Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Uzun vadeli potansiyelize bir çok Kararlı ve tekrarlanabilir Kayıt için geliştirilmiş Hazırlık ve Hipokampal Fare Dilimleri korunması

Published: June 26, 2013 doi: 10.3791/50483
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neurosciences, Research Institute for Biosciences, University of Mons

Summary

Bu makale hazırlamak ve korumak için tam bir metodoloji sunar

Abstract

Uzun vadeli potensiyalizasyon (LTP) sinaptik gücü bir artış ile karakterize sinaptik plastisite türüdür ve bellek kodlama dahil olmak inanıyordu. LTP yoğun çalışılmıştır akut hipokampal dilim CA1 bölgesinde ortaya çıkardı. Ancak bu olayın bakım aşamasında altında yatan moleküler mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bu farklı laboratuarlar tarafından kullanılan çeşitli deneysel koşullar, kısmen bağlı olabilir. Gerçekten de, LTP bakım aşamasında oksijen, sıcaklık ve nem gibi dış parametrelere sıkı bir şekilde bağlıdır. Ayrıca diseksiyonu sonra dilimleme uçak ve dilim canlılığı yönelim gibi iç parametreleri bağlıdır.

Tüm bu parametrelerin optimizasyonu çok tekrarlanabilir ve çok istikrarlı uzun vadeli potensiyasyonun indüksiyon sağlar. Bu metodoloji daha da istikrarlı bir artış yer alan moleküler mekanizmaları keşfetmek için imkan sunuyorhipokampal dilim sinaptik gücü. Ayrıca nörofizyolojik olayların in vitro soruşturma deneysel koşullarının önemini vurgulamaktadır.

Introduction

Günümüzde, karmaşık anıları saklanır ve nöronal devre düzeyinde hatırlattı nasıl sınırlı anlayış vardır. Ancak, bellek depolama birleştirici bir hipotez mevcut ve genel olarak kabul edilir: hafızası merkezi sinir sistemindeki nöronlar arasındaki sinaptik bağlantıların gücü değişiklikleri olarak depolanır. Kendi başına, sinaptik plastisite araştırma büyük ölçüde iki atılım keşifler yararlanmıştır. (1) olarak sağlam anestezi tavşan kullanarak yeni ufuklar açan bir deney, Bliss ve Lomo 1,, kısa bir yüksek frekanslı (1 sn, 100 Hz) hipokampus olan delici yoluna stimülasyon teslim uzun süreli (birkaç neden olduğu bulundu saat) ilgili sinaptik bağlantıları artış. Bu büyüleyici fenomen 1.975 2 Douglas ve Goddard tarafından "Uzun Vadeli potansiyelize" veya LTP denirdi. (2) Daha sonra, benzer bir olay (0.4 mm) beyin dilimleri içinde devreye girebilir bulunmuştur yapay in vitro canlı tutulur sunarak, in vitro tespit edildi. LTP indüksiyon mekanizmaları büyük ölçüde ortaya konmuştur. AMPA alıcılarının fosforilasyonuyla (verimlilik artar) ve post-sinaptik zar 3 ilave AMPA alıcılarının bir birleşme: Temel olarak, NMDA reseptörleri ile Ca2 + akışı, iki sonuçları olan enzimleri aktive. Deneysel olarak çok daha zor 30-60 dakika boyunca daha uzun saatler boyunca sağlıklı bir dilim sağlamaktır, özellikle, çünkü aksine, LTP bakım fazı mekanizmaları tam olarak bilinmemektedir.

Birçok çalışma, LTP mekanizmaları ve ilginç teorileri anlayışı ithaf edilmiş yıllar 4-11 üzerinde ayrıntılı edilmiştir. Ama until şimdi, sinaptik gücü istikrarlı bir artış altında yatan kesin moleküler mekanizmaları ortaya konamamıştır. Bu hazırlanması için farklı teknikler kullanarak farklı laboratuvarlarda önceki sonuçları yeniden zorluk ve hipokampal dilim bakım kısmen olabilir. Onların metodoloji yazıda, Sajikumar ve ark. 12 sıçan hipokampal dilimleri ve istikrarlı LTP kayıt hazırlanması için deneysel koşullar önemini vurguladı. Bu videoda fare hipokampal dilim çok istikrarlı LTP kayıt edebilmek için yıllar boyunca laboratuarımızda geliştirilen tüm optimizasyon adımları sunuyoruz.

Bu optimizasyon farenin 13 ve 11 sıçan LTP mekanizmaları incelemek diğer laboratuarlar tarafından geliştirilmiştir ve başarılı bir şekilde kullanılan protokoller yapılmıştır. Bu deneyimli araştırmacılar neden ve başarı oranı yüksek olan yetişkin farelerde çok uzun ömürlü LTP kaydetmenize olanak verir. Pbağlı LTP hysiological olarak dikkatli bir şekilde kontrol ve 14 gösterilmiştir. Bu metodoloji yazıda, diseksiyon işlemi derin dilimleri heyecanlanma değiştirebilirsiniz ise sıcaklık veya oksijen gibi deneysel koşullardan herhangi bir değişiklik, LTP bakım üzerinde derin bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Ayrıca tüm bu parametrelerin hassas kontrol acemi öğrenciler için birkaç aylık bir eğitim gerektirdiğini vurgulamak gerekir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri araştırma hayvanların bakım ve kullanımı için Sağlık düzenlemeler Ulusal Sağlık Enstitüleri uygun olarak ve yerel etik kurul onayı ile yapılmıştır.

1. Yapay Cerebro-spinal Sıvı hazırlanması

Aynı medya, incelemek kesme ve dinlenme süresi ve elektrofizyolojik sırasında dilimleri (1 ml / dak) serpmek için kullanılır. Bu ortam, 124 mM NaCI, 4.4 mM KCI, 26 mM NaHCO 3, 1 mM NaH 2 PO 4, 2.5 mM CaCl2, 1.3 mM MgSO 4 ve 10 mM D-glukoz oluşmaktadır.

  1. (1 M) ile çözelti içinde zaten MgSO 4 hariç ACSF 2 L farklı bileşenler tartılır. Toz MgSO 4 derece higroskopik + için bir standart solüsyon kullanılarak Mg 2 tam konsantrasyonu emin olmasını sağlar. Ca 2 +: Mg 2 + oranı büyük ölçüde LTP indüksiyon ve bakım etkiler14 ve böylece oranları her zaman saygı gösterilmelidir.
  2. Bir bardak CaCl 2 hariç tüm bileşenleri koymak dereceli silindir ve distile H 2 O ile 2 L getirmek
  3. Şiddetle karıştırın. Her çözülür, tank (% 95 O2,% 5 CO2) bağlanmış bir akvaryum fıskiyeden ve borunun içinden karbojen ekleyin. Birkaç dakika bekleyin ve pH bikarbonat tampon etkisi ile 7.4 'de sabit kalsiyum klorür ekleyin.
  4. Bir soğuk dikdörtgen cam tabak içinde 600 ml tutmak ve ° C çanak çevresinde buz ile 4 için soğumasını. Bu ortam, hipokampus diseksiyon için kullanılacaktır.
  5. Kalan 1.400 ml filtre ve bir Erlenmeyer şişesi bulundurun.

2. Elektrofizyolojik Rig ve Beyin Dilim Kayıt Odası hazırlanması

Perfüzyon devresi 2 peristaltik pompa, bir rezerv tankı taze sıvı pompalama bir ve t diğer pompalama kullanılan sıvı yapılmıştıro bir bölmeye odası kayıt. Taze sıvı yeniden oksijenli ve ağırlık (Şekil 1A) tarafından arayüzü kayıt odasına ulaşmadan önce ısıtılır bir ev yapımı perfüzyon sistemi eklenir. Arayüzü kayıt odasına FST (Güzel Bilim Araçları, Vancouver, Kanada, Şekil 1B) tarafından tasarlanmıştır. Doku dilimleri çıkarılabilir iyi halka bağlı ve sürekli iyi iğne emme yüksekliğini ayarlayarak arayüzü koşullar altında korunabilir dokuma net filtre yerleştirilir. Sonuna ve (0.5 mm) yanal delikli bloke bir ev yapımı plastik tüp odasında istikrarı artırmak için emme iğne sabitlenir. Kayıt kafası da kayıt kafasının (su damlacığı oluşumu azaltmak için) olarak sapma bağlantı noktaları üzerinden nemli hava geçirerek nemli ortam sağlamak yardımcı olan bir gaz dağılım taş içeren bir su banyosu üzerinde monte edilir. Küvet ve orta sıcaklıkta sürekli DC akım inci seviyesini değiştirmek sureti ile kontrol edilirkaba bir silikon kauçuk-gömülü su banyosunda ısıtıcı. Su banyosu ve kayıt kuyularda termistör oda sıcaklığında bu sitelerde kurmak ve tam izlenecek sağlar.

Odasının ısıtma sistemi, tüm teçhizat sıcaklığını kontrol küresel bir ısıtma sistemi ile tamamlanmıştır. Edinburgh Üniversitesi'nde (araştırmacılar tarafından geliştirilen yazılım www.etcsystem.com ) oksijenli havanın sıcaklığı, beyin dilim, elektrotlar ve uzun vadeli kayıtları (Şekil 1C) için istikrarlı bir ortam sağlayarak kalan teçhizat izler ve eşitler . Fare hipokampal dilimler için kullanılan sıcaklık 28 ° C 'dir

  1. 20 dakika arasında, en az damıtılmış H2O ile tüm perfüzyon devre durulayın ve ısıtma sistemleri başlar.
  2. Devredeki karbojen köpüren başlatın. Carbogen f ile ev yapımı perfüze tüpler geldiilter mumlar ve kayıt odasının altındaki su banyosu içinde soğutulmuştur. Su banyosu içinde akış hızı, bir akış ölçer tarafından kontrol edilir. Akış hızı çok yavaş ise, doku hipoksik haline gelebilir. Debisi çok yüksek ise tersine, gaz yeterince ısıtılmış ve doku kurutma neden nemli olmayabilir. Yüksek gaz akış oranı da ozmotik şok yol açan aşağıdaki su banyosundan doku üzerinde püskürtme su şansını artırabilir. Bu sapma portların çıkışında naylon örgü bit (100 mikron) eklenerek önlenebilir.
  3. Devre boşaltın ve filtre ACSF ile doldurun.
  4. Tutma odasında dilim destekleyecek halka koyun. 500 ila 750 mikron arasında değişen örgü delikleri olan bir dokuma ağ filtre iki parçalı epoksi yapıştırıcı reçine ile gerilmiş ve halka takılır. Dokuma net filtre% 87 polyamid ve% 13 elastan (külot 15 den) yapılmıştır. Tutkal rin yüzeyinde kabartmalar oluşumunu önlemek için dikkatli bir şekilde uygulanmalıdırg.
  5. Devre tüm hava kabarcıkları dikkatlice çıkarın.
  6. Emme iğne vida ile kayıt odasında ACSF seviyesini ayarlayın. Peristaltik pompa hızı giriş pompa boyunca 1 ml / dak ve 5 ml / dak çıkış pompası için ayarlanır.

Perfüzyon sistemi katı bir titreşime dayanıklı masa üzerine yerleştirilir ve bir Faraday kafesi ile çevrilidir.

3. Diseksiyon Alanı hazırlanması

Cerrahi aletler: Bir # 11 bıçak, küçük standart diseksiyon makas, yaylı makas, kavisli bir forseps, iki Heidemann spatulae ve bir kaşıkla bir neşter.

Yardımcı madde: bir giyotin, bir selüloz, bir tıraş bıçağı ile bir Mcllwain doku kesici, filtre kağıdı, bir plastik emzik olan bir cam Pasteur pipeti, 2 plastik pastör geniş bir ağız, bir Petri kabı, bir metal silindir ile bir pipetler 7 mm çaplı (Şekil 2A).

    (Şekil 2A) ile hava kabarcıkları ve oksijen ACSF çıkarın.
  1. Kullanım sırasına göre aletleri yatıyordu. Doku kesici plaka ve distile su ve eter (Şekil 2B) ile temizlenir, yeni bir tıraş bıçağı filtre kağıdı üç tabaka ekleyin. Bu kağıt dokunduğunda tıraş bıçağı yatay konumda olmalıdır. Bıçak gücü maksimal değerin üçte biri maksimum değeri ve hızının yarısı ayarlanır.
  2. Daha sonra zamanımız yok, çünkü her şey (aletleri, sıcaklık ...) hazır olup olmadığını dikkatle kontrol edin.
  3. Soğuk ACSF dolu bir Pasteur pipeti ile diseksiyon sprey birine sormak.
  4. Dekapitasyon önce Nembutal IP (100 mg / kg) ile fare anestezisi. Halotan anestezisi de kullanılabilir. Bu yöntemler ve hem de obta karşılaştırıldığındaaynı sonuçları ined. Dekapitasyon anestezi altında gereken ancak servikal dislokasyon de kullanılabilir. Ancak servikal dislokasyon hayvan acı önlemek için çok iyi bir uygulama ihtiyacı var.
  5. Soğuk ACSF sürekli duş altında kısa sürede selüloz üzerinde parçalara ayır.

4. Beyin Kaldırma

  1. Namlu üzerinde bir elin işaret parmağı ve başparmak ile hala kafa tutarken, giyotin kesme kenarında başlayan ve frontal kemik rostrally çalışan başın üst ortasında boyunca diseksiyon makas ile bir kesi yapmak .
  2. Tam kafatası tabakaları ortaya çıkarmak ve başın kaudal kenarındaki kas çıkarmak için başın her iki tarafındaki deri kas kesti.
  3. Diseksiyon makas ile, her iki tarafta temporal kas kesmek temporal plaka boyunca, daha sonra enine, ortada ön plakalar kesti. Daha sonra, iki pl arasında, oksipital kemik küçük bir kesim yapmakates.
  4. Her bir tarafı için, oksipital plakaların kuyruk dibinde kesilir.
  5. Yaylı makas ile sagital sütür boyunca kesin.
  6. Forseps ile, birbirinden onları yayarak kafatası yarısı çıkarın.
  7. Neşter ile, sadece koku ampul sonra enine kesilmiş ve beyincik sonra soğuk ACSF ile diseksiyon çanak içine ayıklanan beyin dalma hemen önce.

5. Hipokampal Diseksiyon

  1. Beyin diseksiyon çanak immerged sonra, orta takılı bir neşter ile birbirinden iki hemisfer sever.
  2. Hipokampus diseksiyonu bir binoküler cerrahi mikroskop (X25, Şekil 2A) ile görsel kontrol altında spatulae ile yapılır. Beynin bir yarısı üzerinde, dikkatli bir şekilde lateral ventrikül görmek için yapılar yayıldı. Beyin sapı ve diencephalon çıkarın. Bu bir tarafta frontal korteks üzerinde spatulae uygulayarak ve ilgili diensefalon yapılırdiğer tarafta. Spatulae ile hipokampus dokunmayın ve doku kesit sırasında germek değil dikkat edin.
  3. Forniks yavaşça ventrikül bir spatula ekleyerek korteks (uzak rulo), en hipokampus dışarı itmek sever.
  4. Hipokampus ayıklanır, aşırı korteks dokusu ve geri kalan kan damarları çıkarın.

6. Dilimleri kesimi

  1. Geniş bir ağız plastik Pasteur pipet ile, onun alvear yüzey üst (dışbükey tarafı) ile bir kaşık hipokampus aktarın.
  2. Bir standart plastik Pasteur pipeti ile aşırı sıvı çıkarın.
  3. Dikey neredeyse helikopter filtre kağıdı (Şekil 2B) dokunmadan kaşık İpucu ve hızlı bir şekilde filtre kağıdı dokunarak, kaşık hipokampus düşüyorlar sonra kaşık geri hareket ettirin.
  4. Hipokampus yönlendirmek ve (hipokampal yönünü Şekil 2C gördüğünüz helikopteri ile 400 mikron enine dilimtıraş bıçağı göre irin). Mümkün olduğunca çabuk hareket.
  5. Dilimlenmiş hipokampus ile filtre kağıdı çıkarın ve dilim biraz yaymak için metal silindir etrafında sarın. Daha sonra, ücretsiz standart plastik Pasteur pipeti ve soğuk ACSF ile dolu bir Petri kabındaki bunları toplamak kullanarak ACSF spreyler ile dilimleri.

7. Arayüz Dilimleri Kuluçka

  1. Bir standart plastik Pasteur pipeti ile dilim seçin ve hızlı bir şekilde kayıt odasına koyun. Dilimler 28 de arayüzü, doğrudan kayıt odasında diseksiyonu travma kurtarmak ° C
  2. Dilim büyük olasılıkla lavabo olacaktır. Dilim seviyeye ulaşmak için sıvı seviyesi indirin ve sonra yüzer yapmak için yükseltmek.
  3. Seviyesinin düşürülmesi sırasında doğru pozisyonda kesit getirin. Dilimler CA1 bölgesinde elektrot yerleştirme (2 uyarıcı ve bir kayıt elektrotları) kolaylaştırmak için her zaman aynı şekilde konumlandırılmıştır.
  4. Durdurmaksıvı arayüzü bulunmaktadır. Dilim etrafında bir ortam "menisküs" medya yeterli düzeyde göstergesidir. Net filtre ortamı ile doymuş ama tamamen sular altında değil olmalıdır.
  5. Delikli kapağı üzerine yerleştirilen filtre kağıtları ile kaplı odası tutun.
  6. 28, en az 1.5 saat için dilim dinlenmesine izin ° C

8. Synaptic Yanıtları kaydedilmesi

  1. Elektrot Kayıt: ACSF dolu zaman cam kılcal MQ 2-5 bir ucu direnci elde etmek için çekilir. Filtre kağıdı küçük bir parça, elektrot ucu etrafında yerleştirilir ve kemik mumu yoğunlaşma azaltmak için ucunda uygulanmaktadır. Uyarıcı elektrotlar: 12.5 mikron çaplı platin-iridyum bipolar küme elektrotlar FHC (ABD) satın alınır. Doğru bakım ile, her elektrot en az 30 kez (Şekil 1B) kullanılabilir.
  2. CA1 bölgenin stratum radiatum elektrotlar yerleştirin, tüm elektrotları kaplıkadar (Şekil 3A). Elektrotlar Narishige mikromanipülatörler ile dilim yüzeyinin altında 75 ile 150 mikron indirilir. İki uyarıcı elektrot Schaffer teminat iki ayrı demetleri uyarmak için yerleştirilir. Elektrotlar dilim üzerine indirilir zaman, filtre kağıtları, dikkatli bir şekilde kapatılması için odasına etrafına yerleştirilir.
  3. Iki fazlı uyarım (yarım dalga 0.08 milisaniye darbe süresi) SIU V tecrit birimleri bağlı bir Grass uyarıcısı sabit voltaj gerçekleştirilir. Maksimum cevap 12 V. Alan EPSPS bir TEFE ISO-80 amplifikatör ile 1000 kez yükseltilir ve 10 Hz ve 10 kHz süzülür en fazla 2 V uyaran yoğunluğunu artırarak kontrol edilir. Daha sonra sinyal bir Ulusal Enstrüman A / D dönüştürücü ile bir PC'ye gönderilir. Uyarım, veri toplama ve analiz WinLTP programı (kullanılarak gerçekleştirilir www.winltp.com ). Alan EPSPS bir giriş-çıkış elde edilen maksimum genlik% 40 kaydedilireğri koydu. Her dilim için, fEPSP yamaçlarında LTP indüksiyon önceki 30 dakika boyunca ortalama eğim karşı normalize edilmiştir.
  4. LTP ikinci yolu bir kontrol olarak sunarken, bir yol üzerinde testi güçte stimülasyon tek bir tren (100 Hz) uygulayarak tetiklenir.

9. Kurulum temizliği

  1. En az 10 dakika boyunca, hidrojen peroksit (H2O 2)% 3'lük bir çözeltisi ile tüm devre durulayın, sonra süzün. Devre dikkatle herhangi bir deney başlamadan önce distile su ile durulanır olacak. Diğer laboratuvarlar temizlenmesi için sadece saf su kullanmak ancak sadece su kullanılarak biz boru sistemindeki koyu kalıntı çökelmesi fark olarak H 2'nin kullanımı O 2 kesinlikle gerekli değildir.
  2. Kayıt odasına altında su banyosunda su değiştirin.
  3. 5 dakika boyunca alkol banyo uyarıcı elektrotlar ipuçları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu metodoloji, erişkin farenin C57Bl/6J (JANVIER SAS, Fransa) 14 akut hipokampal dilimler indüklenir uzun süreli uzun süreli potansiyasyon özelliklerini analiz etmek için kullanılmıştır. Şaşırtıcı bir şekilde, deneysel koşullarının iyileştirilmesi LTP bakarak yeni bir yol yol açmıştır. Biz sinaptik gücü uzun süreli artış yeni protein sentezi gerektirmeyen gösterdi.

Burada, LTP indüksiyon dilim canlılığı ve heyecan bağlı olduğunu göstermektedir. hipokampus diseksiyonu çok yavaş ya da çok zararlı olduğunu, dilim heyecanlanma artarak polisinaptik yanıtları (Şekil 3B) LTP indüksiyon sonra gözlenebilir. Bu durumda, LTP indüksiyonu çok daha az etkili olduğunu ve Potentiation devam edildi.

Biz bir tek yol açtığı bile dilim görünüşte sağlıklı, teknik şartlar LTP süresi üzerinde büyük bir etkisi var, gerçeği vurgulamak istiyorumstimülasyon tren. Önceki yayınlarda, bizim grup kısa süreli LTP dilim 15 kurtarma koşulları değiştirerek uzun süreli bir dönüştürülebilir gösterdi. Günlük uygulama yıl içinde, bizim teknik birbirini izleyen gelişmeler standart koşullarda bir tek trenle neden LTP süresi ilerici bir artışa neden olduğu görülmektedir. Nitekim, 2005 yılında yapılan kayıtları 3 saat (Şekil 3C, dolu daireler) içinde temel geri giderek kısa süreli LTP gösterdi. Uzanan doku azaltılması diseksiyonu prosedüründe değişiklikler mümkün 6 saat 16 (Şekil 3C, dolu kareler) için sürekli bir LTP elde etmek için yaptık. Ve son olarak, elektrot standardizasyon ile birlikte arayüzü oksijen ve sıcaklık kontrolü gelişmeler, fazla 8 saat (Şekil 3C, açık daireler) için bir LTP istikrarlı yol açmıştır. Üç grup arasındaki fark (bir-w önemlidiray ANOVA, F (2,20) = 49,5, p <0.001).

Ayrıca, sıcaklık ya da oksijen yapılacak herhangi bir değişiklik bir artış ya da sinaptik tepkiyi (Şekil 4) bir azalma olduğunu gösterdi. Bu parametrelerin kontrolü her zaman iki uyarıcı elektrotlar kullanılarak kontrol edildi. Başka bir paket sinaptik gücü stabilite bir iç kontrol olarak kullanıldı LTP Schaffer kollateral bir paket üzerinde oluşturuldu.

Şekil 1
Şekil 1. Elektrofizyolojik teçhizat ve beyin dilim kayıt odası. Bir peristaltik pompa, izole stimülasyon birimi (elektrot başına iki), cerrahi mikroskop ve kayıt odası tarafından beslenmiştir ev yapımı ağırlık perfüzyon sistemi ile (A) Perfüzyon devre. (B) Arayüz kayıt uyarıcı ile oda vekayıt elektrotları. Filtre kağıtları dilim destekleyen halka görmek için kapağı kaldırıldı. (C) 2 uyarıcıları, osiloskop, A / D dönüştürücü, sıcaklık kontrol yazılımı ve WinLTP yazılımı ile kontrol ünitesi.

Şekil 2,
Şekil 2. Dilimleme hipokampus için kullanılan araç ve malzeme. Soğuk ACSF ve cerrahi mikroskop içeren (A) Diseksiyon çanak. Neşter bir 11. bıçak, küçük standart diseksiyon makas, yaylı makas, kavisli bir forseps, iki Heidemann spatulae, kaşıkla monte, 2 plastik Pasteur pipetler biri geniş bir ağzı, Petri kabı, destekler 7 mm çapında ve halka metalik silindir kayıt odasında dilim. (B) McIlwain doku kıyıcı. (C) Çizim ve fotoğraf okesme konumunda F sol hipokamp. Jilet yönü kırmızı kesik çizgi ile gösterilir. Retikül Ölçek:. 1 mm daha büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. Hipokampal dilimleri içinde LTP indüksiyonu. (A) aynı nöronal nüfusa S1 ve S2 iki bağımsız sinaptik girişi gösteren Sketch. Her dilim, iki uyarıcı elektrotlar (S1 ve S2) uygulamaya konuldu. S2 yolu bir kontrol olarak hareket ederken S1 yolu, LTP ikna etmek için kullanıldı. (B) mükemmel sağlıklı bir dilim (solda) ve bir dilim bireysel deneyler örnek fEPSP izleri heyecan yüksek düzeyde bir (sağ) sunulması. Sadece BEF kaydedildi cevher LTP indüksiyon (kırmızı izleri) ve LTP indüksiyon (mavi izleri) bir saat sonra. Dilimleri (sağ), polisinaptik yanıtları mükemmel sağlıklı gözlenir değildir ve fEPSP eğim potansiyasyonu azalır. (C) fEPSP eğimin zamanlı kurslar karşılaştırılması LTP yüksek frekanslı stimülasyon tek bir tren (100 Hz, 1 tarafından uyarılan sonra zaman sn) 2005 yılında kaydedilen, laboratuvarımızda 2010 ve 2011. İlk deneyler (dolu daireler, n = 11) 2005 yılında kaydedildi. Sonraki kayıtları (Villers, et al. 2010) geliştirilmiş bir diseksiyon işlemi (dolu kareler, n = 6) yararlanmıştır. Şu sonuçları elektrot standardizasyon (açık daireler, n = 6) ile birlikte arayüzü oksijen ve sıcaklık kontrol optimizasyonu kaynaklanmaktadır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

/ "Src =" / files/ftp_upload/50483/50483fig4.jpg "files/ftp_upload/50483/50483fig4highres.jpg />
Şekil 4. Sıcaklık ve oksijen akış hızının bir fonksiyonu olarak fEPSP eğim değişimi. 0.15 den 0.25 L / dak için kayıt odasına altında su banyosunda (A) Artan oksijen akış hızı (mavi eğri) 20% (pembe eğrisi) fEPSP eğimi azalma neden olur. (B) 29 28'den sıcaklık artırılması ° C (yeşil eğri) fEPSP eğimi (pembe eğri) bir% 50'den fazla artış neden olur. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz laboratuvarda geliştirilen ve LTP kayıtları 11,17 büyük bir uzmanlığa sahip diğer laboratuvarlar tarafından kullanılan yöntemlerin kombinasyonu kaynaklanan bir protokol geliştirdik. Bu protokol, yetişkin fare hipokampus adapte edilir ve her yaşta ve arka plan genotip hayvanlarda kullanılabilir. Ayrıca, Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların 18,19 gelişmekte olan transgenik farenin LTP analizine izin verir.

Sıçan hipokampal dilim için bu protokol kullanımının bir uyarlamalar yapılmasını gerektirebilir olabilir. Örneğin, sıçanlarda yapılan çalışmaların çoğu 32 ° C yerine 28 ° C arasında bir sıcaklıkta kullanmak Mathis ve diğerleri. 20 yaşlanma fare veya sıçan hipokampal dilimler hazırlanması için başka bir yöntem önerilmiştir.

Gereç ve yöntem

JANVIER SAS (Fransa) ama aynı sonuçları gelen C57BL/6J fareler Charl gelen C57BL/6J fare ile elde edilir es Nehri Fransa.

Doku hücre hasarı azaltmak için soğuk ACSF batık ise hipokampus hızla izole edilmiştir. Bu eksitotoksisite bir azalma sağlar ama daha fazla yapısal sinaptik plastisite maske sinaps çoğalması 21,22 neden olduğu bilinmektedir.

Sonra Vibratome yerine dilimleme için bir doku helikopter kullanın. Bir doku helikopter özellikle fare hipokampus gibi doku küçük parçalar kesit uyarlanmıştır. Doku kesici üzerinde, hipokampus Cezayir ark edilen prosedüre göre her zaman aynı şekilde yönlendirilir. 23. Bunlar paralel jilet için, eğik aydınlatma ile görülebilir, alvear yüzeyinde çizikleri yerleştirilir. Bu yöntem, enine eksen (bakınız Şekil 2C) ile 15 ° 'lik bir açı ile sırt kısmı kesme hipokampal dilimler içerir. Daha sonra, dilim doğrudan temas en az manipüle.

ove_content "> Dilimler 28 arayüzü olarak korunur ° C sıcaklıkta ayrıldıktan sonra,. Bu yöntem, fare ve sıçan dilimleri 24 polysinaptik aktivite ve epileptogenicity azaltmak için gösterilmiştir.

Dış parametreleri dikkatle tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kontrol edilir. Bipolar küme uyarıcı elektrotlar (FTC), LTP indüksiyonu genliği çok elektrot kalitesine bağlıdır, görme, indüksiyon üretilebilirliğe artırmak amacıyla yerine ev yapımı elektrot kullanılır.

Edinburgh 11 Üniversitesi'nden ETC sistemi tüm deneysel teçhizat ve carbogen tüketimi içinde sabit ve düzgün sıcaklık sağlayan bir debimetre ile stabilize edilir. Arabirimi düzeyini bir binoküler mikroskop cerrahi yardımı ile görsel olarak kontrol edilir ve bir peristaltik pompa aspirasyon sistemi ile çok kararlı korunur.

Sonuçlar

Bu protokol tümsıcaklık ve oksijen gibi dış koşullara bağımlı kalır bir çok kararlı LTP indüksiyon OWS. Daha önce, bu koşullarda UVP'u LTP 14 dahil, klasik moleküler yollar vardır NMDA reseptörleri, α-CaMKII otofosforilasyon ve PI3-kinaz aktivasyonu bağlı olduğunu göstermiştir. Buna karşılık, yeni protein sentezi üzerinde LTP bakım aşamasında olan bağımlılığını yeniden koyamadık. Bu indüksiyon etrafında kullanıldıklannda, L-LTP geç faz gelişimini önlemek için, özellikle protein sentez inhibitörleri, ve anisomycin kabiliyeti, art arda 4,25 bildirilmiştir. Bu yaklaşık 2-3 saat daha uzun süre sinaptik plastisite stabilize yeni proteinler 26 geçici bir sentezi LTP-endüktif uyaran tetikleme gerektirdiği sık tutulan hipotezine yol açmıştır. Ancak, son deneyler şeyler 27 daha karmaşık olduğunu ileri sürmüşlerdir -32. Bizim deneysel koşullarda neden LTP hatta yeni protein sentezi dışındaki mekanizmalar LTP kalıcı aşamasında dahil edilebileceğini öne protein sentezi inhibitörleri varlığında devam edildi.

Bununla birlikte, in vitro deney her zaman gözlenen bir olgu fizyolojik alaka sorusunu gündeme getirmektedir. Dilimleme doku 34 metabolik durumunu sinaptik plastisite 33 ve alterasyon aktivite bağımlı formları dahil proteinlerin fosforilasyon durumu değişikliklerine neden olur. Protein sentezi oranının 10-15 in vivo 35 gözlemlenenin% ve mRNA ve protein arasında bir denge bozulur 36 düşürülür. Tüm bu nedenlerden dolayı, biz sonuçların yorumlanmasında dikkatli olmalıdır.

Tanım LTP tarafından hızla neden uzun ömürlü (gün, hafta) bir eksitatör sinaps geliştirme, muhtemelenuzun süreli hafızada önemli bir rol oynar. LTP, in vivo olarak, 37,38 öğrenme sırasında meydana sinaptik gücü birkaç hafta ve benzer değişiklikler sürebilir. Buna ek olarak, çoğu zaman, zaman uzun vadeli LTP mutasyonlar tarafından engellenir, uzun süreli bellek 39 bozulur.

Daha sorunlu kısa süreli bellek ve kısa süreli uzun vadeli potansiyasyonu arasındaki paraleldir. İlk sorun, her bir fenomen süresi bilinmemektedir olmasıdır. Kısa süreli bellek kısa vadeli LTP az 5 saat sürmesi beklenen ise prosedürü öğrendikten sonra 1 gün, 1 saat çalışılmıştır. İkinci soru kısa süreli hafıza (ya da kısa süreli LTP) sadece bir adım uzun süreli bellek (veya uzun süreli LTP) veya farklı moleküler mekanizmaları 40 ile ayrı bir varlık olup olmadığıdır. Üçüncü olarak, kısa vadeli LTP uzun süreli LTP neden kısa düşüyor ya da aynı uyarının sonucu ise zayıf bir uyarının sonucu olup olmadığını bilmek ama olmayan biruzun ömürlü LTP altında yatan mekanizmaları başarısız sadece ppears.

Bizim deneysel koşullar altında LTP uzun süreli stabilite 10 saat ve 24 saat arasında kalıcı kısa süreli hafıza için bir kısa vadeli LTP eşdeğer olarak görülebilir. Sinaptik plastisite bu formunda, yüksek dilimleri azalır protein sentezi, gerekli değildir ve LTP stimülasyon tek bir tren ile uyarılabilir. Sinaptik gücü Bu uzun süreli artış omurga yeniden olmadan sinaptik-sonrası membranda AMPA reseptörlerinin sayısında kararlı bir artışa bağlı olabilir.

Bu hipoteze göre, protein sentezi omurga genişleme ve uzun süreli bellek birkaç hafta süren yol açan sinapsların yapısal değişiklikler için gerekli olabilir. Bu durumda, LTP azaltmada tek fazlı indüksiyon 24 saat sonra gözlenebilir. Ne yazık ki, şu ana kadar, akut dilim sadece yaklaşık 16 saat boyunca canlı korunabilir.

ve arkadaşları. 41 uzun vadeli sinaptik plastisite ve bellek korunur ise bu farelerde, in vivo ve kısa süreli bellek kısa vadeli LTP engelli, göstermiştir.

Farklı laboratuarlarda yapılan farklı çalışmalar arasındaki tutarsızlıklar dilimlerin metabolik durumunu ya da protein yıkımı 42 oranında, enzimatik aktivite değişkenlik nedeniyle, kısa süreli LTP süresine bağlı olabilir. Protein sentezi öğrenme süreci tarafından kullanılan, ya da diğer kurucu hücre elemanlarının 43 olan enzimlerin yeniden konumlandırmak içeren bir serbest yenileme süreci olarak görülebilir.

Bu sonuçlar LTP istikrar üzerinde deneysel koşullar önemini vurgulamak. Protein sentezi bir istikrarlı LTP bağımsız uzun ömürlü sonrası traduc rolünü incelemek için yardımcı olabilirreseptörleri ciro rağmen sinaptik-sonrası membranda sistemindeki AMPA reseptörleri olmak sayısının istikrarlı bir artış temel sinaptik protein ve mekanizmaları gözlemcinin geleneksel modifikasyonları.

Bu video umarım farklı laboratuvarlarda tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için yardımcı olacaktır bir ayrıntılı bir protokol gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Teknik yardım için Bernard Foucart teşekkür ederim. Bu çalışma Bilimsel Araştırma Belçika Fonu (FRS-FNRS) tarafından ve Tıbbi Araştırma Kraliçe Elisabeth Fonu tarafından desteklenmiştir. Agnès Villers Bilimsel Araştırma için Belçika Fonu Araştırma üyesidir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
NaCl Sigma - Aldrich S7653
NaHCO3 Sigma - Aldrich S8875
KCl Sigma - Aldrich P9333
D-glucose Sigma - Aldrich G7528
NaH2PO4 Sigma - Aldrich S9638
MgSO4 1M Sigma - Aldrich 63126
CaCl2 Sigma - Aldrich C4901
Carbogen Air Liquide (Belgium)
Capillaries WPI, Inc. (UK) TW150-4
Stimulating Electrodes FHC (USA) CE2B30
Surgical tools FST (Germany)
Filter paper 84 g/m2 Sartorius FT-3-105-110
Mesh Lycra 15 den
Glue UHU plus endfest300
Instrument
Amplifier WPI, Inc. (UK) ISO-80
Interface recording chamber FST (Germany)
Peristaltic pumps Gilson (USA) Minipuls 3
Temperature controller University of Edinburgh www.etcsystem.com
Tissue Chopper Mcllwain
Stimulators Grass (USA) S88X + SIU-V
Program analysis WinLTP www.winltp.com
Micromanipulators Narishige MM-3 and MMO-220A
Surgical microscope Leica Microsystem
A/D converter National Instruments NIPCI-6229 M-series

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
  2. Douglas, R. M., Goddard, G. V. Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus. Brain Res. 86, 205-215 (1975).
  3. Squire, L., Kandel, E. Memory: From mind to molecules. , WH Freeman & Company. New York, New York, USA. (1999).
  4. Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).
  5. Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).
  6. Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).
  7. Migues, P. V., Hardt, O., et al. PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking. Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).
  8. Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).
  9. Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones. J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).
  10. Fonseca, R. Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture. Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).
  11. Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
  12. Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).
  13. Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation. J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).
  14. Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development. PLoS One. 7 (7), e40823 (2012).
  15. Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions. Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).
  16. Villers, A., Godaux, E., Ris, L. Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture. Neuroreport. 21, 210-215 (2010).
  17. Nguyen, P. V., Kandel, E. R. Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus. Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).
  18. Dewachter, I., Ris, L., et al. Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1. Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).
  19. Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice. Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).
  20. Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330 (2011).
  21. Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
  22. Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
  23. Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., et al. Appendix: Brain slice methods. Brain Slices. Dingledine, R. , Plenum. New York. 381-437 (1984).
  24. Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons. Brain Res. 775, 134-143 (1997).
  25. Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).
  26. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  27. Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation. Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).
  28. Rudy, J. W. Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis. Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).
  29. Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin. J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).
  30. Volianskis, A., Jensen, M. S. Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus. J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).
  31. Ris, L., Villers, A., Godaux, E. Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation. Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).
  32. Abbas, A. -K., Dozmorov, M., et al. Persistent LTP without triggered protein synthesis. Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).
  33. Ho, O. H., Delgado, J. Y., O'Dell, T. J. Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro. J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).
  34. Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation. J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).
  35. Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain. Brain Res. 99, 303-318 (1975).
  36. Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression. J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).
  37. Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice. J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).
  38. Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. Learning induces long-term potentiation in the hippocampus. Science. 313, 1093-1097 (2006).
  39. Grant, S. G. N., Silva, A. J. Targeting learning. TINS. 17 (2), 71-75 (1994).
  40. Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. Separate mechanisms for short- and long-term memory. Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).
  41. Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome. Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).
  42. Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. Brain Slice Protein Degradation and Development. J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).
  43. Izquierdo, I. Long-term potentiation and the mechanisms of memory. Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).

Tags

Nörobilim Sayı 76 Nörobiyoloji Anatomi Fizyoloji Biyomedikal Mühendisliği Cerrahi Bellek Bozuklukları Öğrenme Bellek Nörobilim Nörofizyoloji hipokampus uzun vadeli potansiyasyonu fare akut dilimleri sinaptik plastisite, Elektrofizyoloji hayvan modeli
Uzun vadeli potansiyelize bir çok Kararlı ve tekrarlanabilir Kayıt için geliştirilmiş Hazırlık ve Hipokampal Fare Dilimleri korunması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Villers, A., Ris, L. Improved… More

Villers, A., Ris, L. Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation. J. Vis. Exp. (76), e50483, doi:10.3791/50483 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter