Summary
الوقت الفاصل بين المجهري من علامات الالتهام الذاتي fluorescently المسمى يسمح رصد استجابة الالتهام الذاتي ديناميكية مع القرار الزماني عالية. باستخدام الالتهام الذاتي محددة وعلامات عضية في مزيج من 3 ألوان مختلفة، ونحن يمكن أن يتبع مساهمة بروتين لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي في سياق المكاني والزماني قوية.
Abstract
الالتهام الذاتي هو استجابة الخلوية الناجمة عن نقص المواد الغذائية، وخاصة لعدم وجود الأحماض الأمينية. يتم تعريف الالتهام الذاتي من قبل تشكيل هياكل غشاء مزدوج، ودعا autophagosomes، أن تنحية السيتوبلازم والبروتينات طويلة الأمد والمجاميع البروتين، العضيات معيب، وحتى الفيروسات أو البكتيريا. Autophagosomes تلتحم في نهاية المطاف مع الجسيمات الحالة مما يؤدي إلى تدهور الجزء الأكبر من محتواها، مع المواد الغذائية المنتجة التي يجري إعادة تدويرها مرة أخرى إلى السيتوبلازم. ولذلك، الالتهام الذاتي هو أمر حاسم لتوازن الخلية، والتقلبات من الالتهام الذاتي يمكن أن يؤدي إلى المرض، وأبرزها تنكس عصبي والشيخوخة والسرطان.
تشكيل جسيم بلعمي ذاتي هو عملية معقدة جدا، لالخلايا التي خصصت مجموعة معينة من البروتينات، ودعا الآلية الأساسية الالتهام الذاتي. الآلية الأساسية الالتهام الذاتي ويكمل وظيفيا من البروتينات إضافية تشارك في العمليات الخلوية المتنوعة، على سبيل المثال في MEMBRANالاتجار ه، في علم الأحياء الميتوكوندريا والليزوزومية. التنسيق بين هذه البروتينات لتشكيل وتدهور autophagosomes يشكل استجابة ديناميكية للغاية ومتطورة من الالتهام الذاتي. تصوير الخلايا الحية يسمح احد لمتابعة مساهمة الجزيئي للبروتين كل المتصلة الالتهام الذاتي وصولا الى مستوى حدثا تشكيل جسيم بلعمي ذاتي واحد وفي الوقت الحقيقي، وبالتالي هذه التقنية توفر دقة الزمانية والمكانية العالية.
هنا نستخدم خط خلية معربا عن GFP-DFCP1 ثابت، لتأسيس السياق المكاني والزماني لتحليلنا. DFCP1 علامات omegasomes، التي هي هياكل السلائف تؤدي إلى تشكيل autophagosomes. يمكن أن تكون علامة A البروتين من الفائدة (POI) مع إما أحمر أو أزرق سماوي علامة فلوري. العضيات المختلفة، مثل ER، الميتوكوندريا والجسيمات الحالة، وتشارك في جميع الخطوات المختلفة من تشكيل جسيم بلعمي ذاتي، ويمكن أن تكون علامة باستخدام صبغة تعقب محددة. الوقت الفاصل بين المجهري من AUTOPهاجي في هذه المجموعة التجريبية أعلى، يسمح للمعلومات ليكون استخراجه عن البعد الرابع، أي وقت. ومن هنا يمكننا أن اتباع مساهمة POI إلى الالتهام الذاتي في المكان والزمان.
Introduction
الالتهام الذاتي هو عملية ديناميكية للغاية، الأمر الذي يتطلب التنسيق لعدد كبير من البروتينات لالنتيجة النهائية لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي 1-3. المجهري هو على الارجح تقنية تطبيقها الأكثر شيوعا لدراسة الالتهام الذاتي 4. توطين معظم البروتينات الالتهام الذاتي وقد درس على نطاق واسع في الخلايا الثابتة، سواء من جانب المناعية تلطيخ البروتينات الذاتية والتعبير عن الموسومة fluorescently البروتين الخارجية. وبالإضافة إلى ذلك، وقد وصفت المجهر الإلكتروني (EM)، وحده، وبالاشتراك مع وضع العلامات المناعية الذهب، التفاصيل الدقيقة لهذه الهياكل 5،6. على الرغم من حقيقة أن وضعت هذه التقنيات فهمنا لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي في الأبعاد 3 من الفضاء، إلا أنهم فشلوا في توفير كمية كافية من المعلومات حول البعد ال 4 - الوقت. تصوير الخلايا الحية يتغلب على هذا الحاجز كما أنه يسمح في أعقاب تشكيل جسيم بلعمي ذاتي أقرب ما possiبلي لفي الوقت الحقيقي 7. كان يعمل هذا الأسلوب الأول لدراسة الالتهام الذاتي من قبل Yoshimori وزملاؤه 8، واستخدمت على نحو متزايد من الآن فصاعدا.
الوقت الفاصل بين المجهري يلتقط توطين POI في الخلايا الحية وعلى مدى فترة من الزمن. من خلال مقارنة هذه المعلومات مع الالتهام الذاتي جيدا اتسم و / أو علامة عضية، يمكن تحليل التصوير الخلية الحية وضع POI في سياق المكاني والزماني أكبر من تشكيل جسيم بلعمي ذاتي. ويستند تحليل التصوير الخلية الحية على اسر المتكررة من توطين POI على طول جميع الخطوات من تشكيل جسيم بلعمي ذاتي، في حين يستند التصوير من الخلايا الثابتة على التقاط واحدة. لذلك، يمكن تصوير الخلايا الحية تثبت مساهمة POI في خطوات محددة من تشكيل جسيم بلعمي ذاتي، في حين التصوير من الخلايا الثابتة إلا أن نفترض دور POI، على أساس متوسط التوطين في العديد من autophagosomes القبض في وقت واحد في مراحل مختلفة من lifecy بهمكلي.
على الرغم من أن التصوير الخلية الحية هي طريقة لقوة تحليلية عالية، لديها بعض القيود المتأصلة، التي ينبغي أن تؤخذ بعين الاعتبار. بادئ ذي بدء، تصوير الخلايا الحية يتطلب التعبير عن واحد أو أكثر من البروتينات الخارجية fluorescently المسمى. به نيون تميل إلى أن تكون كبيرة في حجمها وأنها يمكن أن يغير في بعض الأحيان سلوك من البروتين وذلك لأسباب الفراغية. ويتفاقم هذا الوضع بالنسبة للبروتينات الغشاء، لأنها تحتاج لتعمل في مساحة محدودة من أبعاد 2 من الأغشية. من المذكرة، autophagosomes هي هياكل غشائي، وفقا لتكوينها يتطلب عددا كبيرا من البروتينات المرتبطة الغشاء.
يتم توصيل مجموعة أخرى من المشاكل إلى مستويات التعبير من POI. من حيث المبدأ، ينبغي التعبير عن بروتين الخارجية عند مستويات مماثلة لبروتين الذاتية. وهذا يضمن أن المنظمين هامة للتوطين في شبه الخلوية لن تكون مشبعة، وعشرةوتحليل ه تكون ذات صلة من الناحية البيولوجية. وعلاوة على ذلك، ينبغي تجنب overexpression من البروتينات الالتهام الذاتي، كما هو الحال عندما يتم التعبير عنها فوق المستويات المحلية، فإنها تميل إلى تثبيط استجابة الالتهام الذاتي 9. وعلى العكس، منذ مستويات التعبير عن POI ينبغي أن تكون عالية بما يكفي للسماح بعد الأقلمة الذي تضطلع به لفترة جيدة من الوقت بدون صورة تبيض، حلا وسطا لابد من التوصل إليها. تحقيق مستويات التعبير الأمثل من البروتين في الخلايا الخارجية mammalians يتطلب الكثير من ضبط، ولكن كان من الممكن من خلال إنشاء وفحص خطوط الخلايا معربا عن ستابلي مستويات مختلفة من POI.
القرار المكانية التي لا يمكن أن يتحقق مع المجهري مضان هو معيار عامل آخر يحد. قد يكون القرار محدودة لعدد من الأسباب، ولكن في أحسن الأحوال، سوف يكون القرار الجانبي حوالي 250 نانومتر. وهذا يعني أن أي أجسام مفصولة مسافة أصغر من هذا سوف تظهر متصلة (أو كوحدة واحدةكائن) وكائنات أصغر من 250 نانومتر سوف تكون ممثلة في الصورة أكبر مما هي عليه في الواقع. ولذلك ينبغي دائما أن تفسر الصور مع هذا في الاعتبار، وسوف تكون هناك حاجة تقنيات تكميلية مثل EM لحل التفاصيل فائقة الهيكلية غرامة.
وأخيرا، تصوير الخلايا الحية يتطلب بطبيعته تعريض الخلايا للضوء، ويحتمل أن تكون لفترة طويلة من الزمن. وهذا قد يغير من الاستجابات الفسيولوجية للخلية، وهي ظاهرة تعرف باسم صورة سمية.
لقد استخدمت بنجاح التصوير الخلية الحية من البروتين PI3P ملزم DFCP1 لوصف للمرة الأولى التي تنشأ من autophagosomes الغنية PI3P مثل خاتم الهياكل omegasomes يطلق عليه، والتي هي في ارتباط وثيق مع فروع ER 10،11. لقد أظهرنا بوضوح أن هياكل إيجابية LC3 بدء تشكيل في ارتباط وثيق مع omegasomes. نقترح هنا أن توظيف خط خلية معربا عن GFP ثابت-DFCP1 للخلية الحيةالتصوير من البروتين من الفائدة، ويضع الإطار المكاني والزماني قوي لتوصيف دورها في تشكيل جسيم بلعمي ذاتي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الخلية
- البذور منخفضة عدد مرور الخلايا HEK-293T معربا عن ستابلي GFP-DFCP1 في 22 coverslips على جولة مم؛ خلايا الثقافة بين عشية وضحاها في متوسطة Dulbecco التعديل النسور في (DMEM)، إلى confluency من 30-40٪ (الهدف لconfluency من 80٪ بعد 2 أيام - يوم من التصوير الخلية الحية).
2. ترنسفكأيشن الخلية
- تحضير مزيج ترنسفكأيشن المعقدة لكل لوحة، والتي تحتوي على 100 ميكرولتر OptiMEM أنا خفضت المتوسطة المصل، 3 ميكرولتر X-tremeGENE 9 الحمض النووي الكاشف ترنسفكأيشن، و 0.5 ميكروغرام من pECFP-LC3 DNA البلازميد. المزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا واحتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. [ملاحظة: لقد وجدنا مرارا وتكرارا أن الكواشف ترنسفكأيشن أخرى، مثل Lipofectamine عام 2000، لديهم الكثير من سمية، وبالإضافة إلى ذلك، فإنها تنتج جزيئات الفلورسنت من تلقاء نفسها التي تتداخل مع العديد من تقنيات الفحص المجهري.]
- نضح المتوسطة من لوحات وإضافة جديدة DMEM قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية.
- إضافة ترانsfection المعقدة للخلايا قبل pipetting؛ الخلايا احتضان لمدة 24 ساعة.
3. الحضانة الخلية مع ماركر العضيم (اختياري)
- إضافة mitotracker / lysotracker إلى DMEM في تركيز النهائي من 75 نانومتر، والحفاظ على الجليد، في أنبوب فالكون مغطاة رقائق الألومنيوم، وعلى طول يوم كامل التجريبية، لتجنب التعرض للضوء وتجميد متكررة ودورات الذوبان.
- إزالة قسامة من 2 مل من mitotracker / lysotracker المحتوية المتوسطة والاحماء عند 37 درجة مئوية؛ نضح المتوسطة من الخلايا transfected واستبدالها مع mitotracker / lysotracker التي تحتوي على الخلايا المتوسطة واحتضان لمدة 30 - 60 دقيقة.
4. إعداد غرفة الحضانة ليعيش التصوير خلية (الشكل 1)
- نظيفة المعدن والبلاستيك O-حلقات مع 75٪ من الإيثانول وتطبيق الشحوم السيليكون على حافة من المعدن يا الدائري.
- باستخدام ملقط إزالة ساترة من لوحة وتجفيف الفائض من المتوسط من الجانب السفلي من ساترة،لتجنب الخلط كثيرا المتوسطة مع الشحوم، حيث سيؤدي ذلك إلى زيادة احتمال تسرب.
- ترك ساترة للراحة على الحافة من البلاستيك يا الدائري وتناسب المعدن O-حلقة على الجزء العلوي من البلاستيك يا الدائري، مع ساترة تقع في بين، من أجل إنشاء غرفة مغلقة.
- أعلى حتى مع غرفة متوسطة من لوحة، من هذه النقطة، وعلى، وتجنب الحضانة لفترات طويلة من الخلايا في DMEM المتوسطة دون وكيل التخزين المؤقت، لمنع التغييرات في الرقم الهيدروجيني إلى أن يحدث، حيث ان النظام العازلة بيكربونات DMEM يتطلب الاصطناعي تركيز CO 2 من 5-10٪ وتركيز CO 2 من الهواء المحيط هو أقل من ذلك بكثير.
5. تجويع الخلايا
- وضع غرفة الحضانة على المسرح المجهر.
- نضح المتوسطة كاملة ويغسل مع 2 مل من المتوسط المجاعة 3 مرات، لضمان عدم وجود الأحماض الأمينية ظلت من DMEM، والتي سوف تمنع في نهاية المطاف استجابة الالتهام الذاتي؛ تعيينتوقيت ON.
6. المجهر
- وسوف تكون هناك حاجة إلى نظام التصوير المناسبة لتكوين الخلية الحية واسعة المجال برنامج التحصين الموسع ومضان. هذا وسوف تتألف عادة من الدرجة البحوث إطار مجهر مقلوب، مكثفة واسعة الطيف مصدر الضوء، والمرايا والفلاتر محددة لبروتين فلوري (ق) / صبغ (ق) من الفائدة، عدسة الهدف جودة عالية، وCCD الحساسة / sCMOS كاميرا وغرفة الحضانة. جميع الشركات المصنعة الكبرى المجهر نقدم أنظمة واسعة المجال الكامل المناسبة لتصوير الخلايا الحية، ولكن من الممكن أيضا أن المنزل بناء نظام باستخدام مكونات من مجموعة متنوعة من الشركات المصنعة والسيطرة عليه باستخدام البرمجيات مفتوحة المصدر مثل الصغرى، مدير ( HTTP: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki / ). الجانب الأكثر أهمية في رأينا هو استخدام نظام من حساسية عالية جدا، بحيث يمكن أن تظل مستويات التعبير للصحفيين الفلورسنت إلى أدنى حد ممكن.
- SELecting الخلايا المناسبة لصورة.
- حدد الخلايا الكبيرة والمسطحة التي تسمح الأحداث تشكيل أكثر جسيم بلعمي ذاتي ليتم القبض. أيضا، اختيار الخلايا التي قد بدأت بالفعل إنتاج عدد أكبر من omegasomes.
- بدء تسجيل الفيديو بعد 30 دقيقة أو جيدا في الاستجابة الالتهام الذاتي، من أجل الاستيلاء على نسبة أكبر من الأحداث تشكيل جسيم بلعمي ذاتي في الفيديو.
- التصوير.
- استخدام عدسة التكبير عالية (100X 1.4 NA).
- ضبط كثافة الضوء الإثارة إلى 10-20٪ من الحد الأقصى لمنع الصور تبيض.
- ضبط الكاميرا (هاماماتسو ORCA ER، حجم بكسل 6.45 ميكرون) إلى 100-500 ميللي ثانية التعرض، binning 2X2 و 100 مكسب.
- تعيين معدل الحصول على الصور ل1 الإطار كل 10 ثانية.
7. خلق التنسيقات من الأحداث تشكيل جسيم بلعمي ذاتي مع يماغيج
ويمكن أن يتم [هذا بطريقة غير منهجية ببساطة عن طريق مسح الفيديو المدمجة للبريدالمخارج من الفائدة، ولكنه يمكن أيضا أن يكون المقنن كما هو مبين أدناه.]
- مداخن صورة مفتوحة لل3 (أو 2) القبض على القنوات في ImageJ / فيجي.
- تطبيق طرفية الأخضر والأحمر والأزرق (جداول البحث) إلى القناة المقابلة؛ دمج 3 ألوان وانقاذ.
- من علامة التبويب تحليل، حدد أدوات> ROI مدير ... > تحديد، ثم حدد منطقة عشوائية من حجم محدد في الصورة الأولى من المكدس.
- من علامة التبويب صورة، حدد تكرار، بما يضاعف من المساحة المحددة من المكدس.
- من علامة التبويب صورة، حدد الأكوام> جعل المونتاج ... لإنشاء المونتاج مؤقتة تحتوي على القبض على جميع الإطارات. مسح جميع الأطر في المونتاج لاستكمال تشكيل حدث جسيم بلعمي ذاتي؛ حفاظ على الملاحظات من الإطار الأول والأخير من الحدث.
- من علامة التبويب تحليل، حدد أدوات> ROI مدير ... حدد نفس المنطقة في الصورة الأولى من المكدس لأخرى 2 الألوان وكذلك للألوان الصورة المدمجة وتكرارا المداخن.
- من tانه علامة التبويب ملف، اختر جديد> صورة، وتعيين لعرض وفقا لعدد من وحدات البكسل اختيارها في البداية باستخدام مدير ROI، تعيين لارتفاع 4 أضعاف ارتفاع تعيينها في إدارة العائد على الاستثمار بالإضافة إلى 3 بكسل للفضاء في فترة ما بين 3 ألوان ولل اندمجت، وتعيين شرائح وعدد الإطارات في كل ستاك.
- من علامة التبويب صورة، حدد الأكوام> أدوات> إدراج ...، ثم تضاف كل واحد شبه كومة على رأس آخر، وترك مساحة من 1 بكسل في بين.
- من علامة التبويب صورة، حدد الأكوام> جعل المونتاج ... لإنشاء المونتاج البدء والانتهاء مع الإطار الأول والأخير من الحدث تشكيل جسيم بلعمي ذاتي القبض عليه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في وصف البروتوكول، ونحن قد استخدمت الوقت الفاصل بين المجهري لمتابعة توطين CFP الموسومة LC3 في خط خلية معربا عن ستابلي GFP الموسومة DFCP1، في ظل ظروف حمل الالتهام الذاتي. نتائج هذه التجربة هو القبض على 2 سلسلة أو رزمة من الصور، واحدة من الأخضر واحد من القناة الزرقاء، الموافق GFP-DFCP1 وCFP-LC3. ونحن كذلك تحليل أشرطة الفيديو هذه باستخدام يماغيج، من أجل خلق مونتاج الموافق الأحداث تشكيل جسيم بلعمي ذاتي واحد، كما هو موضح في قسم البروتوكول. سمح لنا هذا التحليل لإثبات أن جسيم بلعمي ذاتي إيجابية LC3 تنبع من omegasome إيجابية DFCP1. في المونتاج هو مبين في الشكل 2، وتشكيل لomegasome يصبح واضحا من الإطار الثاني، في شكل بقعة صغيرة. وomegasome يبدأ التوسع من أجل تشكيل مثل حلقة بنية مميزة، ويصل أقصى قطر لها بعد 6 دقائق. المقبل، ويبدأ omegasome جollapsing ويختفي في نهاية المطاف، بعد ما يقرب من 10 دقيقة. وضع الآن تشكيل هيكل إيجابية LC3 أو جسيم بلعمي ذاتي في سياق تشكيل omegasome، نلاحظ أن يظهر جسيم بلعمي ذاتي بعد omegasome، وتصبح واضحة للعيان بعد حوالي 1.5 دقيقة. وجسيم بلعمي ذاتي يبدأ التوسع في ارتباط وثيق مع omegasome، بقعة أولا ثم الحلبة، وعندما يبدأ الانهيار omegasome براعم جسيم بلعمي ذاتي قبالة. في نهاية المطاف يبقى وراء جسيم بلعمي ذاتي، على ما يبدو لتندمج مع الجسيمات الحالة، بعد يختفي omegasome. يوفر هذا التحليل إشارة واضحة عن العلاقة الوظيفية بين هياكل 2، التي تنص على LC3 autophagosomes إيجابية تنبع من omegasomes المقابلة.
وفي مثال آخر، وأضاف لدينا تعقب يحلول من أجل التقاط جمعية الزمانية والمكانية للجسيم بلعمي ذاتي تشكيل مع الجسيمات الحالة (الشكل 3
ومع ذلك، يمكن لنفس النوع من التحليل تعطي نتائج uninterpretable، ويرجع ذلك إلى مجموعة متنوعة من الأسباب. في المثال المعروض في الشكل 4، وتصبح النتائج uninterpretable بسبب الانجراف في التركيز. يبدأ التقاط الفيديو بنجاح تشكيل جسيم بلعمي ذاتي، ومع ذلك الانجراف في التركيز يحدث بعد دقيقة علامة 3. وتواصل التقاط الفيديو من التركيز للدقيقة 6 القادم، ولكن في نهاية المطاف يتم تصحيح التركيز يدويا بعد 9-10 علامة دقيقة. هذا التحليل رغم ذلك، يجعل من المستحيل أن تميز ما إذا كان حدث تشكيل جسيم بلعمي ذاتي التقاطها عندما يتم تصحيح التركيز هوحدث الأولي التي يتم الانتهاء تقريبا، أو واحد جديد التي بدأت بعد الانجراف في التركيز.
ويمكن أن يعزى إلى مشاكل إضافية confluency من الخلايا المستزرعة. على سبيل المثال، عندما تزرع الخلايا في أعلى من confluency الأمثل، فإنهم يضطرون إلى توسيع على رأس خلية مجاورة، مما يجعل التركيز صعبة للغاية. وعلاوة على ذلك، الخلايا التي تزرع في ارتفاع confluency تميل إلى التشديد، وزيادة مستويات النشاط الالتهام الذاتي الخلفية قبل بدء المجاعة.
وأخيرا، والقضايا المتصلة مضان شائعة جدا. CFP له نشاط مضان أضعف بالمقارنة مع GFP، وغالبا ما يحصل الصورة مقصور في مراحل لاحقة من التقاط الفيديو. تحليل هذه أشرطة الفيديو يمكن أن يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة حول جمعية المكاني للPOI مع autophagosomes تشكيل. ومع ذلك، يمكن التغلب على هذه المشاكل عن طريق استخدام واحدة من المتغيرات مثل mTurquise2. آخر phenomeno المشتركةن تنبع من حقيقة أن مضان من العلامات الحمراء لا تطفأ في الرقم الهيدروجيني أقل من الجسيمات الحالة. العديد من البروتينات الالتهام الذاتي من الناحية الفسيولوجية إنهاء دورة حياتها في الجسيمات الحالة، في حين autophagosomes تلتحم في نهاية المطاف مع الجسيمات الحالة. وعلاوة على ذلك، غالبا ما يتم استهداف البروتينات غير وظيفية للتدهور في الجسيمات الحالة. لذلك، يمكن للمرء أن ينتهي الأمر بعد جمعية غير ذات الصلة من autophagosomes مع الجسيمات الحالة، بدلا من وجود ارتباط المادي الفعلي من بين POI الموسومة الأحمر وomegasomes.
الشكل 1. غرفة الحضانة. البلاستيك يا الدائري يلتف حول حافة معدنية O-حلقة ولها في أسفل افريز رقيقة الذي يمتد إلى الداخل. يتم وضع ساترة على الحافة من البلاستيك يا الدائري، وبعد ذلك يتم تركيب البلاستيك يا الدائري في الجزء السفلي من المعدن يا الدائري. بهذه الطريقة، ساترة هو الرمالwiched بين 2 O-الخواتم، وخلق غرفة مغلقة.
الشكل 2. تم تجويع الخلايا معربا عن GFP-DFCP1 وCFP-LC3 لمدة 30 دقيقة والتقط بمعدل 1 الإطار كل 10 ثانية. ويرد المونتاج لحدث جسيم بلعمي ذاتي تشكيل ممثل. إشارات من قنوات خضراء وزرقاء هي الزائفة الملونة الخضراء والحمراء تبعا لذلك. تبين الأسهم أول omegasome ملحوظ وجسيم بلعمي ذاتي. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
فايجوري 3. وحضنت الخلايا معربا عن GFP-DFCP1 وCFP-LC3، مع lysotracker الأحمر والتجويع لمدة 30 دقيقة والتقط بمعدل 1 الإطار كل 15 ثانية. ويرد المونتاج لحدث جسيم بلعمي ذاتي تشكيل ممثل. إشارات من قنوات الأخضر والأحمر والأزرق هي الزائفة الملونة الأخضر والأزرق والأحمر تبعا لذلك. تبين الأسهم أول omegasome ملحوظ وجسيم بلعمي ذاتي. رأس السهم يشير إلى التقاط أول من الانصهار جسيم بلعمي ذاتي مع يحلول. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 4. تم تجويع الخلايا معربا عن GFP-DFCP1 وCFP-LC3 لمدة 30 دقيقة والتقط بمعدل 1 الإطار كل 10 ثانية. A المونتاج مثال شبه O ويرد التقاط ptimal. إشارات من قنوات خضراء وزرقاء هي الزائفة الملونة الخضراء والحمراء تبعا لذلك. تبين الأسهم أول omegasome ملحوظ وجسيم بلعمي ذاتي. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
فيديو 1. فيديو للحدث تشكيل جسيم بلعمي ذاتي المعروضة في الشكل 2. في معدل التشغيل هو 4 إطارات في الثانية الواحدة. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم .
فيديو 2. فيديو للحدث تشكيل جسيم بلعمي ذاتي المعروضة في الشكل 3. يشير السهم الأول، تشكيل omegasome، والثانية، والانصهار من جسيم بلعمي ذاتي مع يحلول. معدل التشغيل هو 4 إطارات في الثانية الواحدة."> اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.
الفيديو 3. فيديو للحدث تشكيل جسيم بلعمي ذاتي المعروضة في الشكل 4. في معدل التشغيل هو 4 إطارات في الثانية الواحدة. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم .
الجدول 1. قائمة الكواشف والمعدات المحددة المطلوبة للبروتوكول، جنبا إلى جنب مع مقدم المناظرة ورقم الكتالوج.
BUFFERS
| العازلة | تركيب | الخطوة مستعملة |
| متوسطة المجاعة | 20 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4 | 5.2 |
| 140 مم كلوريد الصوديوم | ||
| 1 مم CaCl 2 | ||
| 1 ملي MgCl 2 | ||
| 5 الجلوكوز ملي | ||
| 1٪ BSA |
الجدول 2. قائمة من المخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول. المخازن المؤقتة المستخدمة، يتم سرد تكوينها والخطوة الأولى التي يتم استخدامها في البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يسمح التصور من توطين بروتين خلال تشكيل جسيم بلعمي ذاتي. لقد حاولت وسائل مختلفة من تصور وصف الأحداث بما في ذلك نقطة مسح متحد البؤر، الغزل القرص مبائر وتوتال الإسفار التأمل الداخلي (TIRF) المجهري. لقد وجدنا أن لأغراض عامة القياسية واسعة المجال برنامج التحصين الموسع ومضان يوفر أفضل حل وسط بين الحساسية والقرار. وهذا يضمن إشارة جيدة للضوضاء، photo-bleaching/photo-toxicity الحد الأدنى، واكتساب سريع. عدم وجود باجتزاء البصرية ليست المشكلة إذا تم اختيار المناطق المناسبة للخلية إلى صورة أي هامش حيث ينتشر الخليوي ومسطحة. ومع ذلك، فمن المهم أن يتم تكوين نظام التصوير المستخدمة بشكل مناسب (سواء من حيث الأجهزة المستخدمة وإعدادات النظام).
للحصول على أفضل قرار المكانية، فمن المستحسن استخدام التكبير عالية، حIGH النفط الفتحة العددية عدسة الغمر (الغمر بالماء العدسات سوف تقدم أي فائدة في التصوير مقربة من ساترة). ويقترح لتحقيق التوازن في شدة الإضاءة (على سبيل المثال مع مرشحات الكثافة محايدة)، وإعدادات الكاميرا (زمن التعرض، binning وكسب) لتعظيم إشارة إلى الضوضاء وتقليل التبييض. هذا وسوف يتعين القيام به تجريبيا، ولكن كدليل، عند استخدام 100X 1.4 NA عدسة نحن عادة تقليل قوة ضوء الإثارة جهدنا ل10-20٪ من الحد الأقصى وضبط الكاميرا (هاماماتسو ORCA ER، حجم بكسل 6.45 ميكرون) إلى 100-500 ميللي ثانية التعرض، binning 2X2 و 100 مكسب.
يجب أن يتم تعيين معدل الحصول على الصور في حدود 1 الإطار كل ثانية 1-10. سوف الحصول على الصور في أعلى معدلات الإطار ضمان استمرارية أفضل بين الصور (قرار أفضل الزمنية) ولكن سوف تعرض الخلايا لمزيد من الضوء وبالتالي زيادة photo-bleaching/photo-toxicity.
إذا التصوير أكثر fluorescencالقنوات الإلكترونية، أنه لا بد من التأكد من أن التأخير بين القبض على قناة تم تصغير (تقليل وقت التعرض، وتناسب مغير فلتر سريع). وهذا سوف يقلل من فرص الحركة الفنية التي تظهر في الصورة المركبة. إذا الحركة الفنية تثبت الصعب تجنب النظر في استخدام الخائن صورة (جهاز لتسهيل اقتناء وقت واحد من قناتين مضان باستخدام كاميرا واحدة) أو محول كاميرا مزدوجة.
يتطلب التصوير قناة الأزرق اختيار المرشحات والمرايا مناسبة لمنع انتقال الانبعاثات من مضان الزرقاء لقناة خضراء. وقد استخدمنا بنجاح CellR المجهر أوليمبوس، والذي يستخدم حتى فازة V إضاءة، مما يتيح اختيار محددة من الطول الموجي، عرض النطاق الترددي وشدة وذلك هو مرنة للغاية. ومع ذلك، فإن مصدر الضوء هو 'المتسرب' مع بعض الضوء الأبيض الذي يأتي من خلال بالإضافة إلى wavelengths.For تحديد هذا السبب قمنا تركيبها (موضوع) مرشحات الإثارة ممر الموجة فيمكعبات، حتى لا يكون هناك تصفية إضافية من ضوء الإثارة. تم استخدام التركيبة التالية من المرايا / مرشحات (كل Semrock). لGFP وmCherry: المثير FF01-479-585، باعث FF02-525/40 (GFP) وFF01-607/36 (mCherry)، مزدوج اللون مرآة FF505/606-Di01. لCFP: المثير FF01-416/501، باعث FF01-523/610، مزدوج اللون مرآة FF440/520-Di01. وقد استخدمنا أيضا المجهر CellR المختلفة، والتي أعطت نتائج دون المستوى الأمثل، مع العابرة للانبعاث مضان الزرقاء لقناة خضراء. يستخدم هذا المجهر مصدر الضوء الأبيض ويحتوي على عجلة تصفية سريعة لتحديد wavelengths.This الإثارة يعني أن اختيار الطول الموجي يقتصر على مرشحات 8 في عجلة القيادة، ولكن هناك عجلة منفصلة لتنظيم كثافة. تم استخدام التركيبة التالية من المرايا / المرشحات. لGFP (Semrock): المثير FF01-470/40، باعث FF02-525/50، مزدوج اللون مرآة FF495-Di02. لCFP وmCherry: المثير FF01-427/10 (CFP، Semrock) 572/23 (mCherry، كروما)، باعث FF01-472/30 (CFP، Semrock) 632/60 (mCherry، كروما)، مزدوج اللون مرآة 89006bs (كروما).
أهمية هذه التقنية مقارنة مع تقنيات التصوير الأخرى هي ذات شقين: أولا، فإنه يمكن التقاط توطين بروتين من الفائدة في الخلايا الحية، والثانية، فإنه يمكن زيادة المعلومات المستخرجة مضيفا البعد الرابعة من الوقت. ومع ذلك، كما هو الحال مع البروتينات الخارجية هناك دائما إمكانية mislocalization، إما بسبب زيادة مستويات التعبير أو بسبب الجغرافية، ينبغي الجمع بين التصوير الخلية الحية مع ذلك المناعية تلطيخ من POI الذاتية في الخلايا الثابتة، من أجل تأكيد النتائج . وأخيرا، فمن الجدير بالملاحظة أن يمكن الجمع بين التصوير الخلية الحية مع المناعية EM، من أجل زيادة دقة المكاني للتحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم عملنا من خلال التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث. ونود أن نشكر الأستاذ تاموتسو Yoshimori لتوريد تتكرم علينا مع البلازميد للتعبير عن CFP-LC3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41965 | |
| OptiMEM I | Invitrogen | 31985-062 | |
| MitoTracker Red FM | Invitrogen | M22425 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 | |
| X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche Applied Science | 6365787001 | |
| 22 mm coverslips | VWR | 631-0159 | |
| 35 mm plates | Fisher NUNC | 153066 | |
| Silicon grease | RS Components Ltd. | RS 494-124 | |
| O-rings | Custom made | ||
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A-7816 | Suggested alternative to custom-made O-rings |
| Microscope | Olympus | IX81 | Inverted microscope |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 100XO | N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5 |
| Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600 10B | Progressive scan interline CCD |
| Illuminator | TILL Photonics | Polychrome V | Ultrafast monochromator |
| Incubation chamber | Solent Scientific | Cell^R IX81 | |
| Software | Olympus | SIS xcellence |
References
- Mizushima, N. Autophagy: process and function. Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of Atg proteins in autophagosome formation. Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).
- Klionsky, D. J. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).
- Klionsky, D. J. Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve. Autophagy. 4, 740-743 (2008).
- Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).
- Hayashi-Nishino, M., et al. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Mizushima, N., et al. Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).
- Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy. 6, 764-776 (2010).
- Axe, E. L., et al. Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).
- Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue. Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).
