Summary
Se describen los protocolos que se utilizan para investigar las interacciones de 13.56 MHz de radiofrecuencia (RF) de electricidad-los campos con coloides de nanopartículas de oro en ambos sistemas no biológicos y biológicos (in vitro / in vivo). Estas interacciones están siendo investigados para su aplicación en la terapia del cáncer.
Abstract
Terapias de cáncer que son menos tóxicos y invasiva que sus contrapartes existentes son altamente deseables. El uso de la RF-campos eléctricos que penetran profundamente en el cuerpo, provocando una toxicidad mínima, en la actualidad se está estudiando como un medio viable para la terapia del cáncer no invasivo. Se prevé que las interacciones de la energía de RF con nanopartículas internalizados (NPS) pueden liberar calor que puede causar un sobrecalentamiento (hipertermia) de la célula, en última instancia, que termina en la necrosis celular.
En el caso de los sistemas no biológicos, se presentan los protocolos detallados en relación con cuantificación del calor liberado por los coloides NP altamente concentradas. Para los sistemas biológicos, en el caso de los experimentos in vitro, se describen las técnicas y las condiciones que deben cumplirse a fin de exponer con eficacia las células cancerosas a la energía de RF sin artefactos de calentamiento del material a granel que oscurecen considerablemente los datos. Por último, damos una metodología detallada fo in vivo en modelos de ratones con tumores de cáncer hepático ectópicos.
Introduction
La absorción de energía de RF por el tejido biológico (debido a su permitividad eléctrica inherente) da lugar a temperaturas elevadas de tejido como una función del tiempo, lo que finalmente conduce a la muerte celular por hipertermia. Se planteó la hipótesis de que la hipertermia cáncer se puede optimizar mediante el uso de nanomateriales específicas que internalizan dentro de la célula del cáncer y actúan como transductores de RF-térmicas, dejando las células sanas, normales vecinas intacta. Varios informes han demostrado ya que una variedad de NPS puede actuar como fuentes de calor RF eficaz que ayuda en la necrosis cáncer de 1-4.
En estos aspectos, NP de oro (AuNPs) 3-5, los nanotubos de carbono 1, y los puntos cuánticos 6, 7 han mostrado características interesantes cuando se utiliza en tanto in vitro como in vivo en experimentos de RF. Aunque todavía se está debatiendo la naturaleza exacta del mecanismo de calentamiento de estos PN cuando se expone a un campo de RF, una serie deexperimentos fundamentales utilizando AuNPs ha dado gran importancia tanto en el tamaño de NP y estados de agregación. Se demostró que sólo AuNPs con diámetros <10 nm se calentarán cuando se expone a un campo de RF 8. Además, este mecanismo de calentamiento se atenúa significativamente cuando se agregan los AuNPs. Esta condición agregación también fue validado dentro de los modelos in vitro que dio importancia a la optimización AuNP estabilidad coloidal dentro de los compartimentos intracelulares endolysomal para la terapia de RF eficaz 4. Sin embargo, las técnicas y los principios experimentales utilizados para recoger y evaluar estos datos pueden ser problemáticos, especialmente en el caso de la validación de perfiles de calor de RF de coloides NP.
Varios informes han demostrado que el calentamiento Joule del fondo suspensión iónica que los PN se suspenden en puede ser la fuente principal de la producción de calor de RF y no los propios 9-12 PN. Aunque nuestro reciente documento de 8 ha validado tl uso de las interacciones de RF en la generación de calor de AuNPs de diámetro inferior a 10 nm, nuestro objetivo es describir estos protocolos con más detalle en este artículo.
También demuestran los protocolos y técnicas necesarios para evaluar la eficacia de AuNPs como agentes térmicos de hipertermia en tanto in vitro como en experimentos in vivo para modelos de cáncer de hígado. Aunque nos centramos principalmente en coloides simples de AuNPs citrato-capsulado, las mismas técnicas se pueden aplicar a otros híbridos AUNP tales como anticuerpos y complejos de quimioterapia-conjugado. Al adherirse a estos principios el experimentalista con suerte debe ser capaz de evaluar rápidamente el potencial para cualquier nanomaterial para ser un agente de hipertermia térmica inducida por RF eficaz.
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Protocol
Una visión general de ensayo completo se representa en la Figura 1.
Más detalles se representan en los pasos 1-3 a continuación.
1. Evaluar Calefacción RF de NP Coloides: AuNPs como ejemplo
- En general, para que se investigó cada muestra NP, primero Lavar la muestra varias veces a través de un filtro de centrifugación con agua desionizada (DI) para eliminar los iones y contaminantes de fondo. Todos los iones y contaminantes se han eliminado de la suspensión AuNP cuando el líquido que se lavan a cabo tiene velocidades de calentamiento de RF similares (HR) como agua DI. Este proceso de purificación también permite mayores concentraciones de PN a ser obtenidos. Vale la pena señalar que, aunque el uso de AuNPs en este ejemplo, los principios fundamentales se pueden aplicar a otros materiales NP.
- Como un ejemplo, purificar una botella de 500 ml de AuNPs disponibles comercialmente de 5 nm de diámetro y, a continuación someterlos a un campo de RF de 13,56 MHz de eléctrica-Field fuerza 90 kV / m.
- Tome ~ 125 ml de la solución madre AuNP y dividido entre seis 50 kDa tubos de filtración centrífuga. Se centrifuga a 3.000 rpm. durante 2 min 5 seg. Borrar filtros de amortiguamiento y recarga filtrados con más solución de reserva. Repita hasta que se ha filtrado a los 500 ml.
- Reemplazar el tampón se filtró con un volumen similar de agua DI y repetir aproximadamente 8 veces (o hasta que los HRs RF tampón filtrados son equivalentes a agua DI). Nota, análisis UV-Vis también se puede utilizar para controlar los picos de absorción de contaminantes. Una vez que los contaminantes de amortiguamiento se han eliminado totalmente, pipeta aproximadamente 0,5 ml de agua DI en cada filtro y resuspender las AuNPs por pipeteo repetido. Esto debería eliminar por completo los AuNPs del filtro y permitir la completa resuspensión. Combine todos los seis suspensiones en un tubo de 15 ml Eppendorf.
- Una vez que los AuNPs se han purificado y concentrado, analizar la muestra mediante ICP-OES y / o ICP-MS, UV-vis y el potencial Zeta de datos sobre concentratioN y NP estabilidad, respectivamente. SEM y / o análisis de TEM también se puede utilizar para obtener datos morfológicos. La preparación detallada de la muestra para estas técnicas se puede encontrar en la literatura 4.
- Usando el sistema de Kanzius de RF descrito en estudios previos 8, o derivaciones de este sistema, colocar un 1,3 ml cilíndrica cubeta de cuarzo de modo que el campo eléctrico de RF en el aire (sin muestra presente) sería ~ 90 kV / m en el interior de la cubeta. Para una muestra estándar de solución salina (0,9% NaCl)-el campo eléctrico se reduciría a ~ 1,1 kV / m. Estas son las condiciones aproximadas utilizados para permitir que se hagan comparaciones entre los diferentes sistemas.
- Pipetear 1,3 ml de una muestra de 1.000 mg / l de coloide AUNP purificada en la cubeta de cuarzo y introducir este en el campo de RF. Esto se puede hacer mediante el uso de un soporte de muestras de teflón a la medida. Exponer a la muestra de campo de RF para un período de 120 segundos o hasta que la muestra alcanza 70 ° C para evitar la formación de arco eléctrico o de ebullición rápida. Californiapture los datos de imagen térmica (así como las áreas de control) usando una cámara IR y el software asociado. Repita este procedimiento en tres ocasiones.
- Se filtra la muestra a través de otro filtro de centrífuga de 50 kDa a extraer los AuNPs de la memoria intermedia de agua DI. Volver a exponer el búfer para el campo de RF, de nuevo tres veces. La diferencia en jonrones entre el coloide AuNP y el búfer de fondo de agua DI determina la HR por los propios AuNPs. Esperar a obtener jonrones de ~ 0.3 ° C / seg y 0,05 º C / s para dar un HR depende AuNP de ~ 0,25 ° C / seg. Resuspender las AuNPs hayan quedado en el filtro en 1,3 ml de agua para los experimentos in vitro / in vivo.
2. La hipertermia inducida RF-Nanopartículas asistida: Estudios in vitro
- Estos estudios in vitro se pueden aplicar a cualquier tipo de cáncer tipo de células que forman monocapas 2D. En este experimento utilizar carcinoma hepatocelular humano derivado células Hep 3B.
- Placa ~ 50.000 cells en los tres delanteros pocillos de una placa de 12 pocillos con 1 ml de medio de crecimiento. Repita este 6 veces (usar tres placas para estudios de NP y tres placas como controles). Incubar a 37,5 ° C durante 24 horas antes de la introducción de los PN. Esterilizar NPs primero usando Bioseguridad Gabinete de exposición de luz UV durante 5 min.
- En cada pocillo introducir 0,1 ml de una solución de 1,000 mg / L AuNP y dejar actuar durante otras 24 horas. Añadir 0,1 ml de agua en cada pocillo de las tres placas de células de control y también dejar durante 24 horas.
- Después de haber pasado 24 horas, aspirar el medio celular y lavar con PBS para eliminar cualquier AuNPs unidos a la superficie. Sustituya el medio celular. Las células están listas para la exposición RF.
- Coloque cada paquete celular de 12 pocillos dentro del campo de RF. Espere hasta que las células se hayan enfriado a 31 ° C. Encienda el generador de RF y exponer de 3,5 min. La temperatura final de los medios de comunicación celular será ~ 37 ° C. Apague el campo de RF. Retire las células y colocarlas en una incubadora durante 24 horas antes del análisis.
- <li> Eliminar las células de la incubadora y medio celular aspirado. Añadir 1,6 ml de medio de células a cada pocillo así en 0,4 ml de reactivo MTT. Se incuban las células durante 4 horas. Medios aspirar y renovar con 2 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Coloca las placas de células sobre un rockero banco y dejar actuar durante 10 minutos para permitir que el DMSO para solubilizar los reactivos MTT. Por último, la pipeta 100 l de cada pocillo en una placa de 96 pocillos y ópticamente leer el pozo a 570 nm usando un lector de placas tales como el lector de placas SPECTROstar Nano.
3. La hipertermia inducida RF-nanopartículas asistida: estudios in vivo
- Estos estudios in vivo se pueden aplicar a cualquier tipo de cáncer que se forma tumores sólidos en un modelo murino ortotópico o ectópico. Este experimento utiliza células de cáncer de hígado Hep 3B en un BALB-C modelo de ratón desnudo del tumor ectópico.
- Nota: todos los experimentos in vivo se ejecutan en cumplimiento de todas las directrices, reglamentos y las agencias reguladoras. Además, el protocolo que se está demostrado se llevó a cabo bajo la dirección y aprobación de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Centros de Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC).
- Crecer un número apropiado de células (~ 100 K) en un matraz de cultivo de tejidos con el medio de crecimiento apropiado. Incubar en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 durante la duración del cultivo celular.
- Tratar las células con tripsina (para separar del matraz) y producir una solución de 2 millones de células por cada 25 l. Añadir una cantidad igual de Matrigel (en hielo) y mezclar a fondo para preparar la solución de la inyección final. Inyectar esta solución en la posición deseada en el lomo del ratón y esperar una cantidad adecuada de tiempo para que los tumores crecen hasta el tamaño deseado (2-4 semanas para la mayoría de las células). Antes de la exposición a RF, BALB-C ratones desnudos deben tener tumores ectópicos sólidos 0,5-1 cm de diámetro.
- Preparar a los ratones a utilizar (en este caso BALB-C ratones Desnudos) por anaesthetizing ellos con una solución de ketamina y xilazina por inyección IP. Mientras que los ratones están cayendo dormido, mantenerlos en una cámara de temperatura controlada a 37 º C. Se necesitarán 20 ratones en total, todos los tumores tamaño similar rodamientos. Diez ratones se utilizarán en conjunción con y sin AuNPs (este último es sólo inyecciones de PBS), mientras que los 10 ratones restantes se dividirán entre los controles de RF-expuesta sin exposición de RF y: todos sin inyecciones AUNP.
- Una vez adecuadamente anestesiados, inyectar los AuNPs directamente en el tumor usando una jeringa de 1 cc con una aguja de calibre 27. La solución AUNP debe ser a una concentración de Au de 200 mg / L en 0,1 ml de PBS. Después de la inyección, utilice un hisopo de cirugía para absorber la sangre y limpiar el lugar de inyección con un algodón con alcohol.
- A continuación, monte el ratón para ser tratado en la cabeza de recepción del generador de RF. El ratón debe colocarse de manera que el tumor es más cercano a la cabeza de la transmisión. Proteja las áreas que no deben ser tratados, así como la sensibilidadtiva áreas tales como los ojos, los oídos y dedos de los pies, con la cinta de cobre. Asegúrese de que la cinta de cobre está en contacto con el avión a tierra apropiadamente de modo que no se produzca la acumulación de carga. Además, el área de exposición tiene que tener un espacio de al menos 1 cm mayor que el tamaño del sitio de tratamiento deseado.
- Cámara térmica Posición IR para que el tumor y el área de tratamiento son visibles. Encienda RF durante 5 min. Registre la curva de temperatura resultante. Si la terapia alcanza temperaturas superiores a 42 ° C de tratamiento para inmediatamente.
- Después de la exposición a RF de los ratones a recuperarse de la anestesia en una cámara caliente hasta que estén conscientes.
- Repita el experimento con los mismos ratones 48 horas más tarde (pasos 3.3.1 - 3.4.1).
- Después del experimento, la eutanasia a los ratones de acuerdo con los protocolos y procedimientos institucionales. Anotar el peso del tumor. Para el análisis histológico fijan los tumores utilizando formol e incrustarlos en parafina. Secciones tumorales suelen ser manchadas ingenioh hematoxilina y eosina y metas pertinentes para medir la eficacia terapéutica, por ejemplo, Ki-67, exfoliados caspasa-3, etc.
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Representative Results
1. Evaluación de calentamiento por RF de coloides NP: AuNPs como un ejemplo.
Después de seguir el apartado 1.1 - 1.2.3 esperar tener una solución altamente concentrada, estable y purificada de 5 nm y 10 nm de diámetro AuNPs. De los 500 ml AS-comprado solución madre, esperar para obtener al menos 4 ml de solución a una concentración de 1000 mg / L. La diferencia en los CR entre los AuNPs y la solución tampón de agua DI fondo a esta concentración debe ser ~ 0,25 ° C / s y 0,1 º C / s durante 5 nm y 10 nm AuNPs, respectivamente, como se muestra en la Figura 2.
2. La hipertermia RF-Induced nanopartículas asistida: Estudios in vitro
Los resultados deberían idealmente muestran que las células expuestas a un campo de RF que han internalizado AuNPs son menos viables que las células expuestas no-AUNP de RF. Un ejemplo de este tipo de resultados esperados se destacan en la figura 3.
3. NanoparLa hipertermia RF-Induced tículo asistida: Estudios in vivo
Tras la inyección de AuNPs suspendidos-PBS y después del tratamiento de exposición a la RF de ~ 2-3 semanas, el análisis póstuma debe revelar el crecimiento del tumor controlada y / o una disminución en el tamaño del tumor / masa (como se muestra en la Figura 4). También puede haber evidencia de ablación térmica celular directo. Sin embargo, esto puede no ser el caso como AuNPs citrato-capsulado simples están lejos de ser optimizado y tienden a agregarse en el tejido tumoral. Como puede verse en las publicaciones recientes, AuNPs deben ser no agregadas dentro de orgánulos intracelulares para mejorar la citotoxicidad inducida RF-. Además, estudios recientes han demostrado que la conjugación de medicamentos de quimioterapia como la gemcitabina para AuNPs optimiza la terapia de RF. El investigador puede seguir utilizando estos protocolos sin embargo la comparación directa de la eficacia de su propia AuNP complejo en relación con el trabajo previo de nuestros grupos.
Figura 1. Visión general Experimental. AUNP evaluación de calentamiento: AS-comprado AuNPs (1.a) se colocan en un filtro de 50 kDa (1.b) y centrifugaron para separar las AuNPs del filtrado (1.c). Esto permite AuNPs altamente concentrados y purificados a formarse (1.d). La muestra se coloca entonces en el sistema de RF usando un soporte de muestras de teflón montado en una etapa rotativa ajustable (1.e). Las velocidades de calentamiento AuNPs, así como otros cuatro áreas de control, se registran utilizando una cámara de infrarrojos (1.f) protocolos in vitro:. Células cancerosas hepáticas Hep3B se cultivan en las delanteras 3-pozos de varios paquetes de células de 12 pocillos como se muestra en 2.a (la cantidad de células de paquetes utiliza DEP termina en lo que el experimentador desea investigar en términos de potencia RF aplicada, la concentración AuNP, controles, etc.) Cada placa de 12 pocillos se somete entonces a la campo de RF (2.b). Aunque no es necesario que el tiempo de exposición a la RF óptima ya que se ha determinado la temperatura de los medios de comunicación también se puede grabar utilizando la cámara IR (2.c) in vivo protocolos:. Ratones BALB-C con tumores hepáticos ectópicos (3.a) fueron sometidos a inyecciones intra-tumorales de AuNPs y expuestas al sistema de RF (3.b) durante varios minutos. Cinta de cobre se utiliza para conectar a tierra los ratones con el fin de evitar que se queme la piel. Una cubeta de cuarzo lleno de AuNPs también se muestra al lado del ratón para validar la exposición a RF. El área del tumor debe tener una temperatura más alta que el resto del ratón y generalmente aparece de color rojo en la imagen IR (3.c). YS ">
Figura 2. Las velocidades de calentamiento (° C / seg) de 5 nm y 10 nm de diámetro AuNPs soluciones. Según las instrucciones de protocolo, velocidades de calentamiento se determinan para AuNPs con sobrenadante (AuNPs + SN), AuNPs filtran de modo que sólo el sobrenadante está presente (SN) , y la diferencia en las velocidades de calentamiento entre estos dos (diferencia). Las tasas medias de calefacción son de tres experimentos diferentes (A, B, y C).
Figura 3. . Viabilidad idealizado hipertermia citotoxicidad (ensayo MTT) Se muestran los cuatro experimentos de células: control (sin RF), sólo AuNP (sin RF), solamente RF y RF con adición de AuNPs internalizados celulares (A, B, C, y D, respectivamente ).
Figura 4. Análisis póstuma de tumores ratones ectópicos. El tumor de la izquierda es lo que se espera de ambas muestras de control, es decir, no de RF y sin inyección AuNP). El tumor del medio muestra una ligera disminución en el tamaño cuando se somete al campo de RF solo. Sin embargo, el tumor de la derecha muestra que la RF + AUNP terapia combinada puede reducir / controlar el crecimiento del tumor aún más.
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Discussion
Estos protocolos permiten que el experimentador para analizar completamente la medida en que los nanomateriales (en este caso AuNPs) puede aumentar la hipertermia inducida por RF para el tratamiento del cáncer. El primer protocolo se ocupa específicamente de analizar la producción de calor a partir de muestras AUNP altamente concentrados y purificados. Aunque otros grupos han informado de la producción de calor principalmente a partir de los tampones que los AuNPs se suspenden en y no los propios 9-11 AuNPs, sus sistemas de RF utilizan concentraciones más bajas de AuNPs con diámetros> 10 nm, así como potencias de funcionamiento de RF más bajas con eléctrico- intensidades de campo <90 kV / m, que son demasiado bajos para ver los efectos de calentamiento RF notables de AuNPs. Sólo siguiendo los protocolos y parámetros que figuran en este informe puede experimentador observar el fenómeno térmico nanoescala.
La sección in vitro permite el desarrollo de interfaces de celulares-RF-NP a estudiar para optimizado RF / hipertermia inducida por NP. BEFAdemás del mineral de AuNPs y exposición a la RF, se debe esperar a tener un crecimiento de la capa 2D viable de las líneas celulares de cáncer pertinentes (en este caso Hep3B). Sin embargo, el tiempo de exposición a la RF correcta para cada línea celular necesita ser predeterminada antes de estos experimentos mediante la exposición de las células al campo de RF a diferentes puntos de tiempo por ejemplo, 2 -8 min) y mirando a su perfil de viabilidad después de 24 horas. El tiempo de exposición a la RF correcto a utilizar debe estar donde las células son ~ 80% viable. En el caso de células Hep 3B este se encontró que era ~ 3,5 min.
El ensayo más simple de elección para la viabilidad es el estándar de 3 - (4,5-dimethylthiazol2-il)-2.5-difeniltetrazolio bromuro (MTT), aunque puede ser necesario otro ensayo si se prevé que los PN van a interactuar con los reactivos de ensayo (como era el caso con el ensayo de MTT reaccionar con nanotubos de carbono 13). Otros ensayos más avanzados y detallados pueden ser usados para evaluar mecanismo de la muerte celular tales como el análisis de FACS con anexina-V y el yoduro de propidioe (PI) tinción. Futuro en desarrollos de sistemas in vitro dentro de nuestro grupo se verá en la colocación de las células en una incubadora-RF inerte a temperatura controlada para descartar por completo cualquier posible fuente de hipertermia debido al calentamiento mayor parte de los medios de comunicación celular. También, la cantidad de AuNPs que necesitan ser interiorizado dentro de una célula para la muerte celular máxima, así como su estabilidad dentro de los orgánulos intracelulares, se investigó con mayor detalle. Esto está de acuerdo con el trabajo reciente que mostró que AuNPs no deben ser agregados dentro de los lisosomas para la mejora de RF-terapia 4.
Por último, los protocolos in vivo se describen para permitir la bio-análisis completo de AuNPs en modelos de ratones cáncer hepático ectópicos para su capacidad para controlar o disminuir el crecimiento y / o el tamaño del tumor en combinación con la terapia de RF. Un punto importante a discutir es la capacidad para que el campo de RF para inducir quemaduras de piel en el ratón, debido a los procedimientos de puesta a tierra incorrectas. El uso de properly a tierra y se coloca cinta de cobre, como se mencionó en la sección de protocolo, es un requisito con el fin de poner fin a estas quemaduras.
Futuro en el trabajo vivo en nuestro laboratorio funcionará en la evaluación del propio mecanismo de control del tumor muerte / tamaño de la exposición RF-AuNP. Aunque existe la hipótesis de que la hipertermia juega un papel crítico, esto tiene que ser validado aunque el uso de tales controles como la inserción directa de sondas térmicas de fibra óptica en el tumor y las células sanas circundantes para buscar en la respuesta de la temperatura inducida de RF-de tales tejidos . Además, el desarrollo de un colorante fluorescente intracelular térmica cuya longitud de onda de emisión es una función directa de la temperatura sería una excelente herramienta para este validación y también podría ser utilizado para los modelos in vitro.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el NIH (U54CA143837), los del MD Anderson Cancer Center de Subvenciones de apoyo de los NIH (CA016672), la Fundación V (SAC), y una beca de investigación sin restricciones de la Fundación de Investigación Kanzius (SAC, Erie, PA). Agradecemos a Kristine Ceniza del Departamento de Oncología Quirúrgica, Centro de Cáncer MD Anderson, por la asistencia administrativa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| 500 ml gold nanoparticles (5 nm) | Ted Pella, INC | 15702-5 | |
| Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa) | Millipore | UFC805024/UFC910096 | (4 ml and 15 ml volumes) |
| MEM X1 Cell Culture Media | Cellgro | 10-101-CV | (add extra nutrients as necessary) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135-500 ml | |
| Copper Tape | Ted Pella | 16072 | |
| Equipment | |||
| Kanzius RF System (13.56 MHZ) | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| IR Camera | FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA) | Contact FLIR | |
| 1.3 ml Quartz Cuvette | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| Teflon Sample holder with Rotary Stage | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| SPECTROstar Nano Microplate reader | BGM Labtech | ||
| UV-Vis spectrometer | Applied Nanofluorescence, Houston, TX) | NS1 NanoSpectralyzer | |
| ICP-–S | PerkinElmer | Optima 4300 DV | |
| Zetasizer | Malvern | Zen 3600 Zetasizer | |
References
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