Summary
מיקרוסקופיה זמן לשגות של סמני autophagy כותרתו fluorescently מאפשרת ניטור של תגובת autophagy הדינמית עם רזולוציה גבוהה זמנית. שימוש autophagy ספציפית וסמני אברון בשילוב של 3 צבעים שונים, אנו יכולים לעקוב אחר תרומתו של חלבון להיווצרות autophagosome בהקשר מרחב ובזמן חזק.
Abstract
Autophagy היא תגובה תאית מופעלת על ידי חוסר של חומרים מזינים, במיוחד היעדרות של חומצות אמינו. Autophagy מוגדרת על ידי היווצרות של מבני קרום כפולים, שנקראה autophagosomes, שלעקל חלבוני ציטופלסמה, חיים ארוכים ואגרגטים חלבון, אברונים פגומים, ואפילו וירוסים או חיידקים. Autophagosomes סופו של דבר להתמזג עם lysosomes המוביל לזילות עיקר התוכן שלהם, עם החומרים המזינים המיוצרים להיות ממוחזרים חזרה לציטופלסמה. לכן, autophagy היא חיונית לאיזון תא, וdysregulation של autophagy יכול להוביל למחלות, בעיקר ניוון מוחיים, הזדקנות וסרטן.
היווצרות Autophagosome היא תהליך מאוד מורכב, שבו תאים להקצו לקבוצה מסוימת של חלבונים, הנקראת מכונות autophagy ליבה. מכונות autophagy הליבה היא השלימה תפקודית על ידי חלבונים נוספים הכרוכות בתהליכים תאיים שונים, למשל בmembranסחר בדואר, בביולוגיה של המיטוכונדריה וlysosomal. תיאום של החלבונים הללו ליצירת והשפלה של autophagosomes מהווה תגובה הדינמית והמתוחכמת ביותר של autophagy. הדמיה תא חי מאפשרת לעקוב אחר התרומה המולקולרית של כל חלבון הקשור לautophagy עד לרמה של אירוע היווצרות autophagosome אחת ובזמן אמת, ולכן טכניקה זו מציעה רזולוציה גבוהה של זמן ומרחב.
כאן אנו משתמשים שורת תאים ביציבות להביע GFP-DFCP1, להקים הקשר מרחב ובזמן לניתוח שלנו. DFCP1 omegasomes סימנים, שהם מבנים מבשר מובילים להיווצרות autophagosomes. חלבון של עניין (POI) יכול להיות מסומן עם או אדום או תג ניאון ציאן. אברונים שונים, כמו ER, מיטוכונדריה וlysosomes, כולם מעורבים בשלבים של היווצרות autophagosome שונים, ויכולים להיות מסומן באמצעות צבע גשש ספציפי. מיקרוסקופיה זמן לשגות של autophagy בסט את הניסוי הזה, מאפשר למידע להיות מופק על הממד הרביעי, כלומר הזמן. מכאן אנו יכולים לעקוב אחר התרומה של POI לautophagy במרחב ובזמן.
Introduction
Autophagy היא תהליך דינמי מאוד, שמצריך תיאום בין מספר רב של חלבונים לתוצאה הסופית של היווצרות autophagosome 1-3. מיקרוסקופית הוא כנראה הטכניקה מיושמת בדרך כלל ללימוד autophagy 4. הלוקליזציה של רוב חלבוני autophagy, נחקרה בהרחבה בתאים קבועים, הן על ידי חיסוני מכתים-החלבונים אנדוגניים ועל ידי ביטוי של חלבון אקסוגני מתויג fluorescently. בנוסף, מיקרוסקופית אלקטרונים (EM), לבד ובשילוב עם תיוג חיסוני זהב, תאר את הפרטים הקטנים של מבנים אלה 5,6. למרות העובדה שטכניקות אלה הקימו את ההבנה של היווצרות autophagosome ב 3 הממדים של החלל שלנו, הם לא הצליחו לספק כמות מספקת של מידע על ממד ה 4 - זמן. הדמיה תא חי מתגברת על המכשול הזה כפי שהוא מאפשר לאחר היווצרות autophagosome הקרוב ככל possi כble לזמן אמת 7. טכניקה זו הועסקה ראשונה ללמוד autophagy ידי Yoshimori ועמיתים 8, וכבר בשימוש יותר ויותר מעתה ואילך.
מיקרוסקופיה זמן לשגות לוכדת את הלוקליזציה של נקודות עניין בתאים חיים ועל פני תקופה של זמן. על ידי השוואת מידע זה עם autophagy ו / או אברון סמן מאופיינים היטב, ניתוח הדמיה תא חי יכול לשים את נקודת העניין בהקשר המרחב ובזמן גדול יותר של היווצרות autophagosome. ניתוח הדמיה תא חי מבוסס על הלכידה החוזרת ונשנית של לוקליזציה POI לאורך כל השלבים של היווצרות autophagosome, תוך הדמיה של תאים קבועים מבוססת על לכידה אחת. לכן, הדמיה תא חי יכולה להוכיח את התרומה של נקודות עניין בשלבים מסוימים של היווצרות autophagosome, תוך הדמיה של תאים קבועים יכולה רק להניח את התפקיד של נקודות עניין, המבוסס על הלוקליזציה הממוצעת שלה בautophagosomes רבים שנתפסו בו זמנית בשלבים שונים שלהם lifecyCLE.
למרות שהדמית תא חי היא שיטה של כוח האנליטי גבוה, יש לו כמה מגבלות מובנות, שיש להביאם בחשבון. קודם כל, הדמיה תא חי דורשת את הביטוי של אחד או יותר מחלבונים שכותרתו fluorescently אקסוגניים. תגי ניאון נוטים להיות גדול בגודל ולפעמים הם יכולים לשנות את ההתנהגות של חלבון בשל סיבות סטריות. מצב זה מודגש לחלבונים בממברנה, כפי שהם צריכים כדי לתפקד במרחב המוגבל של 2 ממדים של ממברנות. ראוי לציין, autophagosomes הם מבנים קרומיים, ובהתאם להיווצרותם דורשת מספר רב של חלבוני קרום הקשורים.
קבוצה נוספת של בעיות קשורה לרמות הביטוי של נקודות עניין. באופן עקרוני, צריך לבוא לידי ביטוי חלבון אקסוגני ברמות דומות לחלבון אנדוגני. הדבר מבטיח כי רגולטורים חשובים של לוקליזציה משנה הסלולר שלו לא רוויים, והניתוח דואר יהיה רלוונטי מבחינה ביולוגית. יתר על כן, יש להימנע מביטוי יתר של חלבוני autophagy, כפי שהם באים לידי ביטוי כאשר מעל הרמות אנדוגניים, הם נוטים לדכא את תגובת autophagy 9. לעומת זאת, מאחר שרמות הביטוי של נקודת העניין צריך להיות גבוה מספיק כדי לאפשר ביצוע הלוקליזציה שלה לתקופה טובה של זמן בלי תמונה הלבנת-, יש פשרה שהושגה. רמות הביטוי האופטימליות של חלבון בתאי אקסוגני mammalians השגת דורשת הרבה כוונון עדין, אבל זה אפשרי על ידי ההקמה וסינון שורות תאים ביציבות להביע רמות של נקודות עניין שונות.
הרזולוציה מרחבית שניתן להשיג עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הסטנדרטי היא עוד גורם מגביל. ההחלטה עשויה להיות מוגבלת למספר הסיבות, אבל במקרה טוב, ברזולוציה רוחב תהיה סביב 250 ננומטר. משמעות דבר היא כי כל החפץ מופרד על ידי מרחק קטן יותר מזה יופיע מחובר (או כאחתאובייקט) ואובייקטים קטנים מ -250 ננומטר יהיו מיוצגים בתמונה הגדולה יותר ממה שהם באמת. לכן תמונות צריכים תמיד לפרש עם זה בחשבון וטכניקות משלימות כגון EM תידרש לפתור בפירוט אולטרה מבני בסדר.
לבסוף, הדמיה תא חי מטבעו דורשת חשיפת תא לאור, שעלול להיות לתקופה ממושכת של זמן. זה עשוי לשנות את התגובות הפיזיולוגיות של תא, תופעה הידועה בצילום רעילות.
אנחנו השתמשנו בהצלחה הדמיה תא חי של חלבון PI3P מחייב DFCP1 לתאר בפעם הראשונה שautophagosomes מקורן מבני PI3P עשירים דמויי טבעת omegasomes כינה, הנמצאים בקשר הדוק עם חדר מיון גדילים 10,11. באופן ברור יש לנו הראינו כי מבני LC3 חיוביים להתחיל להרכיב בשיתוף הדוק עם omegasomes. אנחנו כאן מצביעים על כך שהעסקת שורת תאים להביע GFP-DFCP1 יציבות לתא החיהדמיה של החלבון של עניין, קובעת מסגרת מרחב ובזמן חזקה לאפיון של תפקידה בהיווצרות autophagosome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תא
- מספר מעבר הנמוך של תאי זרע HEK-293T להביע ביציבות ה-GFP-DFCP1 על 22 מ"מ coverslips עגול, תאי תרבות לילה בבינוני של Dulbecco הנשרים שונים (DMEM), לconfluency של 30-40% (למטרת confluency של 80% לאחר 2 ימים - יום של הדמיה תא חי).
2. Transfection הסלולרי
- מכין את התערובת המורכבת transfection לכל צלחת, המכיל OptiMEM μl 100 שהפחתי בינוני סרום, 3 מגיב Transfection DNA μl X-tremeGENE 9, ו0.5 מיקרוגרם של pECFP-LC3 פלסמיד דנ"א. מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה והדגירה 15 דקות בטמפרטורת חדר. [הערה: יש לנו שוב ושוב כי מצאנו ריאגנטים transfection אחרים, כגון Lipofectamine 2000, יש לי הרבה של רעילות, ובנוסף, הם מייצרים חלקיקי ניאון בעצמם שמפריעים לשיטות מיקרוסקופיה רבות.]
- לשאוב את המדיום מהצלחות ולהוסיף טרי DMEM מראש התחמם ב 37 ° C.
- הוסף טראןsfection המורכב לתאים על ידי pipetting; תאי דגירה למשך 24 שעות.
3. דגירה סלולרי עם מרקר אברון (אופציונלי)
- הוסף MitoTracker / Lysotracker לDMEM בריכוז סופי של 75 ננומטר, ולשמור על קרח, בצינור פלקון מכוסה ברדיד אלומיניום, לאורך כל היום, ניסיוני, כדי להימנע מחשיפה לאור והקפאה חוזרת ומחזורי הפשרה.
- הסר aliquot של 2 מ"ל של מדיום המכיל Lysotracker MitoTracker / ולהתחמם על 37 מעלות צלזיוס, לשאוב ממדיום תאי transfected ולהחליף עם MitoTracker / Lysotracker המכילים בינונית ותאי דגירה במשך 30 - 60 דקות.
4. הכנה של תא דגירה הדמיה תא חי (איור 1)
- נקי מתכת ופלסטיק O-טבעות עם אתנול 75% ולמרוח משחה סיליקון על שפת מתכת O-Ring.
- בעזרת מלקחיים להסיר coverslip מהצלחת ולייבש את העודפים של מדיום מהצד התחתון של coverslip,כדי להימנע מערבוב מדי בינונית עם השומן, כמו זה יגדיל את הסבירות לדליפה.
- השאר את coverslip לנוח על האדן של O-טבעת הפלסטיק והמתכת תתאים טבעת O על גבי O-טבעת הפלסטיק, עם coverslip דחוקה שביניהם, על מנת ליצור תא סגור.
- תא עליון עם המדיום מהצלחת; מנקודה זו והלאה, למנוע דגירה ממושכת של התאים במדיום DMEM ללא סוכן חציצה, כדי למנוע שינויים בחומציות להתרחש, שכן מערכת חיץ סודה לDMEM דורשת ריכוז CO 2 מלאכותי של 5-10% וריכוז CO 2 מאוויר הסביבה הוא הרבה יותר נמוך.
5. רעב של תאים
- שים את תא הדגירה על הבמה מיקרוסקופ.
- לשאוב את המדיום השלם ולשטוף עם 2 מ"ל של מדיום רעב 3 פעמים, כדי לוודא ששום חומצות אמינו נותרו מDMEM, שסופו של דבר לעכב את תגובת autophagy; להגדירשעון עצר.
6. מיקרוסקופיה
- מערכת הדמיה מתאימה מוגדרת לתא חי רחב בתחום הקרינה עלית תידרש. זה יהיה בדרך כלל מהווה מסגרת מיקרוסקופ הפוכה מחקר בכיתה, אינטנסיביים ספקטרום רחב מקור אור, מראות ומסננים ספציפיות לחלבון פלואורסצנטי (ים) / הצבע (ים) של עניין, עדשה אובייקטיבית באיכות גבוהה, CCD / sCMOS רגיש מצלמה ותא דגירה. כל היצרנים הגדולים מציעים מערכות מיקרוסקופ שדה רחבות מלאות מתאימים להדמית תא חי, אבל זה אפשרי גם לבית לבנות מערכת תוך שימוש ברכיבים ממגוון רחב של יצרנים ולשלוט בו באמצעות תוכנות קוד פתוחות כגון מיקרו מנהל (http: / / Valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki /). ההיבט החשוב ביותר לדעתנו הוא להשתמש במערכת של רגישות גבוהה, כך שיכולות להיות כל הזמן את רמות הביטוי של כתבי הניאון למינימום.
- סילecting התאים המתאימים לתמונה.
- בחר תאים גדולים ושטוחים שיאפשר אירועי היווצרות autophagosome יותר להיות בשבי. כמו כן, לבחור עבור תאים שכבר התחילו לייצר מספר גדול יותר של omegasomes.
- התחל לכידת וידאו לאחר 30 דקות או גם לתוך תגובת autophagy, על מנת ללכוד את יחס גדול יותר של אירועי היווצרות autophagosome לוידאו.
- הדמיה.
- השתמש בעדשת ההגדלה גבוהה (100x 1.4 NA).
- התאם את עוצמת אור עירור ל10-20% ממקסימום כדי למנוע הלבנת תמונה.
- הגדר את המצלמה (Hamamatsu ORCA ER, גודל פיקסל 6.45 מיקרומטר) ל100-500 חשיפת אלפיות שנייה, binning 2x2 ו100 רווח.
- הגדר קצב רכישת תמונה למסגרת 1 בכל 10 שניות.
7. יצירת מצרפי תמונות של אירועי גיבוש Autophagosome עם ImageJ
[ניתן לעשות זאת בצורה שאינה שיטתית, פשוט על ידי סריקת וידאו הממוזג לדוארפתחי אוורור של עניין, אבל זה גם יכול להיות שיטתי כמפורט להלן.]
- ערימות תמונה פתוחות 3 (או 2) כבשו בערוצי ImageJ / פיג'י.
- החל LUT ירוק, אדום והכחול (לוחות בדיקה) לערוץ המקביל; למזג 3 צבעים ולשמור.
- מכרטיסיית ניתוח, בחר כלים> ההחזר על ההשקעה של מנהל ... > ציין, לאחר מכן בחר אזור אקראי של גודל מוגדר בתמונה הראשונה של הערימה.
- בכרטיסייה התמונה, בחר לשכפל, כדי לשכפל את האזור שנבחר מתוך הערימה.
- בכרטיסייה התמונה, בחר ערימות> הפוך מונטאז' ... כדי ליצור מונטאז' מהוסס המכיל את כל המסגרות שנתפסו. לסרוק את כל המסגרות במונטאז' לאירוע היווצרות autophagosome מלאה; לשמור על הערות של המסגרת הראשונה והאחרונה של האירוע.
- מכרטיסיית ניתוח, בחר כלים> ההחזר על ההשקעה של מנהל ... בחר את אותו האזור בתמונה הראשונה של הערימה של 2 צבעים האחרים, כמו גם לתמונת הצבעים הממוזגת ולשכפל את הערימות.
- מלאהוא קובץ כרטיסייה, בחר> תמונה חדשה, ולהגדיר לרוחב בהתאם למספר הפיקסלים בתחילה נבחרו באמצעות מנהל ההחזר על ההשקעה, שנקבעו לגובה 4 פעמים את הגובה שנקבע בתוספת ההחזר על ההשקעה של המנהל 3 פיקסלים על שטח שבבין 3 צבעים ואת פרוסות מוזגו, וקבעו כמספר מסגרות בכל ערימה.
- בכרטיסייה התמונה, בחר ערימות> כלים> הוספה ..., ואז להכניס כל תת ערימה אחת על גבי שני, ומשאיר מרווח של 1 פיקסל באמצע.
- בכרטיסייה התמונה, בחר ערימות> הפוך מונטאז' ... כדי ליצור מונטאז' מתחיל ומסיים עם הפריים הראשון והאחרון של אירוע היווצרות autophagosome שנתפס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בפרוטוקול מתואר, השתמשנו מיקרוסקופיה זמן לשגות לעקוב הלוקליזציה של LC3 CFP מתויג בשורת תאים ביציבות להביע DFCP1 GFP-tagged, בתנאים ישכנעו autophagy. התוצאה של ניסוי זה היא לכידתו של 2 סדרה או ערימות של תמונות, אחד מירוק ואחת מהערוץ הכחול, מתאימות לGFP-DFCP1 וCFP-LC3. יש לנו עוד ניתחו את סרטי הווידאו האלה באמצעות ImageJ, על מנת ליצור מצרפי מתאימים לאירועי היווצרות autophagosome אחת, כפי שתוארו בסעיף הפרוטוקול. ניתוח זה מאפשר לנו להוכיח שautophagosome LC3 חיובי נובע מomegasome DFCP1-חיובי. במונטאז' שמוצג באיור 2, היווצרות של omegasome מתבררת מהמסגרת השנייה, בצורה של נקודה קטנה. Omegasome מתחיל הרחבת על מנת ליצור מבנה דמוי טבעת האופיינית, ומגיע לקוטר המרבי שלו לאחר 6 דקות. בשלב הבא, מתחיל omegasome גollapsing וסופו של דבר הוא נעלם, לאחר כ 10 דקות. עכשיו לשים את היווצרות מבנה LC3-החיובי או autophagosome בהקשר של היווצרות omegasome, אנו צופים כי autophagosome מופיע לאחר omegasome, והופך להיות גלוי לעין לאחר כ -1.5 דקות. Autophagosome מתחיל להרחיב בשיתוף הדוק עם נקודת omegasome, הראשונה ולאחר מכן טבעת, וכאשר מתחיל omegasome קורסת את ניצני autophagosome. סופו של דבר autophagosome נשאר מאחור, כנראה למזג עם lysosomes, לאחר omegasome נעלם. ניתוח זה מספק אינדיקציה ברורה על הקשר הפונקציונלי בין 2 המבנים, לפיו LC3 autophagosomes חיובי מקורן omegasomes המקביל.
בדוגמה נוספת, הוסיפו גשש יזוזום על מנת ללכוד את הקשר של הזמן ומרחב של autophagosome להרכיב עם lysosomes (איור 3
עם זאת, אותו הסוג של ניתוח יכול להניב תוצאות uninterpretable, בשל מגוון רחב של סיבות. בדוגמא שמוצגת באיור 4, התוצאות הפכו uninterpretable בשל להיסחף בפוקוס. וידאו מתחיל ללכוד את היווצרות autophagosome בהצלחה, עם זאת להיסחף בפוקוס מתרחש לאחר סימן 3 דקות. לכידת הווידאו ממשיכה מחוץ לפוקוס ל6 דקות הבאים, אבל בסופו של המוקד הוא תיקן באופן ידני אחרי סימן דקות 9 עד 10. ניתוח זה אם כי, עושה אי אפשר להפלות בין אם אירוע היווצרות autophagosome נתפס כאשר המוקד הוא תיקן הואאירוע ראשוני שבו כמעט הושלם, או אחד חדש שהחל לאחר להיסחף בפוקוס.
ניתן לייחס לבעיות נוספות confluency של התאים בתרבית. למשל, כאשר תאים גדלים בconfluency גבוה מהאופטימלי, הם נאלצים להרחיב על החלק העליון של תא סמוך, מה שהופך את ההתמקדות מאתגרת למדי. יתר על כן, תאים, כי הם גדלו בconfluency הגבוה נוטים להיות לחוצים, להגדיל את רמות פעילות autophagy רקע לפני תחילתו של הרעב.
לבסוף, נושאים הקשורים לקרינה הם נפוצים למדי. יש CFP פעילות הקרינה חלשה יותר בהשוואה לGFP, ולעתים קרובות מקבל תמונה-מולבן בשלבים מאוחר יותר של לכידת וידאו. ניתוח של קטעי וידאו מסוג זה יכול להוביל למסקנות שליליות כוזבות על עמותת מרחבי של POI עם autophagosomes יוצרים. עם זאת, ניתן להתגבר על בעיות אלה על ידי שימוש באחת מהגרסות כגון mTurquise2. עוד phenomeno המשותףn נובע מכך שהקרינה של תגים אדומים היא לא תרווה ב-pH נמוך יותר של lysosomes. חלבוני autophagy רבים מבחינה פיזיולוגית לסיים את מחזור החיים שלהם לתוך lysosomes, בעוד autophagosomes סופו של דבר להתמזג עם lysosomes. יתר על כן, חלבונים שאינם פונקציונליים לעתים קרובות מטרה להשפלה בlysosomes. לכן, עלול בסופו בעקבות העמותה שאינה קשורה לautophagosomes עם lysosomes, במקום עמותה פיזית ממשית של בין נקודות עניין וomegasomes האדומים מתויגים.
איור 1. תא דגירה. O-טבעת הפלסטיק מתאימה סביב השפה של O-טבעת המתכת ויש לו בתחתית מעקה צר המשתרע פנימה. Coverslip מונחת על המדף של O-טבעת הפלסטיק, ולאחר מכן O-טבעת הפלסטיק מצוידת בתחתית מתכת O-Ring. בדרך זו, היא coverslip חולwiched בין 2 הטבעות האטימות, יצירת תא סגור.
איור 2. תאים להביע GFP-DFCP1 וCFP-LC3 הורעבו למשך 30 דקות וצלמו בשיעור של פריים 1 בכל 10 שניות. מונטאז' של אירוע היווצרות autophagosome נציג מוצג. אותות מערוצי ירוק וכחול ירוקים ואדום בהתאמה פסאודו בצבע. חצים מצביעים omegasome ניכר הראשון וautophagosome. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Figure 3. תאים להביע GFP-DFCP1 וCFP-LC3, הודגרו עם Lysotracker אדום, הורעבו למשך 30 דקות וצלמו בשיעור של פריים 1 בכל 15 שניות. מונטאז' של אירוע היווצרות autophagosome נציג מוצג. אותות מערוצים ירוקים, אדום וכחול הם פסאודו בצבע ירוק, כחולה ואדום בהתאמה. חצים מצביעים omegasome ניכר הראשון וautophagosome. ראש חץ מצביע על לכידתו הראשונה של היתוך autophagosome עם יזוזום. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. תאים להביע GFP-DFCP1 וCFP-LC3 הורעבו למשך 30 דקות וצלמו בשיעור של פריים 1 בכל 10 שניות. מונטאז' של דוגמה של תת-O לכידת ptimal מוצגת. אותות מערוצי ירוק וכחול ירוקים ואדום בהתאמה פסאודו בצבע. חצים מצביעים omegasome ניכר הראשון וautophagosome. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
וידאו 1. וידאו של אירוע היווצרות autophagosome מוצג באיור 2. שיעור ההשמעה הוא 4 פריימים לשנייה. לחץ כאן לצפייה בסרט.
וידאו 2. וידאו של אירוע היווצרות autophagosome מוצג באיור 3. מצביע החץ ראשון, היווצרות של omegasome, ושנית, שילוב של autophagosome עם יזוזום. שיעור ההשמעה הוא 4 פריימים לשנייה."> לחץ כאן לצפייה בסרט.
וידאו 3. וידאו של אירוע היווצרות autophagosome מוצג באיור 4. שיעור ההשמעה הוא 4 פריימים לשנייה. לחץ כאן לצפייה בסרט.
טבלת מס '1. רשימה של חומרים כימיים ספציפיים וציוד הנדרשים לפרוטוקול, יחד עם ספק המקביל ומספר קטלוגים.
חוצצים
| חוצץ | הרכב | שלב משומש |
| בינוני רעב | 20 מ"מ 7.4 pH HEPES | 5.2 |
| 140 מ"מ NaCl | ||
| 1 מ"מ CaCl 2 | ||
| 1 מ"מ MgCl 2 | ||
| גלוקוז 5 מ"מ | ||
| BSA 1% |
טבלת 2. רשימה של מאגרי שימוש בפרוטוקול זה. מאגרי המשמשים, הרכבם והצעד הראשון שבו הם נמצאים בשימוש בפרוטוקול מפורטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה שתוארה בפרוטוקול זה מאפשרת הדמיה של הלוקליזציה של חלבון במהלך היווצרות autophagosome. יש לנו ניסינו שיטות שונות של לדמיין את האירועים מתוארים בי-סריקת נקודת confocal, ספינינג confocal דיסק וקרינת השתקפות הכל (TIRF) מיקרוסקופיה. מצאנו כי למטרות כלליות סטנדרטית עלית הקרינה רחבה בתחום מספקת את הפשרה הטובה ביותר בין רגישות ורזולוציה. הדבר מבטיח אות לרעש טובה, photo-bleaching/photo-toxicity מינימאלי ורכישה מהירה. חוסר חתך אופטי הוא לא בעיה אם האזורים המתאימים של התא נבחרים לתמונה כלומר בפריפריה שבו התא מתפשט ושטוחה. עם זאת, חשוב שמערכת ההדמיה משמשת מוגדרת כראוי (הן במונחים של החומרה המשמשת ואת הגדרות המערכת).
לרזולוציה מרחבית הטובה ביותר, מומלץ להשתמש בהגדלה גבוהה, hעדשת igh מספרית צמצם שמן טבילה (עדשות טבילה במים לא תציע כל הדמיה יתרון בסמיכות לcoverslip). הוא הציע לאזן את עוצמת ההארה (למשל עם מסנני צפיפות ניטראליים), את הגדרות המצלמה (זמן חשיפה, binning ורווח) על מנת למקסם את האות לרעש ולמזער את הלבנת. זה צריך להיעשות באופן אמפירי, אבל כמדריך, בעת שימוש בעדשת NA 1.4 100x אנחנו בדרך כלל לצמצם את כוחו של אור העירור שלנו 10-20% ממקסימום ולהגדיר את המצלמה (Hamamatsu ORCA ER, גודל פיקסל 6.45 מיקרומטר) ל100-500 חשיפת אלפיות שנייה, binning 2x2 ו100 רווח.
שיעור רכישת התמונה צריך להיות מוגדר בטווח של פריים 1 בכל שנייה 1-10. רכישת תמונות במסגרת שיעורים גבוהים יותר יהיה טובה יותר להבטיח המשכיות בין תמונות (רזולוציה של זמן טוב יותר), אבל יחשוף את התאים ליותר אור וכך להגדיל photo-bleaching/photo-toxicity.
אם הדמיה יותר fluorescencערוצים אלקטרוניים, יש בו כדי להבטיח שהעיכוב בין לכידת ערוץ ממוזער (לצמצם את זמן חשיפה, תתאים חלפני סינון מהירים). זה יקטין את הסיכוי לממצא תנועה המופיע בתמונה המורכבת. אם ממצא תנועה מוכיח קשה להימנע מלשקול את השימוש במפצל תמונה (מכשיר כדי להקל על הרכישה בו זמנית של שני ערוצי הקרינה באמצעות מצלמה אחת) או מתאם מצלמה כפול.
הדמיה כחולה ערוץ דורש בחירה של מסננים ומראות מתאימים כדי למנוע צולבת פליטה של הקרינה הכחולה למסלול הירוק. אנחנו השתמשנו בהצלחה מיקרוסקופ CellR אולימפוס, אשר עושה שימוש בנורת ה-V עד צבעונית, המאפשר בחירה ספציפית של אורך גל, רוחב פס ועוצמתו וכך הוא מאוד גמיש. עם זאת, מקור האור הוא "דולף" עם קצת אור לבן מגיע דרך בנוסף לwavelengths.For נבחר מסיבה זו יש לנו מצוידת (רב) מסנני עירור bandpass בקוביות, כך שיש נוספות סינון של אור העירור. השילוב הבא של מראות / מסננים שימש (כל Semrock). לGFP & mCherry: Exciter FF01-479-585, פולט FF02-525/40 (GFP) וFF01-607/36 (mCherry), Dichroic מירור FF505/606-Di01. לCFP: FF01-416/501 Exciter, פולט FF01-523/610, Dichroic מירור FF440/520-Di01. יש לנו גם השתמשנו במיקרוסקופ CellR שונה, אשר נתן תוצאות תת אופטימליות, עם צולבת פליטה של הקרינה כחולה למסלול הירוק. מיקרוסקופ זה משתמש במקור אור לבן ויש לו גלגל מסנן מהיר כדי לבחור את wavelengths.This העירור אומר שבחירת אורך הגל מוגבלת ל8 המסננים בגלגל, אבל יש גלגל נפרד לווסת העצמה. השילוב הבא של מראות / מסננים היה בשימוש. עבור ה-GFP (Semrock): FF01-470/40 Exciter, פולט FF02-525/50, Dichroic מירור FF495-Di02. לCFP וmCherry: Exciter FF01-427/10 (CFP, Semrock) 572/23 (mCherry, Chroma), פולט FF01-472/30 (CFP, Semrock) 632/60 (mCherry, Chroma), Dichroic מירור 89006bs (Chroma).
משמעותה של טכניקה זו בהשוואה לשיטות הדמיה אחרות היא כפול: ראשית, הוא יכול ללכוד את הלוקליזציה של החלבון של עניין בתאים חיים, ושנית, היא יכולה להגדיל את המידע שחולץ הוספת הממד הרביעי של זמן. עם זאת, כמו חלבונים אקסוגניים תמיד יש את האפשרות של mislocalization, או בשל רמות ביטוי מוגברים או בשל תיוג, הדמיה תא חי ולכן צריכה להיות משולבת עם חיסוני מכתים של POI אנדוגני בתאים קבועים, על מנת לאשש את התוצאות . לבסוף, ראוי לציין כי הדמיה תא חי יכולה להיות משולבת עם EM חיסוני, על מנת להגדיל את הרזולוציה המרחבית של הניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
העבודה שלנו היא נתמכת על ידי ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה. ברצוננו להודות לפרופ 'Tamotsu Yoshimori לחביבות לספק לנו עם פלסמיד לביטוי של CFP-LC3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41965 | |
| OptiMEM I | Invitrogen | 31985-062 | |
| MitoTracker Red FM | Invitrogen | M22425 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche Applied Science | 6365787001 | |
| 22 mm coverslips | VWR | 631-0159 | |
| 35 mm plates | Fisher NUNC | 153066 | |
| Silicon grease | RS Components Ltd. | RS 494-124 | |
| O-rings | Custom made | ||
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A-7816 | Suggested alternative to custom-made O-rings |
| Microscope | Olympus | IX81 | Inverted microscope |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 100XO | N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5 |
| Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600 10B | Progressive scan interline CCD |
| Illuminator | TILL Photonics | Polychrome V | Ultrafast monochromator |
| Incubation chamber | Solent Scientific | Cell^R IX81 | |
| Software | Olympus | SIS xcellence |
References
- Mizushima, N. Autophagy: process and function. Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of Atg proteins in autophagosome formation. Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).
- Klionsky, D. J. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).
- Klionsky, D. J. Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve. Autophagy. 4, 740-743 (2008).
- Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).
- Hayashi-Nishino, M., et al. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Mizushima, N., et al. Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).
- Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy. 6, 764-776 (2010).
- Axe, E. L., et al. Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).
- Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue. Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).
