Systems 240-B Used at 10ng/ml
Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody R&D Systems NL648R Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry
Anti-E-Cadherin R&D Systems MAB1838 Used at 0.1 μg/ml for western blotting
Anti-Fibronectin R&D Systems MAB1918 Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting
Anti-GAPDH R&D Systems AF5718 Used at 0.2 μg/ml for western blotting
Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody R&D Systems NL009 Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry
Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody R&D Systems HAF109 Used at 1:2000 for western blotting
Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody R&D Systems HAF007 Used at 1:2000 for western blotting
EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit R&D Systems SC026 Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.
96 Well BME Cell Invasion Assay R&D Systems 3455-096-K This kit was used according to the manufacturer's recommendations.
Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit R&D Systems ARY002B This kit was used according to the manufacturer's recommendations19.
Mounting Media R&D Systems CTS011
0.4% Trypan Blue Solution Life Technologies 15350-061
1X Phosphate Buffered Saline (PBS)
95% Ethanol
Bovine Serum Albumin Sigma A3311
Normal Donkey Serum Jackson Labs 017-000-121
Triton-X-100 Roche Molecular Biochemicals 789-704 Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution
Paraformaldehyde Sigma P6148 Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.
DAPI Solution Sigma D9542 Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.
Fine pointed curved forceps Thermo-Fisher Scientific 08-875
12 mm coverslips Carolina Biological 633009
Nonfat dry milk Used at 5% in TBST for blocking in western blotting
TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20] For western blotting blocking and washing
PVDF Membrane For western blotting
4-20% SDS-page gel For western blotting
ECL substrate For western blotting
15 ml conical tubes
Plates/flasks, tissue culture treated
24-well plates, tissue culture treated
Pipettes / pipette tips
Pipet Aid / pipets
Hemocytometer
37 °C Water Bath
37 °C/5%CO2 Incubator
Centrifuge
Inverted light microscope
Fluorescence microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
  2. Thiery, J. P. Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).
  3. Heuberger, J., Birchmeier, W. Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).
  4. Onder, T. T. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Research. 68, 3645-3654 (2008).
  5. Tian, X. E-cadherin/β-catenin complex and the epithelial barrier. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-6 (2011).
  6. Scheel, C. Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast. Cell. 145, 926-940 (2011).
  7. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Research. 19, 156-172 (2009).
  8. Kasai, H. TGF-β1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition. EMT). Respiratory Research. 6, 56-70 (2005).
  9. Miettinen, P. J., et al. TGF-β induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors. Journal of Cell Biology. 127, 2021-2036 (1994).
  10. Pelton, R. W., et al. Differential expression of genes encoding TGFs β1, β2, and β3 during murine palate formation. Dev. Biol. 141, 456-460 (1990).
  11. Taube, J. H. Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes. PNAS. 107, 15449-15454 (2010).
  12. Roussos, E. T., et al. AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment. Cancer Research. 70, 7360-7364 (2010).
  13. Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).
  14. Brown, K. A. Induction by transforming growth factor-β1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro. Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).
  15. De Falco, V., et al. CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells. Cancer Research. 72, 1449-1458 (2012).
  16. Xie, L. Activation of the Erk pathway is required for TGF-β1-induced EMT in vitro. Neoplasia. 6, 603-610 (2004).
  17. Bachelder, R. E., et al. Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).
  18. Pon, Y. L. p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells. Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).
  19. Wegner, G. J., et al. Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays. J. Vis. Exp. , (2012).

Tags

Molekylær Biologi cellebiologi biokemi Biomedical Engineering stamcellebiologi kræft biologi medicin bioteknologi anatomi fysiologi biologi (generelt) patologiske tilstande tegn og symptomer sår og skader neoplasmer diagnose Therapeutics Epithelial til mesenkymale overgang EMT cancer metastase kræft stamceller celle analyse immunhistokemi
Induktion og analyse af Epithelial til Mesenchymale Transition
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, Y., Herr, G., Johnson, W.,More

Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition. J. Vis. Exp. (78), e50478, doi:10.3791/50478 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter