Summary
我们描述了用于研究的13.56MHz的射频（RF）的相互作用的协议电领域，在这两种非生物和生物系统（ 体外 / 体内 ）纳米金胶体。这些相互作用正在研究用于癌症治疗的应用。
Abstract
癌症疗法的毒性较小和侵入比现有的同行是非常可取的。使用射频电领域的深入渗透到体内，引起毒性最小的，目前正在研究作为非侵入性癌症治疗的可行手段。可以预想到的RF能量与内在化纳米粒子（纳米粒子）的相互作用可以解放热，然后可以引起细胞的过热（热疗），最终结束于细胞坏死。
在非生物系统的情况下，我们提出有关量化由高浓度的NP胶体释放的热量详细的协议。对于生物系统，在体外实验的情况下，我们描述了必须坚持，才能有效地揭露癌细胞射频能量而不散装媒体加热工件显著模糊数据的技术和条件。最后，我们给出了一个详细的方法f或体内小鼠模型异位肝癌肿瘤。
Introduction
射频能量的生物组织（由于其固有的介电常数）的吸收导致在升高组织温度作为时间的函数，这最终导致通过热疗细胞死亡。据推测，癌症热疗可通过使用靶向的纳米材料内化的癌细胞内，并作为射频热换能器，使相邻的健康，正常细胞完整的优化。有几份报告已经表明，各种纳米粒子可作为有效的射频热源，其帮助癌症坏死1-4。
在这些方面，金粒子（金纳米粒子）3-5，碳纳米管1，和量子点6,7已经表现出令人兴奋的特性在体外和体内射频实验时使用。虽然当暴露在射频领域的这些纳米粒子的加热机制的确切性质仍存在争议，一系列用金纳米粒子基础实验寄予了很大意义上都NP大小和聚集状态。它表明，直径<10nm的金纳米粒子仅当暴露于射频场8将加热。此外，当金纳米粒子聚集该加热机构被显著衰减。这种聚合条件也有效的体外模型放置在endolysomal细胞车厢内优化金纳米粒子的胶体稳定性的有效射频治疗4中的重要性。然而，用于收集和评估该数据的技术和实验原理可能会产生问题，特别是在从NP胶体验证射频热访问的情况下。
一些报告显示，背景离子悬浮液，该纳米颗粒被悬浮在焦耳加热可以是射频产热的主要来源，而不是粒子本身9-12。尽管我们最近的一篇论文8已经验证吨他使用RF相互作用从直径小于10纳米的金纳米粒子产生热量，我们的目标是在这篇文章中详细描述了这些协议。
我们还证明了协议和评估金纳米粒子作为体外和体内实验为肝癌模型温热热剂中均有效性所需要的技术。虽然我们主要集中于柠檬酸封端的纳米金胶体简单，相同的技术可以被应用到其他金纳米粒子的杂交如抗体和化疗结合的复合物。通过遵循这些原则，实验者应该希望能够快速评估对于任何纳米材料是一种有效的射频感应热温热剂的潜力。
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Protocol
一个完整的实验概述如图1所示。
进一步的细节被描述在下面的步骤1月3日。
1。 NP胶体评估射频加热：金纳米粒子为例。
- 在一般情况下，对于每个样品NP正在研究中，首先通过离心过滤洗涤样品数次，用去离子（DI）水，以去除背景离子和污染物。所有离子和污染物将被从什么时候被洗出液也有类似的射频加热速率（HRS）为去离子水在金纳米粒子悬浮液中除去。此纯化过程还允许粒子以获得更高的浓度。值得注意的是，尽管在本例中使用金纳米粒子，基本原理可以应用到其它的NP材料。
- 作为一个例子，净化的500ml瓶的直径为5nm市售的金纳米粒子，然后使他们受到电连接的一个13.56MHz的射频场ELD强度90千伏/米。
- 拿〜125毫升从六个50 kDa的离心过滤管之间的股票金纳米粒子溶液和分裂。离心机在3000转每分钟。 2分钟5秒。更多原液过滤除去缓冲和填充的过滤器。重复，直到所有500毫升已被过滤。
- 更换过滤缓冲液DI水相似的体积和重复约8倍（或直到滤波后的RF缓冲器的HR等同于DI水中）。注意，紫外 - 可见分析也可以用来监视污染物的吸收峰。一旦缓冲区污染物已完全清除，吸管约0.5毫升去离子水到每个过滤器和通过反复吹打重悬金纳米粒子。这应该完全从过滤器中删除金纳米粒子，并允许充分重悬。结合所有六个悬浮成一个15毫升的Eppendorf管中。
- 一旦金纳米粒子被提纯和浓缩，用ICP-OES和/或ICP-MS，UV-vis和Zeta电位上concentratio数据分析样本n和NP稳定，分别为。 SEM和/或TEM分析，也可用于获得形态学数据。对这些技术的详细的样品制备可以在文献4中找到。
- 通过在先前的研究中8所述的Kanzius射频系统或该系统的派生，放置一个1.3毫升圆柱形石英比色皿，使空气中的射频电场（无样品存在）将〜90千伏/米的反应杯内。对于一个标准的盐水样品（0.9％NaCl）中的电场将减少到〜1.1千伏/米。这些是用来允许在不同系统之间进行的比较的近似条件。
- 吸移管130的纯化的金纳米粒子胶体到石英比色皿1000毫克/升样品的溶液和该引入到RF场。这可以通过使用一个定制的聚四氟乙烯样品架来完成。样品暴露于RF场为一个周期120秒或直至样品达到70℃，以防止电弧或快速沸腾。钙利用红外相机及相关软件pture热成像数据（以及控制区）。重复此步骤三次。
- 通过另一个50 kDa的离心过滤器过滤样品，从去离子水缓冲液中提取的金纳米粒子。缓冲区重新暴露于RF场，再次三次。在金纳米粒子胶体和背景DI水缓冲器之间的HR的差异决定了HR由于金纳米粒子本身。预计取得的HR〜0.3°C /秒和0.05℃/秒，得到〜0.25℃/秒的金纳米粒子相关的人力资源。重悬从过滤器的剩余金纳米粒子130毫升水中的体外/体内实验。
2。纳米粒子辅助射频热疗诱导： 体外研究
- 这些体外研究可以应用于任何类型的形成2D单层癌细胞类型。在这个实验中使用派生的Hep3B细胞肝癌。
- 板〜50,000 CELLS在前面3口井12孔板用1毫升生长培养基中。重复此6倍（使用三个板块为NP的研究和三大板块作为对照）。孵化在37.5℃，引入纳米颗粒前24小时。使用生物安全柜紫外线灯照射5分钟消毒粒子第一。
- 在每孔中介绍加入0.1ml 1000 mg / L的金纳米粒子的溶液，留下另外24小时。加入0.1毫升的水成三个控制细胞板的每个孔中，并放置24小时。
- 后24小时已经过去了，吸出细胞培养基，用PBS洗涤以除去任何表面结合的金纳米粒子。更换细胞培养基。细胞现在已经准备好为RF暴露。
- 将射频场中的每个12孔细胞组。等到细胞已经冷却到31°C。打开RF发生器和暴露为3.5分钟。细胞培养基的最终温度为〜37℃。关闭RF场。取下电池，并将其放置在孵化器进行分析前24小时。
- <LI>从孵化器和吸细胞介质中删除单元格。加1.6毫升细胞培养基到每个孔中，以及在0.4毫升MTT试剂。孵育细胞4小时。吸媒体和替换用2毫升二甲基亚砜（DMSO）的。将电池板的长凳上摇臂，离开10分钟，使DMSO溶解的MTT试剂。最后，用酶标仪如SPECTROstar纳米板读取器移液管加入100μl每孔加入到96孔板中并光学读取以及在570nm处。
3。纳米粒子辅助的射频诱导热疗： 体内研究
- 这些体内研究可以应用于任何类型的癌症，形成实体瘤中原位或异位小鼠模型。本实验采用的Hep3B肝癌细胞在异位瘤BALB-C裸鼠模型。
- 注：所有体内实验均符合所有相关指引，法规和监管机构执行。此外，得克萨斯大学MD安德森癌症中心实验动物管理和使用委员会（IACUC）的指导和批准下进行演示的协议。
- 生长细胞的适当数量（〜100 k）在第一个组织培养瓶用适当的生长培养基中。孵育在37℃的培养箱中5％CO 2的细胞培养物的持续时间。
- 处理细胞，用胰蛋白酶（从烧瓶中分离），并产生2百万个细胞每25微升的溶液中。添加基质胶的等量（冰），调匀，以准备最后的注射液。注入此溶液到鼠标的背面所需的位置，然后等待适当的时间量对肿瘤生长到所需的大小（2-4周对大多数细胞）。 RF暴露之前，BALB-c裸鼠应承担固体异位瘤0.5-1厘米直径。
- 制备的小鼠中使用（在这种情况下的BALB-C裸鼠）由ANAEsthetizing他们用氯胺酮和甲苯噻嗪通过IP注射的溶液。当小鼠入睡，让他们在一个温度控制腔在37°C 20只小鼠中总将是需要的，所有的轴承同样大小的肿瘤。十只小鼠将与结合和未经金纳米粒子用于（后者仅PBS注射）而剩余的10只小鼠将射频曝光和未射频暴露的对照组之间进行分割：两组无金纳米粒子射入。
- 一旦正确麻醉，注入纳米金直接用1毫升注射器用27号针头的肿瘤。在金纳米粒子的溶液应该是在200毫克/升的金浓度在0.1ml PBS中。注射后，用棉签手术吸收血液和擦拭注射部位用酒精擦拭。
- 然后挂接鼠标放在射频发生器的接收头进行处理。鼠标必须定位，以使所述肿瘤是最接近于传输头。屏蔽并非要处理的区域，以及敏感略去，如眼睛，耳朵，脚趾和地区，铜带。可以肯定的是，这样没有电荷积聚时铜带适当接触接地平面。另外，在曝光区域必须具有至少1cm大于所需治疗部位的大小的间隙。
- 位置红外热成像摄像机，使肿瘤及其治疗区域是可见的。打开射频5分钟。记录所产生的温度曲线。如果治疗达到立即温度高于42℃停止治疗。
- 经过RF暴露恢复小鼠从麻醉中一个温暖的室内，直到他们是有意识的。
- 重复实验，相同的小鼠48小时后（步骤3.3.1 - 3.4.1）。
- 实验结束后，安乐死小鼠按照机构的协议和程序。记录肿瘤的重量。组织学分析解决使用福尔马林的肿瘤和它们嵌入在石蜡。肿瘤切片通常机智染色ħ苏木精伊红和相关的衡量治疗效果， 如 Ki-67的目标，裂解的caspase-3 等 。
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Representative Results
1。评估的NP胶体的射频加热：纳米金作为例子。
下一节1.1后 - 1.2.3期望有5 nm和10 nm的金纳米粒子的直径高度集中，稳定，纯净的解决方案。从500毫升如购买的原液，期望获得至少为4毫升溶液在1000毫克/升的浓度该金纳米粒子，并在此浓度的背景DI水缓冲溶液之间的HR的差值应为〜0.25℃/秒和0.1℃/秒为5 nm和10 nm的金纳米粒子，分别为显示在图2。
2。纳米粒子辅助射频热疗诱导： 体外研究
结果应理想地表明，细胞暴露于其中已经内化金纳米粒子的RF场是比非金纳米粒子的RF暴露的细胞不太可行。这种预期的效果，例如，在图3中突出显示。
3。纳米颗粒ticle辅助射频感应热疗： 在体内研究
在注射后的PBS悬浮金纳米粒子的和〜2-3周的射频辐射处理后，谥分析应该揭示控制肿瘤的生长和/或肿瘤的大小/质量下降（ 见图4）。也可能有直接的细胞热消融的证据。然而，这可能并非如此简单，柠檬酸盐封端的纳米金远未优化，并趋向于肿瘤组织内聚集。如可以在最近的出版物中可以看出，纳米金必须非聚集细胞内细胞器内，以提高射频诱导的细胞毒性。此外，最近的研究表明化疗药物如吉西他滨是缀合到纳米金优化射频治疗。研究者仍然可以使用这些协议却直接就我们组'以前的工作比较自己的金纳米粒子复合物的有效性。
图1的试验概要。金纳米粒子加热评价 ：作为购买的金纳米粒子（1.A）被放置在一个50 kDa的过滤器（1.B）并离心下来到金纳米粒子从滤液中分离出来（1.C）。这允许高度浓缩和纯化的金纳米粒子，以形成（1.d中）。然后将样品放置到使用安装在一个可调节的旋转台（1.E）特氟隆样本保持器的射频系统。金纳米粒子的加热速率，以及其它四个控制区域，利用红外相机（1.F）进行体外的协议 。的Hep3B肝肿瘤细胞生长在前面3-井的几个12孔细胞包所示在2.A（细胞式包装使用量DEP结束于什么样的实验者希望在所应用的射频功率，金纳米粒子浓度，控制等 ）方面进行调查。每个12孔板中，然后进行RF场（2.B）。虽然没有必要为最佳的射频暴露时间已经确定使用红外摄像机（2.C）的介质温度也可以记录在体内的协议 ：BALB-C小鼠异位肝肿瘤（3.A）进行金纳米粒子的瘤内注射和暴露在射频系统（3.B）数分钟。铜带被用于地面的小鼠中，为了防止皮肤的燃烧。石英比色皿充满了金纳米粒子也显示旁边的鼠标来验证射频辐射。肿瘤区域应具有比鼠标的其余部分更高的温度下，通常会出现红色的IR图象（3.C）。 YS“>
图2。 5 nm和10 nm的金纳米粒子直径的解决方案，升温速率（℃/秒）。由于每个协议的说明，加热速率为确定纳米金与上清液（纳米金+ SN），金纳米粒子过滤掉，这样只有上清存在（SN） ，而这两个（差）之间的加热速率的差异。平均升温速率是从三个不同的实验（A，B和C）。
图3。 。理想化热疗杀伤活力（MTT法）显示的是四种细胞实验：对照组（无RF），只有金纳米粒子（无RF），只有射频和RF与另外的细胞内化金纳米粒子（A，B，C和D，分别为）。
图4。小鼠肿瘤异位谥分析，左手的肿瘤是可以预期从两个对照样品，即无射频，没有金纳米粒子注入）。中间的肿瘤显示了当单独进行的RF场的大小略有下降。然而，右侧的肿瘤表明，RF +金纳米粒子联合治疗可以减少/甚至进一步控制肿瘤的生长。
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Discussion
这些协议允许实验者充分分析的程度的纳米材料（在这种情况下金纳米粒子）可以增加射频诱导的高热用于癌症治疗。第一个协议，专门处理与分析产热量从高度集中及纯化的金纳米粒子样品。尽管其它研究小组报道的产热主要从该金纳米粒子悬浮于而不是金纳米粒子本身9-11的缓冲器，它们的射频系统中使用的较低的金纳米粒子的浓度，直径> 10nm时，以及具有较低的RF工作功率电电场强度<90千伏/米的太低看到来自金纳米粒子任何明显的射频加热效应。只有遵循本报告中所列的协议和参数可以在实验者观察到纳米级的发热现象。
体外部分允许研究了蜂窝射频接口的NP开发优化的射频/ NP引起的高热。 BEF矿石此外金纳米粒子和射频暴露，你应该期望有相关的癌症细胞系（在这种情况下的Hep3B）的一个可行的二维层生长。然而，需要正确的RF暴露时间对于每种细胞系这些实验之前，通过在不同时间点的细胞暴露于RF场被规定，例如 2 -8分钟），并在寻找自己的生存能力更新24小时后。正确的RF暴露时间使用应该是那里的细胞〜80％是可行的。在Hep3B细胞的情况下，这被认为是〜3.5分钟。
首选的生存力的最简单的测定的标准3 - （4,5 - dimethylthiazol2 - 基）-2.5-二苯基溴化（MTT）测定法，尽管另一个实验，可能需要在预期的纳米粒子将与测定试剂相互作用（因为是与碳纳米管13 MTT法检测反应的情况下）。其他更先进，更详细的测定可用于评估细胞死亡机制，如膜联蛋白-V和碘化丙啶iodid FACS分析E（PI）染色。未来在我们集团内的体外系统的发展将着眼于把细胞在温度控制的RF-惰性孵化器完全排除热疗任何可能的来源是由于大量的加热单元格媒体。此外，它需要被小区内的内化最大的细胞死亡，以及细胞内的细胞器内的稳定金纳米粒子的量，将进行更详细的考察。这是根据最近的工作这表明，金纳米粒子必须是不聚集的溶酶体内用于增强射频治疗4。
最后， 在体内的协议进行了说明，以便全面的生物分析金纳米粒子在异位肝癌小鼠模型，其控制或降低肿瘤的生长和/或大小与射频治疗相结合的能力。讨论的一个重要的一点是要引起皮肤灼伤鼠标由于不正确的接地程序的能力的射频场。使用PROPE的RLY接地，放置铜箔胶带，所提到的协议部分，是为了阻止这些灼伤的要求。
未来在我们的实验室体内工作将致力于评估从RF-金纳米粒子暴露肿瘤死亡/尺寸控制的实际机制。虽然它是假设，热疗起着至关重要的作用，这有虽然使用这样的控制作为直接插入光纤热探针插入肿瘤和周围的健康细胞来看看这样组织的射频诱导的温度响应进行验证。此外，细胞内的荧光染料热，其发射波长与温度的直接函数的发展将是一个极好的工具，此验证，也可用于体外模型。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院（U54CA143837），美国国立卫生研究院MD安德森癌症中心支持资助（CA016672），在V基金会（SAC），以及从Kanzius研究基金会（国资委，伊利，宾夕法尼亚州）不受限制的研究经费。我们感谢和Kristine从灰肿瘤外科部，MD安德森癌症中心，对行政协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| 500 ml gold nanoparticles (5 nm) | Ted Pella, INC | 15702-5 | |
| Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa) | Millipore | UFC805024/UFC910096 | (4 ml and 15 ml volumes) |
| MEM X1 Cell Culture Media | Cellgro | 10-101-CV | (add extra nutrients as necessary) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135-500 ml | |
| Copper Tape | Ted Pella | 16072 | |
| Equipment | |||
| Kanzius RF System (13.56 MHZ) | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| IR Camera | FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA) | Contact FLIR | |
| 1.3 ml Quartz Cuvette | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| Teflon Sample holder with Rotary Stage | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| SPECTROstar Nano Microplate reader | BGM Labtech | ||
| UV-Vis spectrometer | Applied Nanofluorescence, Houston, TX) | NS1 NanoSpectralyzer | |
| ICP-–S | PerkinElmer | Optima 4300 DV | |
| Zetasizer | Malvern | Zen 3600 Zetasizer | |
References
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